专利名称：一种免佐剂具有防治人胰岛素依赖型糖尿病作用的免疫调节剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术、蛋白分离纯化技术及医学相关领域。更具体地，本发明涉及融合蛋白HSP65-6×p277的构建、表达及分离纯化。在医学领域中，本发明是一种免疫调节剂，能用于预防和治疗人胰岛素依赖型糖尿病。
背景技术：
人胰岛素依赖型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)，包括1型糖尿病和1.5型糖尿病。1型糖尿病，是一种具家族遗传性的自身免疫性疾病，患者以青少年居多。主要表现为胰岛β细胞的大部分被破坏和胰岛素的绝对缺乏。目前尚无有效的治疗方法，患者需终生依靠胰岛素，十分痛苦。1992年后，我国一些地区根据WHO diamond Project计划，在统一方法和标准下，对15岁以下儿童1型糖尿病的发病率进行了调查，据收集到的已发表的11个地区的资料中，1988年到1995年期间我国儿童1型糖尿病的年发病率在0.19/10万～1.26/10万，多数地区年发病率在0.5/10万～0.9/10万。自20世纪80年代起，儿童1型糖尿病的发病在我国有不断增高的趋势。1.5型糖尿病学名叫“成人隐匿性自身免疫糖尿病”，它是以胰岛β细胞破坏为主，因此从本质上属于1型糖尿病。但它的起病又具有隐匿、迟发的特点，发病初期服降糖药治疗有效，无需使用胰岛素，这又符合2型糖尿病的特点，因此称它为1.5型糖尿病，这种特殊类型的糖尿病约占患者的10％~15％，我国约有病人800万。
一般情况下，自身免疫性疾病可通过免疫注射疾病相关的自身抗原来治疗。目前已经从IDDM病人血清中检测出许多自身抗体，其中重要的有胰岛细胞抗体(islet cell antibody，ICA)，胰岛素抗体(insulin antibody，IA)，抗热休克蛋白60((heat shock protein60，HSP60)抗体，抗谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)抗体等。由此进一步验证引起疾病的自身抗原有胰岛细胞表面抗原-512(ICA-512)，胰岛素，HSP60，GAD，此外可能存在的还有胰岛素受体，羧肽酶H，外周蛋白等。
当存在多种可能的抗原时，确定其中的优势抗原尤为重要。热休克蛋白(HSP)是所有的细胞，包括原核细胞和真核细胞在受到温度的突然增高和其他理化因素的刺激产生应激反应后而形成的一种高度保守蛋白，具有很强的免疫原性，与多种自身免疫性疾病相关，其中与IDDM相关的为HSP60家族。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的热休克蛋白65(MT-HSP65)本身有抗糖尿病作用，但注射免疫会诱发动脉粥样硬化，采用粘膜免疫途径不仅不会诱发动脉粥样硬化，而且还能够保持HSP65本身的抗糖尿病效果。
HSP60是IDDM中极其重要的一个抗原，迄今为止，未见有报道称由HSP60引发IDDM，倒是有许多文献表明，用此种抗原免疫机体能使其在下一次遇到该抗原时对其产生耐受性，阻止自身免疫性疾病的发生。有人把人工合成的多肽固定在聚乙烯材料上，来进行HSP60的线性抗体表位扫描，发现糖尿病儿童组的血清中特异性针对p277的抗体水平显著高于健康儿童组。p277多肽是存在于人HSP60蛋白上437-460的一段特异性多肽，是在IDDM中发挥作用的特异片段，序列为VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。有文献报道了一次随机的，双盲的二期临床实验，实验结果表明，p277能挽救机体内未受损的胰岛β细胞的功能(即使机体已表现出明显的临床症状)，使其能继续释放内源性的胰岛素。至于p277的作用机理，可以通过一种抗原能调控机体对其它抗原反映的现象(亦称“旁路抑制”理论)来解释，即一种抗原在炎症部位激活抑制炎症因子的Th2型细胞因子可关闭Th1细胞对附近抗原的反应，这也是目前对此较为成熟与合理的解释。在鼠和人中，与胰岛β细胞决定簇作用的主要为CD4+T细胞，而CD4+T细胞按其分泌的细胞因子不同又分为Th1细胞和Th2细胞。Th1细胞主要分泌IL2和IFN-γ，前者能有效刺激T细胞增值，后者为炎症因子，能引起组织发炎并诱导β细胞产生IgG2a抗体。而且由于77％的Th1细胞具有细胞毒作用，它可以溶解呈递自身移植抗原的β细胞，从而使抗体生成降低，降低体液免疫。Th2细胞分泌IL4和IL-10，能降低Th1效应。IL-4促进β细胞产生IgGI抗体，抑制Th1产生前炎症因子。IL-10通过影响抗原呈递细胞和巨噬细胞释放前炎症因子而抑制Th1活性。至于p277为什么能诱导这种变化，现在认为关键在于p277本身的抗原特性、结构等，因为T细胞表型的分化受不同抗原刺激产生不同的结果。因此可考虑用此作为免疫调节剂来预防和治疗胰岛素依赖型糖尿病。
采用免疫调节剂可以克服传统的口服或注射胰岛素及器官移植等方法的诸多缺点，更重要的是它能挽救未损伤的β细胞，使其继续释放内源性的胰岛素。然而p277作为只具有20几个氨基酸的多肽，免疫原性很弱，这在一定程度上限制了其作用的发挥。通常，多肽疫苗需要加入佐剂，才能激发机体产生足够强的免疫应答。许多常用的佐剂，如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等仅能用于动物，不能用于人体人体可用的佐剂目前仅有铝佐剂，而这种佐剂常常对多肽疫苗不能起到强化免疫原性的作用。本发明采用HSP65与六段p277融合表达，其中HSP65具有“在位”佐剂的功能，可以非特异性刺激T细胞或作用于巨噬细胞，起到呈递特异性抗原的作用；抗原表位六段重复又可以增大表位剂量，从而提高药效。
发明内容
本发明的目的是提供一种强化多肽免疫原性的方法。
本发明的另一目的是提供一种具有防治人胰岛素依赖型糖尿病作用的免疫调节剂。
本发明的再一目的是提供生产该免疫调节剂的方法。
本发明的又一目的是提供了该免疫调节剂的免疫途径。
本发明的最终目的是该免疫调节剂的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种强化多肽免疫原性的方法，这种方法是将六段重复的抗原表位多肽串联基因反复插入HSP65基因的下游，使多重复串联抗原表位多肽与HSP65融合表达。这种强化多肽免疫原性方法的原理是(1)将抗原表位多肽重复多次，可以增加抗原表位的剂量，增加整个抗原的分子量，从而增加抗原表位多肽的免疫原性；(2)通过重复抗原表位基因的反复循环克隆实现抗原表位的多次重复；(3)分枝杆菌HSP65具有在位佐剂的功能，将抗原表位多肽重复片断与分枝杆菌HSP65基因融合表达的蛋白作为免疫调节剂，可以不需添加佐剂，诱发机体产生强烈的免疫应答。而且，将HSP65基因与抗原表位融合表达可省去抗原表位多肽与在位佐剂HSP65化学偶联的步骤。本发明的免疫调节剂可简写为HSP65-n×p277，n指用于串联排列的重复抗原表位p277的个数，且大于1，抗原表位之间可以直接相联，也可以有间隔的氨基酸残基。在疫苗研究中，表位之间可以在空间上相邻也可以不相邻。
在本发明的第二方面，提供了一种具有防治人胰岛素依赖型糖尿病作用的免疫调节剂。该免疫调节剂采用本发明的第一方面所述的方法进行设计。在免疫调节剂分子中，(重复抗原表位)n等于6，即含有六段(但不限于)作为抗原表位的源于人HSP60(437-460)的抗原表位多肽p277。为了叙述方便，在实施例中，本发明含六段p277抗原表位用“6×p277”表示。HSP65是指来源于牛分枝杆菌的热激蛋白，基因库登录号是M17705。将抗原表位多肽与HSP65融合表达，能强化多肽疫苗的免疫原性，不需添加佐剂就能激发机体产生强烈免疫应答，用于防治人胰岛素依赖型糖尿病。将六段抗原表位与HSP65融合表达所获得的具有防治人胰岛素依赖型糖尿病作用的免疫调节剂表示为“HSP65-6×p277”。
在本发明的第三方面，提供了生产该免疫调节剂的方法，其技术路线详述如下1.p277基因的设计与获得p277是人HSP60上的一段437VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED460氨基酸序列，该序列是HSP60对IDDM发挥作用的特异片段。我们将442和447位的C(半胱氨酸)用V(缬氨酸)来置换，以增强肽段的稳定性，两者具有相同的免疫特性。根据多肽p277氨基酸序列，选择原核和真核生物均适用的密码子，借助于计算机设计两条寡核苷酸链，分别作为上游、下游引物，并在上游引物5’端加上限制性核酸内切酶BamHI的酶切位点，下游引物5’端加上终止密码子和限制性核酸内切酶HindIII的酶切位点，两条引物互补序列为20个碱基，通过聚合酶链式反应(PCR)法获得p277多肽基因的核苷酸序列。
2.HSP65基因的设计与获得在不改变HSP65氨基酸序列的前提下，选用原核和真核生物均适用的密码子，借助于计算机设计两条寡聚核苷酸链，从市售的卡介苗提取的DNA中通过PCR法获得HSP65基因的核苷酸序列，5’端添加了Nco I的识别位点，3’端添加了Nhe I和Bgl II的识别位点。
3.pED-p277重组基因工程菌的构建p277基因经BamHI、HindIII切割插入经BamHI、HindIII切割的pED质粒载体中，组成融合表达的重组质粒PED-p277，重组质粒转化大肠杆菌BL21，获得重组基因工程菌。
4.PED-HSP65-p277重组基因工程菌的构建HSP65基因经Nco I、Bgl II切割插入经Nco I、BamHI切割的pED-p277质粒中，BglII和BamHI为同尾酶，组成融合表达的重组质粒pED-HSP65-p277，重组质粒转化大肠杆菌BL21获得重组基因工程菌。
5.PED-HSP65-6×p277重组基因工程菌的构建在不改变串联多肽氨基酸序列的前提下，选用大肠杆菌偏爱的密码子，借助于计算机设计两条寡聚核苷酸链，通过PCR法获得重复抗原表位多肽基因的核苷酸序列，5’端添加了Xba I的识别位点，3’端添加了Nhe I的识别位点。p277基因经Xbal、Nhel切割插入经Nhel切割的PED-HSP65-p277质粒载体中，组成融合表达的重组质粒PED-HSP65-2×p277，HSP65后仍然留有单一酶切位点Nhel，在此基础上重复操作可再插入一段p277基因，即插入p277基因6次则得到融合表达的重组质粒pED-HSP65-6×p277，重组质粒转化大肠杆菌BL21，获得重组基因工程菌。重要的一点是p277最后一个氨基酸是天冬氨酸，其密码子为GAT，以便于阳性克隆的筛选。因为载体质粒采用单酶切，插入p277基因时会有正向和反向两种情况，如果是正向插入则GAT表达为天冬氨酸，HSP65-p277蛋白的分子量比HSP65蛋白要大2800左右；如果是反向插入则GAT变为TAG，为终止密码子，HSP65-p277蛋白的分子量与HSP65蛋白的分子量相等。所以用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色电泳可判断正向正确插入p277基因的重组克隆。
6.工程菌发酵及重组HSP65-6×p277融合蛋白的获得以LB为基础培养基，玉米浆培养基为发酵培养基，发酵参数如下温度36-38℃，pH6.8-7.2。发酵后离心收集工程菌，反复冻融裂解菌体，离心获得上清可溶性蛋白，硫酸铵分级沉淀，30％-40％硫酸铵沉淀中含有目的融合蛋白，沉淀重新溶解后经DEAE阴离子交换柱层析纯化，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以判断纯化的HSP65-6×p277的纯度。
在本发明的第四方面是提供了该免疫调节剂的免疫途径。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的热休克蛋白65(MT-HSP65)本身有抗糖尿病作用，但用该蛋白注射免疫会诱发动脉粥样硬化，采用粘膜免疫途径不仅不会诱发动脉粥样硬化，而且还能够保持HSP65本身的抗糖尿病效果。在本发明的免疫调节剂中，MT-HSP65不仅具有抗糖尿病的作用，而且还起到了“在位”佐剂的功能，将抗原表位多肽p277多次重复串联与HSP65融合表达，能强化p277的免疫原性，不需添加佐剂就能激发机体产生强烈免疫应答，可以通过粘膜给药来防治人胰岛素依赖型糖尿病。利用鼻粘膜给药进行粘膜免疫简便易行，药物经鼻粘膜部丰富毛细血管吸收后直接进入体循环，使药物不良反应的发生机率大为降低，体液免疫是粘膜免疫效应的主要过程，即产生分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，sIgA的多聚体结构能增强其对抗原的亲和力，而且sIgA表面特殊的糖成分或糖链有助于使其粘附于粘膜的表面和抵抗蛋白水解酶的消化作用。通过鼻粘膜给药还可免受胃肠道中酶的破坏和肝脏对药物的首过清除效应，有利于提高生物利用度和血药浓度，可极大地减少药物用量。同时IgG，IgM，IgE等免疫球蛋白在粘膜反应中也起着不可忽视的重要作用。
在本发明的第五方面是该免疫调节剂的用途，如上所述，此种免疫调节剂能用于防治人胰岛素依赖型糖尿病的发生。我们选用国际上通用的胰岛素依赖型糖尿病的动物模型NOD(non-obese diabetic mouse，NOD)小鼠，随机分成五组，每组十只，分别是HSP65-6×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫组，HSP65-1×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫组，HSP65蛋白鼻腔粘膜免疫组，PBS空白对照组，卵清蛋白滴鼻对照组。分别于4周龄、7周龄、10周龄3次免疫，蛋白都用PBS溶解，不加其他佐剂，每次免疫剂量为100μg/只。每月测小鼠体内血糖水平及相应的抗体滴度。结果显示，HSP65-6×p277、HSP65-1×p277和HSP65都可以不同程度的抑制NOD小鼠糖尿病的发生，这可能由于热休克蛋白高度保守，MT-HSP65和人的HSP60中含有相似的抗原表位，当以可溶性的方式粘膜免疫时可以诱导机体产生免疫耐受，从而起到降低针对胰岛β细胞的免疫损伤来防治糖尿病的发生。这样一来通过粘膜免疫HSP65不仅不会诱发动脉粥样硬化，而且还具有“在位”佐剂的功能并同时能够保持其本身的抗糖尿病效果。将其与多次重复p277组成重组蛋白，明显优于单独使用p277，更有利于防治人胰岛素依赖型糖尿病的发生。
图1载体质粒pED-HSP65-p277以及重组质粒pED-HSP65-6×p277结构图。
图2重组质粒pED-HSP65-6×p277C端部分基因测序结果。
图3SDS-PAGE电泳显示重组质粒pED-HSP65-6×p277的融合表达。1.大肠杆菌BL21细胞全蛋白；2.载荷pET28a质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；3.载荷pET28a-HSP65质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；4.载荷pED-HSP65-6×p277质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；5.标准分子量蛋白。
图4SDS-PAGE电泳显示HSP65-6×p277蛋白的纯化.1.标准分子量蛋白；2.大肠杆菌BL21细胞全蛋白；3.载荷pET28a质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；4.乳糖诱导6小时后载荷pED-HSP65-6×p277质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白；5.分离的融合蛋白HSP65-6×p277。
图5SDS-PAGE电泳显示HSP65-1×p277蛋白及HSP65蛋白的纯化.1.标准分子量蛋白；2.乳糖诱导6小时后载荷pED-HSP65质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白；3.分离的HSP65-1×p277蛋白；4.分离的HSP65蛋白。
图6ELISA测定结果显示HSP65-6×p277和HSP65-1×p277蛋白经粘膜免疫都能诱发小鼠产生抗p277的抗体。
图7Westernblot检测结果显示HSP65-6×p277能诱发NOD小鼠产生抗p277抗体。A蛋白转膜后用丽春红染色显示相应的蛋白条带；B杂交后显色结果。1.标准分子量蛋白；2.氧化态rhVEGF-p277；3.还原态rhVEGF-P277；4.氧化态rhVEGF；5.还原态rhVEGF。
图8各组NOD小鼠免疫后不同月龄血清中血糖的含量。结果显示HSP65-6×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫以及HSP65-1×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫均可以显著降低NOD小鼠血糖含量，HSP65给药组NOD小鼠的血糖也有不同程度的降低。
具体实施例方式
(1)菌株，细胞系和质粒宿主菌E.coliBL21(Escherichia coliBL21)是基因工程常用工具菌种，在与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。
质粒pET28a购自Novagen公司。
卡介苗由上海生物制品公司生产，该制品中含有牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)。
质粒pED由本实验室构建并保存。
质粒pET28a-HSP65由本实验室构建并保存，HSP65蛋白也由本实验室分离纯化。
(2)酶和试剂分子克隆工具酶和试剂、细菌基因组、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品PCR回收试盒和琼脂糖胶回收试剂盒为上海华舜生物工程公司产品。
(3)培养基LB培养基，配方见参考文献Salmbrook J，Fristsh EF，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。该书是基因工程技术的经典著作，在许多高校图书馆都有收藏。
玉米浆培养基含有玉米浆25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
(4)Cellouse-DEAE DE-52为Whatman公司产品。
(5)辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗为武汉博士德公司产品。
(6)3、3’、5、5’一四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)、过氧化氢尿素和牛血清白蛋白(BSA)为美国西格马(sigma)公司产品。
(7)96孔酶标板为美国康宁(Corning)公司产品。
(8)硝酸纤维素膜为美国Millipore公司产品。
(9)测定血清中血糖浓度的仪器为Hitachi Automatic Analyzer(Model-7150，Tokyo，Janpan)。
方法分子生物学操作方法质粒提取、聚合酶链反应、限制性核酸内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYColdspringHarborLaboratoryPress，1989，pp.16-340。
重组蛋白表达量的测定参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press.1989，方法进行。
实施例1HSP65-6×p277多肽基因的设计、合成和克隆根据MT-HSP65基因和p277多肽基因的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子，在计算机的辅助下设计出6条寡核苷酸片段。首先通过PCR法合成p277多肽基因，将该基因克隆到pED的L-ansB-C基因的C端，转化大肠杆菌得到重组质粒命名pED-p277。再以pET28a-HSP65质粒为模板，通过PCR的方法获得MT-HSP65基因，将该基因替换pED-p277中的L-ansB-C基因，转化大肠杆菌得到重组质粒命名pED-HSP65-p277。重复克隆p277基因得到重组质粒pED-HSP65-2×p277；再重复克隆p277基因，直至得到重组质粒pED-HSP65-6×p277。具体方法如下6条寡核苷酸PI5’-GCTGGATCCAGTTCTGGGTGGTGGCGTTGCTCTGCTGCGCGTTATCCCGGCTCTGG-3’P25’-GTCAAGCTTA ATCTTCGTTAGCCGGGGTCAGGGAGTCCAGAGCCGGGATA ACGCGC-3’P35’-TTG ACC ATG GCC AAG ACAATT GCG TAC-3’P45’-TAAAAGATCTGCGCTAGCGAAATCCATGCCACCCAT-3’P55’-ATGGGCTAGCGTTCTGGGTGGTGGTGTTGCTCTGCTGCGCGTTATCCCGGCTCTG-3’P65’-TATGTCTAGAATCTTCGTTAGCTGGGGTCAGGGAGTCCAAAGCCGGGATAACGCG-3’通过PCR获得p277多肽基因将寡核苷酸片段P1和P2按一定比例混合，二者互为引物和模板，94℃，30sec，58℃，30sec，72℃，30sec，共30个循环72℃，10min。将扩增获得的PCR产物经试剂盒纯化后用限制性核酸内切酶BamHI和HindIII消化，与用相同限制性内切酶消化的pED质粒连接，连接产物转化大肠杆菌BL21，所获得的转化子中含连有p277多肽基因的重组质粒pED-p277。
通过PCR获得HSP65多肽基因以P3为上游引物，P4为下游引物，pET28a-HSP65质粒为模板，经94℃变性5min，然后以94℃变性1min、62℃复性1min、72℃延伸2min，共进行35个循环后，再72℃延伸10min。将扩增所得PCR产物经PCR纯化试剂盒纯化后用限制性核酸内切酶Ncol和Bgl II消化，与用Ncol和BamHI消化的pED-p277质粒连接，其中Bgl II和BamHI为同尾酶，连接产物转化大肠杆菌BL21，所获得的转化子中含HSP65-p277融合蛋白基因的重组质粒pED-HSP65-p277。结构框架见图1。
通过PCR获得HSP65-6×p277多肽基因以寡核苷酸片段P5和P6按一定比例混合，二者互为引物和模板，经94℃变性5min，然后以94℃变性1min、58℃复性50sec、72℃延伸30sec共进行30个循环后，再72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物p277用限制性内切酶Xbal和Nhel消化，与用限制性内切酶NheI消化的pED-HSP65-p277质粒连接，连接产物转化大肠杆菌BL21，所获得的转化子中含HSP65-2×p277多肽融合蛋白基因的重组质粒pED-HSP65-2×p277。限制性内切酶Xbal和Nhel是同尾酶，酶连后形成的粘合位点不再被Xbal或Nhel识别，因此重组质粒pED-HSP65-2×p277中仍然只留有一个Nhel酶切位点。再将PCR扩增产物p277用限制性内切酶Xbal和Nhel消化，与用限制性内切酶Nhel消化的质粒pED-HSP65-2×p277连接，连接产物转化大肠杆菌BL21，所获得的转化子中含HSP65-3×p277多肽融合蛋白基因的重组质粒pED-HSP65-3×p277；六次进行这一过程得到含HSP65-6×p277多肽融合蛋白基因的重组质粒pED-HSP65-6×p277，其结构框架见图1。
实施例2HSP65-6×p277基因在大肠杆菌中的表达将重组质粒pED-HSP65-6×p277转化大肠杆菌BL21。从生长有不同转化子平板上挑取单菌落接种含有50ug/ml卡那霉素LB液体培养基，于37℃恒温振荡培养过夜，按1％比例转接种入新鲜的玉米浆液体培养基(50ug/ml卡那霉素)中，37℃培养4小时后，加入终浓度为0.5mmol/L的α-乳糖诱导大肠杆菌表达T7RNA聚合酶，继续培养从而表达融合蛋白HSP65-6×p277。诱导后每隔1小时取少量菌液，离心回收菌体，SDS-PAGE电泳再经薄层扫描显示已经实现了HSP65-6×p277多肽基因的融合表达。融合蛋白在诱导后6小时达到稳定的最大表达量，融合蛋白占细菌总蛋白的40％左右，结果见图3。
实施例3重组蛋白HSP65-6×p277的分离纯化诱导表达后的工程菌经离心回收菌体，将菌体悬浮在菌体裂解液(pH8.0，50mM磷酸盐缓冲液，0.02％溶菌酶)中，37℃搅拌30分钟，加入DNase将DNA消化至溶液不粘稠为止，离心回收上清，用硫酸按分级沉淀，目的蛋白主要在35％-45％硫酸按沉淀中。将沉淀的融合蛋白重新溶解在pH6.8磷酸盐缓冲液中，透析脱盐，离心后取上清进行阴离子交换柱层析，DEAE纤维素DE-52柱(2×60cm)，用PB/NaCI梯度洗脱，分段收集进行SDS-PAGE电泳检测，HSP65-6×p277在120～150mmolNaCI处的洗脱峰中，用SDS-PAGE电泳检查制备样品的纯度，见图4。HSP65-1×p277蛋白和HSP65蛋白由本实验室保存，用SDS-PAGE电泳检查其纯度，见图5。
实施例4HSP65-6×p277重组蛋白的免疫原性研究选用4周龄雌性NOD小鼠，随机分成五组，每组十只，分别是HSP65-6×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫组，HSP65-1×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫组，HSP65蛋白鼻腔粘膜免疫组，PBS空白对照组，卵清蛋白滴鼻对照组。分别于4周龄、7周龄、10周龄3次免疫，蛋白都用PBS溶解，不加其他佐剂，每次免疫剂量为100μg/只。每次免疫后3周内眦取血一次，血量为0.5-0.8ml，离心，取血清冷冻保存。
用纯化的重组人血管内皮生长因子121和p277的融合蛋白(rhVEGF-p277)4℃过夜包被96孔ELISA酶标板，每孔100μl含50μg融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃满孔封闭一小时。免疫后取血所得抗血清用5％BSA(于pH7.5的PBS中)稀释100倍，然后每孔加入100μl稀释后的抗血清于37℃作用1小时。用PBST(含0.1％Tween-20)和自来水间隔洗涤6次后加入100μl以1∶20000稀释的羊抗小鼠IgG二抗(辣根过氧化物酶标记)，每孔100μl，37℃作用1小时。PBST和自来水间隔洗涤6次，每孔加入100μl过氧化氢尿素和3，3’-5，5’一四甲基联苯胺(TMB)溶液于37℃显色30分钟后，加入50μl 2MH2SO4终止反应，并于450nm波长下，测定各孔吸光度值。结果见图6。HSP65-6×p277和HSP65-1×p277免疫组都能诱发NOD小鼠产生特异的抗p277抗体，但HSP65-6×p277组抗体值明显优于HSP65-1×p277组。
实施例5抗p277特异抗体的Western检测将纯化后的rhVEGF、还原态rhVEGF-p277和氧化态rhVEGF-p277用15％SDS-PAGE电泳后，于30V电压电泳过夜转移到硝酸纤维素膜上，然后以5％BSA溶液室温封闭2小时。实施例5和例6中所得抗血清稀释20倍后，与硝酸纤维素膜上的抗原于37℃作用1小时后，以pH7.5TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；加入稀释400倍的羊抗小鼠或兔IgG(辣根过氧化物酶标记)二抗，于37℃作用1小时，再以pH7.5TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；最后，加入二氨基联苯胺(DAB)溶液显色。具体操作方法参考Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.888-898。氧化态rhVEGF-p277(泳道2)由于其链间二硫键的作用，部分蛋白质形成二聚体，在PAGE胶上表现为分子量分别为17kD和34kD的双条带，还原态rhVEGF-p277(泳道1)为单体，在胶上表现为分子量为16kD的单条带。由于NOD小鼠血清中有抗p277抗体的存在，因此可以分别和膜上16kD和32kD的rhVEGF-p277蛋白带杂交，但不和rhVEGF杂交(泳道4和5)，证实了HSP65-6×p277和HSP65-1×p277实验组都能诱发NOD小鼠产生特异的抗p277的抗体。结果见图7。
实施例6HSP65-6×p277重组蛋白的药效学研究选用4周龄雌性NOD小鼠，随机分成五组，每组十只，分别是HSP65-6×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫组，HSP65-1×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫组，HSP65蛋白鼻腔粘膜免疫组，PBS空白对照组，卵清蛋白滴鼻对照组。分别于4周龄、7周龄、10周龄3次免疫，蛋白都用PBS溶解，不加其他佐剂，每次免疫剂量为100μg/只。每次免疫后3周内眦取血一次，血量为0.5-0.8ml，离心，取血清5小时内用全自动生化分析仪测定血糖含量。结果见图8。结果显示HSP65-6×p277蛋白鼻腔粘膜免疫组，HSP65-1×p277蛋白鼻腔粘膜免疫组可以显著降低NOD小鼠血糖含量。以血糖浓度≥11.1mmol/只判为糖尿病。各组发病率见下表。结果表明重组蛋白HSP65-6×p277鼻腔粘膜免疫组效果最好，至8月龄时NOD鼠尚无糖尿病的发生。HSP65-1×p277蛋白鼻腔粘膜免疫组HSP65蛋白鼻腔粘膜免疫组也能对NOD小鼠糖尿病的发生也有一定的预防作用。
基因序列表atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac gccctcgccgatgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgeaacgt cgtcctggaa aagaagtggg gtgcccccacgatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgccgagctggtca aagaggtagc caagaagacc gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgctggcccaggc gttggttcgc gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacgcggcatcgaa aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaaggagcagattg cggccaccgc agcgatttcg gcgggtgacc agtccatcgg tgncctgatc gccgaggcgatggacaaggt gggcaacgag ggcgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc tttgggctgc agctcgagctcaccgagggt atgcggttcg acaagggcta catctcgggg tacttcgtga ccgacccgga gcgtcaggaggcggtcctgg aggaccccta catcctgctg gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat ctgctgccgctgctcgagaa ggtcatcgga gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggcgctgtccaccctg gtcgtcaaca agatccgcgg caccttcaag tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggcgaccgccgca aggcgatgct gcaggatatg gccattctca ccggtggtca ggtgatcagc gaagaggtcggcctgacgct ggagaacgcc gacctgtcgc tgctaggcaa ggcccgcaag gtcgtggtca ccaaggacgagacoaecatc gtcgagggcg ccggtgacac cgacgccatc gccggacgag tggcccagat ccgccaggagatcgagaaca gcgactccga ctacgaccgt gagaagctgc aggagcggct ggccaagctg sccggtggtgtcgcggtgat caaggccggt gccgccaccg aggtcgaact caaggagcgc aagcaccgca tcgaggatgcggttcgcaat gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtgggg gtgtgacgct gttgcaagcggccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa ggcgacgagg cgaccggcgc caacatcgtg aaggtggcgctggaggcccc gctgaagcag atcgccttca actccgggct ggagccgggc gtggtggccg agaaggtgcgcaacctgccg gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt gtctacgagg atctgctcgc tgccggcgttgctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg ctgcagaatg cggcgtccat cgcggggctg ttcctgaccaccgaggccgt cgttgccgac aagccggaaa aggagaaggc ttccgttccc ggtggcggcg acatgggtggcatggatttc gctagcgttc tgggtggtgg cgttgctctg ctgcgcgtta tcccggctct ggactccctgaccccggcta acgaagattc tagcgttctg ggtggtggcg ttgctctgct gcgcgttatc ccggctctggactccctgac cccggctaac gaagattcta gcgttctggg tggtggcgtt gctctgctgc gcgttatcccggctctggac tccctgaccc cggctaacga agattctagc gttctgggtg gtggcgttgc tctgctgcgcgttatcccgg ctctggactc cctgaccccg gctaacgaag attctagcgt tctgggtggt ggcgttgctctgctgcgcgt tatcccggct ctggactccc tgaccccggc taacgaagat tctagcgcag atccagttctgggtggtggc gttgctctgc tgcgcgttat cccggctctg gactccctga ccccggctaa cgaagat表1
MAKTIAYDEE ARRGLERGLN ALADAVKVTL GPRGRNVVLE KKWGAPTITN DGVSIAKEIE LEDPYEKIGAELVKEVAKKT DDVAGDGTTT ATVLAQALVR EGLRNVAAGA NPLGLKRGIE KAVEKVTETL LKGAKEVETKEQIAATAAIS AGDQSIGDLI AEAMDKVGNE GVITVEESNT FGLQLELTEG MRFDKGYISG YFVTDPERQEAVLEDPYILL VSSKVSTVKD LLPLLEKVIG AGKPLLIIAE DVEGEALSTL VVNKIRGTFK SVAVKAPGFGDRRKANLQDM AILTGGQVIS EEVGLTLENA DLSLLGKARK VVVTKDETTI VEGAGDTDAI AGRVAQIRQEIENSDSDYDR EKLQERLAKL AGGVAVIKAG AATEVELKER KHRIEDAVRN AKAAVEEGIV AGGGVTLLQAAPTLDELKLE GDEATGANIV KVALEAPLKQ IAFNSGLEPG VVAEKVRNLP AGHGLNAQTG VYEDLLAAGVADPVKVTRSA LQNAASIAGL FLTTEAVVAD KPEKEKASVP CGGDMGGMDF ASVLGGGVAL LRVIPALDSLTPANEDSSVL GGGVALLRVI PALDSLTPAN EDSSVLGGGV ALLRVIPALD SLTPANEDSS VLGGGVALLRVIPALDSLTP ANEDSSVLGG GVALLRVIPA LDSLTPANED SSADPVLGGG VALLRVIPAL DSLTPANED表权利要求
1.一种免佐剂具有防治人胰岛素依赖型糖尿病作用的免疫调节剂，其特征在于该免疫调节剂是将源于HSP60的抗原表位多肽p277基因六次串联重复后与源于牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)HSP65融合形成的融合蛋白。
2.按照权利要求1所述的免疫调节剂，其特征在于该免疫调节剂中含有六段源于人HSP60的抗原表位多肽p277，每段p277的氨基酸序列是VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。
3.按照权利要求1所述的免疫调节剂，其特征在于该免疫调节剂的基因序列见附图1。
4.按照权利要求1所述的免疫调节剂，其特征在于该免疫调节剂的蛋白序列见附图2。
5.按照权利要求1所述的免疫调节剂，其结构可表示为HSP65-n×p277，其特征在于HSP65携带有n个人HSP60的抗原表位多肽p277，n＞1。
6.一种免佐剂具有防治人胰岛素依赖型糖尿病作用的免疫调节剂的制备方法，包括用化学合成法和PCR法合成六段源于人HSP60的抗原表位多肽p277和HSP65的编码序列DNA，将这些DNA分步插入表达载体，在大肠杆菌中表达出可溶性融合蛋白，经硫酸铵分级沉淀、阴离子交换树脂DEAE纤维素纯化，得到防治人胰岛素依赖型糖尿病的免疫调节剂。
7.按照权利要求6所述得到的免疫调节剂，其特征在于不需添加佐剂，也不需要将抗原多肽与载体化学偶联，通过粘膜免疫途径能诱发机体产生HSP65和p277特异的免疫应答。
8.按照权利要求6所述得到的免疫调节剂，其特征在于能显著降低NOD小鼠糖尿病的发生，能够起到防治胰岛素依赖型糖尿病的作用。
9.根据权利要求6所述得到的免疫调节剂，其特征在于可与药物载体或药物活性成分组合制成药物组合物。
全文摘要
本发明提供了一种能用于预防和治疗胰岛素依赖型糖尿病的免疫调节剂。针对抗原多肽的弱免疫原性，将抗原表位多肽基因(源于人HSP60的一段抗原表位p277)六次重复串联反复插入源于牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的热休克蛋白HSP65基因的下游，实现了多重复串联抗原表位多肽与HSP65的融合表达。产生的融合蛋白可不需添加佐剂，也不需将抗原多肽与载体化学偶联直接用于免疫。该融合蛋白通过粘膜免疫途径可激发机体产生高滴度针对p277的抗体，显著降低NOD小鼠糖尿病的发生，能够起到防治1型和1.5型等以胰岛素依赖为主要特征的糖尿病的作用。
文档编号A61P3/00GK1831012SQ20061003773
公开日2006年9月13日 申请日期2006年1月12日 优先权日2006年1月12日
发明者刘景晶, 金亮, 王宇, 朱爱华, 陈庆梅, 李建平, 熊祺琰, 曹荣月, 吴洁 申请人:中国药科大学