专利名称：Poloxamer化胸腺肽α1长效温度敏感凝胶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种Poloxamer化胸腺肽α1长效温度敏感凝胶及其制备方法，其特征在于该凝胶由Poloxamer化胸腺肽α1和温度敏感凝胶组成。
背景技术：
胸腺肽α1(又名胸腺素)是胸腺组织分泌的具有生理活性的一组乙酰化的多肽，有如下的氨基酸组合Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH，分子量是3108，PI是3.8。可使由骨髓产生的干细胞转变成T细胞，有增强细胞免疫功能的作用。其作用可能是①能连续诱导T细胞分化发育的各个阶段。②具有调节机体的免疫平衡的作用。③能增强成熟T细胞对抗原或其他刺激的反应。胸腺肽α1用于胸腺发育不全综合征、运动失调性毛细血管扩张症、慢性皮肤黏膜真菌病等免疫缺陷病。对全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病有一定疗效。在用于治疗复发性口疮、麻风、重症感染、慢性肾炎等伴有细胞免疫功能低下的患者时，发现对麻风和重症感染的效果最为满意，对病毒性肝炎、恶性肿瘤、某些眼病也有一定疗效。
市场上的胸腺肽α1产品主要有片剂、胶囊、注射液和注射用冻干粉针，但口服胸腺肽α1，在胃肠道易受到酶作用而失活，导致疗效不理想；注射制剂能够快速起效，但半衰期短，而胸腺肽的治疗需要较长周期，需要频繁注射给药，增加了用药的不便和病人的痛苦。
在体凝胶是指以溶液状态给药后，在给药部位迅速发生相转变，形成半固体凝胶的一类液体制剂。根据凝胶化机制，在体凝胶可分为温度敏感型、离子敏感型和pH敏感型等。温度敏感型在体凝胶，亦称温敏在体凝胶，其凝胶化机制是通过环境温度的变化而形成在体凝胶，该系统一般含有温度敏感的高分子聚合物，给药后聚合物溶液因体内外温度的变化而形成非化学交联的凝胶。应用于在体凝胶的几种温敏高分子聚合物主要包括N-异丙基丙烯酰胺类聚合物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物和多糖类衍生物等。
Poloxamer修饰是20世纪70年代后期逐渐发展起来的一项技术，它可以解决多肽和蛋白质类药物在临床应用过程中存在的诸多问题。多肽经Poloxamer修饰后不仅可较好地保留其生物活性，而且还增加了稳定性，显著延长体内半衰期。与原型药物相比，其优势在于1)延长半衰期；2)提高溶解性；3)减小免疫原性；4)血药浓度波动较小；5)减少用药频率，提高病人顺应性，降低治疗费用等。
泊洛沙姆(Poloxamer)是一种聚氧乙烯与聚氧丙烯嵌段共聚物，根据组成不同具有不同的类型，如F68是一种含81％聚乙二醇和19％丙二醇的嵌段共聚物，其平均分子量为8600；F127由聚氧乙烯与聚氧丙烯以7∶3的比例构成分子量为11500的高分子化合物。泊洛沙姆(Poloxamer)物理化学性质稳定，可因表面活性剂形成胶团增加多种难溶性药物的表观溶解度，用作增溶剂。
采用泊洛沙姆(Poloxamer)对蛋白质进行结构修饰具有聚乙二醇修饰所不及的优点，如根据Poloxamer分子结构中聚氧乙烯与聚氧丙烯的不同聚合度可具有更多的结构组成和比例，能够满足药物不同释放行为的需要。
在此情况下，如能将胸腺肽α1制备成温度敏感型缓释凝胶制剂，一次皮下注射给药可缓慢释药，维持数周或数月的药效，必然能够减轻病人的痛苦，增加临床使用的顺应性。而胸腺肽α1为蛋白质多肽类药物，遇酸、碱、热、酶等容易失活，并且其水溶解性不够理想，因此拟将胸腺肽α1进行Poloxamer化修饰改性，以增强其稳定性和水溶性。
发明内容
鉴于胸腺肽α1制剂在临床应用的上述问题，结合胸腺肽α1的物理化学性质，本发明将其制成新型温度敏感型缓释凝胶制剂，采用蛋白质多肽的Poloxamer修饰技术和温度敏感凝胶化技术，首先将胸腺肽α1以Poloxamer进行修饰以增加水溶性和稳定性，然后以生物可降解高分子材料包被，制成皮下注射的长效缓释温度敏感凝胶。该制剂用于皮下注射，可立即形成半固体的凝胶，滞留于注射部位，随着时间延长和生物可降解材料的降解，缓慢释放药物，从而发挥药理药效。本制剂可精确定位注射，缓慢靶向释放，在机体内长期起效，适用于大量长期使用的药物给药系统。Poloxamer化胸腺肽α1长效温度敏感凝胶具有载药量大、定位靶向释药、安全性及稳定性好、用药方便、病人顺应性好等特点，具有重要的理论意义与实际应用价值。在研究该产品的同时，解决蛋白质多肽类药物凝胶制剂的关键技术，积累新型凝胶给药系统新产品的开发经验，丰富药物剂型新品种，为凝胶给药制剂的工业化生产奠定基础，为形成新型凝胶给药系统的技术平台奠定基础，从而推动蛋白质多肽类药物的产业化进程。
胸腺肽α1的结构中含有5个氨基，包括1个N端氨基和4个赖氨酸侧链氨基，本发明的Poloxamer化修饰正是建立在活化的Poloxamer与N端氨基上的麦克尔加成反应，通过Poloxamer的空间位阻并控制反应的温度、时间、溶剂、催化剂等参数，该反应可专一性地发生在N端氨基上。
该反应基本方法如下首先是Poloxamer的活化，制备可用于胸腺肽α1修饰的活化Poloxamer分子，包括Poloxamer-醛(Poloxamer-aldehyde)、Poloxamer-三氟乙磺酸(tresylated-Poloxamer)、Poloxamer-环氧化物(Poloxamer-epoxide)等，然后再按照一定摩尔比与胸腺肽α1混合，于37℃搅拌(300r/min)反应45min，制备得到不同修饰率的Poloxamer化的胸腺肽α1。以超滤法(切割分子量20000)的超滤膜于4℃的PBS液中透析1h，10％甘油-PBS透析2h即得。
Poloxamer化胸腺肽α1长效温度敏感凝胶的制备工艺研究主要涉及载药基质、成型工艺等方面。
温度敏感性材料选择生物可降解材料如聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)、聚(氧化乙烯-氧化丙烯-氧化乙烯)体系(PEO-PPO-PEO)、聚乙二醇-聚(D，L-乳酸-co-乙醇酸)(PEG-PLGA)共聚物体系、PLGA-PEG-PLGA，PEG-PLGA、PEG-PLGA-PEG、PEG-PLGA-PEG接枝聚合物等。
为保持蛋白质多肽类药物的稳定性和活性，通常在凝胶制剂中加入适当的稳定剂，稳定剂可以选择蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻酸钠以及低分子右旋糖苷中的一种或一种以上。
实施例一聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物(PLGA-PEG-PLGA)作为载体材料制备注射用Poloxamer修饰的胸腺肽α1敏感型缓释凝胶制剂。
制备方法是取聚合物适量(比例关系需要考察，如10％，15％，20％，25％，30％等)置于容器中，加注射用水搅拌溶解。另取处方量的Poloxamer修饰的胸腺肽α1，与聚合物水溶液混匀，待溶解后微孔滤膜过滤即得。
实施例二聚(氧化乙烯-氧化丙烯-氧化乙烯)体系(PEO-PPO-PEO)作为载体材料制备注射用Poloxamer修饰的胸腺肽α1敏感型缓释凝胶制剂。
制备方法是取聚合物适量(比例关系需要考察，如10％，15％，20％，25％，30％等)置于容器中，加注射用水搅拌溶解。另取处方量的Poloxamer修饰的胸腺肽α1，与聚合物水溶液混匀，待溶解后微孔滤膜过滤即得。
实施例三聚乙二醇-聚(D，L-乳酸-co-乙醇酸)(PEG-PLGA)作为载体材料制备注射用Poloxamer修饰的胸腺肽α1敏感型缓释凝胶制剂。
制备方法是取聚合物适量(比例关系需要考察，如10％，15％，20％，25％，30％等)置于容器中，加注射用水搅拌溶解。另取处方量的Poloxamer修饰的胸腺肽α1，与聚合物水溶液混匀，待溶解后微孔滤膜过滤即得。
实施例四PEG-PLGA-PEG接枝聚合物作为载体材料制备注射用Poloxamer修饰的胸腺肽α1敏感型缓释凝胶制剂。
制备方法是取聚合物适量(比例关系需要考察，如10％，15％，20％，25％，30％等)置于容器中，加注射用水搅拌溶解。另取处方量的Poloxamer修饰的胸腺肽α1，与聚合物水溶液混匀，待溶解后微孔滤膜过滤即得。
体外释放实验1、Poloxamer修饰的胸腺肽α1敏感型缓释凝胶制剂的制备取PLGA-POLOXAMER-PLGA共聚物适量，加入10mM的磷酸盐缓冲液(pH4.6)磁力搅拌下溶解。取Poloxamer修饰的胸腺肽α1溶液(50mg/ml)适量与共聚物溶液混合，共聚物溶液的浓度为20％(w/w)。
2、Poloxamer修饰的胸腺肽α1敏感型缓释凝胶制剂的体外释放实验取载药共聚物溶液0.4ml置于玻璃试管中，然后将试管放入溶出仪中，水浴温度为37℃。待溶液完全形成凝胶后，加入3ml释放介质(含有0.02％NaN3和0.5％肝素的pH 4.6磷酸盐缓冲液)，转速为20rpm，释放面积为0.50cm2。在预定的时间取出全部溶出介质，同时加入同体积新鲜的释放介质以保证漏槽条件。释放介质中的药物浓度稀释后采用ELISA试剂盒进行测定，以累积药物释放量对时间作图，得到释放曲线。
3、体外释放结果Poloxamer修饰的胸腺肽α1敏感型缓释凝胶制剂的释放曲线如下图所示。胸腺肽α1的释放量随时间的升高而逐渐升高，在第20d的累积释放百分数为73％。
本文采用的PLGA-POLOXAMER-PLGA共聚物制备的Poloxamer修饰的胸腺肽α1敏感型缓释凝胶制剂，在体外获得了较好的缓释效果，以比较均匀的速率持续释放20d左右，累积释放百分数超过60％，并且没有明显的突释现象，具体见说明书附
图1Poloxamer修饰的胸腺肽α1敏感型缓释凝胶制剂的释放曲线。
权利要求
1.一种Poloxamer化胸腺肽α1长效温度敏感凝胶及其制备方法，其特征在于该凝胶由Poloxamer化胸腺肽α1和温度敏感凝胶组成。
2.根据权利要求1中的Poloxamer化胸腺肽α1，其特征在于活化的Poloxamer与N端氨基上的麦克尔加成反应实现胸腺肽α1的Poloxamer化修饰，该反应可专一性地发生在N端氨基上。
3.根据权利要求1中的温度敏感凝胶，其特征在于选择生物可降解的材料如聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)、聚(氧化乙烯-氧化丙烯-氧化乙烯)体系(PEO-PPO-PEO)、聚乙二醇-聚(D，L-乳酸-co-乙醇酸)(PEG-PLGA)共聚物体系、PLGA-PEG-PLGA，PEG-PLGA、PEG-PLLA-PEG、PEG-PLGA-PEG接枝聚合物中的一种或一种以上。
4.根据权利要求2中的Poloxamer化胸腺肽α1，其制备方法如下首先将Poloxamer活化，制备可用于胸腺肽α1修饰的活化Poloxamer分子，包括Poloxamer-醛(Poloxamer-aldehyde)、Poloxamer-三氟乙磺酸(tresylated-Poloxamer、Poloxamer-环氧化物(Poloxamer-epoxide)等，然后再按照一定摩尔比与胸腺肽α1混合，于37℃搅拌(300r/min)反应45min，制备得到不同修饰率的Poloxamer化的胸腺肽α1；再通过超滤法(切割分子量20000)的超滤膜于4℃的PBS液中透析1h，10％甘油-PBS透析2h即得。
5.根据权利要求1中的温度敏感凝胶，其特征在于还可以含有稳定剂，稳定剂可以选择蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻酸钠以及低分子右旋糖苷中的一种或一种以上。
全文摘要
本发明公开了一种Poloxamer化胸腺肽α1长效温度敏感凝胶及其制备方法，其特征在于该凝胶由Poloxamer化胸腺肽α1和温度敏感凝胶组成。
文档编号A61P37/00GK1903172SQ200610091009
公开日2007年1月31日 申请日期2006年7月10日 优先权日2006年7月10日
发明者张文芳, 仇峰 申请人:张文芳