专利名称：：凋亡基因Caspase-4为靶标的反义寡核苷酸及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程药物领域，具体地说涉及一种靶向凋亡基因Ca印ase-4为靶标的反义寡核苷酸及其用途。
背景技术：
：机体的生理状态是一种细胞内分子信号传导通路组成的分子相互作用动力学网络的平衡。辐射作为一种细胞的物理刺激信号，可以引起多种细胞的病理反应，导致细胞内多种信号传导通路和网络的异常并诱导细胞凋亡、进而引起多器官损伤，甚至功能衰竭和死亡。从这层意义上看放射病实际上是一种辐射引起的机体细胞凋亡等分子信号传导通路组成的相互作用动力学网络平衡的失调。大量研究己表明，辐射可以激活细胞信号传导途径和众多基因的表达，诱导细胞DNA损伤、细胞周期改变和细胞凋亡。细胞凋亡、细胞周期改变和DNA的损伤修复与细胞放射敏感性之间具有明显的相关性，于是，那些影响这些辐射反应的基因，理所当然会对细胞的放射敏感性产生不同程度的影响。大量研究表明它们不仅是肿瘤细胞辐射敏感性的生物标志，而且可以作为辐射防护和增敏药物的潜在靶标。针对这些潜在靶标设计的药物将成为新一代的辐射防护药和增敏药物。反义脱氧寡核苷酸(Antisenseoligodeoxynuclecotide,AS0DN)是一段与mRNA或DNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子。与传统药物相比，反义药物具有更高的特异性、更优的疗效和更低的毒性。因此，反义药物越来越成为人们研究和开发的热点。其中，反义药物作为肿瘤辐射增敏剂已被大量研究。同样如果反义序列靶向的是辐射敏感靶基因，反义寡核苷酸药物便可以用于辐射防护。
发明内容半光氨酸蛋白酶基因家族在细胞的凋亡中具有非常重要的作用。本发明的目的是选择凋亡相关基因Caspase-4为靶标，利用本实验室设计发明的反义寡核苷酸设计软件设计5条反义寡核苷酸序列(表l),对这些序列进行筛选获得辐射防护药物先导结构。寡核苷酸序列采用PE公司产391A型DNA合成仪合成并采用硫代修饰，经MicroPureII反向柱(SolidPhaseScience)纯化后，以此产物作为辐射防护药物。表l反义寡核苷酸序列及特征<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>本发明的主要内容是选取了Caspase基因作为靶标进行辐射防护反义寡核苷酸的筛选和评价。Caspase-4是Caspase-1亚家族中的一员，该基因主要存在于细胞的内质网，当细胞受到损伤刺激时，该基因编码的蛋白前体断裂活化，活化的Caspase-4参与细胞凋亡的诱导。抑制Caspase-4的表达能抑制细胞的凋亡。在针对Caspase-4基因的5条反义寡核苷酸中，Cas4-3的体外保护细胞增殖作用最强。在0.2yM给药浓度时，2Gy照射后细胞的存活率与单纯照射组相比，细胞存活率增加了21.1%。集落形成实验表明Cas4-3反义寡扼苷酸处理后的细胞辐射后集落形成能力与单纯照射组相比也明显增加，抑制细胞的凋亡。根据本发明，发明中所涉及的寡核苷酸或其修饰组成物具有辐射防护的作用，可用于肿瘤放射治疗中的辐射防护。根据本发明，发明中针对Caspase-4基因辐射防护的优选序列为A3。图1为反义寡核苷酸(O.2uM)在细胞水平上的辐射防护作用；其中con为未照射细胞对照，IR为单独照射组,IR+Lip为脂质体对照组，其余为不同反义序列转染后照射组。图2和3为不同浓度反义寡核苷酸转染后对辐射后24h和48h细胞的辐射防护作用其中control为未照射对照组，IR为照射对照组，Scramble为随机序列对照组，caspase4-3为反义组。图4为0.4uM反义寡核苷酸在细胞水平上对靶基因mRNA表达的抑制作用；图5为0.4uM反义寡核苷酸在细胞水平上对靶基因蛋白表达的抑制作用；图6为0.4uM反义寡核苷酸增强细胞辐射后的集落形成能力；图7为0.4uM反义寡核苷酸抑制辐射后细胞R0S的产生；图8为反义寡核苷酸抑制辐射后细胞的凋亡。其中A:为未照射细胞对照；B:为单独照射组，IR;C:为转染随机序列对照组；D:为转染0.2uMcaspase4-3组；D:为转染0.4uMcaspase4-3组。具体实施例方式实施例一体外辐射防护活性ASODN的筛选和评价1.材料和方法1.1反义寡核苷酸的设计本研究选取了Caspase4基因作为靶标进行辐射防护反义寡核苷酸的筛选和评价，基因序列由Genbank获得。根据靶基因的mRNA序列，利用本实验室开发的基于多预测结构的反义核酸设计软件(软件登记号2005SR12155)设计反义核酸序列(表1).1.2反义寡核苷酸的合成根据设计的反义寡核苷酸序列，合成5条(Cas4-1-Cas4-5)反义序列(具体序列见表l)。反义硫代寡聚核苷酸为无色粉末状，合成后浓氨水55'C脱保护15小时，然后用反向柱(购自solidphasescience公司)层析纯化。体外实验用无双抗的DMEM培养基配制，保存于-2CTC。1.3细胞培养、脂质体转染及辐射防护活性测定人细胞株(A549)由军事医学科学院放射与辐射医学研究所保存。用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养液，于37'C、5%C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将细胞悬液接种在96孔培养板中，每孔接种培养液100uL，含4乂103细胞。待40-60%的细胞融合后，吸去培养液，用无血清无双抗的DMEM培养基洗2次，在无血清状态下，采用脂质体Lipofectin(GIBCO,lmg/ml)试剂并参照说明书操作进行硫代反义寡核苷酸的转染。反义寡核苷酸转染浓度为0.2MM，每个浓度重复3个孔，并设细胞和脂质体对照。转染6小时后，换含10%胎牛血清的DMED培养液继续培养24h后，细胞进行2Gy照射，照射后换新鲜培养液继续培养48小时，每孔加20WMTS(CellTiter96Aqueousonesolutioncellproliferationassay,Promega)并继续避光培养90min，在多标记酶联免疫检测仪(VICTORWallac1420MultilabelCounter,Wallac)上测定490nm处吸光值A,计算细胞存活率。1.4反义寡核苷酸在体外对靶基因mRNA表达的影响选取细胞水平辐射防护效果较好的A3硫代反义寡核苷酸，检测其对靶mRNA表达的抑制作用。A549细胞培养条件同上。将细胞悬液接种在6孔培养板中，每孔接种培养液2mL,含1.5X10S细胞。待40_60%的细胞融合后，吸去培养液，进行硫代反义寡核苷酸的转染(操作过程同上)。反义寡核苷酸的浓度分别为0.l幽、0.2幽、0.4MM，并设细胞对照和脂质体对照。转染6h，换含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养48h后，TRIZ0L法(Gibco)提细胞总RNA,紫外定量并将各组提取物调至相同浓度。采用Reversetranscriptionsystem(P，ega)进行反转录，及PCR扩增耙基因mRNA。以看家基因NADPH作为内标进行双重PCR，设不加模板的空白对照。NADPH扩增片段317bp，靶基因Caspase4扩增片段为200bp。扩增产物用2%琼脂糖胶(Sigma)电泳检査。1.5反义寡核苷酸在体外对靶基因蛋白表达的影响细胞培养条件同上。将A549细胞悬液接种在6孔培养板中，每孔接种培养液2mL，含1.5X1()5细胞。硫代反义寡核苷酸的转染(操作过程同上)。反义寡核苷酸的浓度为0.4MM，设细胞对照和脂质体对照。转染6h后，换含10%胎牛血清的DMED培养基继续培养48h，RIPA-PICT(Pharmacia)提细胞总蛋白，蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。每孔5(Htg总蛋白，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，并进行Westernbloting观察靶基因蛋白表达情况。2实验结果2.1反义寡核苷酸作用靶位的筛选图1结果表明，5条反义序列转染细胞后经2Gy的照射，除cas-l和cas-5序列外，其余3条序列均能不同程度地提高细胞的存活率，其中0.2umol/LCas4-3反义转染组与单独照射组相比，细胞的存活率提高了21.1%,因此选择Caas4-3进行进一步的分子水平分析。为了进一步证实Cas4-3的辐射防护作用，又进一步检测了不同浓度反义药物转染细胞后的辐射防护作用。同时为了证明反义序列作用的特异性，同时还设计合成了一条随机序列同时进行转染，从图2和图3可以看出，不同浓度Cas4-3转染细胞后，细胞经2Gy照射后24小时和48小时细胞的存活率均比单独照射组提高，且有一定的剂量依赖关系，而转染随机序列(Scramble)组细胞的存活率则与单独照射组相似。表明Cas4-3的作用是序列特异的。2.2反义寡核苷酸对靶基因转录及翻译水平的影响反义药物是通过抑制其靶基因的表达来实现药效作用，同时观察靶基因的表达情况也是评价和衡量反义药物作用特异性的一个重要指标。由图4可以看出，Cas4-3反义序列能抑制靶基因mRNA的表达且具有一定的量效关系，而随机序列和脂质体对照则均不能抑制靶基因的表达。进一步检测了反义寡核苷酸对靶基因蛋白表达的影响。由图4可见，0.4umol/L浓度的Cas4-3可显著抑制耙基因蛋白的表达，而随机序列则无抑制作用。实施例二集落形成实验评价ASODN的辐射防护活性1.材料和方法1.1A549细胞培养条件同上。待细胞长至对数生长期时，将细胞悬液接种在6孔培养板中，每孔接种培养液2mL，含2.0X10S细胞。待40-60%的细胞融合后，吸去培养液，进行硫代反义寡核苷酸的转染(操作过程同上)。反义寡核苷酸的浓度为0.2幽，并设细胞对照和脂质体对照。转染6h，换含l(^胎牛血清的DMEM培养液继续培养24h后，细胞进行2Gy、4Gy和6Gy的照射，照射完后，将细胞种植在直径为30mm的平皿上，每个平皿含100个细胞，继续培养10-14天，细胞进行固定和染色，计算每个平皿中含50个以上细胞的集落数。2实验结果2.10.2umol/LCas4-3反义寡核苷酸转染细胞后能提高辐射后细胞集落形成能力，其中2Gy照射后细胞集落形成率从67%提高到了89%，对4Gy和6Gy照射后细胞的集落形成能力也有不同程度的提高(图5)。实施例三、氧自由基实验评价ASODN的辐射防护作用1.材料和方法1.1A549培养在96孔板上，反义药物的转染条件和方法同前面。反义寡核苷酸的浓度为0.2MM,并设随机序列对照。转染6h,换含l(^胎牛血清的DMEM培养液继续培养24h后，细胞进行2Gy的照射，分别于照射后2，4，8和24小时检测氧自由基(ROS)的产生。ROS的检测采用DCFH-DA法进行测定，细胞吸去培养液，加入100ul含DCFH-DA溶液，置37度30min，细胞用PBS洗三次后，在488和525nm波长处进行测定。2实验结果2.1从图6可以看出，0.2umol/LCas4-3反义寡核苷酸转染细胞后能抑制辐射后24h细胞产生ROS，而在辐射后2，4，8h对R0S的产生则没有明显的抑制作用。表明Cas4-3的辐射防护作用部分是通过抑制ROS的产生而起作用的。实施例四细胞凋亡实验评价ASODN的辐射防护作用1.材料和方法1.1A549细胞的培养和反义药物的转染条件和方法同上。反义寡核苷酸的浓度为0.2刚，并设细胞对照和随机序列对照。转染6h，换含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养24h后，细胞进行2Gy的照射，分别于照射后24h和48h检测细胞的凋亡。细胞的凋亡用AnnexV凋亡检测试剂盒进行检测。2实验结果2.1从图7可以看出，0.2umol/L和0.4umol/L的Cas4-3反义寡核苷酸转染细胞后能抑制辐射后引起的细胞凋亡，细胞的凋亡率由原来照射后的4.3%分别降低到2.9%和1.8%，而随机序列则没有相应的保护作用。核苷酸序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所<120>凋亡基因Caspase-4为靶标的反义寡核苷酸及其用途<160>3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1CAGTTGCGGTTGTTGAATAT20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2TCTCTTCAGCTCTTTCTTTA20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3TTCCTCTAGGTGGCAGCACC20权利要求1.一种与凋亡基因Caspase45’和3’基因互补的反义寡核苷酸，其特征为寡核苷酸序列选自下列之一1)CAGTTGCGGTTGTTGAATAT2)TCTCTTCAGCTCTTTCTTTA3)TTCCTCTAGGTGGCAGCACC。2.根据权利要求1所述寡核苷酸，其特征为组成寡核苷酸的磷酸二酯键部分的单键氧位置选自氧、甲基或硫。3.权利要求1或2所述任一寡核苷酸或其组合在制备辐射防护药物中的用途。全文摘要本发明涉及反义寡核苷酸的结构和用途，具体地说是根据凋亡相关基因(Caspase4)设计并制备的反义寡核苷酸。采用人细胞株(A549)，对所设计、制备的5条反义寡核苷酸进行筛选及评价。体外实验可提高辐射后细胞的存活率，增加细胞辐射后的集落形成率，抑制辐射后细胞中ROS的产生和辐射诱导的细胞凋亡，并阻断该基因表达。文档编号A61K48/00GK101104632SQ20061009103公开日2008年1月16日申请日期2006年7月12日优先权日2006年7月12日发明者伯晓晨,娄绍科,林汝仙,王升启申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所