专利名称：：溶葡萄球菌酶在制备治疗骨髓炎的药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及溶葡萄球菌酶的一种新用途，尤其涉及在制备治疗骨髓炎的药物中的应用。
背景技术：
：骨髓炎是骨组织(包括骨髓、骨质、骨膜)的化脓性感染，属骨科常见病，其发病急剧，病情绵延，治疗棘手，往往因合并症而致终身残疾，严重影响人体健康和生活，是医学界公认的仅次于骨癌的顽症，按病情可分为急性和慢性两类。1.急性血源性骨髓炎急性血源性骨髓炎是由于病人自身免疫功能低下，导致化脓菌由某一部位的病灶经血流进入骨内而引起，常见的病灶多位于体表，如疖、痈、毛囊炎、中耳炎以及上呼吸道感染等。最常见于小儿，2-12岁的小儿约占80%，病儿多为男孩，约为女孩的4倍。急性血源性骨髓炎大多发生在长管状骨的干骺端，因是终末动脉，血流较慢，细菌栓子容易停留。细菌的繁殖和局部骨组织的变态反应引起一系列炎性病变，结果使骨组织坏死，形成一个小的骨脓肿，随后病灶持续扩大，侵入更多的骨组织，甚至波及整个骨干。急性血源性骨髓炎发病突然，因感染程度不同而有不同的表现。一般有中毒症状如发冷、寒战、体温急剧上升，高达3940。c，脉搏加速，全身虚弱，白细胞计数增高，可高达30,000以上，血沉率快，血细菌培养常为阳性。患肢剧痛，肿胀，不敢活动。严重者可发生中毒性休克，甚至死亡。2.慢性化脓性骨髓炎急性骨髓炎治疗不及时或不彻底即转变为慢性化脓性骨髓炎，常有一个或多个窦道，时愈时发，经久不愈，反复排出脓液或死骨，如果脓液引流不畅，局部肿胀疼痛加剧，出现发热和全身不适等症状，经休息或治疗，上述症状消退，但多仍遗留窦道，如此反复发作。慢性骨髓炎长期不愈可导致如下并发症①畸形由于骨骺受炎症的刺激，使患肢过度生长而变长，或因骨骺板破坏，影响发育，结果肢体短縮，骨骺板一侧受破坏，发育不对称，使关节呈内翻或外翻畸形；由于软组织疤痕挛縮，也可引起屈曲畸形。②关节强直由于感染扩散到关节内，关节软骨面破坏，使关节呈纤维性或骨性强直。⑧癌变窦道口皮肤由于不断受刺激，可合并癌变，常见为鳞状上皮疡。更为严重的是部分患者由于无法治疗而必需截肢，甚至死亡。目前临床上主要采用大剂量的抗生素进行治疗，但是先期采用的抗生素全身性给药治疗，如果抗生素选用不当，药品对致病菌不敏感或药量不够大、用药时间不够长，往往使得病症无法治愈，迟早(长达数年)病变仍会复发。这些病变周而复始地发展下去形成长期不愈合的窦道，造成严重病残。而且由于大剂量地使用抗生素，药物在体内的蓄积也会对病人的肝、肾、耳等器官造成不可逆的损害。近二十年来，随着一系列有机高分子材料的发展，局部药物释放系统的新型给药方式得到了广泛的研究和应用。其在治疗骨髓炎上有着较为有利的药动学特点，不但可在感染局部产生较高的药物浓度，且不会产生全身毒副作用，因此抗生素的局部药物释放系统逐渐得到了广泛的应用。然而研究表明，目前临床上治疗骨髓炎常用的庆大霉素、替硝唑等在较高浓度的情况下，对于骨髓炎病人的骨再生及愈合过程中起关键作用的成骨细胞具有明显的抑制作用[卢丙仑，冯志华等.体外评价抗生素对人重组骨形成蛋白一2诱骨活性的影响.中国临床康复.2002，6(22):3344-3345]，使得成骨细胞无法增殖、修复骨缺损，病人的病灶部位愈合缓慢，病程延长，大大增加了病人的痛苦。因此，寻找一种能有效治疗骨髓炎、并且对成骨细胞无明显影响的药物是本发明需要解决的主要内容。
发明内容本发明需要解决的技术问题是公开溶葡萄球菌酶在制备治疗骨髓炎的药物中的应用。本发明的发明构思是这样的骨髓炎是病菌从局部感染的病灶(如上呼吸道感染、毛囊炎等)进入血液，停滞在骨的干骺端，导致局部骨组织的变态反应从而引起一系列炎性病变，结果使骨组织坏死，形成一个小的骨脓肿，随后病灶持续扩大，侵入更多的骨组织而形成。溶葡萄球菌酶(lysostaphin)是一种含锌的金属蛋白酶，它能专一降解革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌)细胞壁肽聚糖层的甘氨酸肽键，从而裂解金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的细胞壁，起到彻底杀死细菌的目的，尤其对耐药性金黄色葡萄球菌等难以根除的致病菌的效果非常好。而且，溶葡萄球菌酶本身是一种蛋白质，其在体内最终被降解成氨基酸为人体所吸收，因此既不会如抗生素类药物一样在体内蓄积而产生毒副作用，也不会对成骨细胞产生抑制作用。将溶葡萄球菌酶与一些骨替代材料相配伍制成的药物制剂，在有效治疗骨髓炎的同时，溶葡萄球菌酶也不会对成骨细胞产生影响，使其充分发挥骨修复的作用，同时骨替代材料还能明显加快骨缺损的修复进程，縮短病人的预后时间，大大减轻病人的痛苦。试验证明，溶葡萄球菌酶对于骨髓炎具有十分显著的疗效，可以以组合物的形式施加于需要治疗的患者，所说的组合物，至少包括溶葡萄球菌酶0.0001-10wt。/。和医药学上人体可接受的药物载体材料，剂量为70-99wt所说的溶葡萄球菌酶可采用采用上海高科联合生物技术员研发有限公司市售的产品；所述及的组合物还可包括溶菌酶0.1-10wt^。所说的溶菌酶可采用大连绿雪蛋品发展有限公司市售的产品；所述及的药物载体材料包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、胶原、纤维蛋白原、聚乳酸/聚羟基乙酸、几丁糖、磷灰石硅灰石多孔剥离陶瓷(PGC)、丙烯酸树脂、纤维素、骨水泥、磷酸钙、硫酸钙、明胶、聚酸酐、多孔玻璃陶瓷、纤维蛋白凝胶的一种或一种以上。其主要作用是作为药物组分的载体，使药物缓慢释放，并作为病变部位的填充物。所述及的药物制剂的制备方法包括如下步骤根据溶葡萄球菌酶和溶菌酶使用方式的不同可分为以下两种制备方法1.以酶溶液进行制备的药物制剂。(1)按上述比例称取溶葡萄球菌酶及溶菌酶与水混和制成酶溶液。(2)将制得的具有一定形状的药物载体置于酶溶液中，经真空吸附、冻干处理制得所需的载药模块。2.以酶冻干粉末进行制备的药物制剂。将上述比例的酶冻干粉末、药物载体粉末按等量递加法混匀，加入溶剂(水或磷酸钠缓冲液或有机溶剂)混匀，采用适当方法(冷冻干燥或减压蒸馏或自固化)处理，制得具有一定形状的载药模块。混匀用溶剂选自水、磷酸钠缓冲液、丙酮、乙醚、二氯甲垸中的一种；干燥固化成型处理方式选自冷冻干燥、减压蒸馏、自固化中的一种。本发明制得的药物制剂，以溶葡萄球菌酶为主要治疗组分与骨替代材料(载体材料)混合制成局部抗菌药物缓释系统植入骨髓炎的病变部位，能有效治疗细菌感染引发的骨髓炎，同时不会对成骨细胞造成抑制，还能明显加快骨缺损的修复，缩短病程，是一种高效、安全的骨髓炎新型治疗药物。具体实施例方式实施例中的溶葡萄球菌酶冻干粉末，采用上海高科联合生物技术研发有限公司的产品，溶菌酶冻干粉末采用大连绿雪蛋品发展有限公司的产品。实施例1称取溶葡萄球菌酶冻干粉末3mg，以灭菌注射用水6ml溶解，配制成浓度为0.5mg/ml的储备液，备用；称取170mg聚乳酸，在无菌层流操作台上加入丙酮3.6ml，搅拌溶解后加入储备液0.4ml，混匀，继续搅拌挥去丙酮，待聚乳酸析出并粘结成块时取出，再用模具塑形，待残留溶剂挥千后放入干燥器中，8h后取出，采用环氧乙垸或7射线照射灭菌，备用。实施例2取明胶10g加蒸馏水75ml浸泡，待膨胀软化后，在水浴上加热使之完全溶解，加入已稀释的4%的甲醛溶液10ml，保持水浴温度35°C，搅拌(900转/分)，使之产生丰富细腻的泡沫，分装于麻布盒中，放入-15"C冰箱中冷冻，取出置于室温鼓风干燥后，加工成具有一定形状的小块，12(TC干热灭菌lh。将制得的明胶海绵小块置lmg/ml溶葡萄球菌酶水溶液中，经真空吸附、冷冻干燥值得载有溶葡萄球菌酶的明胶海绵小块。实施例3取溶葡萄球菌酶冻干粉末7mg，溶菌酶冻干粉末2mg，硫酸钙(a—半水石膏)140mg，按等量递加法混合均匀，加磷酸钠缓冲液(0.25M/0.25M磷酸氢二钠/磷酸二氢钠)56pL调匀成糊状，置模具中塑形，室温固化24小时制得载有抗菌肽的硫酸钙骨水泥，采用环氧乙烷或7射线照射灭菌，备用。实施例4将溶葡萄球菌酶溶于水中配制成15^g/ml水溶液备用；将磷酸钙粉末140mg(a—磷酸三钙80mg，磷酸氢转60mg)按等量递加法混匀，加15/xg/ml溶葡萄球菌酶溶液56pL调匀成糊状，置模具中塑形，在37i:、相对湿度1000%环境中固化4小时制得载有溶葡萄球菌酶(0.001%)的磷酸钙骨水泥，采用环氧乙烷或7射线照射灭菌，备用。实施例5取聚甲基丙烯酸甲酯140mg，加入溶葡萄球菌酶冻干粉末14mg，混匀，再以液体甲基丙烯酸甲酯调配成粘稠状料浆，将粘稠料浆模铸或搓成3lOmm小珠，并以手术缝线串成珠链，采用环氧乙烷或7射线照射灭菌，备用。实施例6抑菌试验葡萄球菌的接种用无菌棉拭子蘸取浓度为5*105cfU/mL溶葡萄球菌(ATCC6538)悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60度，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5分钟。载药模块贴放按实施例1实施例5分别制备载药模块(5mn^4mm)，用无菌镊子取模块贴放于平板表面，贴放好后，用无菌镊子轻压模块，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37'C温箱，培养17小时观察结果，用游标卡尺测量抑菌环的直径并记录。用镊子将载药模块取出，贴放于另一块平板表面，继续重复上述实验，观察结果并记录。x抑菌试验结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例7溶葡萄球菌酶对成骨细胞活性影响的体外实验成骨细胞的培养取健康成年志愿者骨髓5ml，采用全骨髓法置于含100g/L胎牛血清的DMEM完全培养基中于37°C、含5g/L(302湿化空气中进行原代培养。传代后改用含100g/L胎牛血清的条件培养基(DMEM完全培养基中加入地塞米松l(T8mol/L、/3—甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C50mg/mL)继续培养约2周，使骨髓基质干细胞定向诱导分化为成骨细胞。溶葡萄球菌酶对成骨细胞活性的影响将第3代成骨细胞用2.5g/L胰酶消化后，制成浓度为5*104/mL单细胞悬液，将细胞分2组接种于96孔培养板中，每组20孔，毎孔25mL，每组再分别加入含有1%溶葡萄球菌酶DMEM条件培养基275jliL(实验组)、DMEM条件培养基(对照组)，另设一组每孔仅加入DMEM条件培养基300/aL作为空白对照组，继续培养。分别在加样后第2，4，8，14d各取5孑L，去上清，采用MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)测定每孔的光密度值A570。结果见下表。各组细胞增值测定结果(A570,i±s)组别培养时间<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例8动物病理试验(1)动物模型的建立新西兰兔用氯胺酮麻醉，右后肢膝关节外侧剪毛，用6号针头经膝关节穿刺进入兔胫骨近端骨髓腔1/3处，分别注入5。^鱼肝油酸钠O.lml及6*109cfii/ml金黄色葡萄球菌悬液O.lml，取出针头，放入笼中正常饲养。4周后，X线摄片可见骨膜增生，皮质骨增厚，密度增加成为包壳，其内有死骨及死腔，作为实验造模成功。(2)给药治疗将造模成功的36只新西兰兔(雌雄各半，体重1.92.6kg)麻醉，8%的硫化钠脱毛，新洁尔灭酊液常规消毒，在患骨处纵行切开皮肤，长约10mm，分离，用3.5mm钻头由股骨外侧向内侧横向钻孔，钻透两侧皮质骨，冲尽骨碎屑，分3组分别植入空白磷酸钙骨水泥、载有4%庆大霉素的骨水泥和载有溶葡萄球菌酶的骨水泥模块(按实施例4制备)，缝合伤口，术后正常分笼饲养和饮食，不口服或静脉应用抗菌化疗药物。4周后观察治疗效果。(3)治疗后骨X光片对比治疗后取患骨拍X光片，将新西兰兔患骨X线表现分为轻度、中度、重度三级，轻度为治愈恢复型，中度为增殖型和X线稳定型，重度为破坏进展型和死骨形成型，由三位放射科医师盲法对比评定X光片表现。结果见表l。表lX光片对比结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(4)患骨组织病理改变比较由三位病理科医师盲法评价患骨组织病理切片光镜下所见，结果见表2。结果表明载酶骨水泥组与载庆大霉素骨水泥组均优于空白骨水泥组。表2骨组织病理学对比结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1.溶葡萄球菌酶在制备治疗骨髓炎的药物中的应用。2.如权利要求1所述的溶葡萄球菌酶在制备治疗骨髓炎的药物中的应用，其特征在于，以所说的药物的总重量计，组分中至少包括溶葡萄球菌酶0.0001-10%和医药学上人体可接受的药物载体材料。3.如权利要求2所述的溶葡萄球菌酶在制备治疗骨髓炎的药物中的应用，其特征在于，所述及的药物中还包括溶菌酶0.1-10%重量比。4.根据权利要求2或3所述的溶葡萄球菌酶在制备治疗骨髓炎的药物中的应用，其特征在于，所述及的药物载体材料选自聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、胶原、纤维蛋白原、聚乳酸/聚羟基乙酸、几丁糖、磷灰石硅灰石多孔剥离陶瓷(PGC)、丙烯酸树脂、纤维素、骨水泥、磷酸钙、硫酸钙、明胶、聚酸酐、多孔玻璃陶瓷、纤维蛋白凝胶中的一种或一种以上。5.根据权利要求4所述的溶葡萄球菌酶在制备治疗骨髓炎的药物中的应用，其特征在于，所述的药物的制备方法包括如下步骤(1)以酶溶液进行制备的药物制剂；按上述比例称取溶葡萄球菌酶及溶菌酶与水混和制成酶溶液，将制得的具有一定形状的药物载体置于酶溶液中，经真空吸附、冻干处理制得所需的载药模块；(2)以酶冻干粉末进行制备的药物制剂；将上述比例的酶冻干粉末、药物载体粉末按等量递加法混匀，加入溶剂混匀，干燥固化成型处理，制得具有一定形状的载药模块。6.根据权利要求5所述的溶葡萄球菌酶在制备治疗骨髓炎的药物中的应用，其特征在于，所述及制备方法中，混匀用溶剂选自水、磷酸钠缓冲液、丙酮、乙醚、二氯甲垸中的一种；干燥固化成型处理方式选自冷冻干燥、减压蒸馏、自固化中的一种。全文摘要本发明公开了溶葡萄球菌酶在制备治疗骨髓炎的药物中的应用，试验证明，溶葡萄球菌酶对于骨髓炎具有十分显著的疗效，本发明以溶葡萄球菌酶为主要治疗组分与骨替代材料(载体材料)混合制成局部抗菌药物缓释系统植入骨髓炎的病变部位，能有效治疗细菌感染引发的骨髓炎，同时不会对成骨细胞造成抑制，还能明显加快骨缺损的修复，缩短病程，是一种高效、安全的骨髓炎新型治疗药物。文档编号A61K38/48GK101195027SQ200610119208公开日2008年6月11日申请日期2006年12月6日优先权日2006年12月6日发明者磊宋,李国栋,黄青山申请人:上海高科联合生物技术研发有限公司