针对IL-13受体α1的抗体及其用途的制作方法

专利名称：：针对IL-13受体α1的抗体及其用途的制作方法针对IL-13受体oil的抗体及其用途本发明涉及针对IL-13受体al(IL-13Ra(alpha)l)的人抗体，它们的生产方法和用途。
背景技术：
：IL-13是主要由Th2细胞而且也由肥大细胞和NK细胞产生的分泌的单体肽。IL-13的生物功能包括调节IgE产生和调节Th2发育。IL-13结合由IL-13受体al(IL-13Ral)链和IL-4受体a(IL-4Ra)链组成的受体复合体。IL-13结合主要通过STAT6引发信号转导事件。IL-13以低亲和性结合单独的IL-13Ral并且不结合IL-4Ral。与此相反，IL-4结合单独的IL-4Ra并且不结合单独的IL-13Ral。已经描述了IL-13的另一种受体IL-13Ra2。IL-13以高亲和性结合该受体。该受体同样作为docey受体。在转基因小鼠中IL-13的可诱导的过表达导致与哮喘患者共有许多特征的表型。它们显示出粘液组织转化、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞富集的炎症、蛋白酶如MMP-9、-12、-13、-2和-14、组织蛋白酶B、H、K和S的上调，并且它们还呈现上皮下纤维质生成。IL-13敲除小鼠由于Th2发育的损伤而显示出Th2细胞因子产生的显著减少。这些小鼠尽管存在嗜酸性粒细胞炎症但是不产生呼吸道高反应性(AHR)。通过施用IL-13恢复了AHR，表明IL-13是诱导小鼠中AHR必要且足够的。IL-13的与哮喘有关的其他重要的生物功能包括诱导杯形细胞组织转化和粘液产生。它直接作用于呼吸道上皮细胞、成纤维细胞和呼吸道平滑肌细胞并诱导这些细胞类型的每一种中不同的转录程序。有趣的是，IL-13降低平滑肌细胞中的a—肾上腺素能应答，促进呼吸道狭窄。IL-13启动子多态性与变应性哮喘的增加的危险有关。IL-13基因中多态性与高血清IgE水平有关。在IL-4和IL-B基因之间基因间序列中的单核苷酸多态性与特应性哮喘有关。IL-13拮抗剂已经用于动物模型中。例如，可溶性小鼠IL-13Rcx2-IgGFc融合蛋白已经用于显示在完全逆转卵白蛋白诱导的AHR和含有粘液的细胞数目中的功效。即使在该表型完全发展后给予治疗也可以得到该逆转。此外，用IL-13融合细胞毒素分子治疗小鼠导致慢性真菌诱导的变应性炎症中呼吸道疾病的所有特征的减少。总之，IL-13是变态反应中效应臂的关键介体。IL-HRal是hemapoietin受体超家族(1型细胞因子受体超家族)的成员并且由ObiriN.I.，等人，J.Biol.Chem.,270(1995)8797-8804)和WO96/29417鉴定和描述。它是427个氨基酸的蛋白质，包括信号序列。它的DNA和蛋白质序列在WO97/15663和SwissProtNo.P78552中描述。IL-13Ral是以低亲和性结合IL-13的糖基化蛋白质，但是，当连接IL-4Ra成异源二聚体时，它以高亲和性结合IL-13。该复合体也是IL-4的受体。针对IL-13Ral的抗体可以从WO96/29417，WO97/15663,WO03/080675，GraberP.,等人，Eur.J.Immunol.,28(1998)4286-4298;PoudrierJ.,等人，J.Immunol.,163(1999)1153-1161;PoudrierJ.,等人，Eur.J.Immunol.,30(2000)3157-3164;AikawaM.,等人，Cytokine,13(2001)75-84已知。针对IL-13Ral的抗体可以从R&DSystemsInc.USA商购。发明概述本发明包括结合IL-13Ral并且抑制IL-13生物活性的抗体，其特征是所述抗体的可变重链氨基酸序列CDR3选自由SEQIDNO:1、3、5、7或9的重链CDR3序列组成的组。所述抗体优选是人抗体。该抗体优选特征是结合IL-13Ral的亲和性为10'9M(Kd)或更小，优选10'9至lj10'13M。优选地，该抗体的特征是它的重链CDR1、CDR2和CDR3序列选自由SEQIDNO:l、3、5、7或9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列组成的组。该抗体优选特征是所述抗体的可变轻链氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3选自由SEQIDNO:2、4、6、8或10的轻链CDR序列组成的组。该抗体优选特征是所述抗体的可变重链氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3选自由SEQIDNO:1、3、5、7或9的重链CDR序列组成的组，并且所述抗体的可变轻链氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3选自由SEQIDNO:2、4、6、8或10的轻链CDR序列组成的组。CDR序列优选相互独立地选择并且通过FR(构架)区分开。抗体的优选特征是包含SEQIDNO:1的CDR作为重链CDR和SEQIDNO:2的CDR作为轻链CDR，SEQIDNO:3的CDR作为重链CDR和SEQIDNO:4的CDR作为轻链CDR，SEQIDNO:5的CDR作为重链CDR和SEQIDNO:6的CDR作为轻链CDR，SEQIDNO:7的CDR作为重链CDR和SEQIDNO:8的CDR作为轻链CDR，或SEQIDNO:9的CDR作为重链CDR和SEQIDNO:10的CDR作为轻链CDR。可以根据Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的标准定义确定CDR序列。基于此，SEQIDNO:1-8的互补决定区(CDR)具有下面的序列重链CDR:SEQIDNO:1、3、5、7、9的CDR1(aa31-35)，SEQIDNO:1、3、5、7、9的CDR2(aa50-66)，SEQIDNO:1、3、9的CDR3(aa99-108)，SEQIDNO:5的CDR3(aa99-107)，SEQIDNO:7的CDR3(aa99-112);轻链CDR:SEQIDNO:2、4、6、10的CDR1(aa24-34)，SEQIDNO:8的CDRl(aa24-35)，SEQIDNO:2、4、6、10的CDR2(aa50-56)，SEQIDNO:8的CDR2(aa51隱57)和SEQIDNO:2、4、6、10的CDR3(aa89-97)，SEQIDNO:8的CDR3(aa90-97)。优选地，本发明提供了抗体，其包含下面的序列作为互补决定区(CDR):a)抗体重链，其包含SEQIDNO:1、3、5、7或9的重链CDR;b)抗体轻链，其包含SEQIDNO:2、4、6、8或10的轻链CDR，其中CDR彼此相互独立地选择。抗体优选的特征是包含作为重链可变区的SEQIDNO:1和作为轻链可变区的SEQIDNO:2，作为重链可变区的SEQIDNO:3和作为轻链可变区的SEQIDNO:4，作为重链可变区的SEQIDNO:5和作为轻链可变区的SEQIDNO:6，作为重链可变区的SEQIDNO:7和作为轻链可变区的SEQIDNO:8，或作为重链可变区的SEQIDNO:9和作为轻链可变区的SEQIDNO:10。该抗体优选的特征在于包含a)作为重链可变区的SEQIDNO:1和作为轻链可变区的SEQIDNO:2，作为k轻链恒定区的SEQIDNO:11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为重链恒定区的SEQIDNO:12，b)作为重链可变区的SEQIDNO:3和作为轻链可变区的SEQIDNO:4作为k轻链恒定区的SEQIDNO:11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为Yl重链恒定区的SEQIDNO:12，c)作为重链可变区的SEQIDNO:5和作为轻链可变区的SEQIDNO:6，作为k轻链恒定区的SEQIDNO:11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为yl重链恒定区的SEQIDNO:12，d)作为重链可变区的SEQIDNO:7和作为轻链可变区的SEQIDNO:8，作为k轻链恒定区的SEQIDNO:11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为^重链恒定区的SEQIDNO:12，或e)作为重链可变区的SEQIDNO:9和作为轻链可变区的SEQIDNO:10，作为k轻链恒定区的SEQIDNO:11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为重链恒定区的SEQIDNO:12。优选地，抗体的特征在于与抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007禾口/或LC5002-018竞争结合IL-13Ral。优选地，抗体的特征是包含LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或LC5002-018的可变区作为可变区。这些抗体的可变区在SEQIDNO:.l-lO中显示。有用的恒定区是本领域中公知的。实例在SEQIDNO:11-12中显抗体优选是单克隆的或者重组产生的抗体。在本发明的一个实施方案中，抗体是类别改变的人抗体。在本发明的优选实施方案中，抗体含有人Yl重链，其包含a)氨基酸序列Pro233Val234Ala235，其缺失Gly236和/或氨基酸序列Gly327Leu328Pro329Ser330Ser331，b)氨基酸序列Ala234Ala235或c)氨基酸Ala265和Ala297。优选地，根据本发明的抗体以6nM或者更低的ICso值抑制IL-13诱导的Stat-6磷酸化，以20nM或者更低的ICso值抑制IL-13诱导的嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)产生和/或以10nM或者更低(IL-13)和60nM或者更低(IL-4)的IC5。值抑制IL-13或者IL-4诱导的细胞增殖，优选TF-1细胞(ATCCCRL2003)增殖。根据实施例6到8确定IL-13诱导的Stat-6磷酸化、嗜酸细胞活化趋化因子产生和诱导细胞增殖。根据本发明的抗体优选不结合变性的IL-13Ral(结合亲和性KD为l(T6M或者更高)。该抗体优'选特征是显示出基本不与IL-13Ra2和IL-4Ra交叉反应(结合亲和性KD为10—SM或者更高)。本发明还提供了杂交瘤细胞系，其产生针对IL-13Ral的拮抗性单克隆抗体。根据本发明优选的杂交瘤细胞系(hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC5002-002(DSMACC2709)、hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC.5002-003(DSMACC2710)、hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC,5002-005(DSMACC2711)、hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC.5002-007(DSMACC2712))在2005年1月13日保藏在德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ),德国)。从所述细胞系可得到的抗体是本发明的实施方案。本发明还提供了编码包含本发明抗体的多肽的核酸、表达所述核酸的表达载体、用于重组产生所述抗体的宿主细胞。本发明还提供了重组产生所述抗体的方法。根据本发明的核酸编码的多肽为a)包含SEQIDNO:l、3、5、7或9的重链CDR的抗体重链和b)包含SEQIDNO:2、4、6、8或10的轻链CDR的抗体轻链。这些多肽能够与各自的另一抗体链装配产生抗体。根据本发明的抗体对于需要皮质类固醇(corticosteroid)治疗的患者显示出益处。根据本发明的抗体具有新的和创造性性质，其对于患有哮喘或者变应性疾病的患者产生益处。本发明还提供了治疗哮喘和变应性疾病的方法。本发明还包含根据本发明的抗体的用途，用于哮喘治疗和生产根据本发明的药物组合物。此外，本发明包括生产根据本发明的药物组合物的方法。本发明还包括药物组合物，其包含药物有效量的根据本发明的抗体和任选地用于配制用于药物目的的抗体制剂的缓冲剂和/或佐剂。本发明还提供了包含药用载体中的此类抗体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物可以包括在制成品或者试剂盒中。本发明还包括载体，其包含根据本发明的核酸，其能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。本发明还包括原核或者真核宿主细胞，其包含根据本发明的载体。本发明还包括产生根据本发明的重组人抗体的方法，其特征是在原核或者真核宿主细胞中表达根据本发明的核酸并从所述细胞回收所述抗体。本发明还包括通过此类重组方法可以得到的抗体。本发明还包括制备药物组合物的方法，其特征是当与没有所述抗体的测定法比较时，从针对IL-13Rctl的多种抗体中选择针对IL-13Ral的抗体，通过重组表达产生所述抗体，回收所述抗体并将所述抗体与药用缓冲剂和/或佐剂组合。优选地，抗体具有一种或多种上述额外的性质。发明详述术语"IL-13Ral、鼠IL-13Ral、IL-13、IL-13Ra2和IL-4Ra，，和它们的结构域是本领域中众所周知的并且例如通过SwissProtP78552、009030、P35225、Q14627和P24394定义。如果不另外指出，术语"IL-13Ral、IL-13、IL-13Ra2禾卩IL-4Ra"因此表示人多肽IL-13Ral、IL-13、IL-13Ra2和IL-4Ra。本文使用的术语"人抗体"包括具有可变区和恒定区(结构域)的抗体，其可以因为它们与这些种系序列的高度序列相似性或同一性而指定为确定的人种系免疫球蛋白序列。人抗体是本领域中众所周知的(vanDijk,M.A.,和vandeWinkel，J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。也可以在转基因动物(例如，小鼠)中产生人抗体，所述转基因动物当免疫时能够产生人抗体的全部组成成分或者人抗体的选择部分(aselection)而不产生内源免疫球蛋白。在此类种系突变小鼠中人种系免疫球蛋白基因的转移导致当抗原攻击时产生人抗体(见例如，Jakobovits,A.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555;Jakobovits,A.,等人，Nature362(1993)255-258;Bruggemann,M.,等人，YearImmunol.7(1993)33-40)。还可以在噬菌体展示文库中产生人抗体(Hoogenboom，H.R.,andWinter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388;Marks,J.D.,等人，J,Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985);和Boemer,P.，等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。人抗体包括多种形式的抗体，优选单克隆抗体，包括但不限于完整抗体、抗体片段、类别改变的抗体和遗传改造的抗体(变体或者突变抗体)只要保持根据本发明的特征性性质。特别优选重组人抗体。本文使用的术语"单克隆抗体"指都具有基本上相同的氨基酸序列的抗体分子的制备物。本文使用的术语"重组人抗体"意在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从对于人免疫球蛋白基因转基因的宿主细胞如NS0或CHO细胞或者从动物(例如小鼠)分离的抗体，或者使用转染到此类宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。根据本发明的重组人抗体已经进行体内体细胞高突变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是可以分配为特定人种系VH和VL序列的序列，但是不天然存在于体内人抗体种系所有组成成分中。术语"类别改变的抗体"指通常通过重组DNA技术制备的单克隆抗体，优选人抗体，其包含来自一种来源或者种系的可变区即结合区，和与来自不同来源或者种系的抗体的恒定区匹配的恒定区的至少一部分。此类类别改变的抗体不是天然存在的并且因此不能直接从异种移植物小鼠得到。本发明包括的"类别改变的抗体"的形式是这样的形式，其中恒定区与野生型恒定区序列不同，导致根据本发明的具有不同性质，特别是关于Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合的抗体，g卩，通过改变或者突变FC而实现。类别改变的抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，所述基因包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。产生类别改变的抗体的方法包括常规重组DNA和基因转染技术，是本领域中众所周知的(见，例如，Morrison,S丄.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855;美国专利号5,202,238禾B5,204,244)。本文使用的"可变区"(轻链可变区(VL)、重链可变区(VH))指每对轻链和重链的直接参与抗体与抗原结合的部分。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构并且每个结构域包含四个构架(FR)区，它们的序列广泛保守，通过三个"高变区"(或者互补决定区，CDR)连接。构架区采取P折叠构型并且CDR可以形成连接|3折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区保持它们的三维结构并且与来自另一条链的CDR—起形成抗原结合部位。抗体重链和轻链CDR3区，优选地重链CDR3在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和性中起特别重要的作用，并且因此提供了本发明的另一目的。术语"高变区"或者"抗体的抗原结合部分"当在本文中使用时指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自"互补决定区"或者"CDR"的氨基酸残基。"构架"或者"FR"区为不同于本文定义的高变区残基的那些可变结构域区。因此，抗体的轻链和重链从N-末端到C-末端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根据Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed"PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991)的标准定义确定CDR和FR区。"恒定结构域"不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应功能。取决于它们的重链的恒定区的氨基酸序列，将抗体或者免疫球蛋白分成下面的类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些的一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3禾BIgG4、IgAl禾BIgA2。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定区分别称作^S、Y、a和s。根据本发明的抗体优选为IgGl型。抗体的Fc部分直接参与补体激活、Clq结合、C3激活和Fc受体结合。对Clq的结合由FC部分中确定的结合位点引起。此类结合位点是本领域中己知的并且例如由Lukas,T丄，等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560;B謹house,R.,andCebra,J丄，Mol,Immunol.16(1979)907-917;Burton,D.R.,等人，Nature288(1980)338-344;Thommesen,J,E"等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004;Idusogie,E.E.,等人，J,Immunol.164(2000)4178-4184;Hezareh,M.,等人，J.Virol,75(2001)12161-12168;Morgan,A.，等人，Immunology86(1995)319-324;和EP0307434描述。此类结合位点为例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引编号，见下文)。亚类IgGl、IgG2和IgG3的抗体通常显示出补体激活、Clq结合和C3激活，而IgG4抗体不激活补体系幾，不结合C^并且^^栝C3。本文使用的术语"来自人来源的Fc部分"表示Fc部分，其优选具有亚类IgGl的人抗体的Fc部分的氨基酸序列，其以这样的方式修饰使得与人IgGl抗体相比，不能检测到Clq结合、C3激活和/或FcR结合或者结合至少减少50%，优选70%。"抗体的Fc部分"是本领域技术人员众所周知的术语并且基于抗体的木瓜蛋白酶切割定义。根据本发明的抗体含有Fc部分，优选具有人来源的Fc部分的氨基酸序列和优选人恒定区的所有其他部分。优选地，Fc部分是来自人IgGl亚类的突变的人Fc部分。最优选地是包含具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的yl-重链恒定区(实例在SEQIDNO:11中显示)(W099/51642)的Fc部分。人恒定链，例如，yl-重链由Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991),和BrUggemann,M"等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361;Love,T.W.,等人，MethodsEnzymol.178(1989)515-527详细描述。在本发明中优选的恒定结构域不提供补体结合。如本发明中使用"可变区"(轻链可变区(VL)，重链可变区(VH))指每对轻链和重链的直接参与抗体与抗原结合的区域。如本文使用的术语核酸或者核酸分子意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或者双链的，但是优选为双链DNA。当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸是"可操作连接的(operablylinked)"。例如，如果前序列或者分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白质，那么所述DNA可操作连接该多肽的DNA;如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么该启动子或增强子可操作连接该编码序列；或者如果核糖体结合部位位于方便翻译的位置上，那么该核糖体结合部位可操作连接编码序列。通常，"可操作连接"指被连接的DNA序列是顺式的，并且对于分泌前导序列的情况，是连续的和读框内的。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点的连接完成连接。如果不存在此类位点，那么根据常规的实践使用合成的寡核苷酸接头或者连接体。如本文使用的表述"细胞"、"细胞系"和"细胞培养物"可互换使用并且所有此类指定包括子代。因此，单词"转化体"和"转化的细胞"包括原代主题细胞和从其得到的培养物，无论传代次数。还理解由于有意或者无意突变，所有子代不必在DNA含量中精确相同。包括变异子代，其具有在最初转化的细胞中所筛选的相同的功能或者生物学活性。当意在不同的指定时，将从上下文澄清。本文使用的术语"结合IL-13Rod"指在体外测定、优选在结合测定中抗体结合IL-13Ral，在该测定中，抗体结合到表面并且IL-13Ral的结合通过表面等离子体共振(SPR)测量。结合指IO-sm或者更小，优选10'13到10力M的结合亲和性(kd)。"不结合"指10"M或更多的Kd。根据本发明的抗体结合到人IL-13Ral并且优选也结合小鼠IL-13Ral的细胞外结构域。可以通过BIAcore湖!j定法(PharmaciaBiosensorAB，Uppsala,Sweden)研究对IL-13Rcxl的结合。通过术语ka(抗体从抗体/抗原复合体结合的速率常数)、kd(解离常数)和Ko(kd/ka)定义结合亲和性。通过根据本发明的抗体抑制IL-13与IL-13Ral的结合。以ELISA中IL-13与IL-13Ral/IL-4Ra异源二聚体的结合的ICso测量抑制。为了进行这种测定，将IL-13Ral固定并加入IL-13和IL-4Ra。根据本发明的抗体对IL-13与IL-13Ral结合的ICs。值不超过6nM。以至少三次独立测量的平均值或者中值测量ICw值。单次ICso值可能在范围之外。根据本发明的抗体优选显示出与选自由抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或LC5002-018组成的组的抗体相同的结合IL-13R(x1的表位或者由于这些抗体导致的结合的立体位阻而与IL-13Ral的结合受到抑制。可以通过SPR测定使用选自由抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002陽005、LC5002-007或LC5002-018组成的组的固定化抗体和20-50nM浓度的IL-13Ral和100nM浓度的待检测的抗体来检测结合抑制。信号减小50%或者以上表明抗体与选自由抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002画005、LC5002-007或LC5002-018组成的组的抗体竞争。术语"表位"指能够特异结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面组如氨基酸或者糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征，以及特异电荷特征。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂的存在下对前者的结合丧失，但是对后者的结合不丧失。本发明还包括结合IL-13Ral并且抑制IL-13生物活性的人抗体，其特征是对IL-13Ral结合的亲和性为l(t9M(K。)或更小，优选10一到l(t13M，对鼠IL-13Ral结合的亲和性为10'7m(Kd)或更小，优选10'8到10'9m。在本发明的优选实施方案中，根据本发明的抗体进一步通过一种或多种特征表征，所述特征选自结合参数ka、kd和KD，结合的表位与选自由抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或LC5002-018组成的组的抗体结合的表位相同。优选通过重组方法产生本发明的抗体。此类方法是本领域中众所周知的并且包括在原核和真核细胞中表达蛋白质和随后分离抗体多肽并通常纯化至药用纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法向表达载体中插入编码轻链和重链或者其片段的核酸。在合适的原核或者真核宿主细胞像CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达并从细胞(裂解后上清液或者细胞)回收抗体。抗体的重组产生是本领域中众所周知的并且描述于例如Makrides,S.C.,ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.,等人，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R丄，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner,R.G.,DrugRes.48(1998)870-880的综述文章中。抗体可以存在于完整细胞、细胞裂解物中或者为部分纯化的或者基本纯化的形式。通过标准技术进行纯化以便除去其他细胞组分或者其他污染物，例如其他细胞核酸或者蛋白质，所述技术包括碱/SDS处理、CsCl显带法(binding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳、和本领域中众所周知的其他方f去。见Ausubel,F.,等，ed.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience，NewYork(1987)。NS0细胞中的表达由例如Barnes,L.M.,等人，Cytotechnology32(2000)109-123;和Barnes,L.M.,等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬时表达由例如Durocher,Y.，等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。可变结构域的克隆由Orlandi,R.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837;Carter,P.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci,USA89(1992)4285-4289;和Norderhaug,L.,等人，J.Immunol.Methods204(1997)77-87描述。优选的瞬时表达系统(HEK293)由Schlaeger,E,J.，和Christensen,K.，inCytotechnology30(1999)71-83禾口Schlaeger,E.-J.,inJ.Immunol.Methods194(1996)191-199描述。适于原核生物的对照序列例如包括启动子，优选地操纵基因序列，和核糖体结合部位。已知真核细胞利用启动子、增强子和多聚腺苷酸化信号。单克隆抗体适于通过常规的免疫球蛋白纯化方法如蛋白ASepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或者亲和层析从培养基分离。可以使用常规方法容易地分离编码单克隆抗体的DNA和RNA并测序。杂交瘤细胞可以用作此类DNA和RNA的来源。一旦分离，就可以将DNA插入到表达载体中，然后将表达载体转染到宿主细胞，如CHO细胞、HEK293细胞或者骨髓瘤细胞，否则所述宿主细胞不产生免疫球蛋白，以得到宿主细胞中重组单克隆抗体的合成。此外，根据本发明的抗体包括具有"保守序列修饰"的核苷酸和氨基酸序列修饰的抗体，所述修饰不影响或者改变根据本发明抗体的上述特征。可以通过本领域已知的标准技术如位点定向诱变和PCR介导的诱变引入修饰。保守氨基酸替代包括其中氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氮酸、甲硫氨酸)、具有卩分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在人抗-IL-13Ral抗体中预测的非必需氨基酸残基可以优选用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替代。可以基于Riechmann,L.,等人，Nature332(1988)323-327禾卩Queen,C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033描述的分子建模通过诱变进行氨基酸替代。通过向抗体DNA中引入合适的核苷酸改变或者通过肽合成制备人IL-13Ral抗体的氨基酸序列变体。然而，如上述，此类修饰仅可以在非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述抗体特征，如IgG同种型和表位结合，但是可以提高重组生产的产率、蛋白质稳定性或者方便纯化。不参与保持抗-IL-13Ral抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基也可以一般用丝氨酸替代，以提高分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反地，可以向抗体加入半胱氨酸键以提高它的稳定性(尤其当抗体是抗体片段，如Fv片段时)。抗体的另一类型的氨基酸变体改变抗体的最初糖基化模式。改变指缺失一个和多个在抗体中发现的糖类部分，和/或加入一个或多个不存在于该抗体中的糖基化位点。抗体的糖基化通常是N-连接的。N-连接的指糖类部分连接到天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺一X-丝氨酸和天冬酰胺一X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸之外的任一氨基酸)是糖类部分酶促连接到天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列的任一个的存在产生的潜在的糖基化位点。通过改变氨基酸序列使得它含有一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)，可以方便地完成糖基化位点向抗体的加入。通过本领域中已知的多种方法制备编码抗-IL-13Ral抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于，从天然来源(对于天然存在的氨基酸序列变体)分离或者通过寡核苷酸介导的(或者位点定向)诱变、PCR诱变和以前制备的抗-IL-13Ral抗体的变体或非变体形式的表达盒诱变来制备。另一类型的共价修饰涉及向抗体化学或者酶促偶联糖苷。这些方法是有利的，因为它们不需要在具有N-或者O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生抗体。取决于使用的偶联方式，糖可以连接到(a)精氨酸和组氨酸，(b)自由羧基，(C)自由巯基，如半胱氨酸的自由巯基，(d)自由羟基，如丝氨酸、苏氨酸或者羟脯氨酸的自由羟基，(e)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或者色氨酸的芳族残基，或者(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在WO87/05330,和在Aplin，J.D.,和Wriston,J.C.Jr.，CRCCrit.Rev.Biochem.(1981)259-306中描述。可以化学或者酶促地除去存在于抗体上的任何糖类部分。通过将抗体暴露于三氟代甲磺酸或者等同化合物可以完成化学去糖基化。该处理导致切割除了连接糖(N-乙酰基葡糖胺或者N-乙酰基半乳糖胺)之外的多数或者全部糖，而完整的留下抗体。化学去糖基化由Sojahr,H.T.,和Bahl,O.P.,Arch.Biochem.Biophys.259(1987)52-57和Edge,A.S.，等人Anal.Biochem.118(1981)131-137描述。通过使用如Thotakum,N.R.,和Bahl，O.R,Meth.Enzymol.138(1987)350-359描述的各种内切和外切糖苷酶可以实现抗体上糖类部分的酶促切割。抗体的另一类型的共价修饰包括以美国专利号4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337中给出的方法将抗体连接到多种非蛋白质聚合物之一，例如，聚乙二醇、聚丙二醇或者聚氧化烯。在另一方面，本发明提供了从转基因非人动物如转基因小鼠分离的B细胞，其表达根据本发明的人抗-IL-13Ral抗体。优选地，分离的B细胞从转基因非人动物如转基因小鼠得到，所述动物已经用IL-13Ral抗原的纯化或者富集的制备物和/或表达IL-13Ral的细胞免疫。优选地，所述转基因非人动物如转基因小鼠的基因组包含编码本发明的抗体的全部或者部分的人重链转基因和人轻链转基因。然后将分离的B细胞永生化以提供人抗IL-13Ral抗体的来源(例如，杂交瘤)。因此，本发明还提供了能够产生根据本发明的人单克隆抗体的杂交瘤。在一个实施方案中，杂交瘤包括从转基因非人动物如转基因小鼠得到的融合永生化细胞的B细胞，所述动物的基因组包含编码本发明的抗体的全部或者部分的人重链转基因和人轻链转基因。在具体实施方案中，转基因非人动物是转基因小鼠，其基因组包含编码本发明的抗体的全部或者部分的人重链转基因和人轻链转基因。该转基因非人动物可以用IL-13Ral抗原的纯化或者富集的制备物和/或表达IL-13Ral的细胞免疫。优选地，该转基因非人动物如转基因小鼠能够产生针对IL-13Ral的人单克隆抗体的IgGl同种型。通过用IL-13Ral抗原的纯化或者富集的制备物和/或表达IL-13Ral的细胞免疫转基因非人动物如转基因小鼠可以产生根据本发明的人单克隆抗体，所述动物的基因组包含编码本发明的抗体的全部或者部分的人重链转基因和人轻链转基因。然后得到动物的B细胞(例如，脾B细胞)并与骨髓瘤细胞融合形成分泌针对IL-13Ral的人单克隆抗体的永生的杂交瘤细胞。在优选实施方案中，使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠可以产生针对IL-13Ral的人单克隆抗体。这些转基因小鼠在本文中称作"HuMab"小鼠，含有人免疫球蛋白基因小基因座，其编码包括重链(p和Y)和K轻链(恒定区基因)的未重排的人免疫球蛋白基因，以及失活内源n和k链基因座的定向突变(Lonberg，N.,等人，Nature368(1994)856-859)。因此，小鼠显示出小鼠IgM或K的降低的表达，并且应答免疫，导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和性的人lgG单克隆抗体(Lonberg,N.，等人，Nature368(1994)856-859;Lonberg,N.，HandbookofExperimentalPharmacology113(1994)49-101;Lonberg,N.，禾口Huszar,D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93;禾卩Harding,F"和Lonberg,N.,Ann.N.Acad.Sci764(1995)536-546)中综述)。HuMab小鼠的制备在Taylor,L.，等人，NucleicAcidsResearch20(1992)6287-6295;Chen，J.,等人，InternationalImmunology5(1993)647-656;Tuaillon,N.,等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA90(1993)3720-3724;Choi，T.K.,等人，NatureGenetics4(1993)117-123;Chen,J.,等人，EMBOJ.12(1993)821-830;Tuaillon，N.,等人，Immunol,152(1994)2912-2920;Lonberg,N,,等人，Nature368(1994)856-859;Lonberg,N.，HandbookofExperimentalPharmacology113(1994)49-101;Taylor,L.,等人，Int.Immunol,6(1994)579-591;Lonberg,N.,andHuszar,D.,Intern.Rev,Immunol.25(1995)65-93;Harding,F.,禾口Lonberg,N.，Ann.N.Acad.Sci764(1995)536-546;Fishwild,D.M.,等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述，将这些文献的内容完整引入本文作为参考。另外见美国专利号5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,789,650;5,877,397;5，661，016;5,814,318;5,874,299;5,545,807;5,770,429;W098/24884;W094/25585;W093/1227;W092/22645;和WO92/03918。为了产生针对IL-13Rotl的完整人单克隆抗体，可以将HuMab小鼠用IL-13Ral抗原的纯化或者富集的制备物和/或表达IL-13Ral的细胞根据一般方法免疫，如Lonberg,N.,等人，Nature368(1994)856-859;Fishwild,D.M.,等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851和WO98/24884中描述。优选地，当第一次免疫时，小鼠将为6—16周龄。例如，可溶的IL-13Ral抗原的纯化或者富集的制备物(例如，从IL-13Ral表达细胞纯化)可以用于腹膜内免疫HuMab小鼠。对于使用IL-13Rotl抗原的纯化或者富集的制备物免疫不产生抗体的情况，也可以用表达IL-13Ral的细胞，例如用肿瘤细胞系免疫小鼠以促进免疫应答。用多种抗原积累的经验表明当最初用完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内(i.p.)免疫，接着每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原交替i.p.或者s.c.免疫(例如，长达共6周)时，HuMab转基因小鼠最佳地应答。可以在免疫方案的过程中用通过眶后取血得到的血浆样品监视免疫应答。可以通过ELISA筛选血浆，并且具有足够效价的抗IL-13Ral人免疫球蛋白的小鼠可以用于对应的B细胞的永生化。可以用抗原静脉内加强小鼠3到4天后处死并除去脾脏和淋巴结。预期可能需要进行每种抗原的2—3次融合。一些小鼠将用每种抗原免疫。例如，可以免疫HCo7和HCo12品种的共5到12只HuMab小鼠。HCo7小鼠在它们的内源轻链(k)基因中具有JKD破坏(如Chen,j.,等人，EMBOJ.12(1993)821-830中描述)，在它们的内源重链基因中具有CMD破坏(如WO01/14424的实施例1中描述)，KCo5人k轻链转基因(如Fishwild，D.M"等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述)，和HCo7人重链转基因(如美国专利号5,770,429中描述)。HCo12小鼠在它们的内源轻链(k)基因中具有JKD破坏(如Chen，J.,等人，EMBOJ.12(1993)821-830中描述)，它们的内源重链基因中的CMD破坏(如WO01/14424的实施例1中描述)，KCo5人K轻链转基因(如Fishwild,D.M.,等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述)，和HCo12人重链转基因(如WO01/14424的实施例2中描述)。可以分离小鼠淋巴细胞并使用PEG基于标准方法与小鼠骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤。然后对所得杂交瘤筛选抗原特异性抗体的产生。例如，将来自经免疫的小鼠的脾脏和淋巴结来源的淋巴细胞的单个细胞混悬液用50%PEG融合到1/6的数目的SP2/0非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1581)。将细胞以约2x105接种在平底微量滴定板中，然后在选择培养基中培养约2周。然后通过ELISA筛选个体细胞(well)的人抗IL-13Ral单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，就分析培养基，通常在10—14天后。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，并且如果仍然对于人IgG阳性，那么可以通过有限稀释将抗IL-13Ral单克隆抗体亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生用于表征的抗体。因为CDR序列负责抗体一抗原相互作用，所以可能通过构架表达载体表达根据本发明的重组抗体，所述表达载体包括来自不同的人抗体的构架序列上的根据本发明的CDR序列(见例如，Riechmann，L.，等人，Nature332(1998)323-327;Jones,P.,等人，Nature321(1986)522-525;禾卩Queen,C.,等人，Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86(1989)10029-10033)。此类构架序列可以来自包括种系人抗体基因序列的公共DNA数据库。这些种系序列将与成熟的抗体基因序列不同，因为它们将不包括完全装配的可变基因，其在B细胞成熟过程中通过V(D)J连接形成。种系基因序列还将在均匀跨越可变区的个体(individual)处不同于高亲和性次级全套抗体的序列。本发明优选包含编码结合IL-13Ral的多肽的核酸片段，其中所述多肽抑制IL-13与IL-13Ral的结合，所述多肽选自a)包含SEQIDNO:l、3、5、7或9的重链CDR的抗体重链；b)包含SEQIDNO:2、4、6、8或10的轻链CDR的抗体轻链。将重构的重链和轻链可变区与启动子、翻译起始、恒定区、3'非翻译区、多聚腺苷酸化和转录终止的序列组合以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可以组合到单个载体中，共转染、顺序转染或者单独转染到宿主细胞中，然后宿主细胞融合形成表达两条链的单个宿主细胞。因此，本发明提供了产生根据本发明的重组人抗体的方法，其包括表达核酸，该核酸编码a)包含SEQIDNO:l、3、5、7或9的重链CDR的抗体重链；b)包含SEQIDNO:2、4、6、8或10的轻链CDR的抗体轻链。本发明还包含根据本发明的抗体的用途，用于体外检测IL-13Ral，优选通过免疫学测定法检测，所述测定法测定样品的IL-13Ral和本发明抗体之间的结合。另一方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，其包含本发明的人单克隆抗体或者其抗原结合部分韵一种或组合，与药用载体一起配制。本文使用的"药用载体"包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，等等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或者输注)。"药用盐"指保留抗体的所希望的生物活性并且不赋予任何不希望的毒理学作用的盐(见，例如，Berge，S.M.，等人，J.Pharm.Sci.66(1977)1-19)。此类盐包括在本发明中。此类盐的实例包括酸式加成盐和碱式加成盐。酸式加成盐包括衍生自无毒的无机酸的盐，如盐酸盐。本发明的组合物可以通过本领域中已知的多种方法施用。如技术人员将理解的，施用途径和/或方式将取决于所希望的结果而变。为了通过一些施用途径施用本发明的化合物，必须用物质包衣该化合物或者与该化合物共同施用，以防止它的失活。例如，化合物可以在合适的载体如脂质体或者稀释剂中施用于受试者。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲液。药用载体包括无菌水溶液或者分散体和无菌粉剂，其用于当时(extemporaneous)制备无菌注射液或者分散体。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域中己知的。本文使用短语"肠胃外施用"和"肠胃外地施用"指不同于经肠和局部施用的施用方式，通常通过注射施用，并且包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、目匡内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上文的消毒步骤和通过包括多种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等确保预防微生物的存在。还希望在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等等。此外，通过包括延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶可以延长可注射的药物形式的吸收。不管所选的施用途径，通过本领域技术人员已知的常规方法将可以以合适的水合形式使用的本发明的化合物和/或将本发明的药物组合物配制成药用剂型。本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变以便得到一定量的活性成分，其对于具体患者、组合物和施用方式有效实现所希望的治疗应答而对患者没有毒性。所选的剂量水平将依赖于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本发明的具体组合物或者其酯、盐或者酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗史，和医学领域中公知的类似因素。组合物必须是无菌和流体的以至于组合物可通过注射器递送的程度。除了水，载体可以是等渗的缓冲盐水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇，等)和其合适的混合物。通过使用包衣如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持合适的流动性。在许多情况中，在组合物中优选包括等渗剂，如糖，多元醇，如甘露醇或山梨醇，和氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝或者明胶可以引起可注射组合物的长期吸收。提供下面的实施例、参考文献、序列表和附图帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附的权利要求书中给出。将理解可以在步骤中做出修改而不背离本发明的精神。序列表描述SEQIDNO:lSEQIDNO:2SEQIDNO:3SEQIDNO:4SEQIDNO:5SEQIDNO:6SEQIDNO:7SEQIDNO:8SEQIDNO:9SEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12HuMabLC5002-002的重链可变结构域HuMabLC5002-002的轻链可变结构域HuMabLC5002-003的重链可变结构域HuMabLC5002-003的轻链可变结构域HuMabLC5002-005的重链可变结构域HuMabLC5002-005的轻链可变结构域HuMabLC5002-007的重链可变结构域HuMabLC5002-007的轻链可变结构域HuMabLC5002-018的重链可变结构域HuMabLC5002-018的轻链可变结构域K轻链恒定区yi重链恒定区附图描述图1显示了抗-IL-13Ral抗体与固定的重组人IL-13Ral多肽的结合。包括多克隆兔抗人IL-13Ral抗体AF152(R&Dsystems)和抗-KLH作为阴性对照HuMab。图2显示了通过抗-IL-13Ral抗体对IL-13与固定的IL-13Ral/IL-4Ra受体结合的抑制。图3显示了通过抗-IL-13Ral抗体对IL-13与CHO细胞(表达IL-13Ral和IL-4Ra2)结合的阻断。作为阳性对照，包括通过商业途径可获得的抗-IL-13Ral抗体(AF152，R&DSystems,Minneapolis,MN)。图4显示了抗-IL-13Ral抗体与hlL-13Ral的结合和与功能上相关的受体hlL-13Ra2和hlL-4Ra的结合性质。图5显示了抗-IL-13Ral抗体能够结合固定的重组鼠IL-13Ral多肽。包括多克隆山羊抗人IL-13Ral抗体AF152(R&DSystems)和抗KLH作为阴性对照HuMab。实施例实施例1杂交瘤的产生通过用表达人IL-13Ral的细胞免疫转基因非人动物，例如转基因小鼠可以产生根据本发明的人单克隆抗体，所述动物的基因组包含编码本发明抗体的所有或者部分的人重链转基因和人轻链转基因。然后得到动物的B细胞(例如，脾B细胞)并与骨髓瘤细胞融合形成永生化的杂交瘤细胞，其分泌针对IL-13Rctl的人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠可以产生针对人IL-13Ral的人单克隆抗体。这些转基因小鼠在本文中称作"HuMab"小鼠，含有人免疫球蛋白基因小基因座，其编码包括重(p和y)和k(kappa)轻链(恒定区基因)的未重排的人免疫球蛋白基因，以及失活内源p和k链基因座的耙定的突变(LonbergN.,等人，Nature368(1994)856-859)。因此，小鼠显示出小鼠IgM或者k的降低的表达，并且应答免疫，所引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和性人IgG单克隆抗体。为了产生针对人IL-13Ral的完全人单克隆抗体，可以用表达人IL-13Ral的细胞根据如Lonberg，N.，等人，Nature368(1994)856-859;Fishwild,D.M.,等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851和WO98/24884描述的一般方法免疫HuMab小鼠。优选地，当首次免疫时，小鼠将是6—16周龄。例如，可以用IL-13Ral转染的细胞腹膜内免疫HuMab小鼠。可以在免疫方案过程中用通过眶后取血得到的血浆样品监视免疫应答。可以通过ELISA和/或FACS筛选血浆。具有足够效价的抗人IL-13Ral人免疫球蛋白的小鼠可以用于永生化对应的B细胞。可以用抗原静脉内加强小鼠，3到4天后处死并除去脾脏和淋巴结。例如，可以免疫HCo7或HCol2品种的HuMab小鼠。HCo7小鼠在它们的内源轻链(k)基因中具有JKD破坏(如Chen等人(1993)EMBOJ.12:821-830中描述)，它们的内源重链基因中的CMD破坏(如WO01/14424的实施例1中描述)，KCo5人k轻链转基因(如Fishwild,D.M.，等人(1996)NatureBiotechnology14:845-851中描述)，和HCo7人重链转基因(如US5，770，429中描述)。HCo12小鼠在它们的内源轻链(K)基因中具有JKD破坏(如Chen,J.,等人，EMBOJ.12(1993)821-830中描述)，它们的内源重链基因中的CMD破坏(WO01/14424的实施例1中描述)、KCo5人K轻链转基因(如Fishwild，D.M.,等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述)，和HCo12人重链转基因(如WO01/14424的实施例2中描述)。可以分离小鼠淋巴细胞并且使用PEG基于标准方案与小鼠骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤。然后对所得杂交瘤筛选抗原特异性抗体的产生。例如，将来自经免疫的小鼠的脾脏和淋巴结来源的淋巴细胞的单个细胞混悬液用50%PEG融合到SP2/0非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC,CRL1581)。将细胞以约0.75x107接种在平底微量滴定板中，然后在选择培养基中培养约2周。然后通过ELISA和/或FACS筛选个体细胞(wells)的人抗IL-13Ral单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，并且如果仍然对于人IgG阳性，那么可以通过有限稀释将抗IL-13Rctl单克隆抗体亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生用于表征的抗体。转基因小鼠的免疫程序将三只HCo7小鼠(3只雄性)，品种GG2201(Medarex,SanJose,CA，USA),和2只HCo12小鼠(l只雄性和1只雌性)，品种GG2198(Medarex，SanJose,CA,USA)用1x106个HEK293细胞免疫，用IL-13Ral的表达载体转染。在尾根部交替腹膜内(i.p.)和皮下(s.c.)总共给予8次免疫。对于第一次免疫，将100pi1x106HEK293:IL-13Ral细胞与100^完全弗氏佐剂(CFA;DifcoLaboratories,Detroit,USA)混合。对于所有其他免疫，将PBS中的100pi细胞与100pi不完全弗氏佐剂(ICFA;Difco)混合。小鼠的加强当发现抗IL-13Ral的血清效价足够时，在融合前4天和3天，将小鼠额外用200^PBS中的1xlO6HEK293:IL曙13Ral细胞静脉内(i,v,)加强两次。实施例2通过ELISA测试HuMab与固定化的IL-13Ral的结合为了确定本发明的抗体结合重组IL-13Ral的能力，将IL-13Ral(R&DSystems,UK)的细胞外结构域溶解在PBS(1吗/ml)中并通过在4°C过夜温育允许吸附到微量滴定板(NUNCMaxisorb)。用洗涤缓冲液(WB=0.9%NaCl;0.1%Tween20)洗涤平板后，通过加入100pl温育缓冲液(IB=PBS与1。/。croteinC和0.1%Tween20)并在室温(RT)温育30分钟，封闭非特异性结合位点。然后加入连续稀释的HuMab和对照抗体(100pl/孔，在IB中稀释)并在RT温育1小时。再次洗涤平板，通过与以IB中1:500的最终稀释度的过氧化物酶缀合的兔抗人k(DAKO,Denmark)温育来检测结合的人抗体。用过氧化物酶缀合的多克隆猴抗山羊IgG(SantaCruz;用IB以1:1000稀释)检测多克隆山羊抗hlL-13Ral抗体。在RT温育1小时和随后的洗涤步骤后，在室温下黑暗中用随时可用的ABTS溶液(RocheDiagnosticsGmbH)显影平板。最高浓度的吸光度达到足够的OD后在405nm测量吸光度。所有测试的针对IL-13Ralphal的抗体都能够结合人IL-13Ral的固定化的细胞外结构域。对于测试的多种LC抗体，测定的EC50值为0.5-2nM的范围内。阴性对照HuMab抗-KLH不结合IL-13Ral的固定的细胞外结构域。包括作为阳性对照的多克隆山羊抗人IL-13Ral抗体也有效结合IL画13Ral的固定的细胞外结构域(图1)。实施例3IL-13与IL-13Ral/IL-4Ra异源二聚体结合的抑制(ELISA)将微量滴定板用PBS中3pg/ml的100^hlL-13Ral:hFc嵌合蛋白(R&DSystems,UK)在振荡器上4。C过夜温育。用WB洗涤平板后，加入连续稀释的HuMab和对照抗体(100|il/孔；IB中稀释液)并在RT温育30分钟。再次洗涤平板，然后加入IL-13(R&DSystems,UK;0.5|ig/ml;用IB稀释)和IL-4Ra(R&DSystems,UK;0.75pg/ml;用IB稀释)的混合液并在RT温育1小时。洗漆平板后，加入浓度为0.4|ig/ml的100jal生物素化的抗IL-13抗体(BAF213;R&DSystems,UK)并在RT温育1小时。洗涤平板后，通过用IB稀释1:5000的过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白(RocheDiagnosticsGmbH,DE)检测结合的IL-13(RT下温育1小时)。最后，洗涤平板并在黑暗中室温(RT)下用随时可用的ABTS溶液(RocheDiagnosticsGmbH,DE)显影平板。45到60分钟后测量在405nm处的吸光度。抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018能够抑制IL-13与异源二聚体受体的结合，最大抑制值为约50°%到80-85%。阳性对照为AF152(多克隆兔抗体)。如所预期的，阴性对照抗-KLH不抑制IL-13与异源二聚体受体的结合。对于LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018得到的ICso值为1.5nM至lJ10.1nM(图2)。实施例4放射配体结合测定用结合缓冲液(25mMHEPES，150mMNaCl，1mMCaCl2，5mMMgCl2，禾卩0.5%牛血清白蛋白，调节到pH7.2)中表达人IL-13Ral和人IL-4Ra的CHO细胞进行125I-IL-13结合测定。将每孔lxl()S个细胞与抗体混合并预温育15分钟到1小时。加入.lnM125I-IL-13，并将混合物在4°C温育4小时。从饱和结合分析、竞争性分析和确定输入125I-IL-13达到与细胞系的平衡结合来测定用于测定法中125I-IL-13的浓度。在用1%PEI/0.5%BSA预处理的GF/C滤板上收获样品并在PackardTopCount闪烁计数器上计数。用PRISM使用非线性回归曲线拟合进行数据分析(GraphPadSoftware,SanDiego,CA)。所有测试的针对IL-13Ralphal的抗体都阻断标记的IL-13与IL-13Ral/IL-4Ra复合体的结合。对于抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018计算的IC5o值在0.09nM到0.32nM之间，对于AF152为84.8nM(图3)。通过HuMab抑制人B细胞和单核细胞上IL-13诱导的CD23上调通过菲可帕克密度梯度分离外周血单核细胞(PBMC)。用RPMI洗涤细胞后，将它们重悬浮在RPMI/10%FCS中并以3xl05PBMC/孔(体积50pl)分布在96孔平底微量滴定板(ComingIncorporatedCostar)中。然后，加入RPMI/10%FCS中终浓度为0.5|ig/ml的25pi抗人CD40抗体(Immunotech)和RPMI/10%FCS中终浓度为10pg/ml的25pi抗人IgA+IgG+IgM抗体(Immunoresearch)。然后，加入连续稀释的HuMab和对照抗体(50nl/孔；用RPMI/10%FCS稀释)，并将细胞在培养箱(37。C;5%C02)中培养30分钟。然后加入终浓度为0.67ng/ml的重组人IL-13(R&DSystems)(50iul/孔)并在37°C/5%C02培养细胞72小时。该培养后，离心平板并吸取培养基。为了贴壁细胞的脱附，加入200^Accutase(PAA)并将细胞在37°C;5%C02下温育约5分钟。通过反复冲洗来脱附细胞并将其转移到圆底平板中。离心并抽出上清液后，将细胞与200pi抗画CD23-PE、抗-CD20-FITC和抗一CD14-APC(都来自BDBiosciencesPharmingen,SanDiego,CA)的混合物温育。将细胞在4°C温育30分钟，然后离心并抽出上清液。将该洗涤步骤重复一次，最后将细胞重悬浮在200piPBS/0.1。/。人血清白蛋白中并使用CellQuest软件在FACSCalibur流式细胞仪(BDBiosciencesPharmingen,SanDiego，CA)中分析。在多数情况中，获得10000个事件并在光散射栅(gate)上选通(gate)以仅仅包括活的淋巴细胞和单核细胞。将细胞在B淋巴细胞的CD19阳性簇或者单核细胞的CD14阳性簇上预选通(pregate)并进一步分析CD23表达。对B淋巴细胞上CD23上调的抑制观察到的ICso值对于抗体LC5002-002、LC5002-图、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018为0.5nM到>70nM，对于AF152为13.6nM。对于人单核细胞上IL-13诱导的CD23上调的抑制发现了类似图谱。在单核细胞上，对于抗体LC5002-002、LC5002画003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018的IC5o值为0.1nM到62.8nM，对于AF152为62.9nM。实施例6应答作为刺激物的IL-13或者IL-4的TF-1增殖测定TF-1细胞(ATCC#CRL2003)生长在含有ATCC改良的RPMI,10%FBS，1X青霉素/链霉素,2ng/mlGM-CSF的培养基中。在测定前一天，将细胞在无GM-CSF的培养基中保持。将每孔5x103个细胞与合适浓度的抗一IL-13Ral抗体在37。C温育1小时。然后，细胞用2ng/ml人IL-13(R&DSystems,Minneapolis,MN)或者0.1ng/ml人IL-4(R&DSystems,Minneapolis,MN)刺激并在37'C温育48小时。将细胞用0.5^Ci31-胸苷脉冲并在37。C温育16—18小时。用PerkinElmerFiltermate96收获器收获样品到用1%PEI/0.25%BSA预处理的GFC平板上。在PerkinElmerTopcountScintillation计数器上对GFC平板计数。用非线性回归曲线拟合在PRISM中进行数据分析(GraphPadSoftware,SanDiego,CA)。抗一KLH抗体在该测定中没有显示出任何抑制。对于LC5002-007也是这样。所有其他抗体都抑制该应答，即使LC5002-007比其他抗体以更高的IC值抑制该应答。对不同抗体观察到的ICs。值AF152为13.50nM，LC5002-002为9.21nM，LC5002-003为3.07nM禾口LC5002-005为0.39nM。对于IL-4诱导的TF-1细胞增殖观察到类似的图谱，然而，抗体的效力与IL-13诱导的应答相比降低。IL-4诱导的增殖的ICso值抗-IL4R抗体为0.02nM，AF152为74.37nM，对于抗体LC5002画002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018在4.68nM到60nM之间。实施例7通过人肺成纤维细胞对应答IL-13的嗜曙红粒细胞趋化因子(eotaxin)的产生的抑制该测定用HFL-1细胞(人肺成纤维细胞，ATCC弁CCL-153)进行。将细胞以每孔100,000个细胞的密度接种在12孔板中并在37'C培养72小时以达到汇合。然后将细胞在无血清的培养基中饥饿24小时并用抗-IL-13Ral抗体在37t:处理1小时。该处理后，用10ng/mlIL-13(R&DSystems,Minneapolis,MN)在37。C刺激细胞48小时。收集上清液并使用从R&DSystems(Cat.No.DTX00)可购买的ELISA进行嗜曙红粒细胞趋化因子测定。用Spectromax微量板读数仪读数吸光度，并利用PRISM(GraphPadSoftware,SanDiego,CA)分析数据。测试的抗体显示出抑制嗜曙红粒细胞趋化因子释放的不同的能力。除了LC5002-007之外，所有测试的其它抗体都显示出一定的抑制。来自3到4次不同的实验的计算的平均ICso值对于AF152为11.5nM，对于抗体LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007和LC5002-018在2.45nM至lj19.8nM之间。实施例8人支气管平滑肌细胞中IL-13诱导的Stat-6磷酸化的抑制按照生产商的使用说明书培养人支气管平滑肌细胞(BSMC;Clonetics,Cat.NoCC-2576)。将细胞在12孔组织培养板中生长直到它们达到汇合。将细胞在无血清的培养基中饥饿24小时并加入不同量的抗体。将平板温育1小时然后用2.5ng/mlIL-13(R&DSystem)刺激。温育15分钟后，除去上清液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞并加入100nl裂解缓冲液。混合物在冰水快速超声处理并离心。裂解物用于磷酸化的Stat-6的蛋白质印迹检测。将等量的蛋白质装入SDS-凝胶，电泳并转移到膜。使用来自SantaCruzBiotechnology的抗Stat-6抗体(Cat.No.St-11762R)和偶联到过氧化物酶的二级抗体。用Amersham的ECLPlusSystem(CatNoRPN2132)进行检测。在Typhoon9400Imager中进行定量。在该测定中测试的两种HuMabs(LC50002-003和LC5002-005)都抑制IL-13诱导的Stat-6磷酸化。在该测定中发现的效力类似于其他功能测定。计算的ICso值为AF152为18.64nM，LC5002-003为5.98nM，和LC5002-005为1.18nM。实施例9抗hlL-13RalHuMab可变区结构域(k轻链和Yl重链)的克隆和序列分析通过标准cDNA合成/PCR程序分离编码抗hIL-13RalHuMab的轻链可变区VL和重链可变区Vh的核昔酸序列。用GeneRacerTM试剂盒(Invitrogen)从lx106-lxl()7个杂交瘤细胞制备总RNA。来自杂交瘤的RNA用作第一链cDNA合成和GeneRacerTM0iig0_dT引物连接的模板。分别用与k轻链和Yl-重链恒定区的核苷酸序列互补的反向轻链和重链引物和5，特异性GeneRacerTM引物进行第二链cDNA合成和编码Vl和Vh的cDNA片段的进一步PCR扩增。用来自InvitrogenLifeTechnologies的TOPOTA克隆试剂盒和pCR4-TOPOTM作为克隆载体克隆PCR产物。通过使用EcoRI消化对合适质粒的限制性作图鉴定克隆的PCR产物，Vl和Vh的预期的/计算的DNA片段大小分别为740bp和790bp。通过双链测序测定克隆的PCR片段的DNA序列。GCG(GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin)软件包10.2和Vector-NTI8(InforMax,Inc)用于一般的数据处理。用GCG模块CLUSTALW比对DNA和蛋白质序歹U。用程序GENEDOC(版本2.1)进行序列比对。实施例10构建抗hlL-13RalIgGlHuMab的表达质粒将抗hIL-13RalHuMab轻链和重链编码基因分别装配在哺乳动物细胞表达载体中。由此，将编码抗hlL-13RalHuMab轻链可变区(VO和人k轻链恒定区(CbSEQIDNO:ll)的基因区段与抗hIL-13RalHuMab重链可変区(Vh)和人Yl-重链恒定区(ch广铰链-ch2-ch3，SEQIDNO:12)的基因片段一样连接。关于给予密码子选择的人轻链和重链的核苷酸序列的一般信息见Kabat，E.A"Wu,T.T"Perry,H.M.,Gottesman,K,S"andFoeller,C.,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEd.，NIHPublicationNo.91-3242。抗hlL-13RalHuMabk轻链的转录单位由下面的元件组成来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，包括Kozak序列的合成的5'-UT，包括信号序列内含子的鼠免疫球蛋白重链信号序列，克隆的抗hlL-13RalHuMab可变轻链cDNA，在5，末端排列唯一的Bsml限制性位点，在3'末端是剪接供体位点和唯一的Notl限制性位点，基因组人k-基因恒定区，包括内含子2小鼠Ig-k增强子[Picard,D.,禾卩Schaffner，W.,Nature307(1984)80-82]和人免疫球蛋白k-多聚腺苷酸化("polyA")信号序列。抗hlL-13RalHuMabyl重链的转录单位由下面的元件组成-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，包括Kozak序列的合成的5'-UT，包括信号序列内含子的经修饰的鼠免疫球蛋白重链信号序列，克隆的抗WL-13Ral-HuMab可变重链cDNA，在5'末端排列唯一的Bsml限制性位点，在3'末端是剪接供体位点和唯一的Notl限制性位点，基因组人，重链基因恒定区，包括小鼠Igp增强子(Neuberger,M.S.,EMBOJ.2(1983)1373-1378)，人Yl免疫球蛋白多聚腺苷酸化("polyA")信号序列。抗hlL-13RalHuMabk轻链和^重链表达质粒的功能元件除了抗hlL-13RalHuMabk-轻链或者yl重链表达盒外，这些质粒还含有潮霉素抗性基因EB病毒(EBV)的复制起点oriP来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，和卩内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。实施例11突变的(变体)抗hlL-13RalIgGl的表达质粒的构建编码突变的抗hlL-13RalYl-重链的表达质粒可以通过野生型表达质粒的位点定向诱变使用QuickChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)产生并且在表l中描述。根据EU编号[Edelman,G.M.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85;Kabat，E.A.，Wu,T.T.,Perry,H.M.，Gottesman，K.S.,禾口Foeller，C.，(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEd.,NIHPublicationNo.91-3242]对氨基酸编号。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实施例12重组抗ML-13RalHuMab的产生通过在补充10%ultra-lowIgGFCS(Gibco)，2mM谷氨酰胺(Gibco),1%v/v非必需氨基酸(Gibco)和250|ig/mlG418(RocheDiagnosticsGmbH,DE)的DMEM(Gibco)中瞬时转染贴壁的HEK293-EBNA细胞(ATTCCRL-10852)产生重组HuMabs。对于转染FugeneTM6(RocheDiagnosticsGmbH,DE)，以3:1到6:1的试剂(^)与DNA(ng)的比例使用转染试剂。使用1:2到2:1的轻链与重链编码质粒的摩尔比，从两种不同的质粒表达免疫球蛋白轻链和重链。在转染后第4到11天收获含有HuMab的细胞培养上清液。关于人抗体在例如HEK293中的重组表达的一般信息在Meissner,P.,等人，BiotechnolBioeng75(2001)197-203中给出。实施例13a)使用嵌合hlL-13Ral:hFc对HuMabsLC5002-003、-005和-007的亲和分析Biacore3000仪器用于相互作用分析。作为运行和反应缓冲液，使用25。C的HBS-P(10mMHEPES,150mMNaCl，0.005%polysurfactantP，pH7.4)。捕获分子(山羊抗人-IgG，FcY特异的)以20pg/ml的浓度5pl/min的流速进行胺偶联20分钟。以1pg/ml的浓度10pl/min的流速注射HuMabsl分钟。通过注射500nM和30iid/min的人Y球蛋白3分钟实现游离的山羊抗人IgQFCy的封闭。将分析物(hlL-13Ral:hFc嵌合蛋白)以5.63nM到90nM之间的5个浓度注射两分钟并用HBS-P洗涤5分钟。通过两次注射100mMHCl，每次1分钟，完成表面的再生。芯片、测定形式和注射的顺序和动力学数据对应于表2中的描述。从样品曲线扣除阴性对照数据(例如，缓冲液曲线)用于校正系统内在基线漂移和减小噪声信号。用BiaEvaluation版本4.01分析传感图(sensorgram)禾卩计算亲和性数据。通过将动力学数据拟合1:1Langmuir结合模型计算动力学数据(表2)。表2:使用hlL-13Ral:hFc对HuMabs的亲和性分析。基于1:1Langmuir结合模型的数据分析<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>b)使用从hlL-13Ral:hFc嵌合蛋白切割的ML-13Ral的细胞外结构域对HuMabsLC5002-003、-005和-007的亲和性分析Biacore3000仪器用于相互作用分析。运行和反应缓冲液为25。C的HBS-P(10mMHEPES，150mMNaCl,0.005%polysurfactantP,pH7.4)。捕获抗体分子(抗hFqO以100吗/ml的浓度5pl/min的流速进行胺偶联20分钟。以10吗/ml的浓度和10)il/min的流速注射HuMabs30秒。以1.56nM到100nM之间的七种浓度注射切割的hlL-13Ral分子(Mw40kDa)200秒并用HBS-P洗涤5分钟。通过以10|ig/ml的流速两次注射100mMHCl，每次1分钟，完成表面的再生。芯片、测定形式和注射的顺序和动力学数据对应于下面表3中的描述。通过将动力学数据拟合1:1Langmuir结合模型计算动力学数据。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>c)使用从WL-13Ral:hFc嵌合蛋白切割的hlL-13Ral的细胞外结构域对LC5002-005的重组变体的比较亲和分析在这些实验中，将来自杂交瘤的最初的IgGl的亲和性与重组变体IgGl-Ala-Ala的亲和性比较。对于相互作用分析，使用Biacore3000仪器。运行和反应缓冲液为25°C的HBS-P(10mMHEPES，150mMNaCl,0.005%polysurfactantP,pH7.4)。捕获抗体分子(抗Fcy)以20吗/ml的浓度5pl/min的流速进行胺偶联20分钟。以10pg/ml的浓度和10pl/min的流速注射HuMabs。以1.56nM到200nM之间的八种浓度注射切割的hlL-13Ral分子(分析物)5分钟并用HBS-P洗涤5分钟。通过两次注射100mMHC1，每次1分钟，完成表面的再生。芯片、测定形式和注射的顺序和动力学数据对应于表4中的描述。通过将动力学数据拟合二价分析物结合模型计算动力学数据。表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>实施例14通过ELISA测试HuMab与hlL-13Ra2和ML-4Ra的交叉反应性将嵌合蛋白hlL-13Ra2:hFc和hlL-4Ra:hFc(R&DSystems,UK)溶解在PBS(1pg/ml)中并通过在4°C过夜温育允许吸附到微量滴定板(NUNCMaxisorb)。用洗涤缓冲液(WB=0.9%NaCl;0.1%Tween20)洗涤平板后，通过加入100pl温育缓冲液(IB=含有1%croteinC和0.1%Tween20的PBS)并在室温(RT)温育30分钟封闭非特异性结合位点。然后加入连续稀释的HuMab和对照抗体(IOOpl/UIB中稀释液)并在RT温育1小时。再次洗涤平板并通过用IB中1:500的最终稀释度的过氧化物酶缀合的兔抗人k(DAKO，Denmark)温育检测结合的抗体。在RT温育1小时和随后的洗涤步骤后，平板在黑暗中RT下用现成可用的ABTS溶液(RocheDiagnosticsGmbH,DE)显色。最高浓度的吸光度达到足够的OD后在405nm测量吸光度。测试的所有针对IL-13Ralphal的抗体都能够结合人IL-13Ral的固定化的细胞外结构域，但是不结合hlL-13Ra2或hlL-4Rcx(图4)。实施例15HuMab与鼠IL-13Ral的交叉反应性将嵌合的蛋白质鼠IL-13Ral:hFc(R&DSystems,UK)溶解在PBS(1Itig/ml)中并通过在4°C过夜温育允许吸附到微量滴定板(NUNCMaxisorb)。用洗涤缓冲液(WB=0.9%NaCl;0.1%Tween20)洗涤平板后，通过加入100pl温育缓冲液(IB=含有1%croteinC和0.1%Tween20的PBS)并在室温(RT)温育30分钟封闭非特异性结合位点。然后向孔中加入连续稀释的HuMab和对照抗体(HuMab抗-KLH和多克隆山羊抗-hlL-13Rotl(R&DSystems))(100ial/孔，在IB中的稀释液)并在RT温育1小时。再次洗涤平板，并通过与在IB中1:500的最终稀释度的过氧化物酶缀合的兔抗人k(DAKO,Denmark)温育来检测结合的人抗体。通过过氧化物酶缀合的猴抗山羊IgG((SantaCruz;IB中1:1000)检测与平板结合的山羊抗hlL-13Rcd抗体。在室温温育1小时和随后的洗涤步骤后，平板在黑暗中RT下用现成可用的ABTS溶液(RocheDiagnosticsGmbH，DE)显色。最高浓度的吸光度达到足够的OD后在405nm测量吸光度(图5)。实施例16HuMab与猕猴IL-13Ral的交叉反应性通过RT-PCR从猕猴组织分离编码IL-13Ral的基因并转染到鼠细胞系Ba/F3中。为了测试HuMabs是否与猕猴IL-13Ral交叉反应，将稳定转染的Ba/F3细胞以及亲本Ba/F3细胞与10|iig/mlHuMab和对照抗体温育。使用多克隆的山羊抗hlL-13Ral(R&DSystems)作为阳性对照。包括的阴性对照为人IgGl骨髓瘤蛋白(Nordic)和正常山羊血清。使用针对缀合到FITC用于检测HuMabs的人IgG的抗体和针对缀合到FITC用于检测山羊抗体的针对山羊IgG的抗体通过FACS分析检测结合的抗体。对在转染的Ba/F3系和亲本系上测试的各抗体比较平均荧光强度(MFI)。本发明的所有HuMabs都能够结合在转染的Ba/F3细胞中表达的猕猴IL-13Rctl。如从人和猕猴IL-13Ral之间的密切同源性预测的，多克隆的AF152抗体也结合猕猴IL-13Ral。阴性对照当用转染的Ba/F3细胞系测试时仅显示出MFI的可忽略不计(marginal)的增加(表5)。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>实施例17IL-13RalHuMabs对Fcry受体的结合(NK细胞上FcyRIIIa的结合)为了测试本发明的抗体结合自然杀伤(NK)细胞上FcyRIIIa的能力，分离外周血单核细胞(PBMCs)并在20ng/ml针对FcyRIIIa的封闭性鼠抗体(抗-CD16,克隆3G8，RDI,Flanders,NJ)的存在或不存在下与20吗/mlHuMab抗体和对照抗体温育，以验证通过FqRIIIa的结合。使用不结合FcyRIIIa的人IgG2和IgG4(TheBindingSite)作为阴性对照。将人IgGl和IgG3(TheBindingSite)作为用于FcyRIIIa结合的阳性对照。使用PE标记的小鼠抗人CD56(NK细胞表面标记)抗体(BDBiosciencesPharmingen,SanDiego,CA)组合以FITC-标记的山羊F(ab)2抗人IgG(Fc)抗体(Protosimmimoresearch,Burlingame,CA)通过FACS分析检测NK细胞上结合的抗体。确定20ng/ml(Bmax:MFI士标准误差)HuMab下的最大结合。如通过580.6±245.8的Bmax(MFI)值所示的，LC5002-005能够有效结合FqRIIIaI(与对照IgGl抗体相当)。加入针对FcyRIIIa的封闭抗体显著减小LC5002-005与NK细胞的结合(260.4±95.90的Bmax(MFI)值)，表明对FcYRIIIa的特异结合。参考文献列表Aikawa，M.，等人，Cytokine13(2001)75-84Aplin，J.D.,andWriston,J.C.Jr.,CRCCrit,Rev.Biochem.(1981)259-306Ausubel,F.,等人，ed.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)Barnes,L.M.,等人，Cytotechnology32(2000)109-123Barnes,L.M.，等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270Berge,S.M.，等人，J.Pharm.Sci.66(1977)1-19Boerner，P.，等人，J.Immunol.147(1991)86-95Bruegg隱nnM.，等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361Bruggemann,M.,等人，YearImmunol.7(1993)33-40Brunhouse,R.，andCebra，J丄，Mol.Immunol.16(1979)907-917Burton,D.R.,等人，Nature288(1980)338-344Carter,P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289Chen,J.，等人，InternationalImmunology5(1993)647-656Chen,J.，等人，EMBOJ.12(1993)821-830Choi,T.K.,等人，NatureGenetics4(1993)117-123Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss(1985)p.77Durocher,Y.,等人，Nicl.Acids.Res.30(2002)E9Edelman，G.M.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85Edge,A.S.,等人，Anal.Biochem.118(1981)131-137EP0307434Fishwild,D.M.,等人，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851Geisse,S.,等人，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282Graber,P.,等人，Eur.J,Immunol.28(1998)4286-4298Harding,F.，andLonberg,N.，Ann.N.Acad.Sci764(1995)536-546Hezareh,M,,等人，J.Virol.75(2001)12161-12168Hoogenboom,H.R.,andWinter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388Idusogie,E.E.,等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184Jakobovits,A.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555Jakobovits,A.，等人，Nature362(1993)255-258Jones,P.，等人，Nature321(1986)522-525Kabat,E.A.,等人,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEd.,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD,(1991)，NIHPublicationNo.91-3242Kaufman,R丄，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161Lonberg,N.,等人，Nature368(1994)856-859Lonberg,N.,HandbookofExperimentalPharmacology113(1994)49-101Lonberg,N.,andHuszar，D.,Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93Love,T.W.,等人，MethodsEnzymol.178(1989)515-527Lukas,T丄，等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560Makrides，S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202Marks,J.D.，等人，J.Mol.Biol.222(1991)581-597Meissner,P.,等人，BiotechnolBioeng75(2001)197-203Morgan,A.，等人，Immunology86(1995)319-324Morrison,S丄.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855Neuberger,M.S.,EMBOJ.2(1983)1373-1378Norderhaug,L.,等人，J.Immunol.Methods204(1997)77-87Obiri,N丄，etal,J.Biol.Chem.270(1995)8797-8804Orlandi，R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837Picard,D.,andSchaffner，W.,Nature307(1984)80-82Poudrier,J.,等人，J.Immunol.30(2000)3157-3164PoudrierJ.,等人，J.Immunol.,163(1999)1153-1161Queen,C"等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033Riechmann,L.,等人，Nature332(1988)323-327Schlaeger，E,J.，andChristensen,K.,Cytotechnology30(1999)71-83Schlaeger,E.-J,，J.Immunol.Methods194(1996)191-199Sojahr，H.T.，andBahl,O,P.，Arch.Biochem.Biophys.259(1987)52-57SwissProtNo.O0%30SwissProtNo.P24394SwissProtNo.P35225SwissProtNo.P78552SwissProtNo.Q14627Taylor,L.,等人，NucleicAcidsResearch20(1992)6287-6295Taylor,L"等人，Int.Immunol.6(1994)579-591Thommesen,J.E.,等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004Thotakura,N.R.,andBahl,O.P.，Meth.Enzymol.138(1987)350-359Tuaillon,N.,等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA90(1993)3720-3724Tuaillon,N.,等人，Immunol.152(1994)2912-2920美国专利号4,640,835美国专利号4,496,689美国专利号4,301,144美国专利号4，670，417美国专利号4,791,192美国专利号4,179,337美国专利号5,202,238美国专利号5,204,244美国专利号5,545,806美国专利号5,545,807美国专利号5,569,825美国专利号5,625,126美国专利号5,633,425美国专利号5,661,016美国专利号5，770，429美国专利号5,789,650美国专利号5，814，318美国专利号5，874，299美国专利号5,877,397vanDijk,M.A.,andvandeWinkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol5(2001)368-374Werner,R.G.，DrugRes.48(1998)870-880WO,5330WO92/22645WO92/03918WO93/1227WO94/25585WO96/29417WO97/15663WO98/24884WO01/14424WO03/08067权利要求1.抗体，其特征是所述抗体的可变重链氨基酸序列CDR3选自由SEQIDNO1、3、5、7或9的重链CDR3序列组成的组。2.根据权利要求1的抗体，其特征是所述抗体的可变重链氨基酸序列CDR1和CDR2选自由SEQIDNO:1、3、5、7或9的重链CDR1和CDR2序列组成的组。3.根据权利要求1或2的抗体，其特征是所述抗体的可变轻链氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3选自由SEQIDNO:2、4、6、8或10的可变轻链氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3组成的组。4.根据权利要求1到3的抗体，其特征是包含人Yl-重链，该Yl-重链包含a)氨基酸序列Pro233Val234Ala235，其缺失Gly236，和/或氨基酸序列Gly327Leu328Pro329Ser330Ser331，b)氨基酸序列Ala234Ala235或c)氨基酸Ala加和Ala297。5.根据权利要求1到4的抗体，其特征是它是人抗体。6.根据权利要求1到5的抗体，其特征是它对IL-13Ral的结合亲和力为IO-9M(Kd)或更小，优选10-9到l(T13M。7.根据权利要求1到6的抗体，其从杂交瘤细胞系DSMACC2709、DSMACC2710、DSMACC2711或DSMACC2712获得。8.根据权利要求1到7的抗体，其特征是包含作为重链可变区的SEQIDNO:1和作为轻链可变区的SEQIDNO:2，作为重链可变区的SEQIDNO:3和作为轻链可变区的SEQIDNO:4，作为重链可变区的SEQIDNO:5和作为轻链可变区的SEQIDNO:6，作为重链可变区的SEQIDNO:7和作为轻链可变区的SEQIDNO:8,或作为重链可变区的SEQIDNO:9和作为轻链可变区的SEQIDNO:IO。9.根据权利要求1到6的抗体，其特征是包含a)作为重链可变区的SEQIDNO:1，作为轻链可变区的SEQIDNO:2，作为k轻链恒定区的SEQIDNO:11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为Yl重链恒定区的SEQIDNO:12，b)作为重链可变区的SEQIDNO:3和作为轻链可变区的SEQIDNO:4，作为k轻链恒定区的SEQIDNO:11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为^重链恒定区的SEQIDNO:12，c)作为重链可变区的SEQIDNO:5和作为轻链可变区的SEQIDNO:6，作为k轻链恒定区的SEQIDNO:11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为重链恒定区的SEQIDNO:12，d)作为重链可变区的SEQIDNO:7和作为轻链可变区的SEQIDNO:8，作为k轻链恒定区的SEQIDNO:11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为重链恒定区的SEQIDNO:12，或e)作为重链可变区的SEQIDNO:9和作为轻链可变区的SEQIDNO:10，作为k轻链恒定区的SEQIDNO:11和任选具有突变L234A和L235A或D265A和N297A的作为Yl重链恒定区的SEQIDNO:12。10.根据权利要求1到9的抗体用于生产药物组合物的用途。11.药物组合物，其包含药学有效量的根据权利要求1到9的抗体。12.重组宿主细胞，其能够产生根据权利要求1到9的重组抗体。13.生产包含药学有效量的根据权利要求1到9的抗体的药物组合物的方法。14.核酸，其编码能够与下面定义的各自另一抗体链一起装配的多肽，其中所述多肽任一个为a)包含SEQIDNO:l、3、5、7或9的重链CDR的抗体重链；b)包含SEQIDNO:2、4、6、8或10的轻链CDR的抗体轻链，其中所述CDR相互独立地选择。15.包含根据权利要求14的核酸的表达载体，其能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。16.包含根据权利要求15的载体的原核或者真核宿主细胞。17.产生结合IL-13Ral并且抑制IL-13与IL-13Rctl的结合的多肽的方法，其特征是在原核或者真核宿主细胞中表达根据权利要求14的编码重链的核酸和编码轻链的核酸并从所述细胞回收所述多肽。18.治疗需要哮喘或者抗变应性治疗的患者的方法，其特征是对所述患者施用治疗有效量的根据权利要求1到9的抗体。19.制备药物组合物的方法，其特征是通过重组表达产生根据权利要求1到9的抗体，回收所述抗体并将所述抗体与药用缓冲剂和/或佐剂组合。20.杂交瘤细胞系DSMACC2709、DSMACC2710、DSMACC2711或DSMACC2712。全文摘要结合IL-13Rα1、抑制IL-13生物活性并包含可变重链和可变轻链的抗体，其特征是所述抗体的可变重链氨基酸序列CDR3选自由SEQIDNO1、3、5、7或9的重链CDR3序列，该抗体用于治疗哮喘和变应性疾病。文档编号A61P37/08GK101098892SQ200680001753公开日2008年1月2日申请日期2006年1月2日优先权日2005年1月3日发明者伊沃·格劳斯,保罗·帕伦,凯-贡纳尔·施图本劳赫,塞巴斯蒂安·诺伊曼,弗兰克·雷贝阿斯,扬·施特拉克,扬·范德温克尔,拉尔夫·舒马赫,斯特凡·泽贝尔,桑德拉·韦雷科恩-韦普勒格恩,玛丽亚·芬特斯,约尔格·雷古拉,约瑟夫·恩德尔,阿德尔伯特·格罗斯曼,马丁·范武格特申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司