专利名称：：脱纤因子在制备治疗和/或预防血管疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及药物化学领域。具体而言，本发明涉及脱纤因子的新医药用途，即脱纤因子在制备治疗和/或预防血管疾病药物中的应用。
背景技术：
：血管疾病是指涉及到血管方面的疾病，包括心脑血管病、周围血管病等。血管疾病是临床十分常见的危害人类健康的最大疾病，其死亡率高，并伴发严重并发症，因此，展开对血管疾病的防治研究是当今医学和药学中一项重大难题。急性冠脉综合征属于心血管疾病的范畴，包括不稳定心绞痛和急性心肌梗塞。不稳定心绞痛是心肌急剧的暂时的缺血与缺氧所引起的临床症状。急性心肌梗塞是由于冠状动脉粥样硬化、血栓形成或冠状动脉持续痉挛，导致冠状动脉或分枝闭塞，造成心肌因持久缺血缺氧而发生坏死。脑梗塞(又称"脑卒中")是脑血管病中的一种，其是管腔狭窄，或栓塞,甚或闭塞时出现的症状。脑梗塞包括脑血栓形成和脑栓塞，脑血栓是由于动脉粥样硬化、动脉内膜炎以及血液粘稠度高，导致脑血管局部形成血栓，堵塞血管引起的症状。脑栓塞是血管其他部位的栓子如心脏病的附壁血栓，主动脉、颈动脉等的血栓呈动脉硬化斑块脱落，盆腔及下肢静脉血栓脱落，骨折时脂肪栓子等运行到脑部引起血栓塞时出现的症状，多发生于心脏病病人。当脑部动脉管腔狭窄或闭塞，导致急性脑供血不足，引起局部脑组织缺血、缺氧而发生坏死，出现一系列的临床症状。外周动脉疾病和深静脉血栓形成是外围血管疾病的两种重要类型。外周动脉疾病(PeripheralArteryDisease,PAD)是指除冠状动脉之外的主动脉及其分支动脉的狭窄、闭塞或瘤样扩张疾病，如为下肢、足、肾和肠供血的动脉。PAD最常见的病因是由于外周动脉的动脉粥样硬化导致动脉狭窄病变，使得流向下肢的血流减少。PAD可导致心肌梗死、脑卒中、心血管死亡、肢端的截肢、主动脉瘤的破裂、严重髙血压、肾衰等严重疾病。深静脉血栓形成是发生于人体四肢深静脉内的病变，这些血管内的血液因某些不良因素的影响而发生凝固，阻塞血管导致血液回流障碍，并引起相应的临床症状。临床上多见于下肢，特别是左下肢。血栓形成原因主要有三大要素静脉壁损伤、静脉血流滞缓和血液高凝状态。现有的心脑血管类的药物如速效救心丸、地奥心血康、硝酸甘油等，在缓解症状、改善循环机能状态等方面有一定的疗效，但上述药物疗效单一，易产生耐药性，不能长期持续使用药，而且对病情严重的病人如脑血栓、心肌梗塞等疗效差。有些西药虽然有一定疗效，但副作用大，不适宜临床长期使用。总之，目前治疗血管疾病的药物虽多，但显效的少，疗效单一，副作用大，因此，在临床上需要不断研究开发副作用小、疗效显著的治疗血管疾病的药物。
发明内容本发明人经过认真研究和动物试验发现，从哺乳动物组织中提取的脱纤因子对血管疾病有明显的治疗和/或预防作用，而且脱纤因子来自于天然源，对人体无副作用，其对血管疾病的治疗和预防药效显著。因此，本发明的目的是提供脱纤因子在制备治疗和/或预防血管疾病药物中的应用。本发明的另一目的涉及脱纤因子的制备方法。本发明的脱纤因子是从哺乳动物组织中提取得到的一种单链核苷酸混合物，其平均分子量约在1575kDa之间，优选约在2050kDa之间，其具有以下分子式-P"5，(dAp)12-24，(dGp)10_20,(dTp)13墨26，(dCp)i0—20式中P为磷基dAp为脱氧腺苷酸的单体dGp为脱氧鸟苷酸的单体dTp为脱氧胸苷酸的单体dCp为脱氧胞苷酸的单体。该脱纤因子具有以下物理化学性质电泳-均匀阳极的迁移率；消光系数，在260土lnm处的Elcm1%=220±10;消光比，E23()/E26o=0.45±0.04;摩尔消光系数(以磷表示)，e(P)=7.750±0.500;旋光度[a]D20=53°±6;在天然DNA中以％表示的可逆增色性，h=15±5。本发明的脱纤因子的可逆增色性(h)可由下列公式计算OD26o(热或碱性pH)_h=-—1OD260(室温或中和pH)分别测定脱纤因子在260nm溶液中被加热然后冷却，或使其呈碱性然后中和使其pH为5时的光密度(OD)值，由公式计算出可逆增色性。本发明的脱纤因子是从哺乳动物组织中提取得到的，特别是牛、羊、猪或马的肺、肠、肝脏、胸腺或粘膜组织。本发明所述的血管疾病包括急性冠脉综合征如不稳定心绞痛、急性心肌梗塞；脑梗塞；外周动脉疾病，即除冠状动脉之外的主动脉及其分支动脉的狭窄、闭塞或瘤样扩张疾病；深静脉血栓等。本发明的脱纤因子的制备方法包括以下步骤-a)研磨哺乳动物组织，在酸性pH条件下，加入蛋白酶，加热使其蛋白水解；b)将物料加热至沸腾，停止蛋白水解；C)过滤并浓縮溶解产物；d)在浓縮液中添加能够沉淀磷酸盐的阳离子盐，调节pH值使其为酸性e)在沉淀悬浮液的恒容条件下过滤，以分离出存在于溶液中的多糖部分；f)在得到的核酸不溶性盐的悬浮液中加入水溶性碱金属盐，以溶解核酸，在保持恒容的条件下，经过滤从溶液中消除不能溶解的阳离子；或者将得到的核酸不溶性盐的悬浮液进行离子交换来除去不溶性阳离子；g)将浓縮液在滤膜上进行切线流分离过滤，浓縮，添加水溶性碱金属盐使核酸溶液的阳离子强度达到至少1摩尔，然后调节溶液的pH值直至分光光度分析在260nm处显示最大可逆增色反应，即达到了最大可能的聚合反应；h)将溶液加热至60—90'C，进行解聚，通过测量可逆增色性的变化值h来控制解聚过程，直到该值达到以天然DNA的百分数表示是15土5时为止；i)通过冷却，终止解聚反应，调节PH至碱性；j)在高于解聚步骤的温度条件下，加热上一步得到的溶液，维持20_60分钟，以稳定核苷酸的结构；k)热过滤，透析除去溶液中的盐杂质，并尽可能地浓縮；1)用乙醇从浓縮液中沉淀出最终产物，用乙醇洗涤沉淀物，在真空下干燥即得。在本发明脱纤因子的制备方法的步骤a)中，采用蛋白水解酶例如木瓜蛋白酶、tripsin等，将pH调整到4一6.5，在温度10—9(TC条件下，进行蛋白水解，时间为0.5-IO小时。在本发明脱纤因子的制备方法的步骤b)中，将物料加热至沸腾5—20分钟，停止蛋白水解。在本发明脱纤因子的制备方法的步骤c)中，采用切向流膜过滤，选用的切向流膜是截留分子量为50，000—100，000道尔顿的管式薄膜Romicon。在本发明脱纤因子的制备方法的步骤d)中，所述的阳离子盐例如钙、锌的卤化物、硫酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐等，采用酸调节pH至2—5，在该步骤中，使核酸沉淀，从而保证多糖部分留在溶液中。在本发明脱纤因子的制备方法的步骤e)中，沉淀悬浮液在恒容条件下通过孔径为0.45um或更小的如Romincon管式膜进行切向流过滤，除去多糖部分，切向流膜过滤中，采用与d)步骤中相同的阳离子盐的水溶液，连续补充入悬浮液中，以保持恒容过滤，直至滤液中不存在多糖物质。在本发明脱纤因子的制备方法的步骤f)中，所述的水溶性碱金属盐为钠、钾的卤化物或乙酸盐，将悬浮液通过能截留分子量小于10000的滤膜Romicon进行切向流过滤，向浓縮液中加入同样的水溶性碱金属盐溶液，以保持恒容过滤，直至滤液中没有不溶性阳离子存在。在本发明脱纤因子的制备方法的步骤g)中，添加水溶性碱金属盐使核酸溶液的阳离子强度达到1一3摩尔，优选3摩尔。在本发明脱纤因子的制备方法的步骤h)中，将溶液加热至60—9(TC，最好70—75'C进行解聚。在本发明脱纤因子的制备方法的步骤i)中，优选冷却至15—30'C来终止解聚反应，调节pH大于7，优选为8或更高。在本发明脱纤因子的制备方法的步骤j)中，加热温度至少要比解聚温度高5°C，一般为65—100。C;本发明的脱纤因子一般以药物组合物的形式使用，这种组合物含有治疗有效量的作为活性成分的脱纤因子和药用辅料，该药物组合物一般可做成各种剂型，包括片剂、胶囊、软胶囊、微丸、颗粒剂、口服液、注射液、冻干粉针剂等。药用辅料包括淀粉、预胶化淀粉、微精纤维素、海藻酸、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯垸酮、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、糖类、糊精、纤维素及其衍生物类、硬脂酸、石蜡、硬脂酸甘油酯、氢化植物油、半合成脂肪酸酯、乙烯类高分子、各种蜡类、硬脂酸、十八醇、聚乙二醇、蔗糖、淀粉、预胶化淀粉、明胶、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯垸酮、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、羟丙甲基纤维素、纤维素类、丙烯酸树脂类和乙烯聚合物类、丙二醇、甘油、聚乙二醇、甘油三醋酸酯、乙酰单甘油酸酯、邻苯二甲酸酯、蓖麻油、甘露醇、右旋糖苷、水解明胶、拧檬酸钠、甘氨酸、氯化钠、葡萄糖、柠檬酸三钠、甲基对羟基苯甲酸，丙基对羟基苯甲酸中的一种或多种混合。本发明的含有脱纤因子的药物组合物优选制成以静脉注射途径给药的形式，包括冻干粉针剂和注射液剂。本发明的含有脱纤因子的冻干粉针剂可以含有药用辅料，特别是甘露醇、右旋糖苷、水解明胶、柠檬酸钠、甘氨酸等。本发明的含有脱纤因子的注射液剂可以含有药用辅料，特别是甘露醇、氯化钠、葡萄糖、柠檬酸钠、甲基对羟基苯甲酸，丙基对羟基苯甲酸等。本发明的含有脱纤因子的药物组合物的剂量是根据病情的严重程度、治疗时间而定，适于肠胃外给药(如皮下注射或肌肉注射)的剂型，一般日剂量io—800mg脱纤因子/kg体重，口服给药，日剂量为15—1600mg脱纤因子/kg体重。本发明制备的脱纤因子纯度高、稳定性好，生物利用度高，对于血管疾病的治疗疗效显著，同时本发明的脱纤因子具有良好的安全性，对于治疗周期比较长的疾病具有很大意义。因此本发明脱纤因子是一类具有良好开发前景的安全有效的药物。具体实施例方式下面用具体实施例对本发明作进一步说明。实施例l制备脱纤因子a)将100kg冷冻牛肺洗净，研磨，并分散于含有300g木瓜蛋白酶的60升饮用水中，用稀盐酸调整pH至6.0，然后加热至7(TC，进行蛋白水解4小时；b)将物料加热至沸腾，IO分钟后停止蛋白水解；c)通过压滤机过滤，除去分散液中的固体，将滤液在具有截留分子量为50000道尔顿的管式薄膜Romicon上采用切向流过滤并浓縮到25升体积；d)将浓縮液用180g的无水氯化钙处理，调节溶液的pH至4;e)将悬浮液通过孔径为0.45ym的Romicon管式膜进行切向流过滤，并通过加入0.01M氯化钙溶液保持浓縮液体积恒定，直至滤出液中不存在多糖物质；f)向不溶性核酸钙的悬浮液中加入25升3M氯化钠，然后通过能截留分子量10000的滤膜Romicon进行切向流过滤，向浓縮物中加入3摩尔氯化钠溶液以保持恒容过滤，直至滤液中没有不溶性钙离子存在；g)将浓縮液在与f)步骤相同的滤膜Romicon上进行切向流分离过滤，以进一歩浓缩直至体积达到7.5升为止，添加氯化钠，使核酸溶液的阳离子强度达到2摩尔，用盐酸调节pH值直至分光光度分析在260nm处显示最大可逆增色反应；h)将溶液加热至70°C，进行解聚，直至溶液的可逆增色性h达到以天然DNA的百分数表示是15土5时为止；i)将解聚的物质冷却到25。C，终止解聚，用3摩尔Na0H调节pH至8.5;j)将温度升高到85'C，并维持30分钟；k)热过滤，透析除去溶液中的盐杂质，并采用切向流在滤膜Romicon上过滤，浓縮至6500毫升体积；l)用乙醇从浓縮液中沉淀出最终产物，用乙醇洗涤沉淀物，在60。C、真空下干燥即得。得到的产品的性质如下消光系数，在260土l腿处的Eicm"二230;消光比，E23Q/E26o=0.48;摩尔消光系数(以磷表示)，e(p)=7.800;旋光度[Q]d2(^57G;在天然DNA中以%表示的可逆增色性，h=18。得到的脱纤因子的分子式为P3，(dAp)12,(dGp)u,(dTp)13,(dCp)n实施例2制备脱纤因于注射液取实施例1制备的脱纤因子200克，配以辅料二水合柠檬酸三钠25克，甲基对羟基苯甲酸3克，丙基对羟基苯甲酸600毫克，加注射用水至2000毫升，无菌过滤，分装1000个安瓿瓶中，即得每瓶200毫克。以下通过实验来说明脱纤因子的药效-实验1:脱纤因子对犬抗心肌缺血作用实验方法健康犬30只，雌雄各半，随机分为3组对照组(生理盐水)；硝酸甘油组(15ng/kg);脱纤因子组(200mg/kg)(实施例2制备的脱纤因子注射液)。各组动物称重后静脉注射盐酸氯胺酮注射液(6mg/kg)麻醉，用左冠状动脉结扎方法制备心肌缺血模型。在心导管插管吸入麻醉下作股动脉插管至主动脉，接通多道生理仪；上下肢备皮，贴心电图片，接心电监护仪待各指标数值稳定后开始实验。静脉注射生理盐水或药物后即刻以及6小时，用心电监护仪测定动物模型的ST抬高高度。并对动物模型用药前后抽血测量血清肌酸磷酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)的浓度。计量资料采用t检验，计数资料采用x^检验进行统计分析处理。实验结果脱纤因子对犬抗心肌损伤的指标检测结果见表1。表1用药前后犬心肌损伤的变化<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*与给药前比较，PO.01;A与对照组组比较，P<0.01。各组动物结扎后，心肌缺血使ST抬高高度增大，且缺血时心肌细胞受损使CPK和LDH从细胞内溢出，即心肌损伤程度越重，则血清CPK和LDH的含量越高。硝酸甘油是目前公认的对心肌缺血有确切疗效的药物。各组动物在给药后，可以发现脱纤因子组、硝酸甘油组与对照组比较，ST抬高、LDH和CPK浓度的升高程度都有明显降低(P<0.01)，且脱纤因子的疗效比硝酸甘油更佳。本实验结果表明脱纤因子对抗犬心肌缺血有良好的作用。实验2:脱纤因子对大鼠脑梗塞的治疗作用实验方法用三氯化铁局部涂抹损伤血管方法制备大鼠大脑中动脉血栓模型实验用大鼠经腹腔注射10X水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉，颞部开颅，暴露大脑中动脉，置一小片塑料薄膜保护周围血管、组织，将一片吸有50%三氯化铁溶液(lmoL/L盐酸)10ul的小片滤纸(2X2mm)敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。术中术后室温严格控制在24~25°C。动物分组和给药取大鼠36只，体重280320g，随机分为三组对照组(生理盐水)，尿激酶组(5万U/kg)和脱纤因子组(600mg/kg,实施例2制备的脱纤因子注射液)。给药组在手术30min后由舌下静脉给药，24h后判断神经症状，然后抽取血浆测定其组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)活性。实验结果本实验用三氯化铁局部涂抹损伤血管，对照组大鼠麻醉清醒后即有偏瘫样症状出现，主要表现为手术对侧前肢内收、肩内旋、前肢肌张力下降，向手术对侧推动时抵抗阻力下降，表明大鼠大脑中动脉血栓模型制备成功。t-PA是纤溶系统的主要激活剂，PAI为t-PA的特异抑制物，二者既是纤溶系统的关键酶，也是血管内皮细胞损伤的分子标志。血浆中纤溶活性的调节主要取决于内皮细胞分泌的t-PA/PAI的相对比例。本实验研究发现与对照组相比，尿激酶组和脱纤因子组的血浆t-PA活性明显升高，具有统计学意义(PO.05);尿激酶组和脱纤因子组PAI活性显著低于对照组(PO.05)(见表2)。表2脑梗塞大鼠用药前后血浆t-PA和PAI活性变化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>脱纤因子可诱导血管壁产生和释放t-PA，并能够降低PAI活性，从而发挥纤溶和溶血栓作用，减轻脑缺血性损伤，保护脑组织功能。实验3:脱纤因子对家兔股动脉血管闭塞的影响实验方法健康家兔18只，雌雄各半，随机分为对照组、前列环素1(PGE1)组和脱纤因子组(实施例2制备的脱纤因子注射液)。家兔经3%戊巴比妥钠麻醉后，右侧股三角处切开皮肤，股动脉起始部结扎血管，向远心端注入融化的液态石蜡0.5ml/kg。分层缝合切口。单独饲喂，第10日快速放血处死动物。术后即刻及每日耳缘静脉注射药物1次。按下列剂量给药对照组给予生理盐水、PGE1组(300pg/kg)，脱纤因子组(150mg/kg)。实验结束时测定各组动物右侧小腿骨骼肌ATP含量和醛縮酶(Aldolase)活性。实验结果缺血组织能量生成明显减少，ATP储备降低。脱纤因子组的小腿骨骼肌ATP含量为4.87土0.66pmol/g'dw，显著高于对照组2.98士0.39pmol/g'dw(PO.01);PGE1组ATP含量为3.32士0.63nmol/g'dw，高于对照组(P<0.05)。骨骼肌组织缺血时发生糖代谢障碍，本例以醛縮糖活性降低作为指示其变化相对应的指标。脱纤因子组和PGE1组的Aldolase活性值分别为6.02士0.58ku/g'dw和5.51±0.67ku/g-dw，显著高于对照组4.33±0.61ku/g'dw(PO.05)。本实验结果表明脱纤因子可增加组织的ATP储备，减轻缺血组织的糖代谢障碍，对家兔外周动脉闭塞组有明显的作用。实验4:脱纤因子对大鼠深度静脉血栓的影响实验方法取大鼠60只，体重280士30g，随机分为三组对照组，尿激酶组和脱纤因子组(实施例2制备的脱纤因子注射液)，每组20只。各组大鼠用苯巴比妥钠(75mg/kg)腹腔注射麻醉后，腹部备皮，经腹白线正中切口近腹，分离下腔静脉下端与双侧髂总静脉。将丝线结扎下腔静脉和双侧髂总静脉，最后用可吸收缝线双层关腹。模型制备后观察到大鼠双后肢颜色先变苍白，后变青紫，双后肢僵硬，说明深静脉血栓模型制备成功。术后即刻给药对照组给予生理盐水，尿激酶组给予尿激酶5万U/kg，脱纤因子组给予脱纤因子600mg/kg。于实验结束第4天时取血测定各组动物全血粘度与纤维蛋白原含量。实验结果治疗前后大鼠血液流变改变结果见表3。表3治疗前后模型大鼠血液流变改善情况<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注*与给药前比较，PO.01;A与对照组组比较，P<0.01。深度静脉血栓大鼠由于静脉血栓的存在使血流减缓，导致血液粘稠度增大，血小板聚集，红细胞变形能力下降，血液呈高凝状态，而血浆粘度和血液中纤维蛋白原的含量是影响血液流变特性的两个主要指标。通过实验可以发现，与对照组相比，脱纤因子组和尿激酶组均能显著降低血浆粘度和纤维蛋白原含量(P<0.01)，且脱纤因子的疗效优于尿激酶。本实验结果表明，脱纤因子可以显著改善血液粘稠程度，从而达到防治深度静脉血栓形成的作用。权利要求1.脱纤因子在制备治疗和/或预防血管疾病药物中的应用，该脱纤因子是从哺乳动物组织中提取得到的一种单链核苷酸混合物，其平均分子量约在15～75kDa之间，优选约在20～50kDa之间，其具有以下分子式P1-5，(dAP)12-24，(dGp)10-20，(dTp)13-26，(dCp)10-20式中P为磷基dAP为脱氧腺苷酸的单体dGp为脱氧鸟苷酸的单体dTp为脱氧胸苷酸的单体dCp为脱氧胞苷酸的单体。2.根据权利要求1所述的应用，其中脱纤因子具有以下物理化学性质电泳=均匀阳极的迁移率；消光系数，在260土lnm处的E,C二220土10;消光比，E230/E260=0.45±0.04;摩尔消光系数(以磷表示)，e(P)=7.750±0.500;旋光度[a]D20°=53Q±6;在天然DNA中以％表示的可逆增色性，h=15±5。3.根据权利要求2所述的应用，其中所述的哺乳动物组织是牛、羊、猪或马的肺、肠、肝脏、胸腺或粘膜组织。4.根据权利要求3所述的应用，其中所述的血管疾病是急性冠脉综合征、脑梗塞、外周动脉疾病或深静脉血栓。5.根据权利要求4所述的应用，其中所述的药物可做成各种剂型，包括片剂、胶囊、软胶囊、微丸、颗粒剂、口服液、注射液或冻干粉针剂。全文摘要本发明涉及脱纤因子用于制备治疗和/或预防血管疾病的药物的用途，所述的脱纤因子是从哺乳动物组织中提取得到的一种单链核苷酸混合物，本发明的脱纤因子对血管疾病有明显的治疗作用。文档编号A61K31/7076GK101176733SQ20061014589公开日2008年5月14日申请日期2006年11月22日优先权日2006年11月22日发明者李德明申请人:李德明