专利名称：使用受保护胺盐制备含末端胺基团的聚合物的方法
使用受保护胺盐制备含末端胺基团的聚合物的方法 发明领域
本发明涉及活性聚合物例如聚氧化烯的制备方法。具体来说，本发明涉 及制备高纯度含末端胺的线性聚合物的方法。
背景技术：
水溶性聚氧化烯与治疗性部分如蛋白质和多肽的结合作用(conjugation) 是已知的。参见，例如，美国专利4,179,337号，该文献的/>开内容在此引入 供参考。该'337专利公开了用PEG改性的生理学活性多肽在体内循环延长的 时间，并且具有降低的致免疫力和抗原性。
为了结合聚氧化烯结合，该聚合物的羟基末端基必须首先被转化成活性 官能团。这种方法通常称为"活化"且该产物称作"活化聚氧化烯"。类似地活 化其它的聚合物。
胺末端聚合物如PEG-NH2是已知的。参见Zalipsky等人的Eur. Polym. J. Vol. 19 No. 12.,ppll77-1183。它们可以"原态"用于与一些生物活性化合物上 存在的COOH基团直接结合。更通常，当希望其它聚合物输送体系时， PEG-NH2(或PEG-胺)用作进一步官能化的中间体。例如，含有千基消除体系、 三曱基封闭体系等的某些聚合物基药物输送平台体系(platform system)可以 包括PEG-NH2作为合成过程中的关键中间体。参见Greenwald等人J.Med. Chem.Vol. 42, No. 18,3657-3667; Greenwald等人J. Med. Chem,Vol. 47, No, 3,726-734; Greenwald等人的J. Med. Chem. Vol.43, No. 3,475-487。上述文献 每一篇的内容在此引入作为参考。
PEG-胺还可用于与生物活性小分子和具有可利用醛基的多肽结合(经由 还原胺化)。也参见Nektar Advanced PEGylation catalog 2005-2006，24页，该文 献的内容在此引入作为参考。
过去， 一般已知PEG-胺可以如下制备由PEG-OH制备PEG-卤化物、曱 磺酸酯或曱苯磺酸酯，此后与氨水(Hoffmann反应)、叠氮化钠或苯邻二曱酰亚胺钾(Gabriel试剂)进行亲核取代反应。PEG面化物与氨的反应直接地形成 PEG-胺。更重要地， 一个主要缺点在于较大百分率的PEG-卣化物在该浓氨 水处理期间水解而形成PEG-OH。当形成较高分子量的PEG-胺时，这是尤其 关注的。PEG分子量越高，形成PEG-OH越多。例如，在PEG5，,的情况下， 该量大约为5%且在更高分子量PEG如PEG4o，o(M)的情况下，该量可能高达20%。 因此，所需最终产物的纯度可能显著地降低。
即使当使用PEG-叠氮化物作为中间体来制备PEG-胺时，当使用金属催 化氢化时，也已观察到某些缺点。另外，与苯邻二曱酰亚胺钾的反应提供以 碱保护的胺，在回流下用在乙醇中的肼将该以碱保护的胺去保护。这也具有 缺陷。除去邻苯二曱酰基团需要的苛刻条件和需要对最终产物的强烈纯化显 著地增加了所需产物的成本。
鉴于上文所述，最好是提供改进的方法用于制备克服现有技术中的缺点 和缺陷的PEG-胺和相关的含末端胺的聚合物。本发明满足了这种需要。
发明概述
在本发明的一个优选的方面中，提供了制备含末端胺的聚合物的改进方 法。该方法包括使通式(I)的基本上非抗原性的聚合物
(I) R3-R2-R4
其中
R4是活性聚合物末端基如离去基团；
R2是基本上非抗原性的聚合物；和
Ro是封端基团或Rr， 与受保护胺盐反应以形成含末端受保护胺的聚合物；和此后使该由此得到的 含末端受保护胺的聚合物与酸反应以除去该保护基和形成含末端胺的聚合 物。
优选的活性聚合物末端基的实例包括离去基团如曱苯磺酸酯基 (tosylate)、曱磺酸酯基(mesylate)、对溴苯磺酸酯基(brosylate)、三氟乙基磺 酸酯基(tresylate)、间硝基苯磺酸酯基(nosylate)、 Br、 Cl等。
通式(I)的聚合物与受保护胺盐的反应优选在溶剂如二曱基曱酰胺中进
下反应，这最终在该聚合物上形成该末端胺。在本发明更优选的方面中，转变成胺衍生物的聚合物是PEG-曱苯磺酸酯并且该曱苯磺酸酯基团可以在该
PEG的至少一个或多个末端上。
在本发明的另 一个方面中，优选的受保护胺盐是亚氨二碳酸曱基-叔丁
酯的钾盐(KNMeBoc)或亚氨二碳酸二叔丁酯的钾盐(KNBoc2)。
大于98%,更优选大于99%。
本发明的主要优点之一在于所得的含末端胺的聚合物如其聚氧化烯衍 生物是以高纯度制备的。因此，不存在大量的产物污染物，即起始物料如 mPEG-OH,也就是说，污染物的量小于大约5%，优选小于大约2%，最优选 小于大约1%。当优选的PEG-胺以高纯度更经济地形成时，技术人员可以更 有效且低成本地制备包括该PEG-胺的最终产物。可以迫使制备该PEG-胺的 反应完成并且可以通过重结晶除去过量的小分子试剂。获得了效率，部分地 因为所需的胺末端聚合物与起始醇或活性中间体(例如曱^ 黄酸酯)的分离是 不需要的。另夕卜，不需要冗长的柱或离子交换或HPLC技术来提供希望的PEG-胺。因此，本发明在没有昂贵的柱纯化的情况下提供高度纯的PEG-胺。
另一个优点是以下事实由本文所述的方法制成的胺完全不会改变PEG 的骨架。因此，它将与PEG胺的现在和将来的应用相适应。
发明详述
本发明的方法一般涉及其上含至少一种末端胺的聚合物的制备。在本发 明的大多数方面中，可以使用本文所述方法改性的聚合物是基本上非抗原性 的聚合物。在这种聚合物中，聚氧化烯是优选的并且聚乙二醇(PEG)是最优 选的。为了简化描述而不是限制，有时使用PEG作为原型(prototypical)聚合 物描述本方法。然而，应当理解，该方法适用于可以是线性、基本上线性、 支链等的各种聚合物。仅有的要求之一是该聚合物在其上含有用于将所需活 性聚合物末端基共价连接的基团(means)并且可以经得起在本文所述条件下 将甲笨璜酰基或其它中间体转化成胺所要求的处理。
根据上述，本发明的制备含末端胺的聚合物的一个优选的方面包括
a)使通式(I)的基本上3 一抗原性的聚合物
(I) R3-R2-R4
其中Ri是活性聚合物末端基；
R2是基本上非抗原性的聚合物；和
R3是封端基团或Rj; 与受保护胺盐反应以形成含末端受保护胺的聚合物；和
b)使由此得到的该含末端受保护胺的聚合物与酸反应以除去该保护基 和形成含末端胺的聚合物。
对本发明来说，应当理解，术语"活性聚合物末端基"当在上下文中与R！ 一起使用时是指离去基团如相关领域中已知的那些。适合的离去基团的非限 制性实例(list)包括曱苯磺酸酯基、曱磺酸酯基、对溴M酸酯基、三氟乙基 磺酸酯基、间硝基苯磺酸酯基、Br、 Cl等。
如上所述，在一个实施方案中，R3可以是封端基团。对本发明来说，封 端基团应当理解是指在聚合物的末端上存在的基团。在一些方面中，它可以 选自任何一个C02H、 d-6烷基(CH3是优选的)、OH等或普通技术人员了解的 其它末端基。
R2还优选是在室温下水溶性的聚合物如聚氧化烯(PAO),更优选聚乙二 醇如mPEG或双活化的PEG。此类聚合物的非限制性实例因此包括聚氧化烯 均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧亚乙基化多元醇、其共聚物和其 嵌段共聚物，条件是该嵌段共聚物的水溶性得到维持。
为了举例说明而非限制，R2的聚乙二醇(PEG)残基部分可以选自 -CH2CH2-0-(CH2CH20)x-CH2CH2-和 -S-CH2CH2-0-(CH2CH20)x-CH2CH2S-
其中
x是聚合度即大约10-大约2,300。
在本发明的另一方面中，当希望双活化的聚合物时，R3与R,相同，并且 所得反应物用于制备双胺封端聚合物化合物。此种双活化聚合物可以具有通 式(Ia):
(Ia)R广CH2CH2-0-(CH2CH20)x-CH2CH2-R4 其中R^优选是曱^t酸酯基，x和上述相同。
聚合物的聚合度表示聚合物链中重复单元的数目并且取决于聚合物的 分子量。虽然基本上非抗原性的聚合物，PAO和PEG在重均分子量方面可以 显著地变化，但是，优选地，R2在本发明的大多数方面中具有大约200-大约100,000 Da的重均分子量。更优选，该基本上非抗原性的聚合物具有大约 2,000-大约48,000道尔顿的重均分子量。
R2也可以是"星形-PEG "或多臂PEG例如Shearwater公司的2001目录 "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application "中描述的那 些，该文献的公开内容在此引入作为参考。
在又一个优选的实施方案中，R2是对应于本发明聚合物的支链聚合物的
一部分。特别地，R2可以具有通式<formula>formula see original document page 9</formula>其中n是大约10-大约340的整数，以优选提供总分子量大约12，000-大约 40,000的聚合物；并且该残基的至少l个，但是至多3个末端部被曱基或其它 低级烷基封端并且其余末端基是R3基团。也参见上述Nektar目录，26页M-臂 PEG"。在末端胺^:之前此类化合物优选包括
<formula>formula see original document page 9</formula>其中R4是
<formula>formula see original document page 9</formula>1和
<formula>formula see original document page 9</formula>其中R7优选是曱基，所有其它变量如本文前面所限定。能够进行本文描述的 胺化过程的一种具体聚合物是
这一实施方案的其它方面当然可能有末端甲基中的一个或两个被曱苯 磺酰基替代使得与上面的A对应。
在本发明范围内还考虑各种其它PEG-基化合物，包括共同转让的美国专 利号5,605,976、 5,643,575、 5，919，455和6，113,卯6中描述的那些支链聚合物残 基上的末端胺的形成，每篇的公开内容在此引入作为参考。 一些具体化合物 的代表性实例包括
<formula>formula see original document page 10</formula><formula>formula see original document page 11</formula>其中
R7
'R7
R7优选是甲基； z是l-大约120的整数；
"和L3是独立选择的双官能连接基，如以下非限制性化合物之一:-NH(CH2CH20)y(CH2)qNR9-， -NH(CH2CH20)yC(0)-, -NH(CI^oR")qOC(0)-， ((OXCR^OqNHqOXCR^R^qNfV,
-C(0)0(CH2)qO-,
-C(O)(CR10R")qNR9-
-C(0)NH(CH2CH20)y(CH2)qNR9-，
-C(0)CT(CH2CH20)yNR9-， -C(O)NH(CR化R")qO-， -C(O)O(CRwR")qO-， -C(0)NH(CH2CH20)y-,
-NH(CR10R")q
-NH(CR化R")q
(CR13R12)tOC(0)-
(CR13R12)tNR9C(0)-
119.13独立地选自与限定上面R4的基团相同的基团，优选H或CH3;
R6选自与限定R4的基团相同的基团、N02、 (^.6卣代烷基和卣素；和
q、 t和y各自是独立选择的正整数例如l-大约12;和乙2是支链连接基例如 二氨基烷基或赖氨酸残基。参见，例如，上述美国专利号6,113,906。
在另一个实施方案中，并且作为PAO类聚合物的替代方案，R2任选地选 自一种或多种有效非抗原的材料例如右旋糖苷、聚乙烯醇、碳水化合物类聚 合物、羟基丙基曱基丙烯酰胺(HPMA)、聚氧化烯和/或它们的共聚物。也参 见共同转让的美国专利6，153,655号，该文献的内容在此引入作为参考。普通 技术人员应当理解，相同的类型的活化如本文描述了那样用于PAO如PEG。 本领域普通技术人员将进一步认识到上述实例仅是说明性的并且具有本文 所述品质的所有聚合物材料是被考虑的。
还将理解，如果需要的话，本文描述的任何水溶性聚合物在胺化之前可 以经官能化以与R3基团，例如甲笨璜酸酯基、甲^"酸酯基连接，而不需要过 度试验。聚合物(例如PEG)末端OH转化或活化成曱苯磺酸酯等已经在本领域 中进行了报道。参见，例如美国专利5,206344号和美国专利申请公开号 2003/0149307 ，它们每篇的内容在此？ 1入作为参考。
根据本发明方法，含末端受保护胺的聚合物的形成要求使通式(I)的含一个或多个Ri基团例如活性聚合物末端基如曱苯磺酸酯基、曱磺酸酯基、对溴
苯磺酸酯基、三氟乙基磺酸酯基、间硝基苯磺酸酯基、Br或Cl的基本上非抗 原性的聚合物与受保护胺盐反应。该反应在适合的溶剂例如但不限于二曱基 曱酰胺(DMF)、四氪呋喃(THF)、 二曱基乙酰胺或类似的试剂和其混合物中 进行。优选的溶剂是二甲基甲酰胺(DMF)。如普通技术人员将领会的那样， 许多其它适合的溶剂可用于本发明的方法。适合的溶剂包括是极性溶剂的那 些例如曱醇、乙醇、丁醇、异丙醇、二嘌烷等。这一步骤可以在大约室温下 进行，但是温度也可以为大约(TC至该溶剂的回流温度或沸点。
各种受保护胺盐可用于本发明的方法。通常地，该受保护胺盐可以对应 于通式
MNP!R4
其中
M是氢或选自锂、钠和钾的金属；
Pt包括但不限于以下列出的基团C(O)H、 C(O)OMe、 C(O)OBzl(Z)、 C(O)OtBu(Boc)、 C(0)OCH2CCl3(Troc)、 P(0)(OEt)2、 CPli3(三苯曱基);和
R4是Pl或例如，Q—6烷基、Cw2支链烷基、C3-s环烷基、d-6取代的烷基、 <:3.8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、Q-6杂烷基、取代的Q-6杂 烷基、CL6烷氧基、苯氧基和C,-6杂烷氧基等。
在上组可能的试剂内， 一些优选的适合试剂的非限制性实例包括但不限
于，亚氨二碳酸二叔丁酯的钾盐(KNBoc2)、亚氨二碳酸二叔丁酯(LiNBoc2)
的锂盐、亚氨二碳酸二叔丁酯的钠盐等。在本发明的一个优选的方面中，受
保护胺盐是亚氨二碳酸二叔丁酯的钾盐(KNBoc2)。
在本发明上述方面的另一方面中，受保护胺盐可以选自NR4B0c的钾、
钠和锂盐，其中R4如上所述，例如d-6烷基等，Boc是叔丁基氧基羰基
(t-buty lcarbonate)。
在本发明的许多方面内，优选的受保护胺盐是亚氨二碳酸曱基-叔丁基 酯的钾盐(KNMeBoc)。
在含受保护胺的聚合物形成之后，经由上述水解除去保护基(例如Boc) 而得到所需的高纯度PEG-胺衍生物。使用其它技术公认的方法除去非Boc保 护基。
高纯度PEG-胺然后可以按任何技术公认的方式使用。例如，且没有限制，可以使用为普通技术人员熟知的技术将它用于与C02H基团或在所考虑的生
物活性目标上存在的其它适合的活性基团直接结合。另一方面，PEG-胺可以 作为高纯度的中间体用于更复杂的聚合物连接体系例如上述千基清除(RNL) 体系(platform)或甚至作为PEG-脂质体体系的一部分。为了举例说明，RNL 体系可以如下制备使PEG-胺与适合的受保护苯曱醇反应接着使用为普通技 术人员所知的技术进行脱保护和活化。也参见下面最后一个实施例。
在含末端受保护胺的聚合物形成之后，将该聚合物去保护即除去保护 基，以形成所需的胺封端聚合物。该去保护可以使用酸例如但不限于，在 Et20(醚)或二哺烷中的HCl溶液，在二氯曱烷(或二氯乙烷)(15%-35°/。)，或其 它适合溶解酸和允许在有机环境下去保护的溶剂中的乙酸、二氯乙酸、曱酸 和三氟乙酸进行。在本发明的许多方面中，在二氯曱烷中的20。/。三氟乙酸是 优选的。
本发明的方法优选使用至少大约等摩尔量(equimolar amount)的反应物 进行。更优选，受保护胺盐相对于通式(I)的化合物以摩尔过量存在。优选， 受保护胺盐相对于mPEG以至少大约3-5倍摩尔过量存在，即比例为约5至约 1。当使用5-PEG(双PEG或在每一末端上活化的PEG)时，该摩尔过量大约是 两倍高，例如大约6-10倍摩尔过量。如果使用支链聚合物，则相对于待添加 的每个胺基使用类似的比例。应当理解，当使用末端支链的聚合物时，优选
物结构部分(例如曱苯磺酸酯基等)的数目。
在本发明的许多方面中，将聚氧化烯(PAO)例如未封端的PEG-OH(二 -PEG OH)或mPEG转化成通式(IIa)或(IIb)的化合物
在本发明的许多方面中，将聚氧化烯(PAO)例如未封端的PEG-OH(二 -PEG OH)或mPEG转化成通式(IIa)或(IIb)的化合物<formula>formula see original document page 15</formula>
或 (lib)
<formula>formula see original document page 15</formula>其中
R2是PAO例如PEG或mPEG;
X是O、 S或NHRs,其中Rs是氢、d-6烷基、Cw2支链烷基、(33-8环烷基、 Cw取代的烷基、C^取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C,-6杂烷 基、取代的Cw杂烷基、d，6烷氧基、苯氧基和Cw杂烷氧基等；和
R7是例如曱基、卤素、硝基、氟代曱基、二氟曱基、三氟曱基、取代的 羧基和多卤素取代的苯磺酰基。CH3是优选的。
在含受保护胺的聚合物形成之后，经由上述水解除去保护基(例如Boc) 而高纯度地得到所需的PEG-胺衍生物。
高纯度PEG-胺然后可以按任何技术公认的方法使用。例如，它可以没有 限制地使用。
实施例
以下实施例用来提供对本发明的进一步理解但无论如何不限制本发明 的有效范围。
实施例l<formula>formula see original document page 15</formula>
a)PEG-曱苯磺酸酯(PEG-OTs)。向40^aAPEG-OH(100 g， 2.5mmo1， l当 量)在800mL DCM的溶液中添力。400mL 30%NaOH水溶液和BnEt3NCl(228mg, l.Ommol, 0.2当量)。然后，向该剧烈搅拌的混合物中经 由加料漏斗在2小时内逐滴添加对曱苯磺酰氯(2.86 g, 15mmol， 3当量)在 500mL DCM中的溶液，并在室温下搅拌该反应混合物过夜。在添加500mL DCM和200mL饱和NaCl溶液之后，分离有机相并用200mL饱和NaCl溶液洗涤 两次。用无水MgS04干燥该有机相，过滤并在真空下蒸发而获得固体，该固 体溶于最低量的DCM中并用乙醚沉淀。过滤得到97 g化③aAPEG-OTs(产率 96%)。 13CNMR: 21.57， 68.47， 69.07， 70,21-71.75 (PEG)， 127.68, 129.55, 132.69: 144.44。
b) PEG-NBoc2。向40^aAPEG-OTs(96 g， 2.38mmo1, l当量)在500mL无水 DMF中的溶液中添加Boc2NK(3.65 g， 14.28mmo1， 3当量)。将该反应混合物 加热到45。C过夜。在冷却至室温后，添力口1.2L乙醚。过滤所得的固体并用足 够的乙醚洗涤。将粗固体溶于1.2 L DCM并用200mL饱和NaCl溶液洗涤两次。 用MgS04干燥该有机层，过滤并在真空下蒸发。用DCM/乙醚将所得的固体 再结晶而获得90 g 40KDaAPEG-NBoc2(产率940/。)。 13C NMR(ppm): 27.93， 45.01, 69.05， 69.68-70.34 (PEG), 81.94, 152.20。
c) PEG-胺盐(PEG曙NH2.TFA)。向40KDaAPEG-NBoc2(90 g， 2.23mmol)在 900rnL DCM中的溶液中添加225mL TFA。在室温下搅拌该反应混合物4小时 然后在真空下蒸发。将所得的固体溶于300mLDCM并通过添加2 L乙醚沉淀。 在过滤之后，重新用DCM/乙醚将所得的固体再结晶而获得88 g 40KDa八pEG一NH2.TFA(产率980/0)。 13C画R(ppm): 39.87， 66.77, 69.71-70.72 (PEG)。
实施例2 膽a双-PEG-胺
丁sa, DCM
BnEtjNCI(催fli剂)Bo&NK 20%TFA
鹏APEG刁H-咖APB3-OTs-观APEG^NB。Cj- ~ MKAPEG-NH2 TFA
30% NaOH/H20 DMF, 45 °C DCM
5 6 7 8
由按上面相同方法制备的^KDaAPEG-OTs制得相应的加KDaAPEG-胺，只是 使用PEG 20KDa代替PEG 40KDa。
在与实施例1中2的相同条件下制得化合物6。通过NMR证实6的结构。 在与实施例1中3的相同条件下制得化合物7。通过NMR证实7的结构。在实施例1中4的相同条件下制得化合物8。通过NMR证实8的结构。 实施例3
40KDa双一PEG-N-甲胺 <formula>formula see original document page 0</formula>a) PEG-曱苯磺酸酯(PEG-OTs)。重复实施例l的方法。
b) PEG-NMeBoc。在与实施例I相同的条件下制得化合物IO，只是使用相 当量的BocMeNK^/辜Boc2NK。通过NMRi正实10的结构。
c) PEG-N-曱胺(PEG-NHMe)。在与实施例l相同的条件下制得化合物11 ， 只是使用相等量的化合物10代替化合物3 。通过NMR证实结构。
实施例4 3斷mPEG画胺
TsGI, DCM
BnEt3NCK催化剂) Bo&NK,股 ， 20%TFA
咖mPEG-OH-^加KmPEG-OTs-^ 鹏mPEG-NB。C;;-MKmPEG-NH2 TFA
30%NaOH/H2O DMF，45。C DCM
12 13 14 15
a) 3。③amPEG画曱苯磺酸酯(孤DamPEG-OTs)。向3o③amPEG-OH(85 g, 2.83 毫摩尔，1当量)在800mL DCM中的溶液中添加400mL 30。/。NaOH水溶液和 BnEt3NCl(257mg, 1.13， 0.4当量)。然后，向该剧烈搅拌的混合物中经由加 料漏斗在2小时内逐滴添加对曱苯石黄酰氯(1.62g， 8.49mmo1， 3当量)在600mL DCM中的溶液，并在室温下搅拌该反应混合物过夜。在添加800mL DCM和 200mL饱和NaCl溶液之后，分离有机相并用200mL饱和NaCl溶液洗涤两次。 用无水MgS04干燥该有机相，过滤并在真空下蒸发而获得固体，该固体溶于 最低量的DCM中并用乙醚沉淀。过滤得到80 g ^③amPEG-OTs(产率940/0)。
13C NMR: 21.57, 58.83， 68.41， 69.07， 69画69-72.95(PEG), 127,62, 129.52， 132.68, 144.40。
b) 30KDamPEG-NBoc2。向3QKDamPEG-OTs(78 g, 2.59mmo1, l当量)在800mL 无水DMF中的溶液中添加Boc2NK(1.99g， 7.8mmo1, 3当量)。将该反应混合 物加热到45。C过夜。在冷却至室温后，添加3 L乙醚。过滤所得的固体并用 足够的醚洗涤。将粗固体溶于1.2 L DCM并用200mL饱和NaCl溶液洗涤两次。用MgS04干燥该有机层，过滤并在真空下蒸发。用DCM/乙醚将所得的固体 再结晶而获得67 g 30③amPEG-NBoc2(产率86。/())。 13C NMR(ppm): 27.93, 45.01 ,58.83， 69.04, 69.66-71.70(PEG)， 81.94，152,20。
c)皿DamPEG-胺盐(舰DamPEG画NH2.TFA)。向30KDamPEG-NB。c2(67 g， 2.22mmol)在670mL DCM中的溶液中添加335mL TFA。在室温下撹拌该反应 混合物4小时然后在真空下蒸发。将所得的固体溶于300mL DCM并通过添加 2L乙醚沉淀。在过滤之后，重新用DCM/乙醚将所得的固体再结晶而获得64 g 30KDamPEG-NH2TFA(产率98%) 。 13C NMR(ppm): 39.81, 58.83, 66.90， 69.63-71.70 (PEG)。
实施例5-8
重复实施例l-4的方法，只是使用等摩尔量相应的PEG-C1衍生物代替曱
苯磺酸酯。
实施例9
3C)KDamPEG RNL 9连接物
在这一实施例中，才艮据以下反应图解将实施例4的犯化amPEG-NH2转化成 活化的PEG连接物。
<formula>formula see original document page 18</formula>a)30KDamPEGRNL9OTBDMS23。向醇22(238mg, lmmol， 6当量)在无 水CH3C1中的溶液中，添加DSC(235mg， 0.92mmo1， 5.5当量)和吡啶(88pL， 1.08mmo1， 6.5当量)。将所得的悬浮液力口热到回流过夜，冷却至室温并添加 到30^amPEG-丽2.TFA(下文中21)(5 g， 0.17mmo1， 1当量)和吡啶(17(iL， 0.21mmo1, 1.25当量)在25mL无水CH3Cl中的溶液中。在室温下搅拌3天之后， 在真空下蒸发溶剂。将所得的固体溶于最低量的二氯曱烷，然后通过添加醚 沉淀，过滤和用CH3CN/IPA再结晶而获得4.85g(产率94。/。)。 GPC: 98.39%。"C画R(75.4固z， CDC13) 5 154.47， 149.59, 137.90, 126.52， 121.02, 69.09-71.65 (PEG), 64.24, 58.83, 40.83, 25.84， 18.27,5.28。
b) 30KDamPEG RNL90H 24。向23(4.85 g, 0.16mmol)在20mL CHsCN和 10mL水中的溶液中添加50mL水乙酸。在室温下搅拌反应混合物过夜，然后 在真空下蒸发。将残余物溶于75mLCH2Cl2。用15mL水洗涤有^L相两次，用 MgS04干燥，过滤和在真空下蒸发。将所得的固体溶于最低量的CH2Cl2，然 后通过添加乙醚沉淀而获得4.49g(产率94。/。)。 GPC: 98.35%。 13C NMR(75.4 MHz, CDC13) S 154.36， 149.90， 138.18, 127.37， 121,15, 69.42-71.69 (PEG), 63.93,58.80, 40.83。
c) 30KDamPEG RNL9NHS 25。向24(4.49 g, 0.15mmol， l当量)在50mL无 水CH2Cl2和5mL无水DMF中的溶液中添加DSC(305mg, 1.19mmol, 8当量)。 将该混合物冷却至0。C,然后添加吡啶(87iaL， 1.07mmol, 7.2当量)。在室温 下搅拌反应混合物过夜，然后在真空下蒸发。将所得的固体溶于最低量的 CH2C12,然后通过添加醚沉淀，过滤和用CH3CN/IPA再结晶而获得4.26g(产 率94%)。 GPC: 97,04%。 13C NMR(75.4 MHz, CDC13) 5 168.33, 154,01， 151.51， 151.22, 129.80, 129.53, 121.68， 69.88-73.08 (PEG), 58.83, 40.89, 25.32。
最终产物可以用于与许多在其上具有用于结合的可利用胺或羟基的生 物活性多肽、酶、蛋白质、小分子等结合。这些结合反应的方法已经例如， 在共同转让的美国专利6,180,095号(其内容在此引入作为参考)，或上述 Greenwald等人的J. Med. Chem. Vol. 42, No.l8,3657-3667中进行了描述。
权利要求
1.含末端胺的聚合物的制备方法，包括a)使通式(I)的基本上非抗原性的聚合物(I) R3-R2-R1其中R1是活性聚合物末端基；R2是基本上非抗原性的聚合物；和R3是封端基团或R1；与受保护胺盐反应以形成含末端受保护胺的聚合物；和b)使该由步骤a)得到的含末端受保护胺的聚合物与酸反应以除去该保护基和形成含末端胺的聚合物。
2. 权利要求1的方法，其中Ri是选自曱^t酸酯基、曱磺酸酯基、对溴苯 磺酸酯基、三氟乙基磺酸酯基、间硝基^ 黄酸酯基、Br和Cl的离去基团。
3. 权利要求1的方法，其中反应步骤a)在选自二曱基曱酰胺(DMF)、四氢 p夫喃(THF)、 二甲基乙酰胺和它们的混合物的溶剂中进行。
4. 权利要求2的方法，其中该离去基团是曱苯磺酸酯基。
5. 权利要求1的方法，其中该受保护胺盐选自亚氨二碳酸二叔丁酯的钾盐 (KNBoc2)、亚氨二碳酸二叔丁酯的锂盐(LiNBoc2)和亚氨二碳酸二叔丁酯的钠 盐。
6. 权利要求5的方法，其中该受保护胺盐是亚氨二碳酸二叔丁酯的钾盐 (KNBoc2)。
7. 权利要求1的方法，其中该受保护胺盐选自NR4B0c的钾、钠和锂盐，其中R4选自氢、Ci-6烷基、Cw2支链烷基、C3-8环烷基、C^取代的烷基、C3_8 取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、d—6杂烷基、取代的d-6杂烷基、Q-6烷氧基、苯氧基和Cw杂烷氧基；Boc是叔丁基氧基羰基。
8. 权利要求7的方法，其中该受保护胺盐是亚氨二碳酸曱基-叔丁基酯的 钾盐(KNMeBoc)。
9. 权利要求1的方法，其中用来除去所述保护基的酸选自盐酸、乙酸、二氯乙酸、曱酸和三氟乙酸。
10. 权利要求9的方法，其中该酸是三氟乙酸。
11. 权利要求l的方法，其中R3封端基团是CH3。
12. 权利要求1的方法，其中R3是Rj。
13. 权利要求1的方法，其中R2是聚氧化烯。
14. 权利要求13的方法，其中该聚氧化烯选自聚乙二醇和聚丙二醇。
15. 权利要求14的方法，其中所述聚氧化烯是通式-0-(CH2CH20)x-的聚乙 二醇，其中x是大约10-大约2，300的整数。
16. 权利要求1的方法，其中该基本上非抗原性的聚合物具有大约2,00-大 约100,000道尔顿的重均分子量。
17. 权利要求16的方法，其中该基本上非抗原性的聚合物具有大约2,000-大约48，000道尔顿的重均分子量。
18. 权利要求1的方法，其中通式(I)的化合物是(<formula>formula see original document page 3</formula>R2是聚氧化烯；X是O、 S或NHR8，其中Rs选自氢、d-6烷基、Cw2支链烷基、<:3.8环烷基、CL6取代的烷基、(33.8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、d.6杂烷基、取代的d-6杂烷基、Cw烷氧基、苯氧基和Cw杂烷氧基；和R7是曱基、卤素、硝基、氟代曱基、二氟曱基、三氟甲基、取代的羧基或多卣素取代的M酰基。
19. 权利要求18的方法，其中R2是聚乙二醇，X是O， R7是曱基。
20. 权利要求1的方法，其中通过所述方法形成的含末端胺的聚合物的纯度大于大约95%。
21 .权利要求20的方法，其中通过所述方法形成的含末端胺的聚合物的纯 度大于98%。
22.权利要求21的方法，其中通过所述方法形成的含末端胺的聚合物的纯 度大于99%。
全文摘要
本发明涉及制备高纯度线性聚合物例如含末端胺的聚氧化烯的方法。一种优选的方法包括使含末端甲苯磺酸酯基的聚氧化烯例如聚乙二醇与受保护胺盐反应以形成含末端受保护胺的聚合物，此后将该含末端受保护胺的聚合物去保护以形成含末端胺的聚合物。所得聚合物-胺具有足够的纯度以致避免了为药物级聚合物所需要的昂贵和耗时的纯化步骤。
文档编号A61K47/48GK101321516SQ200680045582
公开日2008年12月10日 申请日期2006年9月29日 优先权日2005年10月4日
发明者贝伦·鲁比奥, 洪 赵 申请人:安佐制药股份有限公司