专利名称：祛毒祖师麻及其外用透皮吸收制剂和制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于中药领域，涉及一种治疗肩周炎、关节炎、腰腿痛、跌打损伤引起的疼痛、肿胀等症的祛毒祖师麻及其提取工艺；本发明同时涉及祛毒祖师麻的外用透皮吸收制剂及其制备工艺。
背景技术：
关节炎、肩周炎、腰腿痛、跌打损伤是一种发病率高、涉及人群广泛的多发性、广发性疾病，西药止痛药如“吗啡”、“阿司匹林”、“保泰松”、“布洛芬”等只能缓解症状，减小疼痛，但其副作用合成隐性较多，又给病人带来其他的痛苦和负担。俗语“疼得满地爬，离不开祖师麻”。祖师麻辛温入肝，消肿止痛，活血通络，为民间久用止痛名药，但是由于祖师麻具有毒性，直接作用于人体，会产生一定的副作用。目前含祖师麻的复方制剂主要有注射剂、片剂、硬膏剂，而以祖师麻与具有透皮吸收作用的中药有效部位制成的复方外用透皮吸收制剂尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种祛毒祖师麻及其提取工艺。
本发明的另一目的是提供该祖师麻提取物的制备方法。
本发明还有一个目的，就是提供该祖师麻提取物的外用透皮吸收制剂及其制备方法。
一、本发明祛毒祖师麻及其提取工艺祖师麻辛温入肝，消肿止痛，活血通络，为民间久用止痛名药，祖师麻同时也有毒性；生姜具有解毒作用，同时还有解表散寒之功效；甘草具有调补和解毒之功效，二味共助祖师麻，可减除祖师麻毒性而疗效不变。
1、本发明祛毒祖师麻的提取工艺，包括以下工艺步骤
①按祖师麻根皮6～9份、生姜1～3份、甘草1～3份的重量比份称取原料药；②在上述三味中加10～16倍量的水煎煮1～3次，每次1～3小时，过滤，合并滤液，浓缩至清膏；③将清膏溶于90～95％乙醇中充分搅拌，放置过夜，弃去沉淀，取上清液并回收乙醇，浓缩至相对密度为1.2～1.4(60℃)的稠膏，即得祛毒祖师麻的活性组分。
2、本发明祛毒祖师麻的止痛作用，以小鼠镇痛试验和皮肤刺激试验为判断依据，并与单方祖师麻比较2.1祛毒祖师麻的提取称取祖师麻根皮250g、生姜50g、甘草50g，加适量水煎煮3次，第一次1.5小时，第二次1小时，第三次0.5小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度为1.2～1.3(60℃)，加95％乙醇使含醇量达到60％，充分搅拌，放置过夜，弃去沉淀，取上清液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.3(60℃)的稠膏，备用。
2.2单方祖师麻的提取称取祖师麻根皮250g，加适量水煎煮3次，第一次1.5小时，第二次1小时，第三次0.5小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度为1.2～1.3(60℃)，用二氯甲烷萃取3次(125ml、125ml、125ml)，回收二氯甲烷；萃取后的清膏挥尽二氯甲烷，浓缩至相对密度为1.3的稠膏，备用。
2.3实验方法及结果上述两份稠膏经做小鼠镇痛试验和皮肤刺激性试验，祛毒祖师麻的镇痛效果较单方祖师麻好，在刺激性方面两方法无明显区别。
3、祛毒祖师麻制备工艺的确定称取祖师麻根皮60g、生姜12g、甘草12g，按正交试验表设计方案，用水回流提取，过滤，滤液浓缩，定容至100ml，用高效液相色谱法测定祖师麻甲素的含量。
结果见表1、2、3从表3的正交试验结果中可以确定祖师麻提取工艺的最佳方案为用13倍量的水提取三次，每次1.5小时。从方差分析表中可以得出提取次数对试验影响最显著，其次是水的用量，提取时间的影响最小。
表1试验因素水平表
表2正交试验表
表3方差分析表
二、祛毒复方祖师麻外用透皮吸收制剂及其制备为了达到更好的止痛作用，将本发明提取的祛毒祖师麻与丁香、肉桂、当归油、薄荷脑、樟脑组合。丁香辛温，温阳镇痛；肉桂辛热，温阳止痛，驱风散寒，活血通经；当归辛温，活血祛瘀，温经止痛，三药均提取其挥发油，取效更捷，便于吸收。薄荷辛凉，疏风清热，止痛止痒，提取其薄荷脑效捷力专。樟脑具有通窍、止痛之功效。使以氮酮、丙二醇组成的复合促透剂，可促进透皮吸收，结膜表现有轻-中度充血，从实验平均分值与眼刺激评价标准看莪术油毫微囊滴眼液没有明显刺激性。试验结束将各兔处死，解剖，观察心、肝、脾、肺、肾、胃肠、胸腺、生殖器官等主要脏器进行观察，未见异常变化。
表10 眼刺激反应评分
表11 眼刺激评价标准
结论由单次用药与多次用药结果表明一次用药没有明显的刺激性反应，<p>根据表5的结果，提取36小时为最适宜时间。
表5挥发油提取时间确定表 5、肉桂油提取时间的确定称取肉桂200g，加入2000ml，水蒸汽蒸馏，每隔4小时记录挥发油蒸出量。
根据表6的结果，提取36小时为最适宜时间结果。
表6挥发油提取时间确定表 三、祛毒复方祖师麻外用透皮吸收制剂的毒性研究1急毒性研究1.1试验目的以喷雾剂为例(即香麻止痛喷雾剂)，遵照《中药新药毒理学试验技术要求》的规定，做小鼠皮下注射测定LD50试验。
1.2方法与途径为精确定量给药，选用与临床皮肤用药途径最近似的皮下注射给药。药量以折合生药总量表示。给药最大体积按《中药新药毒理学试验技术要求》的规定，皮下注射体积不超过0.5ml/只。
1.3结果见表7、表8，LD50＝10.1239±0.3515(9.7785～10.4816)相当于原生药(9.7785～10.4816)×0.0667＝(0.6522～0.6991)g/kg。经对香麻止痛喷雾剂急性毒性试验结果表明，香麻止痛喷雾剂小鼠皮下注射LD50为(9.778～10.482)ml/kg，相当于成人每日用量(0.1ml/kg)的97.7～104.8倍在临床规定用量和疗程范围作为皮肤外用药是安全可靠的。
2皮肤过敏性试验本发明香麻止痛喷雾剂经豚鼠皮肤过敏试验表明，无皮肤过敏反应。试验动物亦无哮喘、站立不稳、休克等严重的全身性过敏反应。
3皮肤刺激试验3.1试验目的观察动物完整皮肤及破损皮肤接触受试物(本发明香麻止<p>2、本发明药物制剂粉末组在服药过程中，出现恶心1例，与用药“可疑有关”；元胡组出现恶心2例，与用药“可疑有关”。经判断，灵痛散无明显不良反应。表21是一般情况表。
表21
诊断标准根据《内科疾病诊断标准》有关头痛的诊断标准。
治疗方法粉末组用本发明药物制剂粉末，每包2克。每次1包，于疼痛时即时温水冲服。43例患者共服药121例次。
元胡组用元胡止痛颗粒(每包5克，沈阳飞龙制药有限公司生产，国药准字Z10930041)，每次2包，于疼痛时即时温水冲服。43例患者共服药123例次。分别记录服药前(0分钟)及服药后30分钟、60分钟、90分钟、120分钟疼痛程度的变化。
疼痛程度分级，疼痛疗效评价，服药以后止痛起效时间和维持时间的判断，症状疗效判断和不良反应判断同实施例7。
治疗结果1)粉末组与元胡组基线比较治疗前粉末组疼痛程度较元胡组高。
表22是本发明药物制剂组与元胡组的基线比较。
对肝组织病理学的检查光镜下观察正常组大鼠肝组织完整清晰，肝小叶规则，肝细胞形态排列正常，在中央静脉周围放射状分布。模型组动物均出现程度不等的弥散性肝细胞脂肪变性，脂变肝细胞体积增大，胞浆内可见数量不等、大小不一的脂肪空泡，胞核被推向周边。周围肝细胞明显肿胀，胞质疏松气球样变，肝组织100％存在小叶内炎症，大部分组织可见汇管区炎症，且出现肝细胞点、片状坏死。组织炎症细胞浸润以单核细胞、淋巴细胞为主，偶见纤维组织增生；本发明组合物给药组各剂量组脂变肝细胞较模型组明显减轻，小叶内和汇管内炎症显著减轻，肝脏病理情况接近正常组。
二、对乙硫氨酸所致脂肪肝的作用与空白对照组比较，模型组的TG和ALT显著升高，TC也有较大幅度提高，ALP和MDA也有升高，而肝糖原略有降低。本发明组合物能降低TC、TG、ALP、ALT和MDA的水平，其中以对TG和ALT作用最强，对肝糖元有升高作用，且显著降低肝脏重量系数。见表2。
表2 对大鼠肝生化指标及肝脏重量系数的影响
与模型组比较，*p＜0.05，**P＜0.01。
对肝组织病理学的影响光学显微镜检查，模型组脂滴较大，积聚成团，细胞核被挤推至一边，脂滴形<p>表12香麻止痛喷雾剂破损皮肤刺激性反应结果
4多次给药皮肤刺激性试验4.1试验目的观察动物完整皮肤及破损皮肤多次接触受试物(香麻止痛喷雾剂)后所产生的局部刺激反应。
4.2给药方法左侧去毛区涂受试物1ml，右侧涂赋形剂作为对照，先覆以聚乙烯薄膜，防止液体挥发，再用无刺激性纱布固定，每只动物分笼饲养。
4.3给药周期每日涂抹受试物一次，连续涂抹一周，停药后再观察一周，观察并记录每日的红斑及水肿情况进行评分，观察涂抹部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄等情况、记录其发生时间及消退时间。
4.4试验结果香麻止痛喷雾剂给药一周后对完整皮肤和破损皮肤家兔的活动、食欲、粪便、眼、鼻等分泌物均无任何影响，局部皮肤颜色正常，未见刺激性反应。皮肤涂药区域按皮肤刺激计分标准统计，结果为无刺激性。
5皮肤用药毒性试验5.1试验目的观察动物完整皮肤及破损皮肤短时期接触受试物(香麻止痛喷雾剂)所产生的毒性反应。
5.2试验方法动物给药前24h背部脊柱两侧去毛(用剪毛剪去毛，然后用8％的硫化钠脱毛)，去毛面积约为150cm2。去毛后24h检查去毛皮肤是否受伤，受伤的皮肤不能作完整皮肤的毒性试验。破损皮肤采用去毛消毒皮肤划破(砂纸磨擦打毛)，以渗血为度。
5.3给药周期给受试药物24h后，用温水除去残留的受试物，去除受试物后1，24，48，72小时至第七日，每日观察并记录动物的体重、皮肤毛发、眼和黏膜的变化，呼吸、中枢神经系统、四肢活动等及其他中毒表现，并与对照组比较。
5.4试验结果试验结果表明，香麻止痛喷雾剂在低剂量和高剂量外用时对完整皮肤及破损皮肤家兔的行为、活动、饮食、皮毛光泽均无任何影响，先后观察7日内无家兔死亡，未出现任何急性毒性反应。体重经与对照组t检验表明各组间差异无显著意义(P＞0.05)详见表13。
表13香麻止痛喷雾剂在外用于完整和破损皮肤时对家兔体重的影响(kg)(X±SD)(n＝4)
5.5结论香麻止痛喷雾剂对家兔完整皮肤及破损皮肤短时期喷用不产生毒性反应。因此香麻止痛喷雾剂在规定的剂量和疗程范围内使用是安全的。
四、药理研究1本发明祛毒复方祖师麻外用透皮吸收制剂的镇痛作用1.1对热痛引起小鼠甩尾潜伏期的影响健康雌性小鼠50只，体重20-22g。随机分5组。给药前，将鼠尾浸于50±0.5℃水浴中，同时计时，将热痛引起甩尾时记录时间作为疼痛潜伏期(S)。每只试验鼠测定二次，误差不超过3S，以平均数作为给药前值，然后皮下注射试药或灌服对照药。给药后15分钟测定疼痛潜伏期，计算给药前后潜伏期差，进行组间t检验。
结果香麻止痛喷雾剂大、中、小剂量在给药后15分钟潜伏期明显延长(P＜0.01、P＜0.05)，表明试药有明显镇痛作用。见表14。
表14香麻止痛喷雾剂对热痛引起小鼠甩尾潜伏期的影响(n＝10)(X±SD)
注与生理盐水比较**P＜0.01*P＜0.05
1.2对醋酸引起小鼠扭体次数的影响健康小鼠50只均分5组，分别灌服阿司匹林(0.2gkg-1d)、皮下注射香麻止痛喷雾剂低剂量(0.25mlkg-1d)、中剂量(0.5mlkg-1d)、高剂量(1.0mlkg-1d)、生理盐水(同体积)，1小时后，随即腹腔注射0.7％醋酸0.2ml/只，立即观察记录各试验小鼠10分钟内扭体次数，进行组间t测验。按下列公式计算扭体抑制百分率。
结果香麻止痛喷雾剂和阿司匹林同生理盐水组比较差异有非常显著意义，因此有非常显著的镇痛药理。见表15。
表15香麻止痛喷雾剂对醋酸引起小鼠扭体次数的影响(n＝10)(X±SD)
注与生理盐水组比较**P＜0.01*P＜0.052本发明发明祛毒复方祖师麻外用透皮吸收制剂的抗炎作用2.1对小鼠二甲苯所致耳廓肿胀的影响动物随机分为5组，造模组(生理盐水同体积)，香麻止痛喷雾剂(1.0mlkg-1d)(0.5mlkg-1d)(0.25mlkg-1d)三个剂量组，雪山金罗汉止痛涂膜剂(1.0mlkg-1d)对照组，涂药1小时后，以二甲苯棉球接触小鼠右耳5秒钟，15分钟后拉颈处死，以打孔器将小鼠双耳同部位等面积切下，扭力天平称重。左耳为对照，以左耳重量为100g，计算右耳炎症增重百分率，结果进行统计学处理，按下列公式计算抗炎百分率。
结果香麻止痛喷雾剂和雪山金罗汉止痛涂膜剂与生理盐水组比较差异有显著意义，因此对二甲苯所致的急性炎症有明显的抗炎作用。见表16。
表16香麻止痛喷雾剂对小鼠二甲苯所致耳廓肿胀的影响(n＝10)(X±SD)
注与生理盐水组比较**P＜0.012.2对大鼠棉球肉芽肿的影响动物随机分为5组，造模组(生理盐水同体积)，雪山金罗汉止痛涂膜剂(1.0mlkg-1d)，香麻止痛喷雾剂(1.0mlkg-1d)(0.5mlkg-1d)(0.25mlkg-1d)三个剂量组。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30mgkg-1体重麻醉，在每只鼠的左右蹊部用碘酒消毒，75％酒精棉球脱碘后，各切1cm长小口，用眼科镊子将20mg的高压灭菌棉球(青霉素和链霉素混合液0.2ml)浸泡，烘干，从切口处植入皮下，随即缝合皮肤。从手术当日开始，皮下注射给药，连续7天，第7天打开原切口，将棉球连同周围结缔组织一起取出，剔除脂肪组织，放烘箱中70℃烘干，称重。将称得的重量减去棉球原重量即得肉芽重量，比较五组肉芽肿重量。
按下列公式计算抑制百分率
结果香麻止痛喷雾剂和雪山金罗汉止痛涂膜剂与生理盐水组比较差异有显著意义。见表17。
表17香麻止痛喷雾剂对大鼠棉球肉芽肿的影响(n＝10)(X±SD)
注与生理盐水组比较**P＜0.013香麻止痛喷雾剂对“血瘀”证大鼠模型的作用3.1对血瘀模型大鼠血液流变性的影响取健康SD大鼠60只，雌雄各半，体重180～200g。随机分为6组，每组10只。空白对照组、血瘀模型组、尼莫地平对照组(0.02g/kg.d)、香麻止痛喷雾剂高剂量组(1.0ml/kgd)、香麻止痛喷雾剂中剂量组(0.5ml/kgd)、香麻止痛喷雾剂低剂量组(0.25ml/kgd)。尼莫地平组灌胃给药，每日一次，连续8天。药物组皮下注射给药，每日一次，连续8天。于第7天给药后30min，皮下注射盐酸肾上腺素0.9mg/kg，30min后置冰水冷浴8min，擦干身上的水，在第1次注射盐酸肾上腺素4h后再皮下注射等量盐酸肾上腺素，处理后禁食不禁水，于第8天末次给药后60min，断头取血5ml，置LBY-N6A型自清洗旋转式血液粘度计中测其全血粘度和血浆粘度，结果见附件(在哪？，请补充)。
结论本文实验证实，香麻止痛喷雾剂具有明显的抗炎、镇痛作用；对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀急性炎症，大鼠棉球肉芽肿均有较强的抑制作用；可明显降低小鼠的热刺激甩尾次数和醋酸造成的扭体次数；能对“血瘀”模型大鼠血液流变学有改善、调节作用。因此本试验资料为临床用于治疗肩周炎、关节炎、跌打损伤提供了药效学依据。方法按《中药新药研究指南》药理学部分中的《治疗痹症中药的药效学研究》采用二甲苯、蛋清、甲醛、佐剂等致炎剂，产生的小鼠耳廓肿胀、大鼠实验性关节炎造成的足跖肿胀及实验性佐剂性关节炎的影响；对小鼠热刺激和化学刺激所致疼痛的影响；对小鼠凝血时间的变化影响；对小鼠巨噬细胞吞噬免疫功能调节作用。
五、临床试验经临床前药理、毒理研究结果表明香麻止痛喷雾剂对由二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀、大鼠棉球肉芽肿有明显抑制作用；可明显降低小鼠的热刺激甩尾次数和醋酸造成的扭体次数，且能对“血瘀”模型大鼠血液流变学有改善调节作用。香麻止痛喷雾剂皮肤用药毒性试验结果表明，香麻止痛喷雾剂按规定喷于皮肤后，未见明显的刺激性、过敏性、毒性等不良反应。经对香麻止痛喷雾剂皮下注射急性毒性试验结果表明，香麻止痛喷雾剂小鼠皮下注射LD50为9.778～10.481ml/kg，相当于成人日用剂量(0.1ml/kg)的97.7～104.8倍，在临床规定用量和疗程范围作为皮肤外用药是安全可靠的。
目前本品已上报，申请临床研究，甘肃省食品药品监督管理局已受理(受理号CXZL0500461甘)。
本发明与现有技术相比具有以下优点1.本发明祖师麻提取物采用现代工艺制备而成，其镇痛效果明显优于较单方祖师麻，而且无毒、无刺激，副作用小。
2、本发明的外用透皮吸收制剂，是在配方中加入透皮吸收剂，通过透皮吸收系统制成外用喷雾剂或凝胶剂，促使其药理活性成分的迅速吸收，使其达到高效、速效的治疗效果。
3、本发明成本低、工艺简单，易于工业化生产。
具体实施例方式
实施例1、祛毒祖师麻的提取工艺①按祖师麻根皮6～9份、生姜1～3份、甘草1～3份的重量比份称取原料药；②在上述三味中加10～16倍量的水煎煮1～3次，每次1～3小时，过滤，合并滤液，浓缩至清膏；③将清膏溶于90～95％乙醇中充分搅拌，放置过夜，弃去沉淀，取上清液并回收乙醇，浓缩至相对密度为1.2～1.4(60℃)的稠膏，即得祛毒祖师麻的活性组分。
实施例2、祛毒复方祖师麻喷剂的制备配方以重量份计祛毒祖师麻2～5份丁香8～20份 肉桂30～80份当归油0.25～0.65份 薄荷脑5～12.5份 樟脑6～15份。
工艺①按上述重量比份称取祛毒祖师麻、丁香、肉桂、当归油、薄荷脑、樟脑；②将祛毒祖师麻溶于60～80％的乙醇溶液中使其充分溶解，过滤得滤液，备用；③将丁香用水蒸汽蒸馏法提取丁香油；④将肉桂用水蒸汽蒸馏法提取肉桂油；⑤将当归油、薄荷脑、樟脑、丁香油、肉桂油溶于60～80％的乙醇溶液中使其充分溶解，并与步骤②的祖师麻提取物的滤液混合，浓缩即得祛毒复方祖师麻的活性成分。
⑥加入混合液体积14％～20％量的促透皮吸收剂(促透皮吸收剂为氮酮、丙二醇或由氮酮、丙二醇组成的复合促透剂在复合促透剂中氮酮、丙二醇的体积比份为1∶4～1∶8)，搅拌混匀即得。
权利要求
1.一种祛毒祖师麻的提取工艺，包括以下工艺步骤①按祖师麻根皮6～9份、生姜1～3份、甘草1～3份的重量比份称取原料药；②在上述三味中加10～16倍量的水煎煮1～3次，每次1～3小时，过滤，合并滤液，浓缩至清膏；③将清膏溶于90～95％乙醇中充分搅拌，放置过夜，弃去沉淀，取上清液并回收乙醇，浓缩至相对密度为1.2～1.4(60℃)的稠膏，即得祛毒祖师麻的活性组分。
2.根据权利要求1所述工艺提取的祛毒祖师麻。
3.一种祛毒复方祖师麻外用透皮吸收制剂，主要由以下重量份的原料药与促透皮吸收剂配合制成祛毒祖师麻2～5份丁香8～20份肉桂30～80份当归油0.25～0.65份 薄荷脑5～12.5份樟脑6～15份。
4.一种祛毒复方祖师麻外用透皮吸收制剂的制备方法，包括以下工艺步骤①按上述重量比份称取祛毒祖师麻、丁香、肉桂、当归油、薄荷脑、樟脑；②将祛毒祖师麻溶于60～80％的乙醇溶液中使其充分溶解，过滤得滤液，备用；③将丁香用水蒸汽蒸馏法提取丁香油；④将肉桂用水蒸汽蒸馏法提取肉桂油；⑤将当归油、薄荷脑、樟脑、丁香油、肉桂油溶于60～80％的乙醇溶液中使其充分溶解，并与步骤②的祖师麻提取物的滤液混合均匀；⑥加入混合液体积14％～20％量的促透皮吸收剂，搅拌混匀即得。
5.如权利要求4所述祛毒复方祖师麻外用透皮吸收制剂的制备方法，其特征在于所述促透皮吸收剂为氮酮、丙二醇或由氮酮、丙二醇组成的复合促透剂。
6.如权利要求5所述祛毒祖师麻外用透皮吸收制剂的制备方法，所述复合促透剂中氮酮、丙二醇的体积比份为1∶4～1∶8。
7.如权利要求7、8、9所述祛方法制备的毒祖师麻外用透皮吸收制剂为喷剂或凝胶剂。
全文摘要
本发明提供一种祛毒祖师麻及制备方法，是在一定比例的祖师麻根皮、生姜、甘草等原料中加10～16倍量的水煎煮1～3次，每次1～3小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度为1.2～1.3(60℃)的清膏；加90～95％乙醇使含醇量到50～70％，充分搅拌，放置过夜，弃去沉淀，取上清液并回收乙醇，浓缩至相对密度为1.3(60℃)的稠膏即得。实验证明，该祛毒祖师麻的镇痛效果明显优于普通工艺提取的祖师麻，而且具有无毒、无刺激，副作用小等优点。本发明同时提供了利用该祛毒祖师麻制成的复方外用透皮吸收制剂，该制剂是在祛毒祖师麻中加入促透皮吸收的中药和透皮吸收剂制备而成，有效促进药理活性成分的迅速吸收，使其达到高效、速效的治疗效果。
文档编号A61P19/02GK1857702SQ20061004198
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月20日 优先权日2006年3月20日
发明者张训凯, 张喜民, 梁仲军, 段生玉, 王建红, 邓科雯, 南建理, 何霞, 刘静, 窦霞, 任一杰 申请人:甘肃省药物研究所