专利名称：含自体表皮细胞和异体表皮细胞的复合皮的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学创面修复技术领域，特别是一种用于深度皮肤缺损创面修复的含自体表皮细胞和异体表皮细胞的复合皮。
背景技术：
为解决大面积深度烧伤患者皮源短缺的问题，体外构建含表皮细胞的复合皮用于移植已成为创面修复领域中的热点。目前常规的制备复合皮的方法是患者第一次手术时，取小块皮肤标本(2cm2～4cm2)，分离自体表皮细胞，培养扩增，然后接种于真皮替代物(如脱细胞真皮、海绵状胶原膜等)表面，继续培养，形成含单层或复层表皮细胞的复合皮，将复合皮移植于经手术处理的深度烧伤创面，即可形成新的皮肤组织，从而修复创面。但用这种方法构建复合皮，自体表皮细胞要达到一定的扩增倍数，才能有效地用于临床，因此常需体外培养3～4周甚至更长时间，不能及时应用于临床，尤其是对于创面大皮源极度缺乏的患者，不仅获取充足的自体表皮细胞受到限制，而且漫长的细胞培养周期严重限制了复合皮的临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种除了含自体表皮细胞外还含有异体表皮细胞的复合皮，以节省自体皮源，并缩短细胞体外培养时间，尽早将复合皮应用于患者，有利于创面愈合。
本发明对目前临床上所用的仅含自体表皮细胞的复合皮进行了改进，即将自体表皮细胞和异体表皮细胞混合后再接种在真皮替代物表面构建复合皮。异体表皮细胞可采用常规技术培养、扩增并冻存于液氮中备用。构建复合皮时，可临时解冻、复苏适量异体表皮细胞，与获取的自体表皮细胞混合后接种于临床上常用的真皮替代物(如脱细胞真皮、海绵状胶原膜等)表面，接种的细胞密度为2.5-5×105个/cm2，按常规在细胞培养液中培养1-2周，细胞培养液可选自DMEM、或SFM等表皮细胞培养液，即可形成含单层或复层表皮细胞膜片的复合皮。使用时，将该复合皮按常规植入经手术处理好的深度烧伤或慢性皮肤溃疡等创面。由于移植后的复合皮中的异体表皮细胞会逐渐被机体排斥并被周边的自体表皮细胞爬行替代，因此本复合皮既使裸露创面得以早日覆盖治疗，又可避免因导入异体表皮细胞而可能引起的潜在危害。
本发明复合皮与目前临床上常用的含单纯自体表皮细胞的复合皮比较，具有显著的优点本发明的复合皮含有异体表皮细胞，异体表皮细胞可预先培养、冻存，需要时可随时解冻、复苏与自体表皮细胞混合培养构建复合皮，这样可明显缩短表皮细胞体外培养时间，不仅节省了自体表皮量，而且可及时应用于临床。比如将自体表皮细胞与异体表皮细胞按1∶1比例混合，与单纯的自体表皮细胞培养移植相比，可节省50％的自体表皮量，减少50％的培养时间。若按1∶4比例混合，则可节省80％的自体表皮量，减少约五分之四的体外培养时间，对于皮源极度缺乏的大面积烧伤患者的救治具有重要意义。
具体实施例方式
本发明复合皮的构建方法为1.异体表皮细胞培养取正常人废弃皮肤组织如包皮，采用常规的表皮细胞培养技术，分离表皮层，制备成单个表皮细胞悬液，按2.5-5×105个/cm2细胞密度接种于培养瓶中，置于37℃培养箱中以完全型DMEM培养液进行培养，当表皮细胞达70％～80％融合时进行传代、扩增。当异体表皮细胞达一定数量时，冻存于液氮中备用。
2.自体表皮细胞培养切取患者小块皮肤标本如2cm2～4cm2，采用常规的表皮细胞培养技术，分离表皮层，制备单个表皮细胞悬液，接种于培养瓶培养、扩增(具体同异体表皮细胞培养)，当自体表皮细胞能满足应用需要的数量时，置于培养液中待用。
3.构建复合皮解冻、复苏适量的异体表皮细胞，以适当比例与自体表皮细胞混合后按常规接种于临床上常用的真皮替代物(如脱细胞真皮、海绵状胶原膜等)表面，加入完全型DMEM培养液经体外培养1-2周，每2～3天换液一次，形成含单层或复层表皮细胞膜片的复合皮。
本发明含自体表皮细胞和异体表皮细胞的复合皮，主要用途有两种。第一种，作为永久性皮肤替代物用于大面积深度烧伤、增生性疤痕、慢性深度皮肤溃疡等皮肤缺损创面的修复。经大量动物(裸鼠)实验表明，将自体表皮细胞与异体表皮细胞按1∶1、1∶3、1∶5比例混合，接种于脱细胞真皮替代物表面培养后形成复合皮，然后以真皮替代物一面朝下，植入全层皮肤缺损创面，完全存活率达65％。复合皮移植后，异体表皮细胞随移植时间延长逐渐被排斥，被自体表皮细胞爬行替代，创面无明显裸露。新生皮肤可见基底层、基底上层和角化层，表皮与真皮连接结构正常，真皮中胶原纤维排列规则有序。第二种用途，作为暂时性覆盖物用于促进供皮区、浅度烧伤创面的修复。将含自体表皮细胞和异体表皮细胞的复合皮以细胞面朝下，贴于创面，可充当暂时性覆盖物，表皮细胞通过细胞间接触、释放多种细胞因子促进残存上皮再生，加速供皮区、浅度烧伤创面或慢性皮肤溃疡创面的愈合。
实施例1制备异体表皮细胞取正常人废弃皮肤组织4cm2一块，采用常规的表皮细胞培养技术，分离表皮层，制备成单个表皮细胞悬液，按5×105个/cm2细胞密度接种于培养瓶中，置于37℃培养箱中以完全型DMEM培养液培养1周，表皮细胞达70％～80％融合，进行传代、扩增。当异体表皮细胞达1×108个/ml时，分装后冻存于液氮中备用。
实施例2制备复合皮(1)自体表皮细胞培养切取患者小块皮肤标本2cm2，采用常规的表皮细胞培养技术，分离表皮层，制备单个表皮细胞悬液，接种于培养瓶培养、扩增(具体同异体表皮细胞培养)，自体表皮细胞达1×108个/ml时，置于培养液中备用。
(2)制备复合皮将冻存的异体表皮细胞解冻复苏后，与自体表皮细胞以1∶1比例混合，按常规接种于脱细胞真皮支架表面，细胞密度为5×105个/cm2，在完全型DMEM培养液中37℃下培养1周，每2天换液1次，即形成复合皮。
实施例3制备复合皮时，异体表皮细胞和自体表皮细胞的比例为1∶5，按4×105个/cm2细胞密度接种于脱细胞真皮支架表面，培养液为DMEM，其余条件同实施例2，培养10天即形成复合皮。
实施例4制备复合皮时，异体表皮细胞和自体表皮细胞的比例为1∶1，按5×105个/cm2细胞密度接种于海绵状胶原膜表面，其余同实施例2，培养1周即形成复合皮。
实施例5制备复合皮时，异体表皮细胞和自体表皮细胞的比例为1∶3，按2.5×105个/cm2细胞密度接种于海绵状胶原膜表面，其余同实施例2，培养2周即形成复合皮。
权利要求
1.一种含自体表皮细胞和异体表皮细胞的复合皮，由真皮替代物和覆盖于其表面的单层或复层表皮细胞膜片组成，其特征在于表皮细胞膜片中含自体表皮细胞和异体表皮细胞。
2.权利要求1所述复合皮的制备方法，其特征在于将制备的自体表皮细胞和异体表皮细胞混合后接种于临床上常用的真皮替代物表面，接种的细胞密度为2.5×105～5×105个/cm2，按常规在细胞培养液中培养1～2周，即成复合皮。
3.按权利要求2所述的复合皮制备方法，其特征在于自体表皮细胞与异体表皮细胞的混合比例为1∶1～1∶5。
4.按权利要求2或3所述的复合皮制备方法，其特征在于所说的真皮替代物为脱细胞真皮替代物或海绵状胶原膜。
5.按权利要求2或3所述的复合皮制备方法，其特征在于所说的细胞培养液为DMEM培养液。
6.按权利要求4所述的复合皮制备方法，其特征在于所说的细胞培养液为DMEM培养液。
全文摘要
本发明涉及医学创面修复技术领域，是一种可用于深度创面修复的含自体表皮细胞和异体表皮细胞的复合皮。按常规采用细胞培养技术，将自体表皮细胞和异体表皮细胞混合，然后接种于真皮替代物表面，经体外培养后形成含单层或复层表皮细胞膜片的复合皮。可作为永久性皮肤替代物用于大面积深度烧伤、慢性深度皮肤溃疡等创面的修复，也可作为暂时性覆盖物用于促进供皮区、浅度烧伤创面的修复。由于异体表皮细胞可事先培养、冻存，需要时可以应急随时解冻复苏，且移植后可被自体表皮细胞逐渐替代，因此本发明复合皮与目前常用的不含异体表皮细胞的复合皮相比，既节省了自体表皮量，又缩短了表皮细胞的体外培养时间，有利于根据患者全身情况及创面局部情况及时应用于临床。
文档编号A61L27/38GK1850303SQ20061002704
公开日2006年10月25日 申请日期2006年5月30日 优先权日2006年5月30日
发明者夏照帆, 肖仕初, 田建广, 王光毅, 王广庆, 朱世辉 申请人:中国人民解放军第二军医大学