用基质金属蛋白酶拮抗剂抑制her2脱落的制作方法

专利名称：用基质金属蛋白酶拮抗剂抑制her2脱落的制作方法
技术领域：
本发明关注使用基质金属蛋白酶(MMP)尤其是MMP-15的拮抗剂来抑 制HER2脱落。
背景技术：
受体酪氨酸激酶的HER家族是细胞生长、分化和存活的重要介质。该 受体家族包括四个截然不同的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR、. ErbBl 或HER1 )、 HER2 (ErbB2或pi 85"e" )、 HER3 ( ErbB3 )和HER4 (ErbB4或 tyro2 )。
由eABl基因编码的EGFR已经在原因上与人恶性肿瘤联系起来。具体 而言，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、头癌、颈癌和胃癌以及成"交质细月包瘤中观j 察到EGFR表达升高。EGFR受体表达升高常常与同 一肿瘤细胞的EGFR配 体转化生长因子a(TGF-a)的产量升高有关，通过自分泌刺激途径导致受体 活化。Baselga and Mendelsohn, P/zwtt^c. T7^k 64: 127-154 (1994)。针对EGFR 或其配体TGF-a和EGF的单克隆抗体已经作为此类恶性肿瘤治疗中的治疗 剂进4亍了^H古。参见例长口 Baselga and Mendelsohn,见上文；Masui a/.， C""cwi e化"n^ 44: 1002-1007 (1984); Wu "a/,, / C7/w. /"vesf. 95: 1897-1905 (1995)。
HER家族的第二个成员pl85"e"最初鉴定为来自化学处理大鼠的成神经 细胞瘤的转化基因的产物。恥"原癌基因的活化形式源自所编码蛋白质跨膜 区中的点突变(缬氨酸变成谷氨酸)。在乳腺癌和卵巢癌中观察到"ew的人 同系物的扩增，而且这与不良预后有关(Slamon " a/., 5Wence 23 5: 177-182 (1987); Slamon " a/. 聰244: 707-712(1989);美国专利第4,968，603号)。 迄今为止，对于人肿瘤尚无与wew原癌基因中类似的点突变的报道。在其它
癌中也已观察到HER2的过表达(频繁但不均一，原因在于基因扩增)，包
括胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、曱状腺、胰和膀胱的癌。参见
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Sadasivan^"/.， / f/ro/. 150: 126-31 (1993))。
针对大鼠pl85卿和人HER2蛋白质产物的抗体已有记载。 Drebin及其同事制备了针对大鼠mw基因产物pl85腦的抗体。参见例 ^口Drebin er a/.， Ce〃 41: 695-706 (1985); Myers " a/" Me仇198: 277-2卯(1991); WO 94/22478。 Drebin " a/" 2: 273-277 (1988)报道
了与pl85"e"的两个不同区域有反应性的抗体混合物对植入棵鼠的"ew转化 的NIH-3T3细胞产生协同抗肿瘤作用。还可参见1998年10月20日公告的 美国专利第5，824,311号。
Hudziak"a/.,Mo/. CW/.所o/. 9(3): 1165-1172 (1989)描述了一组HER2抗 体的生成，并使用人乳腺肿瘤细胞系SK-BR-3进行了表征。将SK-BR-3细 胞暴露于抗体后72小时通过细胞单层的结晶紫染色测定了相对细胞增殖。 利用此测定法，用称作4D5的抗体获得了最大抑制，它抑制细胞增殖达56%。 该组其它抗体在此测定法中以较低程度降低细胞增殖。还发现抗体4D5使过 表达HER2的乳腺肿瘤细胞系对TNF-a的细胞毒性作用敏感化。还可参见 1997年10月14日公告的美国专利第5,677,171号。Hudziak等人的文章中 所讨论的HER2抗体在下列文献中进行了进一步表征Fendly " a/.， Owcer i 麼a厂c/2 50: 1550-1558 (1990); Kotts " a/，, /"版o 26(3): 59A (1990); Sarup " a/., G厂om^/z i egw/a"o" 1: 72-82 (1991); Shepard ef a/.,C7f". /mmwwo/. 11(3): 117-127 (1991); Kumar W a/., vWo/. CW/. S/o/. 11(2): 979-986 (1991); Lewis "
5
a/.， Cflwcw/附wwwo/. 7wmw"c^/2eK 37: 255-263 (1993); Pietras ef a/.， Owcoge"e 9: 1829-1838 (1994); Vitetta ef a/.， Ca"cer "e化^r/z 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski a/., 说o/. C/zew. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott e/ a/., J ^/o/. C/^w. 266: 14300-5 (1991); D'souza a/.，iVaf/.爿cgc . 91: 7202-7206 (1994); Lewis " a/.， C麵er i e廳rc/z 56: 1457-1465 (1996); Schaefer e/a/.， Owcoge"e 15: 1385-1394 (1997)。
鼠HER2抗体4D5的重组人源化型式(huMAb4D5-8、 rhuMAb HER2、 Trastuzumab或HERCEPTIN ;美国专利第5,821,337号)在临床上对患有 HER2过表达的转移性乳腺癌并已接受大量现有抗癌疗法的患者起作用 (Baselga C7〖".14: 737-744 (1996) )。 Trastuzumab在1998年9
月25日得到了美国食品和药品管理局的销售许可，可用于治疗其肿瘤过表 达HER2蛋白质的转移性乳腺癌患者。
下列文献中记载了具有各种特性的其它HER2抗体Tagliabue w 乂 C騰w 47: 933-937 (1991); McKenzie d a/" O"cog認4: 543-548 (1989); Maier d fl/" C"wcer51: 5361-5369 (1991); Bacus a/., Mo/ecw/ar C'"oge顧's 3: 350-362 (19%); Stancovski " "/.， 88: 8691-,5
(1991); Bacus a/.， Owcer i e舰rc/ 52: 2580-2589 (1992); Xu a/.，紋 / Ca匿r 53: 401-408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk " C離er i e織rc/z 52: 2771-2776 (1992); Hancock a/" C騰er M 51: 4575-4580 (1991); Shawver a/.， Cawcer 54: 1367-1373 (1994); Arteaga d a/" Cawcer 54: 3758-3765 (1994); Harwerth 腺.C/2流267: 15160-15167 (1992);美
国专利第5,783,186号；Klapper a/., O歸ge"e 14: 2099-2109 (1997)。
同源性筛选使得HER受体家族的两个其它成员得以筌定HER3 (美国 专利第5,183,884和5,480,968号以及Kraus d "/., 7W^S (X/iX" 86: 9193-9197 (1989))和HER4(欧洲专利申请第599,274号；Plowman a/., iVoc.Jcad 5W. 90: 1746-1750 (1993); Plowman " a/" Atoww 366: 473-475 (1993))。 这两种受体都在至少有些乳腺癌细胞系中展示出表达升高。
HER受体在细胞中通常以多种组合发现，而且认为异二聚化增加了对各 种HER配体的细月包应答的多样性(Earp ^ a/.， Brea" Ca"cer i esearc/z 7>eWmem 35: 115-132 (1995))。 EGFR结合6种不同配体表皮生长因子 (EGF)、转化生长因子oc(TGF-a)、双调蛋白、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF) 、 betacellulin和epiregulin ( Groenen ef a/., OowA Factor1 11: 235-257 (1994))。由单一基因的可变剪接产生的调蛋白蛋白质家族是HER3 和HER4的配体。调蛋白家族包括a、 P和Y调蛋白(Holmes "a/., 5We"ce 256: 1205-1210(1992);美国专利第5,641,869号;Schaefer ^a/., O腳g匿15: 1385-1394 (1"7)); neu分化因子(NDF);神经胶质生长因子(GGF);乙酰胆 碱受体诱导活性(ARIA);及感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)。有关综述 参见Groenen OowA Factora 11: 235-257 (1994); Lemke, G" Mo/ec. cfe
CW/. TVewmsc/. 7: 247-262 (1996); Lee da/.,i ev. 47: 51-85 (1995)。最近 鉴定了另外三种HER配体神经调节蛋白-2(NRG-2),据报道它结合HER3 或HER4( Chang " 淑脏387: 509-512 (1997); Carraway ^ a/"淑wm 387: 512-516 (1997));神经调节蛋白-3，它结合HER4 ( Zhang " a/.，/W^SY"S力 94(18): 9562-7 (1997));和神经调节蛋白-4,它结合HER4 (Harari d a/., O coge"e 18: 2681-89 (1999))。 HB-EGF、 betacellulin和epiregulin也结合 HER4。
尽管EGF和TGFa不结合HER2，但是EGF刺激EGFR和HER2形成 异二聚体，它活化EGFR并导敢异二聚体中HER2的转磷酸作用。二聚化作 用和/或转磷酸作用似乎活化HER2酪氨酸激酶。参见Earp"a/.，见上文。 同样，当HER3与HER2共表达时，形成有活性的信号复合物，而针对HER2 的抗体能够破坏此复合物(Sliwkowski " "/., /历o/. C/2e附.269(20): 14661-14665 (1994))。另外，在与HER2共表达时，HER3对调蛋白(HRG) 的亲和力升高到更高的亲和力状态。关于HER2-HER3蛋白质复合物还可参 见Levi d Jow/7 a/ o/A^wnwc/e"ce 15: 1329-1340 (1995); Morrissey ef a/" 尸rac. A^/.爿cad 5W. 92: 1431-1435 (1995》Lewis W a/" Owce厂A仏56: 1457-1465 (l996)。 HER4,与HER3类似，与HER2形成有活性的信号复合 物(Carraway and Cantley， Ce// 78: 5-8 (1994))。
图4中描绘了 HER信号网络。
涉及HER抗体的专利出版物包括US 5,677,171; US 5,720,937; US 5,720,954; US 5,725,856; US 5,770,195; US 5,772,997; US 6,165,464; US 6，387，371; US 6,399,063; US 2002/0192211 Al; US 6,015,567; US 6，333，169; US 4,968,603; US 5,821,337; US 6,054,297; US 6,407,213; US 6,719,971; US 6,800,738; US 2004/0236078 Al; US 5，648，237; US 6,267,958; US6,685,940; US 6,821,515; WO 98/17797; US 6,127,526; US 6,333,398; US 6,797,814; US 6,339,142; US 6,417,335; US 6,489,447; WO 99/31140; US 2003/0147884 Al; US 2003/0170234 Al; US 2005/0002928 Al; US 6,573,043; US 2003/0152987 Al; WO 99/48527; US 2002/0141993 Al; WO 01/00245; US 2003/0086924; US 2004/0013667 Al; WO 00/69460; WO 01/00238; WO 01/15730; US 6,627,196 Bl; US 6,632,979 Bl; WO 01/00244; US 2002/0090662 Al; WO 01/89566; US 2002/0064785; US 2003/0134344; WO 04/24866; US 2004/0082047; US 2003/0175845 Al; WO 03/087131; US 2003/0228663; WO 2004/008099 A2; US 2004/0106161; WO 2004/048525; US 2004/0258685 Al; US 5,985,553; US 5,747,261; US 4,935,341; US 5,401,638; US 5,604,107; WO 87/07646; WO 89/10412; WO 91/05264; EP412，116B1; EP 494,135 Bl; US 5,824,311; EP 444,181 Bl; EP 1,006,194 A2; US 2002/0155527 Al; WO 91/02062; US 5,571,894; US 5,939,531; EP 502,812 Bl; WO 93/03741; EP 554,441 Bl; EP 656,367 Al; US 5,288,477; US 5,514,554; US 5,587,458; WO 93/12220; WO 93/16185; US 5，877，305; WO 93/21319; WO 93/21232; US 5,856,089; WO 94/22478; US 5,910,486; US 6,028,059; WO 96/07321; US5，804，396; US 5，846，749; EP 711,565; WO 96/16673; US 5,783,404; US 5,977,322; US 6,512,097; WO 97/00271; US 6,270,765; US 6,395,272; US 5,837,243; WO 96/40789; US 5,783,186; US 6,458,356; WO 97/20858; WO 97/38731; US 6,214,388; US 5,925,519; WO 98/02463; US 5,922,845; WO 98/18489; WO 98/33914; US 5,994,071; WO 98/45479; US 6，358，682 Bl; US 2003/0059790; WO 99/55367; WO 01/20033; US 2002/0076695 Al; WO (XV78347; WO 01/09187; WO 01/21192; WO 01/32155; WO 01/53354; WO 01/56604; WO 01/76630; WO02/05791; WO 02/11677; US 6,582,919; US 2002/0192652 Al; US 2003/0211530 Al; WO 02/44413; US 2002/0142328; US 6,602,670 B2; WO 02/45653; WO 02/055106; US 2003/0152572; US 2003/0165840; WO 02/087619; WO 03/006509; WO03/012072; WO 03/028638; US 2003/0068318; WO 03/041736; EP 1,357,132; US 2003/0202973; US 2004/0138160; US 5,705,157; US 6，123，939; EP 616,812 Bl; US 2003/0103973; US 2003/0108545; US 6,403,630 Bl; WO 00/61145; WO 00/61185; US 6,333,348 Bl; WO 01/05425; WO 01/64246; US 2003/0022918;US 2002/0051785 Al; US 6,767,541; WO 01/76586; US 2003/0144252; WO 01/87336; US 2002/0031515 Al; WO 01/87334; WO02/05791; WO 02/09754; US 2003/0157097; US 2002/0076408; WO 02/055106; WO 02/070008; WO 02/089842;和WO 03/86467。
HER2胞外结构域(ECD)通过蛋白水解从培养的乳腺癌细胞脱落(Petch a/., Mo/. Ce〃.伤o/. 10: 2973-2982 (1990); Scott d a/., JWb/. Ce〃. B/o/, 13: 2247-2257 (1993); Lee and Maihle， Owcogewe 16: 3243-3252(1998)),而且在有 些癌症患者的血清中有找到(Leitzel & a/., / C7/w. <9腳/. 10: 1436-1443
(1992) )。 HER2 ECD可能是转移性乳腺癌的血清标志物(Leitzel d C7Z". Owco/. 10: 1436-1443 (1992))，而且可能使得过表达HER2的肿瘤逃脱免疫学 控制(Baselga a/" C//". 14: 737-744 (1997》Brodowicz d a/.， /"f. 乂 C朋cw 73: 875-879 (1997))。脱落HER2 ECD血清水平代表患有过表达HER2 的转移性乳腺癌的患者中不良临床结果的独立标志物(Ali&fl/.，C7/". C/zem. 48: 1314-1320 (2002); Molina efa/" C7Z". Qmceri &s. 8: 347-353 (2002))。
截短的HER2胞外结构域还是通过使用内含子内的聚腺苷酸化信号产生 的2.3kb可变转录物的产物(Scott d a/., M /. CW/.脂.13: 2247-2257
(1993) )。可变转录物首先在胃癌细胞系MKN7中得到鉴定(Yamamoto a/., A^ww 319: 230-234 (1986); Scott "/.， Mo/. Ce〃. B/o/. 13: 2247-2257 (1993)),截短的受体位于核周细胞质内，而非由这些胂瘤细胞分泌(Scott" a/" Mo/. Ce〃.腺.13: 2247-2257 (1993))。
还鉴定到了 HER2的另一种可变剪接产物，称为"herstatin" ( Doherty ^ a/., Prac.淑/.爿cad Sc/. 96: 10869-10874 (1999); Azios d a/" O"cog麼20: 5199-5209 (2001); Justman and Clinton, 所o/. C/2e肌277: 20618-20624 (2002))。该蛋白质的组成是来自胞外结构域的亚结构域I和II，随后是由内 含子8编码的独特C-末端序列。
下面的观察结果提出了可能解释过表达HER2的肺瘤中的不良临床结果 的另一种机制，即在有些过表达HER2的肿瘤细胞中，受体受到未知金属蛋 白酶加工以产生截短的膜相关受体(有时称为"stub",也称为p95)、和可 溶性胞外结构域(也称为ECD、 ECD105或p105 )。
与其它HER受体一样，胞外配体结合结构域的丧失使得HER2胞内膜 相关结构域成为组成性活性酪氨酸激酶。因此推定HER2 ECD的加工产生可
将生长和存活信号直接投递至癌细胞的组成性活性受体。参见美国专利第
6,541,214号(Clinton)和美国专利申请第2004/0247602A1号(Friedman et al.)。 Saez ef a/.， C//". Owcer 12(2): 424-431 (January, 2006)报道了其肺瘤 表达高水平p95的患者具有比没有此类肿瘤的患者显著更差的结果。p95水 平现在只能通过Western印迹来测定。
发明概述
第一个方面，本发明关注用于抑制HER2脱落的方法，包括用有效抑制 HER2脱落的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂处理表达HER2的细胞。
另外，本发明提供了用于在哺乳动物中降低HER2胞外结构域(ECD)血 清水平的方法，包括对哺乳动物施用在哺乳动物中有效降低HER2 ECD血清 水平的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
还有一个方面，提供了用于在哺乳动物中治疗癌症的方法，包括对哺乳 动物施用有效治疗癌症的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
同样，本发明关注用于在哺乳动物中治疗HER抑制剂抗性癌症的方法， 包括对哺乳动物施用有效治疗癌症的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
还有一个方面，本发明涉及用于降低细胞中p95HER2水平的方法，包 括将细胞暴露于有效降低p95 HER2水平的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗 剂。
本发明还关注诊断(或预后)方法，包括评估来自癌症患者的样品中的 MMP-15 (MT7-MMP),其中升高的MMP-15水平或活性表明该患者具有升 高的p95 HER2和/或脱落HER2血清水平，和/或将具有不良临床结果。优 选的是，在该方法中评估MMP-15水平(蛋白质或核酸)并用于鉴定具有较 差预后的患者或将具有较差临床结果的患者。任选的是，患者的癌症进一步 展示出HER表达、扩增或活化，最优选HER2过表达或扩增。
附图简迷


图1提供了全长HER2蛋白质结构的示意图及其胞外结构域的结构域 I-IV (分别是SEQIDNO. 1-4)的氨基酸序列。
图2A和2B分别显示了 trastuzumab轻链(图2A; SEQ ID No. 5 )和重 链(图2B; SEQ ID No. 6 )的氨基酸序列。
图3A和3B显示了 pertuzumab轻链(图3A; SEQ ID NO. 7 )和重链(图 3B; SEQ ID NO. 8 )的氨基酸序列。CDR以粗体显示。轻链和重链的计算的 分子量是23,526.22 Da和49,216.56 Da (半胱氨酸为还原形式)。碳水化合物 模块(moiety)附着于重链的Asn 299。
图4描绘了 HER信号网络。
图5图示了与非过表达的乳腺癌细胞系(MCF-7)相比，trastuzumab对来 自过表达HER2的乳腺癌细胞系(SKBR3, MT474)的HER2 ECD脱落的抑制。
图6图示了 MMTVHER2转基因肺瘤(f2:1282肿瘤，trastuzumab敏感 的；和Fo5肺瘤，trastuzumab抵抗的)中p95 HER2和脱落的HER2 ECD水 平的差异。
图7描绘了用于鉴定HER2脱落酶的策略。
图8图示了证实脱落酶具有金属蛋白酶特性的实验。
图9显示了 MMTV-HER2肿瘤和细胞系中的MMP表达。MMP-15是用 于解释trastuzumab敏感的G:1282肺瘤和trastuzumab抵抗的Fo5肿瘤之间 的差异的候选物。
图10反映了 flag-HER2与MMP-15之间的相互作用。
图ll显示了 flagHER2-f2:1282和flagHER2-Fo5与MMP-15之间的相互 作用。f2:1282与Fo5之间的差异不能由MMP-15突变体的差异结合来解释。
图12图示了在MMTVHER2转基因小鼠中发现的体细胞突变。所示序 列是脱落酶位点(SEQ ID NO. 23)、野生型(WT) (SEQ ID NO. 24)、剪接(SEQ ID NO. 25)、 Fo5 (SEQ ID NO. 26)和￡2:3078.10 (SEQ ID NO. 27)。
图13描绘了体外脱落酶测定法的结果。gDHER29(DIV)-IgG是MMP-15 、 MMP-16、 MMP-19和MMP-25的催化结构域的底物。蛋白酶消化的序列是 MMP-15 (SEQ ID NO. 28)、 MMP-16 (SEQ ID NO. 29)、 MMP-19 (SEQ ID NO. 30)、MMP-25 (SEQ ID NO. 31)、所有其它(SEQ ID NO. 32);及用于HER2 ECD C-末端位点的(SEQ ID NO. 33)。
图14图示了证实MMP-15不修剪其它HER受体的实验结果。证实跨膜
结构域附近的序列变异的序列是HER2 (SEQ ID NO. 34)、EGFR (SEQ ID NO.
35)、 HER3 (SEQ ID NO. 36)、 HER4 (Jma) (SEQ ID NO. 37)和HER4 (Jmb)
(SEQ ID NO. 38)。
图15显示了 MMP-15 "全长"修剪HER2(+)-IgG。
图16展示了表明p95HER2组成性磷酸化但必须与HER3异二聚化以活 化Akt的实验。
图17显示了 MMP-15 RNA抑制剂(RNAi)在SKBR3和BT474细胞中降 低HER2 ECD脱落和p95 HER2水平。
图18图示了 SKBR3细胞中trastuzumab介导的生长抑制如何独立于对 HER2脱落的抑制。
图19展示了 Fo5异种移植肿瘤中对金属蛋白酶活性的抑制降低HER2 脱落和抑制p95 HER2水平。
图20描绘了基质金属蛋白酶(MMP)家族的成员。MMP家族成员依照结 构域结构分组。此图中所使用的缩写是PRE,前结构域(pre-domain); PRO， 原结构域(pro-domain); CAT,催化结构域；H，铰链；HEM，血红素结合蛋 白结构域；F,弗林蛋白酶(ftirin)切割共有结构域；FN，纤连蛋白样结构域； GPI,糖磷脂酰肌醇锚；TM,跨膜结构域；Ig,免疫球蛋白样结构域；CA， 半胱氨酸队列(array); CL,胶原样结构域。
优选实施方案的详述
I.定义
术语"基质金属蛋白酶"或"MMP"在本文中指作为基质金属蛋白酶 (MMP)超家族成员的蛋白质，其活性依赖Zn或Ca。 MMP在本文中包括前 蛋白原、成熟蛋白质及其变异形式。具有各种结构域的MMP的例子参见例 如本文中的图20。 MMP的综述有Wagenaar-Miller Ca"cer Metotos^ Aev/謹23: 119-135 (2004)。
"膜束绰的MMP(membrane-tethered MMP)"或"MT-MMP，，在本文中 指如上定义的MMP,其中所述MMP能够经跨膜(TM)结构域或糖磷脂酰肌 醇(GPI)锚附着于细胞膜。跨膜结构域锚定的MT-MMP的例子在本文中包括 MT1-MMP (MMP-14)、 MT2画MMP (MMP-15)、 MT3-MMP (MMP-16)、 MT5-MMP (MMP-24)。通过GPI锚锚定的MT-MMP的例子包括MT4-MMP (MMP-17)和MT6-MMP (MMP-25)。 MMP-15是本文中优选的MT陽MMP。
"MT2-MMP，，和"MMP-15"在本文中同义，描述NCB1数据库中的 前蛋白原NP_002415、包含其第132-699位氨基酸的成熟蛋白质、及其变 异形式。MMP-15的已知底物包括胶原、纤连蛋白、CD44和补体。MMP-15 在有些癌中上调，此蛋白酶的过表达增强肺瘤^f曼入和肺瘤细胞生长。
"MMP拮抗剂"指一定程度上结合和/或干扰至少一种MMP的蛋白水 解活性的药剂。优选的是，MMP拮抗剂选择性结合或抑制MMP但不显著 结合或抑制其它蛋白酶，诸如ADAM (解联蛋白(disintegrin)和金属蛋白酶) 家族的蛋白酶。MMP拮抗剂的例子在本文中包括结合MMP的抗体、小分 子抑制剂、^i拟MMP底物的假肽、结合MMP的催化性锌的非肽分子、分 离的MMP的天然组织抑制剂(TIMP)、核酸抑制剂诸如RNA或反义抑制剂、 等。
"MT-MMP拮抗剂"指一定程度上结合和/或干扰至少一种MT-MMP的 蛋白水解活性的药剂。优选的是，MT-MMP拮抗剂选择性结合或抑制 MT-MMP但不显著结合或抑制其它蛋白酶(包括不是膜束缚的其它MMP)。 MT-MMP拮抗剂的例子包括结合MT-MMP的抗体、小分子抑制剂、模拟 MT-MMP底物的假肽、结合MT-MMP的催化性锌的非肽分子、MT-MMP 的分离的天然组织抑制剂、MT-MMP核酸抑制剂诸如RNA或反义抑制剂、 等。
"MMP-15"拮抗剂"指一定程度上结合和/或干扰MMP-15的蛋白水解. 活性的药剂。优选的是，MMP-15拮抗剂选择性结合或抑制MMP-15但不显 著结合或抑制其它蛋白酶(包括MMP-15以外的MMP )。 MMP-15拮抗剂的 例子包括结合MMP-15的抗体、小分子抑制剂、模拟MMP-15底物的假肽、 结合MMP-15的催化性锌的非肽分子、MMP-15的分离的天然组织抑制剂、 MMP-15核酸抑制剂诸如RNA或反义抑制剂、等。
"MMP水平升高"指生物学样品诸如肿瘤样品中MMP的量超过MMP 的正常量，例如同一组织类型的正常或非肿瘤样品中的量。此类MMP(例 如MMP-15 )的正常量包括没有或检测不到的MMP-15的量。MMP水平升 高可以多种方式测定，包括那些测量MMP蛋白质或MMP核酸的方式。
"HER受体，，是属于HER受体家族的受体蛋白质酪氨酸激酶，包括 EGFR、 HER2、 HER3和HER4受体。HER受体包括天然序列HER受体及 其变体。优选的是，HER受体是天然序列人HER受体。
"全长"HER受体包含胞外结构域，它可结合HER配体和/或与另一 HER受体分子二聚化；亲脂性跨膜结构域；胞内酪氨酸激酶结构域；和羧基 末端信号结构域，它包含可磷酸化的几个酪氨酸残基。
术语"ErbBl"、 "HER1"、"表皮生长因子受体"和"EGFR"在本文中 可互换使用，指例如Carpenter " a/.，爿朋.i ev.所oc/zem. 56: 881-914 (1987)中 公开的EGFR，包括其变异形式(例如如Humphrey & 尸A^S (T7&i) 87: 4207-4211 (1990)中的删除突变体EGFR )。
表述"ErbB2，，和"HER2"在本文中可互换使用，指例如Semba " a/.,尸A^S (X/Si) 82: 6497-6501 (1985)和Yamamoto " a/" 319: 230-234 (1986)中
记载的人HER2蛋白(Genebank编号X03363 )及其变异形式，诸如可变剪 接形式(Siegel"a/,，五MB(9J: 18(8): 2149-2164 (1990))。
在本文中，"HER2胞外结构域，，或"HER2ECD"指HER2在细胞外的 结构域，或是锚定在细胞膜上，或是在循环中，包括其片段。在一个实施方 案中，HER2的胞外结构域可包含4个结构域"结构域I"(大约第1-195位 氨基酸残基；SEQIDNO: 1)、"结构域II"(大约第196-319位氨基酸残基； SEQ ID NO: 2 )、"结构域III"(大约第320-488位氨基酸残基；SEQ ID NO: 3 )和"结构域IV"(大约第489-630位氨基酸残基；SEQ ID NO: 4 )(残基 编号不包括信号肽)。参见Garrett a a/" M /. CW/. 11: 495-505 (2003); Cho " a/" TVa嫌421: 756-760 (2003); Franklin " "/., C彦w CW/ 5: 317-328 (2004); Plowman d "/.,A^/. ^c"d 90: 1746-1750 (1993)，以及本文中的图 1。
在本文中，"HER2脱落"指从表达HER2的细胞的细胞表面释放HER2 的可溶性胞外结构域(ECD)片段。此类脱落可能是由细胞表面HER2的蛋白 水解切割引起的，导致ECD片段从细胞表面释放，或者可溶性ECD或其片 —段可以由不同转录物编码。
"脱落HER2血清水平，，指哺乳动物的血清或循环中存在的HER2 ECD 的量。此类水平可通过多种技术评估，包括下列文献中所记载的Alida/., C/,w. C/zem. 48: 1314-1320 (2002); Molina a/., C/z'w. Ca脏r版8: 347-353 (2002); 1990年6月12日授权的美国专利第4,933,294号；1991年4月18曰 公开的WO 91/05264; 1995年3月28日授权的美国专利第5,401，638号；Sias W/,簡画/. M函oA 132: 73-80 (1990)。
在本文中，"脱落HER2血清水平升高，，指哺乳动物(例如人)血清中 脱落HER2或HER2 ECD的量超过正常哺乳动物(例如人)血清中存在的量。 HER2 ECD血清水平升高可能与晚期乳腺癌患者对内分泌疗法和化疗的预
后不良和响应降低有关。
表述"p95 HER2"在本文中指NH2末端截短的HER2蛋白质。通常， p95是膜结合的残留(stub)片段，可能是由蛋白酶或脱落酶切割全长HER2产 生的(Yuan ef a/., /Vo "'" Expmw/ow aw<i尸z^诉ca/7'ow 29: 217-222 (2003) )。 p95 可具有约95,000的分子量且可磷酸化(Molina a a/.， / e化mr;z 4744—4749 (2001))。 p95已经在有些乳腺癌样品中找到(Christianson a/., Ca"cerW& . 15: 5123-5129(1998))。
"p95水平升高"指癌细胞中的p95水平超过正常水平，例如与该癌细 胞同一组织类型的正常或非癌细胞中的水平。此类p95水平升高可能导致组 成性"[言号(constitutive signaling)和结节性转移(nodal metastasis) ( Molina a/.， C7/". Ga"cer i^searc/z 8: 347-353 (2002》Christianson "/., C""cer Way. 15: 5123-5129(1998))。
"评估"标志物，诸如MMP-15,指其诊断性和/或预后性分析，包括分 析标志物的存在与否、测量其量、和/或分析其活性(例如活性升高)。
具有"不良临床结果"的癌症患者指具有不良预后的癌症患者，他不大 可能响应癌症疗法，诸如化疗或使用HER2抗体诸如trastuzumab的疗法。— 临床结果可通过标准手段测量，诸如存活，包括没有疾病的存活等。
"ErbB3"和"HER3"指例如美国专利第5,183,884和5,480,968号以及 Kraus "a/., /WAS W&i) 86: 9193-9197 (1989)中公开的受体多肽，包括其变 异形式。
术语"ErbB4"和"HER4"在本文中指例如欧洲专利申请第599,274号； Plowman d a/"A^/. ^cad 90: 1746-1750 (1993); Plowman "
a/.， Atoww 366: 473-475 (1993)中公开的受体多肽，包括其变异形式，诸如 1999年4月22日出版的WO 99/19488中公开的同种型(isoform)。
"HER配体"指结合和/或活化HER受体的多肽。本文中特别感兴趣的 HER配体是天然序列人HER配体，诸如表皮生长因子(EGF)( Savage 伤o/. C/ze附.247: 7612-7621 (1972));转化生长因子cx (TGF-a)( Marquardt "a/" 5Wewce 223: 1079-1082(1984));双调蛋白，又称为施旺细胞瘤(schwannoma) 或角质形成细胞自分泌生长因子(Shoyab &&聽243: 1074-1076
(1989); Kimura " a/.,淑脏348: 257-260 (1990); Cook ef 组Ce〃.所o/. 11: 2547-2557 (1991) ); betacellulin( Shing "cr/., Sc/ewce 259: 1604-1607 (1993);Sasada "a/.， Sz'oc/zew. B/0p/7;AS. Commzm. 190: 1173 (1993));肝素纟吉合表 皮生长因子(HB-EGF) (Higashiyama a/.， 6We"ce 251: 936-939 (1991)); epiregulin ( Toyoda d a/., J!肠/. CTzem. 270: 7495-7500 (1995); Komurasaki d a/.， (9wcoge"e 15: 2841-2848 (1997)); a调蛋白(见下文)；神经调节蛋白-2 (NRG-2) (Carmway " a/.， A^ww 387: 512-516 (1997));神经调节蛋白-3 (NRG-3) ( Zhang "a/.,尸roc. 94: 9562-9567 (1997));神经调节
蛋白-4 (NRG-4) ( Harari " a/,， O"coge"e 18: 2681-89 (1999));和cripto (CR-1)
(Kannan 祝o/. C&w. 272(6): 3330-3335 (1997))。结合EGFR的HER
配体包括EGF、 TGF-a、双调蛋白、betacellulin、 HB-EGF和epiregulin。结 合HER3的HER配体包括调蛋白。能够结合HER4的HER配体包括 betacellulin、 epiregulin、 HB匿EGF、 NRG隱2、 NRG-3 、 NRG-4禾口调蛋白。
"调蛋白"(HRG)在用于本文时指由调蛋白基因编码的多肽，如美国专 利第5,641,869号或Marchionni ^a/.,淑,362: 312-318 (1993)中所公开的。 调蛋白的例子包括调蛋白-oc 、调蛋白-P 1、调蛋白-P 2和调蛋白-13 3( Holmes d a/.， 5We"ce 256: 1205-1210 (1992);美国专利第5,641,869号)；wew分化因 子(NDF)( Peles " a/., CW/ 69: 205，216 (1992));乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)
(Falls &a/.， Ce// 72: 801-815 (1993));神经胶质生长因子(GGF) ( Marchionni a/"淑,362: 312-318 (1993));感觉和运动神经元衍生因子(SMDF) (Ho a/., /編.C/zem. 270: 14523-14532 (1995)); y-调蛋白(Schaefer " a/.， Owcoge"e 15: 1385-1394(1997))。
"HER 二聚体"在本文中指包含至少两个HER受体的非共价结合二聚 体。在表达两种或多种HER受体的细胞暴露于HER配体时可形成此类复合 物，可通过免疫沉淀分离并通过SDS-PAGE，如例如Sliwkowski d a/.， 《/ 5/o/. Ozem. 269(20): 14661-14665 (1994)中所述的进行分析。此类HER二聚体的例 子包括EGFR-HER2、 HER2-HER3和HER3-HER4异二聚体。此外，HER 二聚体可包含与不同HER受体诸如HER3、 HER4或EGFR结合的两个或多 个HER2受体。其它蛋白质，诸如细胞因子受体亚基(例如gpl30)可与二 聚体结合。
"展示出HER表达、扩增或活化"的细胞、癌或生物学样品是在诊断 测试中表达(包括过表达)HER,具有扩增的HER基因，和/或以其它方式 展现出HER受体活化或磷酸化的细胞、癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过测量HER磷酸化)或间接(例如通过基因表达制谱或通过检测 HER异二聚体)测定。
"正R2受体过表达或扩增"的癌或肿瘤细胞是与同一组织类型的非癌 细胞相比，具有显著更高水平的HER2蛋白质或基因的癌症。这样的过表达 可以是由基因扩增或者转录或翻译增加引起的。可在诊断或预后测定法中通 过评估细胞表面上存在的HER2蛋白质水平的升高(例如通过免疫组化测定 法；IHC)来确定HER2的过表达或扩增。或者/另外，可测量细胞中的HER2 核酸水平，例如通过焚光原位杂交(FISH;参见1998年10月公开的WO 98/45479)、 Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)4支术，诸如定量实时PCR (qRT-PCR)。还可通过测量生物学流体诸如血清中的脱落HER2来研究HER2 过表达或扩增(参见例如1990年6月12日公告的美国专利第4,933,294号; 1991年4月18日公开的WO 91/05264; 1995年3月28日公告的美国专利第 5,401,638号；Sias " 。/.， J！ /國,/. MeAoA 132: 73-80 (1990))。除了上述测 定法之外，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者体内细 胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估抗 体与患者体内细胞的结合，例如通过放射活性外部扫描或通过分析取自事先
已暴露于所述抗体的患者的活检。
相反，"HER受体不过表达或扩增"的癌或肿瘤细胞是与同一组织类型 的非癌细胞相比，没有高于正常水平的HER受体蛋白质或基因的癌症。抑 制HER二聚化的抗体，诸如pertuzumab，可用于治疗HER2受体不过表达 或扩增的癌。
"HER抑制剂"指干扰HER活化或功能的药剂。HER抑制剂的例子包 括HER抗体(例如EGFR、 HER2、 HER3或HER4抗体)；HER 二聚化抑 制剂；EGFR靶向药物；小分子HER拮抗剂；HER酪氨酸激酶抑制剂；HER2 和EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂，诸如lapatinib/GW572016;反义分子(参 见例如WO 2004/87207 );和/或结合下游信号分子诸如MAPK或Akt或干扰 其功能的药剂。优选的是，HER抑制剂是结合HER受体的抗体或小分子。 HER抑制齐'J的具体例子包才舌trastuzumab、 pertuzumab 、 cetuximab、 ABX-EGF、 EMD7200、 gefitinib、 erlotinib、 CP724714、 CI1033、 GW572016、 IMC-11F8 和TAK165。
"HER二聚化抑制剂"指抑制HER二聚体形成的药剂。优选的是，
HER 二聚化抑制剂是抗体，例如在HER2的异二聚体结合位点结合HER2 的抗体。本文中最优选的二聚化抑制剂是Pertuzumab或单克隆抗体2C4 (MAb 2C4)。 HER 二聚化抑制剂的其它例子包括结合EGFR并抑制其与一种 或多种其它HER受体二聚化的抗体(例如EGFR单克隆抗体806, MAb 806, 它结合活化的或"未束缚的(untethered)，，EGFR;参见Johns e^/.,J所o/. C/zem. 279(29): 30375-30384 (2004));结合HER3并抑制其与一种或多种其它HER 受体二聚化的抗体；结合HER4并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚 化的抗体；肽二聚化抑制剂(美国专利第6,417,168号);反义二聚化抑制剂； 等。
"HER抗体"指结合HER受体的抗体。任选的是，HER抗体还干扰 HER活化或功能。优选的是，HER抗体结合HER2受体。本文中特别感兴 趣的HER2 4元体是trastuzumab和pertuzumab。 EGFR抗体的例子包招: cetuximab、 ABX0303、 EMD7200和IMC-11F5。
"HER活化"指任何一种或多种HER受体的活化或磷酸化。通常，HER 活化导致信号转导(例如由HER受体胞内激酶结构域引起的，磷酸化HER 受体或底物多肽中的酪氨酸残基—)。HER活化可由结合包含.目的HER受体的 HER 二聚体的HER配体介导。结合HER 二聚体的HER配体可活化二聚体 中 一种或多种HER受体的激酶结构域，由此导致一种或多种HER受体中酪 氨酸残基的磷酸化和/或其它底物多肽，诸如Akt或MAPK胞内激酶中酪氨 酸残基的磷酸化。
"磷酸化"指向蛋白质，诸如HER受体或其底物添加一个或多个磷酸基团。
"抑制HER二聚化"的抗体指抑制或干扰HER二聚体形成的抗体。优 选的是，这样的抗体在HER的异二聚体结合位点结合HER2。本文中最优选 的二聚化抑制性抗体是pertuzumab或MAb 2C4。抑制HER 二聚化的抗体的 其它例子包括结合EGFR并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗 体(例如EGFR单克隆抗体806, MAb 806,它结合活化的或"未束缚的 (untethered)" EGFR;参见Johns " 《/所o/. CTzem. 279(29): 30375-30384 (2004));结合HER3并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体； 及结合HER4并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体。
HER2上的"异二聚体结合位点"指形成二聚体时，与EGFR、 HER3
或HER4胞外结构域中某区域接触或形成介面的HER2胞外结构域中的区 域。已发现所述区域在HER2的结构域II中。Franklin & "/., Owe" CW/ 5: 317-328 (2004)。
HER2抗体可以是像trastuzumab那样"抑制HER2胞外域切割，，的抗体 (Molina d， C"聰r紐61: 4744-4749(2001)),或者可以是像pertuzumab 那样不显著抑制HER2胞外域切割(ectodomain)的抗体。
"结合HER2的异二聚体结合位点的"HER2抗体结合结构域II中的残
III中的残基)，且至少在一定程度上可在空间上阻碍HER2-EGFR、 HER2-HER3或HER2画HER4异二聚体的形成。Franklin " a/., C""cer Ce〃 5: 317-328 (2004)表征了存放在RCSB蛋白质数据库(ID Code IS78 )的 HER2-Pertuzumab晶体结构，举例说明了结合HER2的异二聚体结合位点的 例示性抗体。
"结合HER2的结构域II的"抗体结合结构域II中的残基和任选HER2 的其它结构域，诸如结构域I和III中的残基。优选的是，结合结构域II的 抗体结合HER2的—结构域I、 II和III之间的连接处。
"天然序列，，多肽指与衍生自自然界的多肽(例如HER受体或HER配 体)具有相同氨基S^f列的多肽。此类天然序列多肽可以从自然界分离，或 者可通过重组或合成手段生成。如此，天然序列多肽可具有天然存在人多肽、 鼠多肽、或来自任何其它哺乳类物种的多肽的氨基酉M列。
术语"抗体，，在本文中以最广义使用，明确覆盖完整的单克隆抗体、多 克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、 及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
术语"单克隆抗体"在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗 体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的 过程中可能产生的可能变体外，而此类变体通常以极小量存在。此类单克隆 抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中结合靶物的多肽序列 是通过包括从多种多肽序列中选择结合靶物的单一多肽在内的过程得到的。 例如，选择过程可以是从多种克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA 克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，选择的结合靶物的序列可进一步改 变，例如提高对靶物的亲和力、将结合靶物的序列人源化、提高其在细胞培
养物中产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改 变后的结合靶物的序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对 不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备 物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆 抗体制备物的优势在于它们未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语"单克隆" 指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定 方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来
生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler e/a/.， A^we 256: 495 (1975); Harlow " d/"爿77幼oWes, j丄a60rato7 Ma"wa/, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988; Hammerling ^ a/.， in: Mowoc/ora/ Jw幼Wey PCW/外6r/(icway, 563-681, Elsevier, N.Y" 1981 )、重组DNA法(参见例如美国专利第4,816,567 号)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson & a/.， A^ww 352: 624-628 (1991); Marks " a/., J Mo/. 5/o/. 222: 581-597 (1991); Sidhu d a/., J! Mo/. 5/o/. 338(2): 299-310 (2004); Lee " a/.， Mo/. Sfo/. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, 户rac. Ato, Jc^/. 6W. "5^ 101(34): 12467-12472 (2004); Lee /附mimo/. MeAoA 284(1-2): 119-132 (2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白 基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术 (参见例如WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits a/.，A^/.力cao . 5W. 90: 2551 (1993);
Jakobovits d a/" 362: 255-258 (1993); Bruggemann a/.，肠r
/mww"o. 7: 33 (1993);美国专利第5,545,806号；第5，569,825号；第5,591,669 号(都授予GenPharm );美国专利第5,545,807号；WO 1997/17852;美国专 利第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第 5,633,425号；第5，661,016号；Marks 肠/7fecW， 10: 779-783 (1992); Lonberg " 淑廳368: 856-859 (1994); Morrison,淑匿368: 812-813 (1994); Fishwild d a/.，淑匿5/o欣/7"o/ogy 14: 845-851 (1996); Neuberger， A^a wre 5/ofec/z"o/ogy 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, /wferw. Z ev. /附wmwo/. 13: 65-93 (1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括"嵌合"抗体，其中重链和/或轻链的一部 分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同 或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类別或亚类的抗
体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望生
物学活性(美国专利第4,816,567号；Morrison a "/.，A^/. ^c^/. 5W. 81: 6851-6855 (1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类 (例如旧大陆猴类(Old World Monkey)、猿等)的可变区抗原结合序列和人 恒定区序列的"灵长类化"抗体。
"抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片 段的例子包括Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体 分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
"完整抗体"在本文中指包含两个抗原结合区及Fc区的抗体。优选的 是，完整抗体具有一项或多项效应器功能。
根据其重链恒定区氨基酸序列，完整抗体可归入不同的"类"。完整抗 体有五种主要的类IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM,其中有些可进一步分为 "亚类"(同种型)，例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl和IgA2。将与抗 体的不同类对应的重链恒定区分别称作a、 5、 s、 y和P。不同类的免疫球蛋 白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
抗体"效应器功能"—指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸 序列变体Fc区)的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合； 补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调；等。
"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，，和"ADCC"指由细胞介导的反应， 其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、 嗜中性粒细胞和巨喧细胞)识别輩巴细胞上结合的抗体，随后？ 1起靶细胞溶解。 介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcyRIII，而单核细胞表达FcyRI、 FcyRII和FcyRin。 Ravetch and Kinet, 触/麵画/. 9: 457-92 (1991)第 464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性， 可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利第5,500,362或5,821,337号中所记 载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然 杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在 动物模型中,诸如Clynes " < 95: 652-656 (1998)中所披露的。
"人效应细胞"指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优 选的是，该细胞至少表达FcYRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的 人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核 细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细 胞可以从其天然来源分离，例如血液或PBMC ，如本文中所描述的。
术语"Fc受体"或"FcR"用于描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR 是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(y受体)，包 括FcyRI、 FcyRII和FcyRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变 剪接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA("活化受体")和FcyRIIB("抑制受体")， 它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FqRUA 在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体 FcyRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参 见综述Dagron, Wev. /w附w"o/. 15: 203-234 (1997))。 FcR的综述参见
Ravetch and Kinet， i ev. /mwww/. 9: 457-492 (1991); Capel ^ a/.，
Imm画methods 4: 25-34 (1994); de Haas " a/" ￡4 C7/w. Med 126: 330-41 (1995)。术语"FcR"在本文中涵盖其它FcR,包括那些未来将会鉴定的。该 术语还包括新生儿受体，FcRn,它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer"a/., /mm朋o/, 117: 587 (1976)和Kim " a/., J /附m柳o/. 24: 249 (1994))及调控免 疫球蛋白的动态平衡。
"补体依赖性细胞毒性"或"CDC"指在存在补体时分子溶解靶物的能 力。补体激活途径是由补体系统第 一组分(Clq)结合与关联抗原复合的分子 (例如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如 Gazzano-Santoro a/.,/mmww /. Afe决o^s 202: 163 (1996)中所i己载的。
"天然抗体，，指通常由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的 约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链 连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链 和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有可变区(vh)，接 着是多个恒定区(Ch)。每条轻链在一端具有可变区(VO，而另一端是恒定区 (C0。轻链的恒定区与重链的第一恒定区排列在一起，而轻链的可变区与重 链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形 成界面。
术语"可变的"指可变区中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每 种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性并非均匀分
布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区的三个区 段。可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变
区各自包含四个FR,它们大多采取(3-折叠片构象，通过形成环状连接且在 有些情况中形成|3-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区 通过FR非常接近的保持在一起，并与另 一条链的高变区一起促成抗体的抗 原结合4立点的形成(参见Kabat等人，《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第5版,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD， 1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功 能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语"高变区"在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高 变区通常包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如轻链可变 区中的残基24-34 (Ll)、 50-56 (L2)和89-97 (L3)及重链可变区中的残基31-35 (Hl)、 50-65 (H2)和95-102 (H3); Kabat等人，《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第5版,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)和/或那些来自"高变环"的残基(例如轻链 可变区中的残基26-32 (Ll)、 50-52 (L2)和91-96 (L3)及重链可定区中的残基 26-32 (Hl)、 53-55 (H2)和96-101 (H3); Chothia and Lesk, Mo/.脂.196: 901-917 (1987))。"框架区"或"FR"残基指可变区中除本文中所定义的高 变区残基外的那些残基。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作"Fab"片 段，各自具有一个抗原结合位点，和一个残余"Fc"片段，其名称反映了它 易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')2片段，它具有两个抗原结合 位点且仍能够交联抗原。
"Fv"是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧 密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在 这种构造中，各可变区的三个高变区相互作用而在V『VL二聚体表面上确定 了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而， 即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有 识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。 Fab'片段与 Fab片段的不同之处在于重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基，包括
来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定区半 胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是 作为在Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片 段的其它化学偶联。
根据其恒定区氨基酸序列，来自任何脊推动物物种的抗体"轻链"可归 入两种截然不同类型中的一种，称作卡巾自(k)和拉姆达(X)。
"单链Fv"或"scFv"抗体片^a包含抗体的Vh和VL结构域，其中这 些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，Fv多肽在Vh和VL结构域之间 还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综 述参见Pltickthun， 在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中，第 113巻，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag， New York,第269-315页， 1994。 HER2抗体scFv片段记载于W093/16185;美国专利第5,571,894号； 和美国专利第5,587,458号。
术语"双抗体"指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同
一条多肽链(VH-VJ中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过
使用过短的接头使得同 一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与 另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载 于例如EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger " a/"尸腦.廳.^cW, 脂 卯6444-6448 (1993)。
非人(例如啮齿类)抗体的"人源化，，形式指最低限度包含衍生自非人 免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白 (受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种 (供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球 蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基 替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。 进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。 一般而言，人源化抗体将包含 至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个高变环 对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白 序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常 是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones W fl/.， A/flfwe 321: 522-525 (1986); Riechmanna/"淑,332: 323-329 (1988); Presta, C脏Op.
肠/. 2: 593-596(1992)。
人源化HER2抗体包括huMAb4D5-l、 huMAb4D5-2、 huMAb4D5-3、 huMAb4D5陽4、 huMAb4D5匿5、 huMAb4D5-6、 huMAb4D5-7和huMAb4D5-8 或Trastuzumab (HERCEPTIN ),如美国专利第5,821,337号表3中所述， 明确收入本文作为参考；人源化520C9( WO 93/21319 );及人源化2C4抗体， il"^口 pertuzumab， ^口4^i^戶斤ii。
为了本发明的目的，"trastuzumab，'、 "HERCEPTIN "和"huMAb4D5-8" 指包含分别在SEQ ID No. 5和6中的轻链和重链氨基S臾序列的抗体。
在本文中，"pertuzumab"和"OMNITARGTM，，指包含分别在SEQ ID No. 7和8中的轻链和重链氨基酸序列的抗体。
"棵抗体，，指未偶联异源分子，诸如细胞毒性模块(moiety)或放射性标 i己对勿的4;H。
"分离的"抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回 收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物 质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的 实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95%， 最优选重量超过99%,(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的 N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染色的 还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体天然环境的至 少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而， 分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
"亲和力成熟的"抗体指在其一个或多个高变区中具有导致抗体对抗原 的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的一处或多处改变的抗
体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔水平的对靶抗原的 亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知流程生成。Marks d a/., 所o/rec/wo/ogy 10: 779-783 (1992)记载了通过VH和VL结构域改组的亲和力 成熟。下列文献记载了 CDR和/或框架残基的随机诱变Barbas " a/.,户rac. Ato. Jcadt/5^ 91: 3809-3813 (1994); Schier " a/" 169: 147-155
(1995); Yelton " a/.， J /顯,/. 155: 1994-2004 (1995); Jackson d /mwww /. 154(7): 3310-9 (1995); Hawkins e a/., / Mo/. Ao/. 226: 889-896 (1992)。术语"主要种类抗体，，在本文中指组合物中作为数量上主要抗体分子的 抗体结构。
"氨基酸序列变体"抗体在本文中指具有与主要种类抗体不同的氨基酸 序列的抗体。通常，氨基酸序列变体将与主要种类抗体具有至少约70%的同 源性，而且优选的是，它们将是与主要种类抗体至少约80%，更优选至少约 90%同源。氨基酸序列变体在主要种类抗体氨基酸序列内部或邻近的某些位 置具有替代、删除和/或添加。
"糖基化变体，，抗体在本文中指附着有一种或多种碳水化合物模块且所 述碳水化合物与附着于主要种类抗体的 一种或多种碳水化合物模块不同的 抗体。
"脱酰胺"抗体指其中一个或多个天冬酰胺残基衍生成例如天冬氨酸、 琥珀酰亚胺或异天冬氨酸的抗体。
术语"癌症'，和"癌性，，指的是或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长 不受调节的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包 括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、
神经内分泌肿瘤 (包括类癌胂瘤(carcinoid tumor)、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、 间皮瘤、施旺细胞瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、及白血病 或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状 细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌 和肺的鳞癌、腹膜癌症、肝细胞癌症、胃癌症包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质 细月包瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳 腺癌(包括转移性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子 宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、 肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆管肿瘤、以及头和颈癌。
具有"HER抑制剂抗性癌症"的哺乳动物指在接受基于HER抑制剂的 疗法时病情仍有发展的哺乳动物(即患者"对HER抑制剂有抗性")，或是 在基于HER抑制剂的治疗方案完成后12个月内(例如6个月内)病情有发 展的哺乳动物。基于HER抑制剂的疗法包括使用棵露的(naked)或偶联的 HER抑制剂的疗法，其中作为单一药剂或与其它抗肿瘤药联合施用HER抑 制剂。HERj卬制剂可以是trastuzumab、 pertuzumab、 cetuximab、 ABX-EGF、 EMD7200、 gefitinib、 erlotinib、 CP724714、 CI1033、 GW572016、 IMC-11F8
或TAK165, 优选trastuzumab 。
为了治疗的目的，"哺乳动物"指归入哺乳类的任何动物，包括人，家 畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。优选的是， 哺乳动物指人。
"肿瘤样品"在本文中指衍生自患者肿瘤或包含来自患者肿瘤的肿瘤细 胞的样品。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活;险、循环中的肿瘤 细胞、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代 细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包 埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
"固定的"肿瘤样品指已经使用固定剂以组织学方法保存的样品。 "福尔马林固定的，，肿瘤样品指使用曱醛作为固定剂保存的样品。 "包埋的"肿瘤样品指用坚固的且通常是硬的介质诸如石蜡、蜡、火棉 或树脂包围的样品。包埋使得有可能切出薄片供显微镜检查或生成组织微阵 列(TMA)。
"石蜡包埋的"肿瘤样品指用衍生自石油的固体碳氢化合物的纯化混合
物包围的样 品o 一
在本文中，"冷冻的，，肿瘤样品指正在或曾经冷冻的肿瘤样品。 "生长抑制剂"在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是表达
HER的癌细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处 于S期的表达HER的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞 周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导Gl停滞和M期停滞的 药剂。经典的M期阻断剂包括长春碱类(vincas)(长春新石威(vincristine)和长 春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓朴异构酶II抑制剂诸如多柔比 星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊香 (et叩oside)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞Gl的药剂也溢出进入S期停滞， 例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴 口秦(dacarbazine)、双氯乙基曱胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、曱氨蝶呤 (methotrexate)、 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《The Molecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为"Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs ，， ， Murakami 等人,WB Saunders, Philadelphia, 1995，尤其是第13页。
细胞生长的抗体。优选的生长抑制性HER2抗体在约0.5-30吗/ml的抗体浓 度对细胞培养中SK-BR-3乳腺肿瘤细胞的生长抑制大于20%，优选大于50% (例如约50%至约100% )，其中生长抑制是在SK-BR-3细胞暴露于抗体后6 天测定的(参见1997年10月14日公告的美国专利第5，677，171号)。该专 利及下文中更详细的描述了 SK-BR-3细胞生长抑制测定法。优选的生长抑制 性抗体是鼠单克隆抗体4D5的人源化变体，例如trastuzumab。
"诱导凋亡"的抗体指根据膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、 内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜嚢(称作凋亡小体)形成的测定，诱导程序 性细胞死亡的抗体。所述细胞通常是过表达HER2受体的细胞。优选的是， 所述细胞是肿瘤细胞，例如乳房、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、 结肠、甲状腺、胰或膀胱细胞。在体外，所述细胞可以是SK-BR-3、 BT474、 Calu3纟田月包、MDA-MB-453、 MDA-MB-361或SKOV3纟田月包。有多种方法可 用于评估与凋亡有关的细胞事件。例如，可通过膜联蛋白结合来测量磷脂酰
丝氨酸(PS)易位；可通过DNA梯化(laddering)来评估DNA断裂；可通过亚 二倍体细胞的任何增加来评估伴随着DNA断裂的核/染色质浓缩。优选的是， 诱导凋亡的抗体是在使用BT474细胞的膜联蛋白结合测定法(见下文)中， 相对于未处理细胞，导致约2至50倍，优选约5至50倍，最优选约10至 50倍的诱导膜联蛋白结合的抗体。诱导凋亡的HER2抗体的例子有7C2和 7F3。
"表位2C4"指HER2的胞外结构域中抗体2C4所结合的区域。为了筛 选结合2C4表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如《Antibodies, A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow和David Lane, 1988中所记载的。优选的是，所述抗体将2C4对HER2的结合阻断 约50°/。或更多。或者，可进行表位作图以评估抗体是否结合HER2的2C4 表位。表位2C4包含来自HER2胞外结构域中结构域II的残基。2C4和 Pertuzumab在结构域I、 II和III的连接处结合HER2的胞外结构域。Franklin d a/" Ca廳r Ce〃 5: 317-328 (2004)。
"表位4D5"指HER2的胞外结构域中抗体4D5 ( ATCC CRL 10463 ) 和Trastuzumab所结合的区域。此表位接近HER2的跨膜结构域，且在HER2 的结构域IV内。为了筛选结合4D5表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测
定法,诸如《Antibodies, A Laboratory Manual》,Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow和David Lane， 1988中所记载的。或者，可进行表位作图以评估 抗体是否结合HER2的4D5表位(例如HER2 ECD的大约第529位(含该位 点)残基至大约第625位(含该位点)残基区域内的任何一个或多个残基，该残 基编号包括信号肽)。
"表位7C2/7F3"指HER2的胞外结构域的结构域I内N末端处7C2和 /或7F3抗体(各自保藏于ATCC,见下文)所结合的区域。为了筛选结合 7C2〃F3表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如《Antibodies, A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow和David Lane， 1988中所记载的。或者，可进行表位作图以确定抗体是否结合HER2上的 7C2/7F3表位(例如HER2 ECD的大约第22位残基至大约第53位残基区域 内的任何一个或多个残基，残基编号包括信号肽)。
"处理"和"治疗"(treatment)指治疗性处理和预防性措施二者。需要 治疗的受试者包括那些早就患有疾病的以及要预防疾病的。因此，本文中待 治疗的患者可能已经诊断为患有疾病或者可能有患上疾病的倾向性或易感 性。 .
术语"有效量"指在患者中有效治疗癌症的药物量。有效量的药物可减 少癌细胞的数目；缩小肿瘤的大小；抑制(即一定程度的减緩和优选阻止) 癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减緩和优选阻止)肿瘤转移； 一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与癌症有关的症 状。药物可一定程度上阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞，它可以是 抑制细胞的和/或毒害细胞的(细胞毒性的)药物。有效量可延长无进展存活 (progression free survival),导致客观响应(包括部分响应，PR或完全响应， CR)，增加总体存活时间，和/或改善癌症的一种或多种症状。
"完全响应(complete response)"或"完全消退"指癌症的所有症状响应 治疗而消失。这并不总是意味着癌症得到治愈。
"部分响应"指一处或多处肿瘤或损伤的大小或癌症在身体中的范围响 应治疗而缩小。
术语"细胞毒剂"在用于本文时指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞 破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、 I131、 I125、 Y9G、 Re186、 Re'88、 Sm153、 Bi212、 P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸
如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和 /或变体。
"化疗剂"指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂
类(alkylating agents),诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN 环磷酰胺 (cyclophosphamide);石黄酸》克基酯类(alkyl sulfonates), i者如白消安(busulfan)、 英丙舒凡(improsulfan)牙口派泊舒凡(piposulfan); 氮丙p定类(aziridines)，诸i口苯 佐替y泉(benzodepa)、 卡〉皮酉昆(carboquone)、 美妥替》泉(meturedepa)和乌瑞替》泉 (uredepa); 乙撑亚胺类(ethylenimines)和曱基蜜胺类(methylamelamines)， 包 括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙4掌石克i^石粦酰胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羟曱蜜胺(trimethylolomelamine); TLK 286 ( TELCYTA );番荔枝内酯 类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)); 四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol), MARINOL ); (3-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素类(colchicines);白桦脂酸 (betulinic acid);喜初于石咸(camptothecin)(包4舌合成类似物4乇泊替康(topotecan) (HYCAMTIN )、 CPT-11 (伊立替康(irinotecan), CAMPTOSAR )、乙酰 喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin); callystatin; CC-1065 (包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和 比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸 (podophyllinic acid);替尼泊苦(teniposide);隐藻素类(cryptophycins)(对争另'J是 隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin); duocarmycin (包括合成类似 物，KW-2189和CB1-TM1 ); 艾榴塞洛素(eleutherobin); pancratistatin; sarcodictyin;》每纟帛承卩素(spongistatin);氮芥类(nitrogen mustards), i者长口苯丁&臾 氮芥(chlorambucil)、茶氮齐(chlornaphazine)、月旦石粦醜胺(cholophosphamide)、 雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基曱胺 (mechlorethamine)、 盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美法 仑(mdphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司 汀(prednimustine)、曲石粦胺(trofosfamide)、尿嘧卩定氮芥(uracil mustard); 亚硝 脲类(nitrosoureas), i者如卡莫司汀(carmustine)、 氯脲菌素(chlorozotocin)、福 莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀 (ranimustine); 二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate); 抗 生素类，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)， 尤其是加利车霉素yll和加利车霉素coll (参见例如Agnew, C/2em.
33: 183-186 (1994))和蒽环类抗生素(anthracyclines)诸如annamycin、 AD 32 、 alcarubicin 、 柔红霉素(daunorubicin)、 右雷佐生(dexrazoxane)、 DX-52-1、表柔比星(epirubicin)、 GPX-100、伊达比星(idarubicin)、 KRN5500、 美诺立尔(menogaril)、 dynemicin包括dynemicin A、埃斯波霉素(esperamicin)、 新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克 拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、 氛茴霉素(anthramycin)、 偶 氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C (cactinomycin)、 carabicin 、 洋红霉素(carminomycin)、 嗜癌霉素(carzinophilin)、 色霉素 (chromomycin)、放线菌素D (dactinomycin)、地托比星(detorubicin)、 6-二氮 -5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔 比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、多柔比星脂质体和脱氧多 柔比星)、依索比星(esorubicin)、麻西罗霉素(marcellomydn)、丝裂霉素类 (mitomycins)诸如丝裂霉素C、 霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素 (nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、 potfiromycin、 噤呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链 黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美 司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin);叶酸类似物，诸 如二曱叶酸(denopterin)、虫莱酰三谷氨酸(pteropterin)和三曱曲沙(trimetrexate); 嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、 6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、石克咪 。票呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物，诸如安西他滨 (ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、 6_氮尿苷、卡莫氟(carmofUr)、阿糖胞苷 (cytarabine)、 双脱氧尿芬(dideoxyuridine)、去氧氟尿香(doxifluridine)、依i若 他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine); 雄激素类，诸如卡鲁睾酉同 (calusterone)、 丙酉吏屈 <也i#酉同(dromostanolone propionate)、 表石危力#酉享 (epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone);抗肾上腺类，诸 如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane);叶 酸补充剂，诸如亚叶酉l(folinic acid)(leucovorin);醋葡醛内酯(aceglatone);抗 叶酸(盐/酯)抗瘤剂，诸如ALIMTA⑧、LY231514培美曲塞(pemetrexed)、 二氢叶酸还原酶抑制剂诸如曱氨喋呤(methotrexate)、抗代谢物类，诸如5-
氟尿嘧啶OFU)及其前药诸如UFT、 S-l和卡培他滨(capecitabine),及胸苦酸 合酶抑制剂和甘氨酰胺核糖核苷酸曱酰基转移酶抑制剂诸如雷替曲塞 (raltitrexed) ( TOMUDEX , TDX); 二氢嘧咬脱氢酶抑制剂诸如恩尿嘧咬 (eniluracil); 醛磷酰胺糖芬(aldophosphamide glycoside); 氨基乙敞丙酸 (aminolevulinic acid); 安口丫咬(amsacrine); bestrabucil; 比生群(bisantrene); 依达曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖 酉昆(diaziquone) ; elfornithine ; 依利醋4妄(elliptinium acetate); ^矣》皮審素 (epothilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓；羟脲(hydroxyurea);香菇多糖 (lentinan); 氯尼达明(lonidamine); 美登木素生物石威类(maytansinoids), i者^口 美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin); 米4乇胍月宗(mitoguazone); 米4乇 蒽酉昆(mitoxantrone);莫口底达醇(mopidamol); 二胺硝吖口定(nitracrine);喷司他 丁 (pentostatin); 蛋氨氮芥(phenamet); 吡柔比星(pirarubicin); 洛索蒽醌 (losoxantrone); 2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine); PSK 多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);根霉素 (rhizoxin); 西索菲兰(sizofiran); 螺旋锗(spirogermanium);纟田交链孑包菌S同酸 (tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone); 2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢菌素类 (trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin) A、杆孢菌素(roridin) A和蛇行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine)( ELDISINE , FILDESIN );达卡巴。秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine); 二溴甘 露醇(mitobronitol); 二溴卫矛醇(mitolactol); 旅泊溴烷(pipobroman); gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside) ( "Ara陽C，，)；环石舞酰胺(cyclophosphamide); 塞替派(thiotepa);类紫杉醇类(taxoids)和紫杉烷类(taxanes)，例如TAXOL 紫杉醇(paclitaxel) ( Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、 ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉 醇(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois )和TAXOTERE 多西他塞(docetaxel) ( Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony， France); 苯丁酸氮芥 (chlorambucil);抗代谢物化疗剂，诸如吉西他滨(gemcitabine) ( GEMZAR ); 5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(capecitabine) (XELODATM)、 6-巯基嘌呤、曱 氨喋呤(methotrexate)、 6J危鸟嘌呤(thioguanine)、培美曲塞(pemetrexed)、雷 ^齐曲塞(raltitrexed)、 阿4唐月包芬(arabinosylcytosine ARA-C cytarabine) (CYTOSAR-U )、达卡巴嗪(dacarbazine) ( DTIC-DOME )、 azocytosine、
deoxycytosine、 pyridmidene、 氟达拉滨(fludarabine) ( FLUDARA )、克拉屈 滨(cladrabine)、和2-脱氧-D-葡萄糖；6-硫鸟。票呤(thioguanine);巯基噪呤 (mercaptopurine); 基于4白的化疗剂，t者如卡柏(carboplatin)、顺柏(cisplatin) 或奥沙利钮(oxaliplatin); 长春碱(vinblastine) ( VELBAN );依托泊苷 (etoposide) (VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);长 春新i威(vincristine) ( ONCOVIN );长春花生物石威类(vinca alkaloid);长春瑞 滨(vinorelbine) (NAVELBINE );能灭瘤(novantrone);依达曲沙(edatrexate); 道诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希罗达(xeloda);伊本膦酸 盐(ibandronate);拓朴异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟曱基鸟氨酸(DMFO);类 维A酸(retinoids),诸如视黄酸(retinoic acid);任何上述物质的药学可接受盐、 酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多 柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX (奥沙利铂
(ELOXATIN )联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
该定义还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如抗雌 激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)
(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、—雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬 (droloxifene)、 4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、 LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON⑧托瑞米芬(toremifene);抑 制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪 唑、氨鲁米特(aminoglutethimide) 、 MEGASE 醋酸曱地孕酮(megestrol acetate) 、 AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔峻 (fadrozole) 、 RIVISOR 伏罗唑(vorozole) 、 FEMARA 来曲唑(letrozole)和 ARIMIDEX⑧阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、 尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞4木(leuprolide)和戈舍 瑞林(goserelin);以及曲沙他滨(troxacitabine) ( 1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似 物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制涉及粘着细胞增殖的信号途经中的基 因表达的，诸如例如PKC-a、 Raf、 H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫 苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和 VAXID⑧疫苗；PROLEUKIN rIL-2; LURTOTECAN⑧拓朴异构酶1抑制剂； ABARELIX⑧rmRH;及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
"抗血管发生剂，，指阻断或一定程度的干扰血管发育的化合物。抗血管
小分子或抗体。在本文中优选的抗血管发生因子是结合血管内皮生长因子
(VEGF)的抗体，诸如bevacizumab ( AVASTIN )。
术语"细胞因子"是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细 胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多 肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-曱硫氨酰人生长激 素和牛生长激素；曱状旁腺素；曱状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松 驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促曱状腺激素(TSH)和促黄 体激素(LH);肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素； 肺瘤坏死因子-a和-P;穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关 肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO); 神经生长因子，诸如NGF-(3;血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)， 诸如TGF-a和TGF-p;胰岛素样生长因子-I和-II;红细胞生成素(EPO);骨 诱导因子(osteoinductive factor);干扰素，诸如干扰素-a、 -|3和-y;集落刺激 因子(CSF),诸如巨噬细胞CSF (M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF) 和粒细胞CSF(G-CSF);"白介素(IL)，诸如IL-1、 IL-la、 IL-2、 IL-3、 IL陽4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-ll、 IL-12;肿瘤坏死因子，诸如 TNF-a或TNF-(3;及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文 时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然 序列细胞因子的生物学活性等效物。
在用于本文时，术语"EGFR靶向药物"指结合EGFR并任选抑制EGFR 活化的治疗剂。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR 的抗体的例子包括MAb 579 ( ATCCCRLHB 8506)、 MAb 455 ( ATCC CRL HB 8507 )、 MAb 225 ( ATCC CRL 8508 )、 MAb 528 ( ATCC CRL 8509 )(参 见美国专利第4,943,533号，Mendelsohn等人)及其变体，诸如嵌合化225 (C225或Cetuximab; ERBUTIX )和重构人225( H225 X参见WO 96/40210， Imclone Systems Inc.); IMC-11F8,完全人的EGFR靶向抗体(Imclone );结 合II型突变体EGFR的抗体(美国专利第5，212,2卯号)；结合EGFR的人源 化和嵌合抗体，如美国专利第5,891,996号中所述；及结合EGFR的人抗体， 诸如ABX-EGF (参见WO 98/50433， Abgenix ); EMD 55900 ( Stragliotto a/., ￡紅 / Qz"cer 32A: 636-640 (1996)); EMD7200 ( matuzumab ),针对EGFR、
与EGF和TGF-a都竟争EGFR结合的人源化EGFR抗体；及mAb 806或人 源化mAb 806 ( Johns d a/., 所o/. Ozew. 279(29): 30375-30384 (2004))。抗 EGFR抗体可偶联细胞毒剂，如此产生免疫偶联物(参见例如EP 659,439 A2， Merck Patent GmbH )。结合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或Gefitinib (IRESSATM; Astra Zeneca ); CP-358774或Erlotinib ( TARCEVA ; Genentech/OSI);和AG1478、 AG1571 ( SU 5271; Sugen ); EMD-7200。
"酪氨酸激酶抑制剂"指抑制酪氨酸激酶诸如HER受体的酪氨酸激酶 活性的分子。此类抑制剂的例子包括上一段中提到的EGFR靶向药物；小分 子HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如可从Takeda购买的TAK165; CP-724，714, ErbB2受体酪氨酸激酶的口服选择性抑制剂(Pfizer and OSI);优先结合 EGFR但抑制HER2和EGFR 二者过表达细胞的双重HER抑制剂，诸如 EKB-569(可从Wyeth购买)；GW572016(可从Glaxo购买)， 一种口服HER2 和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从Novartis购买)；泛HER (pan-HER) 抑制剂,诸如canertinib ( CI-1033; Pharmacia); Raf画l抑制剂，诸如可从ISIS Pharmaceuticals购买、抑制Raf-1信号传导的反义剂ISIS-5132;非HER靶 向TK抑制剂，i者如可乂人Glaxo购买的Imatinib mesylate ( GLEEVACTM ); MAPK胞外调控激酶I抑制剂CI-1040 (可从Pharmacia购买)；喹唑啉类， 诸如PD 153035, 4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡咬并嘧咬类；嘧咬并嘧咬类；吡 咯并嘧啶类，诸如CGP 59326、 CGP 60261和CGP 62706;吡唑并嘧"定类， 4-(苯氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰曱烷，4,5-双(4-氟苯胺基)-狀亚胺)；含硝基p塞吩模块的tyrphostines; PD-0183805 ( Warner-Lambert); 反义分子(例如那些结合HER编码核酸的)；喹喔啉类(美国专利第5，804，396 号)；tryphostins(美国专利第5,804,396号)；ZD6474( Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG );泛HER抑制剂，诸如CI-1033 ( Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); Imatinib mesylate ( Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth ); Semaxinib ( Sugen ); ZD6474 ( AstraZeneca ); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone);或如任何下列专利出版物 中所记载的美国专利第5,804,396号；WO 99/09016 ( American Cyanimid ); WO 98/43960 ( American Cyanamid ); WO 97/38983 ( Warner Lambert); WO 99/06378 ( Warner Lambert); WO 99/06396 ( Warner Lambert ); WO 96/30347
(Pfizer， Inc.); WO 96/33978 ( Zeneca); WO 96/3397 ( Zeneca); WO 96/33980 (Zeneca )。
II.抑制HER2脱落
本申请关注用于抑制HER2脱落的方法，包括用有效抑制HER2脱落的 量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂处理表达HER2的细胞或将表达HER2的 细胞暴露于有效抑制HER2脱落的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。优选 的是，所述MMP拮抗剂是膜束缚MMP(MT-MMP)拮抗剂，诸如MTl-MMP (MMP-14) 、 MT2-MMP (MMP-15) 、 MT3-MMP (MMP-16) 、 MT5-MMP (MMP-24)、 MT4-MMP(MMP-17)或MT6-MMP(MMP-25)。最优选的是，所 述MT-MMP是MMP-15,而且希望，所述拮抗剂选择性或优先结合MMP-15 但不显著结合其它蛋白酶或MMP-15以外的MMP,和/或所述拮抗剂干扰 MMP-15蛋白水解功能但不显著干扰其它蛋白酶或MMP-15以外的MMP的 功能。
在优选的实施方案中，所处理的细胞展示出HER和/或MMP表达、扩 增或活化。例如，所述细胞展示出HER2和/或MMP-15过表达或扩增。
MMP拮抗剂的活性可通过将其与其它抗肿瘤药物、HER抑制剂或HER2 抗体(诸如trastuzumab或pertuzumab )联合而增强。可以与MMP拮抗剂l关 合的HERJ中制剂的例子包才舌trastuzumab、pertuzumab、cetuximab、ABX画EGF、 EMD7200、 gefitinib、 erlotinib、 CP724714、 CI1033、 GW572016、 IMC-11F8 和TAK165。
本发明还关注用于在哺乳动物中降低HER2胞外结构域(ECD)血清水平 的方法，包括对哺乳动物施用在哺乳动物中有效降低HER2 ECD血清水平的 量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。所述哺乳动物任选具有升高的MMP水平。
本发明还提供了用于在哺乳动物中治疗癌症的方法，包括对哺乳动物施 用有效治疗癌症的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。所述癌可展示出HER 和/或MMP表达、扩增或活化。例如，所述癌可展示出HER2或MMP-15 过表达或扩增。在一个实施方案中，所治疗的哺乳动物具有升高的脱落HER2 血清水平或升高的p95 HER2水平。
本发明还涉及用于在哺乳动物中治疗HER抑制剂抗性癌症的方法，包
括对哺乳动物施用有效治疗癌症的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。例
如，所述哺乳动物可对HER2抗体，诸如trastuzumab有抗性。
还提供了用于降低细胞中p95 HER2水平的方法，包括将细胞暴露于有
效降低p95 HER2水平的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
可使用多种MMP拮抗剂，优选的是，所述MMP拮抗剂是小分子抑制
剂或抗体。下文描述了用于生成抗体的方法。
III.抗体的生产
下文描述了用于生成依照本发明使用的抗体的例示性技术。用于生成抗 体的抗原可以是例如可溶形式的抗原或其包含期望表位的部分。或者，在其 细胞表面表达抗原的细胞(例如经转化而过表达HER2的NIH-3T3细胞；或 癌细胞系，诸如SK-BR-3细胞，参见Stancovski d a/., /WJS (^/5*^) 88: 8691-8695 (1991))可用于生成抗体。可用于生成抗体的其它形式抗原对于本 领域技术人员是显而易见的。
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原 和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯曱酰磺基琥珀 酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、 戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R^N^ONR,其中R和W是不同的烃基，将 相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙 孔虫戚血蓝蛋白、血清清蛋白、牛曱状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如IOO吗或5吗蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍 体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗 原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。 一个月后，通过多个部位的皮下注 射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。 7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫， 直到滴度达到稳定(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质 和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细 胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强 免疫应答。
本领域有多种方法可用于制备本文中的单克隆抗体。例如，单克隆抗体
可使用最初由Kohler Wa/., A^fww 256: 495 (1975)描述的杂交瘤方法、通过重 组DNA方法(美国专利第4,816,567号)来制备。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠， 以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免 疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸 如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding， 《Monoclonal Antibodies: Principles and Practice》,第59-103页,Academic Press, 1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优 选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如， 若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄噤呤鸟噤呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或 HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄噪呤、氨基喋呤和胸苷 (HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水 平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的。在这些细胞中，优选 的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心 (Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA)获4寻的 MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA)获得的 SP-2或 X63-Ag8-653细胞衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生成人 单克隆抗体也已有记载(Kozbor，J /mmw"o/. 133: 3001 (1984); Brodeur等人， 《Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications》,第51-63页, Marcel Dekker, Inc. ， New York, 1987 )。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的 生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测 定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆 抗体的结合特异性。
单克隆4元体的结合亲和力可通过例如Munson e/ "/.，107: 220 (1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞
后，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养
(Goding,《Monoclonal Antibodies: Principles and Practice》，第59-103页, Academic Press, 1986 )。适于这 一 目的的培养基包括例如D-MEM或 RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。 可通过常规抗体纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、 凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或 血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离和测序(例如通过使用 能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤 细胞作为此类DNA的优选来源。 一旦分离，可将DNA置于表达载体中， 然后将该表达载体转染到不另外生成抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆 菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组 宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组 表达的综述'〖生"i仓文包^舌Skerra a/., Cw/r. C^/mbw z'w /mmwwo/. 5: 256-262 (1993)及Pliickthun,/mw朋o/.130: 151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty a/., A^ww 348: 552-554 (1990)所述技术构建的噬菌体抗体库中分离单克隆抗体或抗体片段。 Clackson a/.，淑歸352: 624-628 (1991)及Marks " a/" 乂 Mo/.編.222: 581-597 (1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载 了通过链改组(Marks d a/.，所o/rec/z"o/ogy 10: 779-783 (1992))，以及组合感 染和体内重组作为构建非常大的喧菌体文库的策略(Waterhouse d a/.， M/c. ^c/A i 仏21: 2265-2266 (1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如 此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替 代方法。
还可以-修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定区的编码序列 代替同源鼠序列(美国专利第4,816,567号；Morrison " 尸rac. A^/. ^cad
t/SJ 81: 6851 (1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序 列与免疫球蛋白编码序列共价接合。
典型的，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定区，或者用它们替代 抗体的一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗 原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原
结合位点。
"W 乂源^戎傳
体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常 称作"输入"残基，它们典型的取自"输入，，可变区。人源化可基本上遵循
Winter及其同事的方法进行(Jones 7Va^w 321: 522-525 (1986);
Riechmann a "/., 7V虛re 332: 323-327 (1988); Verhoeyen w a/" /Sc/ewce 239: 1534-1536 (1988))，通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此，此类 "人源化"抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中本质上少于整 个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体典型的 是其中 一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点 的残基替代的人抗体。
用于构建人源化抗体的人可变区的选择，包括轻链和重链二者，对于降 低抗原性非常重要。依照所谓的"最适"(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可 变区序列对已知的人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最 接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR) ( Sims W a/., 乂 /mwwwo/. 151: 2296 (1993); Chothia d J Mo/. Ao/. 196: 901 (1987))。另 一种方法4吏用由 特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架 可用于凄t种不同的人源化抗体(Carter " a/.,尸rac. Mrf/. ^cad t7X4 89: 4285 (1992); Presta " a/.,/麵画/. 151: 2623 (1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生 物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源 化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人 源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员 所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的 计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功 能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这 样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特 征，诸如对把抗原的亲和力提高。 一般而言，高变区残基直接且最实质的涉 及对抗原结合的影响。
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作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏 内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体完整全集的转基因 动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接 区(Jh)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠 中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例
如JakobovitsA^/.90: 2551 (1993); Jakobovits ^a/.: 淑匿362: 255-258 (1993); Bruggermann d a/" F麼/顯画.7: 33 (1993); 及美国专利第5,591,669号、第5,589,369号和第5,545,807号。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty d 。/.，胸置348: 552-553 (1990)) 可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变区(V)基因全集生成人抗 体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克 隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体 颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组 的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那 些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体 展示可以多种形式进行；有关综述参见例如Johnson, Kevin S. and Chiswell， David J., C醉ewf (9—'ow 1w"画/編ogy 3: 564-571 (1993)。 V基因区段 的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson " a/., A^/wre 352: 624-628 (1991)从 衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库中分离得到大量不同的抗o 恶哇酮抗体。可本质上遵循Marks d a/" / Mo/.編.222: 581-597 (1991)或 Griffith " a/., 12: 725-734 (1993)所述技术，由未免疫人供体构建V
基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国
专利第5,565,332号和第5,573,905号。
如上所述，还可通过体外激活B细胞来生成人抗体(参见美国专利第 5,567,610号和第5,229,275号)。
1998年6月30日公告的美国专利第5,772,997号和1997年1月3日公 开的WO97/00271中记载了人HER2抗体。
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已经开发了用于生成包含一个或多个抗原结合区的抗体片段的多种技 术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto ef a/.， Jowma/ 。/ S/oc/ze附/ca/ 5—/z戸'ca/ 7Wef/zc^ 24: 107-117 (1992);
Brennan"fl/.,Sc/ewce229: 81 (1985))。然而，现在可直4妄由重组宿主细胞生 成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者， 可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter & a/.,说o/7k;/^o/ogy 10: 163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主 细胞培养物分离F(ab')2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员 将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参 见WO 93/16185;美国专利第5，571,894号；美国专利第5，587，458号。抗体 片段还可以是"线性抗体"，例如如美国专利第5，641，870号中所述。此类线 性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
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双特异性抗体指具有对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。例示性 的双特异性抗体可结合HER2蛋白质的两种不同表位。其它此类抗体可将 HER2结合位点与EGFR、 HER3和/或HER4的结合位点组合在一起。或者， 可将HER2臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2或 CD3 )或IgG的Fc受体(FcyR)，诸如FcyRI (CD64)、 FcyRII (CD32)和FcyRin (CD16)的臂组合在一起，使得细胞防御机制聚焦于HER2表达细胞。双特异 性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达HER2的细胞。这些抗体拥有HER2 结合臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-cu长春花生物碱类、 蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗 体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。
WO 96/16673记载了一种双特异性HER2/FcyRI11抗体，美国专利第 5,837,234号公开了一种双特异性HER2/FcyRI抗体IDM1 (Osidem)。 WO 98/02463显示了一种双特异性HER2/Fca抗体。美国专利第5,821,337号教 导了 一种双特异性HER2/CD3抗体。MDX-210是一种双特异性HER2-FcyRIH 抗体。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域知道的。全长双特异性抗体的传 统生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特 异性(Millstein "a/., Atowe 305: 537-539 (1983))。由于免疫J求蛋白重链和轻 链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分 子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层 析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。WO 93/08829及
Traunecker^a/.，五M5(97: 10: 3655-3659 (1991)中公开了类似的流程。
依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点) 的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰 链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选的是，在至少一种融合 物中，第一重链恒定区(CH1)包含轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋 白重链融合物和，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体， 并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供 最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵 活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没 有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个表达 载体。
在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结 合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另 一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻 链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性 分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将期望 的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO 94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh ef 她f/ioiis //i ￡"^ymo/ogy 121: 210 (1986)。
依照美国专利第5,731,168号中记载的另一种方法，可改造一对抗体分 子之间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优 选的界面包含至少部分抗体恒定区CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分 子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大側链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。 通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第 二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性"空腔"。 这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或"异源偶联"抗体。例如，异源偶联物中的一 种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用 于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利第4,676,980号)，及用于治 疗HIV感染(WO 91/00360、 WO 92/200373和EP 03089 )。可使用任何便利 的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且 连同许多交联技术一起公开于美国专利第4,676,980号。
文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化
学连接来制备双特异性抗体。Brennan " a/.， 5Wewce 229: 81 (1985)记载了通 过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段的流程。将这些片段在存在二硫 醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键 的形成。然后将产生的Fab，片段转变为硫代硝基苯曱酸酯(TNB)衍生物。然 后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与 等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双 特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最新的进展便于从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段，这些片段可化学 偶联以形成双特异性抗体。Shalaby e/a/.， J 175: 217-225 (1992)记
载了生成完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子。每个Fab'片段由大肠杆菌 分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双 特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人 细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶物的溶解活性。
还记载了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种 技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny " a/.,/www"o/. 148(5): 1547-1553 (1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融 合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单 体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚 体。由Hollinger " a/., Prac. iVw/. Jcad t/5L4 90: 6444-6448 (1993)描述的 "双抗体"技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过
接头相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(vo，所述接头太短使得同一条链
上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的Vh和Vl結枸域与 另一个片段上的互补Vl和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还
报道了通过使用单链Fv (sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另 一种策略。 参见Gruber ef a/" /mmw"o/. 152: 5368 (1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt " a/., 乂/mw画/. 147:60(1991)。
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设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结 合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适宜的核苷酸改变引入抗体核酸或者
通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基si/f
列内的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有期望特性，可 进行删除、插入和替代的任意组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改 变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的 一种方法称
作"丙氨酸扫描诱变"，如Cunningham and Wells, Sc/e"ce 244: 1081-1085 (1989) 所述。这里，鉴定了一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨 酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸 (最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后 通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代展现出功能敏感 性的氨基酸位置。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但 是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在给定位点处的突变的 后果，在耙密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的抗体变 体筛选期望活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围从一个残基至 包含上百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。 末端插入的例子包括具有N-末端曱硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融 合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶(例 如用于ADEPT )或」提高抗体血清半衰期的多肽。
另 一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少 一个氨基 酸残基用不同残基替换。最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但也设 想了 FR改变。
任何不涉及保持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨 酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱 氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
特别优选的一类替代变体涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的 一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生 它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方 法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单的说，将数个高变区位点(例如 6-7个位点)突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗 体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与每个颗粒内包装的M13
基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生 物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进 行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另
外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和人HER2之间的接触
点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代 的候选位点。 一旦产生此类变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择 在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。改变意味着删 除在抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一 个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合 物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰 胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶 促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存 在产生了潜在的糖基化位点。0-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、 半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸i最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可 使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个
上述三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通 过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行 (用于O-连接的糖基化位点)。
若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利 申请US 2003/0157108 Al (Presta,L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合 物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621 Al (Kyowa Hakko Kogyo Co" Ltd.)。 WO 03/011878 (Jean德iret等人)和美国专利第 6,602,684号(Umana等人)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等 分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 97/30087 (Patel等人)中报告了在附着 于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水化合 物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 98/58964 (Raju,S.)和WO "/22764 (Raju,S.)。
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，例如增强抗体的抗体依
赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通 过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc
区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此产生的同 二聚体抗体可具有改进的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗
体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron d "/.， 7!176: 1191-1195 (1992)和Shopes,B., / /附mw"o/. 148: 2918-2922 (1992)。具有增强的 抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可4吏用如Wolff " a/., Ca"cer We"arc/2 53: 2560-2565 (1993)中记载的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有 双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson "a/., 颠-Ca"m"DragZ)鄉"3: 219-230 (1989)。
WO 00/42072 (Presta，L.)记载了在存在人效应细胞时具有改进的ADCC 功能的抗体，其中所述抗体在其Fc区中包含氨基酸替代。优选的是，具有 改进的ADCC的抗体在Fc区的位置298、 333和/或334包含替代。优选的 是，改变的Fc区是在这些位置中的一个、两个或三个处包含替代或由其组 成的人IgGl Fc区。
WO 99/51642、美国专利第6,194,551 Bl号、美国专利第6,242,195 Bl 号、美国专利第6,528,624 Bl号和美国专利第6,538,124号(Idusogie等人)中 记载了具有改变的Clq结合和/和补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体。所述抗 体在其Fc区的氨基酸位置270、 322、 326、 327、 329、 313、 333和/或334 (如Kabat中那样使用Fc区残基的Eu编号)中的一个或多个处包含氨基酸 替代。
为了延长抗体的血清半衰期，可如例如美国专利第5,739,277号中所述 将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语"补 救受体结合表位'，指IgG分子(例如IgG,、 IgG2、 IgG4lgG4)的Fc区中 负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。
WO 00/42072 (Presta， L.)和US 2005/0014934 Al (Hinton et al.)中记载了 具有改进的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合和延长的半衰期的抗体。这些抗 体包含其中具有一处或多处改进Fc区对FcRn结合的替代的Fc区。例如， Fc区可在其一个或多个下列位置具有替代238、 250、 256、 265、 272、 286、 303、 305、 307、 311、 312、 314、 317、 340、 356、 360、 362、 376、 378、 380、 382、 413、 424、 428或434 (如Kabat中那样使用Fc区残基的Eu编号)。优选的具有改进的FcRn结合的含Fc区抗体变体在其Fc区的位置307、 380和434中的一个、两个或三个处包含氨基酸替代。
还设想了具有三个或更多(优选四个)功能性抗原结合位点的工程改造 抗体(美国申请号US 2002/0004587 Al ， Miller等人)。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法制 备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的 情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介 导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
一名瘦偶炎參
本发明还涉及包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物，所述细胞毒剂 诸如化疗剂、毒素(例如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶 活毒素，包括其片段和/或变体)或放射性同位素(即放射偶联物)。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。本文还设想了抗 体与一种或多种小分子毒素的偶联物，诸如加利车霉素、美登素(美国专利 第5,208,020号)、单端孢菌毒素和CC1065。
在本发明的一个优选实施方案中，将抗体与一个或多个美登素分子偶联 (例如每个抗体分子偶联约1个至约IO个美登素分子)。例如，可将美登素 转变为May-SS-Me,后者可还原为May-SH3并与经^修饰抗体反应(Chari " 。/., Owcer i a^arc/7 52: 127-131 (1992))以生成美登木素生物石成-抗体免疫偶 联物。
另一种感兴趣的免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的 抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可 使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于Yi1、 a2l、 (X31、 N画乙酰基-Y,1、 PSAG和9'i( Hinman " a/" C朋cer 7 e化a,c/2 53: 3336-3342 (1993)和Lode " a/.: Owcer^^arc/z 58: 2925-2928 (1998))。还可参见美国专利第5,714,586号； 第5,712,374号；第5,264,586号和第5,773,001号，明确收入本文作为参考。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性 片段、外毒素A链(来自铜绿假单孑包菌(i^ewcfoww w aerag/"osa))、蓖麻毒 蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin) A链、a-帚曲毒素 (sarcin)、油桐(J/ewn'fes /oratt)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆 CP to/aca ylmen'ca憩)毒蛋白(PAPI、 PAPII和PAP-S )、苦瓜(momordica
charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、 巴豆毒蛋白(crotin)、肥急草 (sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局 卩艮曲菌素(restrictocin)、 酴霉素(phenomycin)、依i若霉素(enomycin)矛口单端孑包 菌毒素(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本发明还设想了抗体与具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶或 DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
有多种放射性同位素可用于生成放射偶联的HER2抗体。例子包括 At211、 I131、 I125、 Y90、 Re186、 Re188、 Sm153、 Bi212、 P"和Lu的放射性同位素。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如 N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马 来酰亚胺曱基)环己胺-l-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己 二酰亚胺二曱酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊 二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯曱酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸 如双(对重氮苯曱酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如曱苯2,6-二异氰酸酯)、 和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如， 可如Vitetta " Sc/ewce 238: 1098 (1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。 碳-14标记的l-异硫氰酸苯曱基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用 于将放射性核素与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以 是便于在细胞中释放细胞毒性药物的"可切割接头"。例如，可使用酸不稳 定接头、肽酶每文感接头、二曱基接头或含二硫化物接头(Chari"a/.，Owcer to,A52: 127-131 (1992))。
或者，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合 蛋白。
本文还设想了其它免疫偶联物。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚 合物中的一种连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚 丙二醇的共聚物。还可将抗体包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备 的微胶嚢中(例如分别是羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯) 微胶嚢)、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、 纳米颗粒和纳米胶嚢)、或在粗滴乳状液中。此类技术/>开于《Remington's Pharmaceutical Sciences》，第16版,Osol,A.编，1980。
本文公开的抗体还可配制成免疫脂质体。可通过本领域知道的方法来制
备包含抗体的脂质体，诸如Epstein " 户rac. Waf/. Jcad C/SJ 82: 3688 (1985); Hwang d a/.，尸rac.淑/,5W.园77: 4030 (1980);美国专利第 4，485,045号和第4,544,545号；1997年10月23日公开的WO 97/38731中所 记载的。美国专利第5,013,556号中公开了循环时间延长的脂质体。
特别有用的脂质体可用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰 乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成。将脂质体挤过具有限定 孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可如Martin "fl/.,/.历o/. C/zem. 257: 286-288 (1982)中所记载的，将本发明抗体的Fab，片段经二硫化物交换 反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon a/., / iVa"w a/Owcer81(19): 1484(1989)。
IV.药用配制剂
通过将具有期望纯度的MMP拮抗剂与任选的药学可接受的载体、赋形 剂或稳定齐'J (《Remington's Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编， 1980)混合，以冻干剂型或水溶液的形式，制备依照本发明使用的MMP拮 抗剂的治疗用配制剂供贮存。可接受的裁体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂 量和浓度对接受者是无毒的，包括緩沖剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有 机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和曱硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二 曱基千基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯曱醇；对 羟基苯曱酸烷基酯，诸如对羟基苯曱酸曱酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚； 环己醇；3-戊醇；和间曱酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质， 诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮； 氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单 糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如 EDTA;糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如 钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如 TWEENtm、 PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。 WO97/04801中记载了冻千抗 体配制剂，在此明确收入作为参考。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化 合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。下文治疗方法部分中描述 了可与MMP拮抗剂联合的各种药物。合适的是，所述分子以对于预定目的
有效的量组合。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶嚢 中(例如分别是羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚(甲基丙烯酸曱酉旨)微胶嚢)、 在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和
纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如《Remington's Pharmaceutical Sciences》,第16版，Osol,A.编,1980。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏 水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶嚢。持 续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-曱基丙烯酸酯)或聚 (乙烯S享))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y乙酯 的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物 诸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注 射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过 滤来实现。
V.治疗
上文定义部分列出了可用MMP拮抗剂治疗的各种癌症的例子。MMP 拮抗剂的施用将导致癌症的体征或症状的改善。
依照已知方法对人类患者施用MMP拮抗剂，诸如静脉内施用，例如推 注(bolus)或一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、 关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入路径。
对于疾病的预防或治疗，MMP拮抗剂的剂量将取决于如上定义的待治 疗癌症的类型、癌症的严重程度和进程、施用抗体是为了预防还是治疗目的、 先前的疗法、患者的临床史和对抗体的响应、及主治医师的判断。
虽然MMP拮抗剂可以是施用的唯一抗肿瘤药物，但是任选用MMP拮 抗剂与 一种或多种其它抗肿瘤剂的组合来治疗患者。
联合施用包括使用分开的配制剂(separate formulations)或单一的药用配 制剂(single pharmaceutical formulation)的共施用(coadministration)或同时施用 (concurrent administration),以及任一次序的连续施用，其中优选有一,殳时间 所有两种(或所有)活性剂同时发挥其生物学活性。如此，可在施用MMP
拮抗剂之前或之后施用其它抗钟瘤剂。在此实施方案中，至少一次MMP拮 抗剂的施用和至少一次其它抗肺瘤剂的施用之间的计时优选为约l个月或更 短，最优选约2周或更短。或者，以单一的配制剂或分开的配制剂同时对患
者施用MMP拮抗剂和其它抗肿瘤剂。MMP拮抗剂和其它抗肿瘤剂的联合 治疗可对患者产生协同的、或者大于累加的治疗效益。
可与MMP拮抗剂联合的第二抗肿瘤剂的例子包括 一种或多种化疗剂； HER抑制剂(例如trastuzumab 、 pertuzumab 、 cetuximab 、 ABX-EGF 、 EMD7200 、 gefitinib、 erlotinib、 CP724714、 CI1033、 GW572016、 IMC画11F8、 TAK165 等)；Raf和/或ras抑制剂(参见例如WO 2003/86467 );生长抑制性HER2 抗体，诸如trastuzumab; HER二聚化抑制剂，诸如Pertuzumab; i秀导过表 达HER2的细胞凋亡的HER2抗体，诸如7C2、 7F3、或其人源化变体；针 对肿瘤相关抗原诸如EGFR、 HER3、 HER4的抗体；抗激素化合物，例如抗 雌激素化合物诸如他莫昔芬，或芳香酶抑制剂；心脏保护剂(以预防或减轻 与治疗有关的任何心肌功能障碍)；细胞因子；EGFR靶向药物(诸如 TARCEVA 、 IRESSA⑧或Cetuximab);抗血管发生剂(尤其是Genentech 以商标AVASTINTM销售的bevacizumab );酪氨酸激酶抑制剂；COX抑制剂
(例如COX-l或COX-2抑制剂)；非类固醇抗炎药，Celecoxib (CELEBREX );法呢基转移酶抑制剂(例如可,人Johnson and Johnson购买 的Tipifamib/ZARNESTRA Rl 15777或可从Schering-Plough购买的 Lonafarnib SCH66336);结合癌胚蛋白CA 125的抗体，诸如Oregovomab
(MoAb B43.13 ); HER2疫苗(诸如Pharmexia的HER2 Auto Vac疫苗，或 Dendreon的APC8024蛋白质疫苗，或GSK/Corixa的HER2肽疫苗)；盐酸 多柔比星脂质体注射液(DOXIL⑧)；拓朴异构酶I抑制剂，诸如托泊替康； 紫杉烷；HER2和EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂，诸如lapatinib/GW572016; TLK286 (TELCYTA ) ; EMD-7200 ; 降体温药物，诸如醋氨酚 (acetaminophen)、 苯海拉明(diphenhydramine)或麦口定(meperidine); 造血生长
因子；等。
任何上述共施用药剂的合适剂量就是那些目前所使用的剂量，而且可由
于该药剂与MMP拮抗剂的联合作用(协同作用)而降低。
在上述治疗方案之外，还可对患者进行手术去除癌细胞和/或放疗。
在对患者施用蛋白质MMP拮抗剂之外，本申请设想了通过基因疗法来
施用MMP拮抗剂。参见例如1996年3月14日公布的WO 96/07321，它关 注使用基因疗法来生成胞内抗体。
有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞，即体内 和回体(ex v/vo)。对于体内投递，通常在需要抗体的部位将核酸直接注射到 患者体内。对于回体治疗，采集患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞， 并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入患 者体内(参见例如美国专利第4,892,538号和第5,283,187号)。有多种技术 可用于将核酸导入可存活细胞。这些技术根据是将核酸转移至体外培养细胞 还是目的宿主的体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细 胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖 苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯 疱瘆病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的 脂质有例如DOTMA、 DOPE和DC-Chol)进行的转染。在有些情况中，希 望与耙向輩巴细胞的试剂一起提供核酸源，诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特 异的抗体、耙细胞上受体的配体等。在采用脂质体时，与胞吞作用相关细胞 表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入，例如对特定细胞类型具 有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中进行内在化的蛋白质的抗体、和靶向 细胞内定位和增加细胞内半衰期的蛋白质。例如Wu AW. C7^w. 262:
4429-4432 (1987); Wagner d a/"尸rac. ^cad 5W. "5^4 87: 3410-3414
(1990)中记载了受体介导的胞吞技术。关于目前已知的基因标记和基因治疗 方案的综述参见Anderson " a/.， Sc/e"ce 256: 808-813 (1992)。还可参见WO 93/25673及其引用的参考文献。
VI.材料保藏
以下杂交瘤细胞系已保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type
Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 USA) (ATCC):
抗体名称ATCC编号 保藏日期
7C2 ATCCHB-12215 1996年10月17日
7F3ATCCHB-12216 1996年10月17日
4D5 ATCC CRL 104631990年5月24日
2C4 ATCCHB-12697 1999年4月8日
下文非限制性实施例例示了本发明的进一步详情。在此明确收入说明书 中所有,引文的公开内容作为参考。
实施例
下文实施例研究了基质金属蛋白酶(MMP)在HER2脱落中的作用。
材料和方法
勿/《眷#和脊籴
此项研究中所使用的所有细胞系来自美国典型培养物保藏中心(ATCC， Manassas, VA)。 BT 474、 MCF-7和SKBR-3细胞在补充有10%热灭活FBS 和2mM L-谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM:Ham氏F12 (50:50)中维持。Cos-7细 胞在补充有10%热灭活FBS和2mM L-谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM中维持。 细胞系在供应有5% C02的增湿培养箱中于37。C维持。BT 474和SKBR-3 细胞使用试剂盒V依照制造商的说明书(AMAXATM)所述电穿孔法所述瞬时 转染。Cos-7细胞使用LIPOFECTAMINETM2000(Invitrogen)依照制造商的建 议如所述转染。
尸o5 *y2,"<§2 v、l^^^^^^产y^秀
Fo5和f2:1282系先前已有i己载(Finkle ef a/., C//w. Ca"cer 10: 2499-2511 (2004))。这些系衍生自来自MMTV HER2转基因小鼠的原发性 肿瘤并在FVB小鼠的乳房脂肪垫中传代。
将Fo5肺瘤移植到FVB小鼠中并在启动研究前让其生长至平均大小 400-600 mm3。 GM6001 ( 3-[N-羟基羰酰基]-[2R]-异丁基丙酰基-L-色氨酸曱 酰 胺 , 3-[N-hydroxycarbomyl]-[2R]隱isobutylpropionyl-L-tryptophan methylamide)来自Calbiochem，在4%羧曱基纤维素/0.9% PBS的浆液中重 建，并以100mg/kg体重通过腹膜内注射每天施用一次，持续3天。第三天 的注射后24小时，将动物处死并通过心脏穿刺收集血清。在第0天和第4 天测量肿瘤大小。取出肿瘤并瞬间冻结，供进一步分析。
謝务;^/lFFZMEmxrM萍/！/
使用RNAEASYTM试剂盒(Qiagen, Chatsworth， CA)从瞬间冻结的肿瘤样 品分离总RNA。通过DNA酶I处理(Roche Molecular Biochemicals)除去残余 的基因组DNA。如先前所述(Jin， H " C7rcw/a"ow 103: 736-742 (2001)) 进行和分析微阵列实验。将样品与AFFYMETRIXTM小鼠基因组单一阵列 (MOE430P)和已知基因阵歹'J(MOE430A) (AFFYMETRIXTM, Inc., Santa Clara, CA)杂交。对于三份Fo5和三份f2:1282肿瘤样品，进行一式三份的实验。 进行Mann-Whitney成对比较，认为那些一致性超过80%的表达具有2倍增 量的基因是显著的。使用GeneLogic Bioexpress数据库(GeneLogic, Gaithersburg, MD)，即来自细胞系和组织的AFFYMETRIXTM微阵列分析的基 因表达数据集合，检查蛋白酶的表达，所述蛋白酶是从Fo5-f2:1282肿瘤差 异筛选SKBR-3和BT474细胞系中的表达鉴定的。
//腦五CD虹/5^
通过心脏穿刺收集来自携带Fo5或f2:1282异种移植肿瘤的小鼠的血清， 并使用先前记载的HER2 ELISA( Finkle Wa/.， C7/". Ca"cerA^. 10: 2499-2511 (2004))检测HER2 ECD水平。将血清用测定緩沖液(PBS/0.5% BSA, 0.05% TWEEN 20/10ppm PROCLIN 300/0.2% BGG/0,25% CHAPS/0.15M NaCl/5mM EDTA (pH 7.4)) 1:50稀释，接着进行1:2连续稀释。遵循先前记 载的流程(Sias "a/,, J /纖画/. Me仇109: 219-27 (1990))，用山羊抗HER2 多克隆抗体(Genentech)将脱落的HER2捕捉到NUNC Maxisorp板上，并用 偶联有生物素的兔抗HER2多克隆抗体(Genentech)及后续AMDEXTM-链霉亲 合素-辣根过氧化物酶抗体(Amersham Pharmacia Biotech)才企观'J。对于细胞培养 实验，如所述处理细胞，收集条件培养液，并用测定緩沖液l:2连续稀释。 从标准曲线的四参数拟合测定血清或条件培养液中脱落的HER2的浓度，其 中使用纯化的重组HER2 ECD蛋白质(Genentech)作为标准品。
DA^种建參和f ^者鍵/A
使用origen克隆作为模板，通过PCR将人MMP-15克隆到pRK5中。 使用如下引物通过PCR产生C-末端V5His标记的全长型式 5'-GCCGAAGCTTGCCACCATGGGCAGCGACCCGAGCGCG-3， (SEQ ID NO. 9)和
(SEQ ID NO. 10),
并克隆到pcDNA3.1V5His中。
使用如下引物通过PCR产生缺少跨膜结构域的可溶性型式MMP-15: 5，-GCCGAAGCTTGCCACCATGGGCAGCGACCCGAGCGCG-3， (SEQ ID NO. ll)和
5，-GCTGTCTAGAGACCCACTCCTGCAGCGAGCG-3， (SEQ ID NO. 12)。 通过定点诱变用丙氨酸残基替代成熟蛋白质第260位氨基酸处的谷氨酰
胺，产生MMP-15的无催化活性突变体(catalytically dead mutant)。
使用如下引物通过PCR产生pRK5.gDHER2-Fc (pRK5.gDHER2-IgG):
5，-CGAGTCGACCTCGAGGCCAGCCCTCTGACGTCC-3'
(SEQ ID NO. 13)和
5,-GGCACGCGTCGTCAGAGGGCTGGCTCTCTG陽3， (SEQ ID NO. 14), 并克隆到经过XhoI-Mlu消化的pRK5.gDHER2-Fc中(Fitzpatrick " a/.， F五55S
431(1): 102-6(1998))。这导入了 HER2的推定切割位点，该位点是从分 离自SKBR-3条件培养液的纯化的HER2 ECD鉴定的(Yuan " "/.，尸rafe/" 五x/7mw/o" "W(i./^诉c加'o" 29: 217-222 (2003))。
还使用如下PCR产生只包含HER2的结构域IV的截短型式 gDHER2-Fc:
5'-GGCCTCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAG-3， (SEQ ID NO. 15)和 5，-GGCACGCGTCGTCAGAGGGCTGGCTCTCTG-3， (SEQ ID NO. 16)。
pRK5.HER3-Fc和pRK5.HER4誦Fc先前已有记载(Fitzpatrick a a/.， 431(1): 102-6 (1998))。 将 FLAG 表位 (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys; (SEQ ID NO. 17))导入pRK5的N-末 端。如先前所述将HER-Fc融合蛋白转染到293细胞中并从无血清的条件培 养液纯化(Fitzpatrick " a/" /^S^S431(1): 102-6 (1998))。可溶性 MMP-15V5His和sMMP-15V5His(E260A)蛋白质由瞬时转染的293细胞条件 培养液产生，并使用Ni-NTA琼脂糖依照制造商(Qiagen)的建议纯化。
评估几种不同shRNA在导入细胞时降低MMP-15蛋白质水平的能力。 发现，针对人 MMP-15最有效的shRNA 识别 bp 5，-CCACCATCTGACCTTTAGCTT-3， (SEQ ID NO. 18),对应于nt 1396-1414
(GENBANKTM编号NM—002428)。作为包含形成shRNA的内部发夹的如下 寡聚物，将针对MMP-15的RNAi导入pSIREN载体(BD Biosciences)的 BamHI-EcoRI位点
TGGTGGTTTTTTGCTAGCG-3， (SEQ ID NO. 19)和 TAAAGGTCAGATGGTGGCG-3， (SEQ ID NO. 20)。
针对MMP-25的shRNA购自OPENBIOSYSTEMSTM。使用AMAXATM试剂 盒V遵循制造商的建议，单独将pSIREN shRNA构建物或载体瞬时转染到 SKBR-3和BT 474细胞中。48小时后，收集条件培养液并通过HER2 ELISA 测定脱落HER2，使用2x样品緩冲液在板上直接裂解细胞。使用兔多克隆抗 MMP-15抗体(Labvision目录号RB-1546-P)或小鼠单克隆抗HER2抗体Ab-15 (Labvision目录号MS-599-P0)通过Western印迹4企测MMP-15、全长HER2 和p95 HER2蛋白质。
勿W縱
使用纯化的gDHER2-Fc融合蛋白作为底物，在体外测定候选蛋白酶切 割HER2 ECD的能力。MT1隱MMP (MMP-14)、 MT2-MMP (MMP-15)、 MT3-MMP (MMP-16)、 MT4-MMP (MMP画19)和MT5画MMP (MMP-25)的纯化 的催化结构域购自R&D systems。将纯化的MMP蛋白质与gDHER2-Fc或所 述其它HER-Fc蛋白质在测定緩沖液(100mM Tris (pH=7.4), lOOmM NaCl， 2.5pM ZnCl2， 10mM CaCl2， 0.001% Brij35 )中以1:100的酶:底物比例混合， 并于37。C温育20分钟。加入等体积的2x样品緩冲液(Invitrogen)终止反应， 并在加载到4-20。/。Tris-甘氨酸梯度凝胶(Invitrogen)上之前煮沸5分钟。使用 GEL CODE BLUEtm染色剂(Pierce目录号24592)遵循制造商的建议通过染色 显现蛋白质。使用自动化蛋白质测序仪通过自动化Edman降解法(Kishiyama, A.,爿wa/. C77ew. 72(21): 5431-6 (2000)),通过N-末端蛋白质测序测定MMP 切割位点。
A^沉/定^W;t法f口 ff^ fem伊遂
使用LIPOFECTAMINE 2000，将Cos-7细胞用pRK5.Flag-HER2和 pcDNA3.MMP-15构建物共转染，或者单独用pcDNA3.1载体转染。让细胞 恢复48小时。将转染细胞用PBS漂洗，并在裂解緩冲液(1 % TRITON X-100TM
50mM Tris (pH=7.4)， 150mMNaCl， ImMPMSF, 10(ig/ml亮抑酶肽(leupeptin) 10U/ml抑酶肽(aprotinin)， 2mM Na2V04)中裂解。通过离心除去裂解物中的 不溶性物质，使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce目录号23229)测定总蛋白 质水平。将200吗总细胞蛋白质加到裂解緩沖液中至终体积lml，使用抗Flag M2-琼脂糖(Sigma)或与蛋白A/G琼脂糖复合的多克隆抗MMP-15抗体免疫 沉淀Flag-HER2。将免疫复合物用裂解緩冲液清洗2次，并重悬于SDS样品 緩冲液中煮沸。将样品在4-12% Tris-甘氨酸梯度凝胶(Invitrogen)上分开并转 移至硝酸纤维素膜。如所述将印迹在5% BSA/TBST中封闭，并用针对 MMP-15或HER2的抗体及后续的偶联有过氧化物酶的抗小鼠或兔二抗探 查。通过增强型化学发光(ECL, Amersham Pharmacia Biotech)使印迹显影。
将Fo5和f2:1282肿瘤重悬于含蛋白酶抑制剂的裂解緩冲液，并使用 POLYTRON TISSUEMIZERtm (PT2100)在冰上匀浆。通过离心除去肿瘤裂解 物中的不溶性物质，使用BCA蛋白质测定试剂盒测定总蛋白质水平。使用 与蛋白A/G sepharaose复合的小鼠单克隆抗体Ab-15 (Labvision目录号 MS-599-P0)，从来自至少三份独立肺瘤裂解物的lmg总蛋白质于4。C免疫 沉淀HER2过夜。通过离心使复合物成团，用裂解緩沖液清洗两次，重悬于 SDS样品緩冲液并煮沸。将样品在4-12。/。Tris-甘氨酸凝胶上分开并转移至硝 酸纤维素膜。用检测磷酸化HER2的小鼠单克隆抗体Ab-18 (Labvision目录 号MS-1072-P)或Ab-15 (Labvsion目录号MS-599-P0)探查印迹。使用才企测 MMP-14的兔多克隆Ab-1 (Labvision目录号RB-1544-P)、检测MMP-15的 兔多克隆Ab-1 (Labvision目录号RB-1546-P)或检测MMP-25的兔多克隆 Ab-1 (Oncogene Research Products目录号PC499)，通过来自50ug肿瘤裂解 物或者来自50ug BT474或MCF-7或SKBR-3细胞裂解物的Western印迹， 评估MMP-14、 MMP-15和MMP-25的表达。
通过50吗细胞裂解物的Western印迹测定活化的MAPK (Cell Signaling Technology目录号9101)、 PhosphoAkt Ser473 (Cell Signaling Technology目录 号9271)、总Akt (Cell Signaling Technology目录号9272)、总Erk (Cell Signaling Technology目录号9102)或phosphoHER3 (Cell Signaling Technology 目录号4791)。
将细胞以104细胞/孔的密度一式四份接种到96孔板(Nunc)中并让其贴
壁过夜。如所示处理细胞，或者如所示转染。温育3天后，向每个孔中加入
25^ Alamar blue试剂(Trek Diagnostic Systems,目录号00-100),继续温育3 小时。在荧光计中依照制造商的建议对板读数，激发波长530nm，发射波长 590nm。如先前所述测定相对于未刺激或对照转染细胞的增殖(Lewis da/., O 膨rL 56(6): 1457-65 (1996))。
结果
HER2的ECD通过蛋白水解从培养的乳腺癌细胞上脱落，并在转移性乳 腺癌患者的血清中检测到，在这种情况中它与不良临床预后有关(Molina^ a/" Omcw/ " 61: 4744-4749(2001))。然而，HER2脱落的生物学作用尚不 清楚。本文中的实验是为了鉴定HER2脱落酶(sheddase)而进行的。
HER2脱落酶的鉴定可能也是重要的，因为先前证实trastuzumab在乳腺 癌细胞系中抑制脱落(Molina d a/., 61: 4744-4749 (2001))。与先
前报道的结果一致，trastuzumab在10 (ig/ml的浓度在乳腺癌细胞系BT 474 和SKBR-3细胞中将脱落降低超过60% (图5，左图)，并且在这些细胞系中 将细胞增殖降低50% (图5，右图)。
使用衍生自MMTVHER2转基因小鼠(Finkle " a/.， C/z'". Ca"cer i 仏10: 2499-2511 (2004))的乳腺肿瘤的动物4莫型系统来鉴定HER2脱落酶。此动物 模型系统可重现地将不同水平的HER2脱落到血清中，并且对trastuzumab 展现出不同的敏感性(图6，右图)。血清HER2水平的这种差异还与从三份 独立Fo5肿瘤细胞裂解物免疫沉淀的蛋白质片段的存在很有关联，该蛋白质 片段表观分子量为95 kD,与p95 HER2的大d、一致(图6，左下图)。此片 段在Fo5肿瘤细胞裂解物中组成性磷酸化，表明此片段在这些肿瘤中可能具 有生物学活性。HER2脱落酶水平的升高可能有助于此系的trastuzumab抗性， 因为trastuzumab的表位将通过蛋白水解切割而丧失(Cho or/., A^ww 421: 756-760 (2003))。
因为Fo5肿瘤系脱落更高水平的HER2且具有高水平的p95 HER2片段， 所以通过差异表达分析这种方法来鉴定在Fo5肺瘤中相对于f2:1282肿瘤上 调的转录物。从来自平均肿瘤大小300-600 mm3的Fo5肿瘤或f2:1282肿瘤 的3份个别肺瘤样品制备RNA。将来自每份独立肿瘤样品的RNA —式三份 与AFFYMETRIXtm小鼠基因组单一阵列芯片(MOE430P)和已知基因阵列
(MOE430A)杂交。进行Mann-Whitney成对比较，在Fo5肺瘤样品中鉴定出 638种上调的转录物。因为BT 474和SKBR-3细胞系也将HER2 ECD脱落 到条件培养液中(图5,左图)，所以还使用Genelogic Bioexpress数据库将 此表与在两种细胞系中都表达的转录物进行比较。图7图示了用于鉴定 HER2脱落酶的方法。
为了减少候选基因的数目，使用通用金属蛋白酶抑制剂GM6001来评估 MMP活性是否在调控HER2脱落中发挥作用。根据HER2 ECD ELISA的测 定(图8，左图)，GM6001确实在SKBR-3细胞中剂量依赖性地抑制HER2 脱落，其立体异构体则不然。此结果与先前发表的报告一致，即通用金属蛋 白酶抑制剂BB-94在乳腺癌细胞系中抑制HER2 ECD脱落(Codony-Servat W a/" C露erL 59: 1196-1201 (1999))。 Timp-l、 Timp-2和Timp-3是调控金 属蛋白酶活'f生的天然存在的肽(Overall and Lopez-Otin， iVamw及ev/ews C朋cw 2: 657-672 (2002))。以1吗/ml的浓度向SKBR-3细胞的条件培养液 中添加纯化的Timp-l、 Timp-2或Timp-3降低了 HER2 ECD的水平(图8， 右图)。然而，Timp-2降低HER2 ECD脱落最有效(图8,右图)。已知Timp-2 有效抑制金属蛋白酶的MT-MMP亚家族(Overall and Lopez-Otin， Atowe Z eWe鄉Owcer 2: 657-672 (2002))。这些资料说明在SKBR-3和BT 474细胞 中导致HER2脱落的蛋白酶是金属蛋白酶，显著减少了从生物信息学筛选鉴 定的候选物的数目。
根据GENELOGICTM数据库，MT-MMP家族的几个成员在SKBR-3和 BT 474细胞中表达。根据AFFYMETRIXTM微阵列数据，MT1-MMP和 MT2-MMP也都在Fo5肿瘤中表达。为了确定这些转录物是否表达，将Fo5 和f2:1282肿瘤及乳腺癌细胞系裂解物用针对这些MT-MMP的多克隆抗体进 行免疫印迹，所述抗体识别人和小鼠二者的蛋白质(图9)。所有细胞系都表 达MMP-14、 MMP-15和MMP-25，但7jc平不同。虽然MMP-14在f2:1282 和Fo5肿瘤细胞裂解物中都表达，但是MMP-15在Fo5肿瘤裂解物中大量 表达。此结果与表明Fo5肿瘤中MMP-15的mRNA表达水平高2倍的 Mann-Whitney比较一致。为了验证MMP-15在肿瘤的上皮细胞而非周围的 基质细胞中表达，将Fo5和G:1282肿瘤进行切片并用抗HER2抗体(Dako) 或抗MMP-15抗体(Ab-l)染色。f2:1282和Fo5肿瘤都表达人HER2，但是 MMP-15在Fo5肿瘤中的表达比G:1282肿瘤的量更大。
传统上认为MT-MMP成员的底物是胞外基质蛋白质。建立了生化测定
法以对从微阵列数据鉴定的候选物测试其体外切割全长HER2。此测定法使 用纯化的重组融合蛋白作为候选蛋白酶的底物，所述融合蛋白由N-末端gD 表位标记的HER2 ECD与人IgG的重链Fc以符合读码框的方式组成。这些 研究中使用了几种不同的蛋白质。gDHER2(+)-IgG包含HER2 ECD的氨基 酸第2-656位(GenBank编号AAA75493)， gDHER2(-)-IgG包含HER2 ECD 的氨基酸第2-626位。gDHER2(+)-IgG重组蛋白包含先前已知证明包含推定 HER2脱落酶位点(PA/EQR/ASP; SEQ ID NO. 23)的近膜序列，而 gDHER2(-)-IgG蛋白缺少此序歹'J (Yuan ef 尸rafe/"五xpmwz'o" 尸w诉c加'o" 29: 217-222 (2003))。此测定法中还使用了截短型式的 gDHER2(+)-IgG，即gDHER2(DIV)-IgG，它只有以符合读码框的方式融合的 HER2的结构域IV(DIV)和人Fc。将MMP-14、 MMP-15、 MMP-16、 MMP-19 和MMP-25的纯化的催化结构域(catalytic domains)与gDHER2(DIV)-IgG于 37。C温育20分钟。除MMP-14以外的所有MT-MMP有效切割 gDHER2(DIV)-IgG底物(图13,左图)。切下切割后的蛋白质产物，进行 N-端测序以鉴定切割位点。所有四种MT-MMP都在已发表的序列位点附近 士刀害寸 HER2 (Yuan ef a/"尸ro/ez力五xj: ra^/ow 尸wny ca"ow 29: 217-222 (2003))(图13,右图)。
具有序列PINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPASPLTSIV (SEQ ID NO. 21)的HER2-Fc融合蛋白是这四种MMP在体外的底物(图14 )。此资料说明 HER2是MMP-15的底物。
MT-MMP底物识别可能受到血红素结合蛋白结构域(hem叩exin domain) 的影响(Overall and Lopez-Otin， A^fwre i evz'ews Owcer 2: 657-672 (2002))。 在293细胞中瞬时表达具有C-末端V5 His表位的可溶性形式的MMP-15, 并通过亲和层析从293条件培养液纯化。如图15所示，此可溶性形式的 MMP-15在体外脱落酶测定法中也能切割gDHER2(+)-IgG。
为了确定MMP-15和HER2是否能在膜中结合，使用瞬时转染的Cos-7 细胞进行免疫共沉淀测定法。将pRK5.FlagHER2与载体、 pcDNA3.MMP-15V5His 、 pcDNA3.sMMP-15V5His 或
pcDNA3.MMP-15(E260A)共转染。用抗FLAG树脂免疫沉淀FlagHER2。图 10显示了可溶性MMP-15和无催化活性(E260A)突变体都能与Flag-HER2结
合。这与MMP-15可切割膜中的HER2的想法一致，因为野生型型式的蛋白 酶，pcDNA3.MMP-15V5His，将切除FlagHER2 ECD, HER2-MMP-15复合 物将不会免疫共沉淀。
从来自MMTVHER2转基因动物的乳腺肿瘤中已经鉴定出了体细胞点 突变和删除及剪接变体(Siegel 18: 2149-2164 (1999); Finkle "
a/., C7/". Qwceri &y. 10: 2499-2511 (2004))。这些突变最频繁的存在于HER2 跨膜结构域附近的胞外结构域。Fo5胂瘤系有与HER2切割位点邻近的五个 氨基酸删除，DLDDK(SEQIDNO. 22)， f2:1282肺瘤系有单一点突变，R变 成C(CforR)(图12)。这些突变不影响MMP-15结合(图11)。然而，有 可能的是DLDDK (SEQ ID NO. 22)删除临近HER2 MMP切割位点可能影响 该蛋白酶的酶活性。
RNA抑制(RNAi)是一种能下调目标转录物和蛋白质水平的方法。为了 检验MMP-15在SKBR-3和BT 474细胞中的生物学作用，使用抗MMP-15 RNAi构建物。在导入SKBR-3或BT 474细胞时，此shRNAi表达质粒在两 种细胞类型中都降低MMP-15的内源蛋白质水平(图17,左上图)。此shRNA 的转染还在两种细胞类型中都降低p95 HER2的量(图17,左下图)。这些 细胞中MMP-15蛋白质的丟失在两种系中都显著降低HER2 ECD脱落(图 17，右图)。然而，在将针对MMP-25的shRNAi导入任一细胞系时，没有 观察到HER2 ECD脱落的显著降低(图17，右图)。这些实验强烈说明 MMP-15的丢失显著影响HER2 ECD脱落。
通过RNAi降低MMP-15蛋白质水平还对SKBR-3和BT 474细胞的生 长速率有影响(图18,左图)。针对MMP-25的shRNAi也再现这种效果。 这说明在BT 474和SKBR-3细胞中降低HER2 ECD脱落还下调p95 HER2 的量，由此降低细胞生长速率。在将gD标记的p95 HER2构建物导入这些 细胞系时，在两种细胞系中都检测到相对于对照转染细胞的细胞生长速率的 升高(图18，左图)。在以独立于配体的方式导入Cos-7细胞时，此构建物 -陂组成性磷酸化并活化MAPK (图16)。然而，此构建物必须仍与HER3或 EGFR异二聚化以活化Akt信号途径，与先前发表的研究一致(Xia ef a/., CV coge"e 23: 646-653 (2004) )。 gDp95HER2在SKBR-3细胞中的过表达不显 著抑制这些细胞中trastuzumab介导的生长抑制(图18,右图)。
使用药理学方法来确定在Fo5肿瘤中MMP活性是否在调控HER2脱落
和p95 HER2水平中发挥作用。每天一次给携带平均大小400-600 mm3的Fo5 肺瘤的FVB小鼠腹膜内注射GM6001或对照媒介物(control vehicle),持续3 天。第4天，收集血清并通过ELISA测定HER2 ECD,收集肿瘤并称重。 从肿瘤细胞裂解物免疫沉淀HER2并通过Western印迹测定p95 HER2水平。 用GM6001处理的动物显示出与对照动物相比p95 HER2量的显著降4氐(图 19，右图)。在用々某介和GM6001处理的动物中血清HER2ECD水平都降低 (图19,左图)，然而，在用GM6001处理的动物中观察到更大降低。
总结
以上实验证明基质金属蛋白酶MMP-15在体外在与来自SKBR3细胞的 纯化的脱落ECD—致的位点切割HER2，并且与全长HER2相互作用。降低 此MMP的水平与HER2受体脱落的降低极好关联，并且在SKBR3和BT474 细胞系中降低基础增殖水平。trastuzumab似乎通过间接调控MMP-15活性 而抑制HER2受体脱落，但不与MMP-15竟争底物结合和切割。用MMP拮 抗剂，诸如MMP-15拮抗剂，降低HER2脱落代表了用于治疗癌症的治疗方 法，包凌舌trastuzumab 4元性癌症。
权利要求
1.用于抑制HER2脱落的方法，包括用有效抑制HER2脱落的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂处理表达HER2的细胞。
2. 权利要求1的方法，其中所述MMP拮抗剂是膜束縛MMP (MT-MMP)拮抗剂。
3. 权利要求2的方法，其中所述MT-MMP选自MMP-15 (MT2-MMP)、 MMP-16 (MT3-MMP)、 MMP-24 (MT5-MMP)、 MMP-17 (MT4-MMP)和 MMP-25 (MT6-MMP)。
4. 权利要求3的方法，其中所述MT-MMP是MMP-15。
5. 权利要求1的方法，其中所述细胞展示出HER2过表达、扩增或活化。
6. 权利要求5的方法，其中所述细胞展示出HER2过表达或扩增。
7. 权利要求l的方法，还包括用HER抑制剂处理所述细胞。
8. 权利要求7的方法，其中所述HER抑制剂是HER2抗体。
9. 权利要求8的方法，其中所述HER2抗体是trastuzumab或pertuzumab。
10. 权利要求7的方法，其中所述HER抑制剂选自tmstuzumab、pertuzumab、 cetuximab、 ABX-EGF、 EMD7200、 gefitinib、 erlotinib、 CP724714、 CI1033、 GW572016、 IMC画11F8和TAK165。
11. 用于在哺乳动物中降低HER2胞外结构域(ECD)血清水平的方法，包括 对哺乳动物施用在哺乳动物中有效降低HER2 ECD血清水平的量的基 质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
12. 权利要求11的方法，其中所述哺乳动物具有升高的MMP水平。
13. 用于在哺乳动物中治疗癌症的方法，包括对哺乳动物施用有效治疗癌症 的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
14. 权利要求13的方法，其中所述癌展示出HER表达、扩增或活化。
15. 权利要求14的方法，其中所述癌展示出HER2过表达或扩增。
16. 权利要求13的方法，其中所述哺乳动物具有升高的脱落HER2血清水 平或升高的p95 HER2水平。
17. 用于在哺乳动物中治疗HER抑制剂抗性癌症的方法，包括对哺乳动物 施用有效治疗癌症的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
18. 权利要求17的方法，其中所述HER抑制剂是trastuzumab。
19. 用于降低细胞中p95 HER2水平的方法，包括将细胞暴露于有效降低p95 HER2水平的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
20. 诊断方法，包括评估来自癌症患者的样品中的MMP-15 (MT7-MMP), 其中升高的MMP-15水平或活性表明该患者具有升高的p95 HER2或脱 落HER2血清水平，或者将具有不良临床结果。
21. 权利要求20的方法，其中升高的MMP-15水平表明该患者将具有不良 临床结果。
全文摘要
本申请描述了使用基质金属蛋白酶(MMP)尤其是MMP-15的拮抗剂来抑制HER2脱落。
文档编号A61K39/395GK101115836SQ200680004472
公开日2008年1月30日 申请日期2006年2月9日 优先权日2005年2月9日
发明者拉尔夫·H·施瓦尔, 肯德尔·D·凯里, 马克·X·斯利科夫斯基 申请人:健泰科生物技术公司