基于细胞核形态鉴定并靶向肿瘤干细胞的方法

专利名称：基于细胞核形态鉴定并靶向肿瘤干细胞的方法
基于细胞核形态鉴定并靶向肿瘤干细胞的方法
相关申请
本申请要求2005年12月9日提交的美国临时申请No.60/748，951 的利益，上述申请的全部教导引入本文作为参考。
背景技术：
科学家已经认识到肺瘤细胞和病理学组织构建(诸如畸胎瘤 (teratocarcinomas))与早期胚细胞和组织间的相似性。正常但未分化 的胚胎干细胞能通过不明确的过程产生器官，所述过程逻辑上包括器 官原基(anlage)上细胞数目和分化的快速增加及随后的器官发生。恶性 肿瘤以类似于早期胚胎的速率生长并且包含生态位(niches),这些生态 位或者是组织未分化的或者是以正常组织的组织学形态构造的。
除了细胞表面的葡糖胺聚糖抗原复合物外，在胎儿组织和肿瘤中 还表达"癌胚抗原"，癌胚抗原是涉及细胞粘附和组织重建的分子，例 如钙粘着蛋白、连环蛋白、金属蛋白酶。
在含氧量低条件下的早期胎儿组织中，肿瘤模拟线粒体利用氨基 酸以减少氧。
肿瘤发生样个体发生(oncogenesis like ontogenesis)看来可能是通过 直系后裔通过干细胞群的扩增来发展。仅仅一小部分的人类肺瘤细胞 具有形成新肿瘤的能力，如免疫抑制啮齿类的异种移植。有限稀释的 异种移植实验已表明推定胂瘤发生细胞中的一个或多个细胞显示出类 干细胞性质，表现在它们能够产生包含额外干细胞的新肿瘤并且能够 再生存在于原始肿瘤中的表现型混合群体细胞。
在二十世纪初期就建立了肿瘤单克隆性的概念，并且在二十世纪 确定了几乎所有类型的晚发病癌都经过肿瘤形成前的延长期，而且这 些肿瘤形成前的集落本身是单克隆，并且由一个以上的来自胚DNA的 稀少细胞遗传突变引起。二十一世纪初期，在移植/稀释实验中用"干" 细胞富集肿瘤细胞的直接尝试已经证明，不仅组织干细胞是肿瘤形成 前的可能的细胞来源，而且肿瘤本身也包含"干"细胞。该假说的现代重 申已经提出胂瘤实际上是组织相当良好的异形胎儿结构(heterogeneousfetal structures)。"癌胚，，干细胞有望增加数目并且产生分化的细胞类 型，这些细胞类型会增加肿瘤块内高度的异形生态位。然而，在发育 的器官和肿瘤中还没有实现对细胞如干细胞的识别。
应用于整个干细胞领域的各种抗原标记已经在很大程度上用来富 集能够再生组织或肺瘤的细胞。然而，在这些富集的群体中没有细胞 已经证明任何标明它们是干细胞的显微形态细胞性质。如果肿瘤由单 个干细胞产生是正确的，则需要鉴定它们并收集它们的方法，它们为 足以分析分子和生化分析物的均一的干细胞群(p叩ulation of stem cells) 形式。只有那时才可以集中大分子阵列技术(基因组学、蛋白质组学、 糖组学等)的能力及强大的生化分析形式诸如魔角核磁共振波谱法 (magic angle nuclear magnetic resonance spectrometry)。
发明概述
本发明涉及鉴定肿瘤干细胞并在其封闭环境中不损害或最小限度 损害正常干细胞或维持干细胞(maintenance stem cells)的情况下有选择 地并特异地破坏肺瘤干细胞的方法。本文公开的是意料之外的发现 肿瘤干细胞包含细胞核，在核分裂时，其中的基因组在相当长并且可 利用的一段时间内基本上是单链DNA(ssDNA)。通过利用靶向并改变 ssDNA的诸如化学或酶学试剂等的试剂(例如烷基化试剂、单链特异 核酶、靶向复制机器的试剂、靶向分离(segregation)的试剂及靶向一个 或多个干细胞特异分子的试剂)，肿瘤干细胞的细胞核物质被粑向破 坏，因为改变的ssDNA将不能进行进一步的复制恢复成为双链 DNA(dsDNA)。肿瘤干细胞特异分子是存在于肿瘤干细胞优选存在于细 胞核的分子，而不存在于周围细胞的细胞中。具体的胂瘤细胞特异分 子是可被靶向的，藉此，所述肿瘤干细胞特异性分子的功能或活性的 耙向和破坏可阻止或抑制肿瘤细胞增长。例如，任何阻止ssDNA复制 的试剂例如杂交到DNA却不能被延伸的分子，例如经修饰的寡核普酸 或核酸衍生物，例如没有肽核酸延伸所必需的y J舞酸酯的核酸。递送 试剂到患者细胞或肿瘤组织的方法为本领域所知，其中这样的试剂将 阻止ssDNA基因组的复制，并^v而阻止肺瘤干细^^々增殖。
在一个实施方案中，方法涉及选择性阻止或抑制肺瘤干细胞的生 长(例如细胞核或细胞分裂)，同时基本上不阻止或抑制周围细胞(例如维持干细胞)的生长。特别地，当粑向的干细胞进行核分裂时，该 方法包括将细胞与能够进入该细胞的细胞核并改变或修饰细胞核
ssDNA的试剂接触，从而阻止或抑制耙向细l包的进一步细月包核和细月包 的分裂。
在另一个实施方案中，方法涉及抑制患者肿瘤生长的方法，包括 利用改变或修饰肿瘤干细胞特异分子(例如ssDNA)的试剂或处理(agent ortreatment)来把向患者的肿瘤干细胞，从而阻止或抑制ssDNA的复制 并最终阻止或抑制肿瘤干细胞的增殖。在一个具体实施方案中，试剂 靶向在细胞内合成的肿瘤干细胞特异分子并分离入子代钟形细胞核 (segregated into daughter bell國shaped nuclei)。 在一个实施方案中,肿瘤 干细胞特异分子是单链DNA(ssDNA)。在另一个实施方案中，试剂是 化学试剂、放射性试剂、酶、或放射疗法，藉此靶向胂瘤细胞特异分 子。
附图简述


图1是主要图像的概要。A)人类胎儿肠管、正常结肠粘膜、腺瘤 和腺癌的分裂间期和早前期(E.P.)细胞中观察的细胞核形态型的实例。 B)胎儿肠管的钟形细胞核的高分辨率图像(xl400)。凝聚的DNA看起来 形成维持向中空钟形结构开口的环。比例尺，5jum。
图2A和B是5-7周胚胎肠管的图像。图2A:相差图像(左图)、 染色的细胞核图像(中图)和合并图像(右图)示出直径~50微米的管 状合胞体内线性排列的细胞核。图2B:细胞核的高分辨率图像显示中 空的钟形结构。所有观察的胚管都维持钟形的"从头到脚"方向，但 是该胚管前后迂回前进，从而使得平行的胚管具有局部反平行反向的 钟形细胞核方向。低放大倍数时，比例尺为50inm,高放大倍数时，比 例尺为5pm。
图3A-D显示胎儿胚管中的钟形细胞核的核分裂图像。图3A和B: ,,#^核分裂。钟形细胞核由具有相似形状的钟形细胞核产生。图3C 和D:不乂i/^》^核分裂。由钟形细胞核产生的球形细胞核和"雪茄" 形细月包核。比例尺，5 pm。
图4A-C显示正常成体结肠隐窝(crypt)的图像。图4A:约2000个 球状体、球形或盘状细胞核的隐窝，偶而(<1/100)包含可识别的位于隐窝底部的钟形细胞核(箭头处)。图4B:示出另一个钟形细胞核的隐窝 基部。图4C:良好展片的隐窝中壁和腔表面分裂间期和有丝分裂的细 胞核的形态型。放大的图像显示(i)间期的球形和椭圆形细胞核；(iUii) 早前期的球形和椭圆形细胞核；和(iv)前末期细胞核。低放大图像的比 例尺为100pm,高放大图像的比例尺为5nm。
图5A-E显示腺瘤的图像。图5A:腺瘤特征性大分支隐窝。图5B: 整个腺瘤都发现不规则的隐窝样结构。这些大的(>4000个细胞)不规 则隐窝样结构的基底通常出现2个，但有时1个、4个乃至8个钟形细 胞核(插入物)。图5C:具有相似细胞核形态型、包含一个钟形细胞核 的细胞簇。这些簇形式总共包含正好16、 32、 64和128个细胞。左图， Feulgen-Giemsa染色。右图，相差自动荧光图像。图5D:腺瘤中出现 钟形细胞核的情境(Context): (i)具有31个椭圆形细胞核和一个钟形细 胞核的簇；(ii)肩并肩排列的多个钟形细胞核；(iii)并排模式排列的钟形 细胞核(箭头)(iii)。具有几个钟形细胞核的~250个细胞核的不规则 混合物暗示新生的隐窝基底。图5E:不规则的隐窝样结构，包含具有 5种不同细胞核形态型、明显为同种细胞的细胞团，且在基底处具有一 个钟形细胞核(箭头)。在'a,b，中比例尺为100 pm在'e，中比例尺为5pm。
图6A-E显示腺癌的图像。图6A:非常大的隐窝样结构(>8000 个细胞)，具有较多折点的分支。箭头指示主要在肿瘤表面附近发现 的~250个细胞的隐窝样结构的实例。图6B:内部胂瘤块具有多个钟 形细胞核(所有细胞核形态型的~3°/。)。图6C:图6B中的钟形细胞 核定向为从头到脚的合胞体和非合胞体的横列式布局。图6D:腺癌中 对称的核分裂。图6E:腺癌中钟形物不对称的核分裂形成雪茄形的细 胞核。已经在结肠到肝脏的转移性病灶中观察到相似的结构。比例尺， 5 )Lim。
图7A-D是在人组织和细胞中研究的定量图像细胞计数各阶段的 说明。图7A:准备用于固定的外科手术废弃的新鲜结肠。图7B:显 微镜载玻片标本显示穿过息肉的lmm切片的铺片结果(息肉的位置， 画出"从顶到底"的轮廓)。图7C:整个隐窝中可观察到的细胞核排列 (绛红色)。与上文所示5ju切片(BrdU染色和H&M染色)相比，所 有隐窝细胞核得以保存。图7D:电动Axioscop显微镜-AxioCam彩色 CCD相机-KS 400软件图像分析工作站。图8A和B应用FISH来探测肿瘤中未分裂和分裂的钟形细胞核中 的"目的靶标"的图示。图8A:染色质(因为每jumM交高的DNA含 量被染为深色)形成独特的类似前期染色体、排列成两个平行圏的结 构。附图中的这些圈说明在钟形细胞核的这个特异位点可发现特异的 染色体这一预测。图8B:染色质分布和随想象的转变而发生的特异染 色体位置变化(此处细胞核"从钟形转变为椭圆形")在整个钟形细胞 核的不对称的分裂过程中发生。
图9A-D为显示TK-6人细胞球形细胞核中11号染色体的焚光原位 杂交结果的图像。图9A:前期染色体铺片的两对染色体。图9B:球形 细胞核的DAPI核染色。图9C:与FITC荧光探针杂交的相同的染色体 对。图9D:间期染色体DAPI和FITC染色的合并图像。比例尺5微 米。
图10显示排布在合胞体中的钟形细胞核的对称核分裂图像。 图11为显示进行细胞核分裂的钟形细胞核中DNA定位的图像。 图12显示在钟形细胞核核分裂期间细胞核物质的排列和组成 (ssDNA或者dsDNA)。
图13A-D显示来自人类胎儿标本、示出一系列以前未识别的细胞 核形式的图像。这些形式产生最初的钟形细胞核。图13A显示具有由~ 10%总DNA含量凝聚成围绕球形或者略微为椭圆形细胞核的长轴的 "带"的细胞核。图13B显示其中两条凝聚的细胞核"带"看起来已 经分离但仍然为单个细胞核一部分的细胞核。图13C显示看来像是由 图13B的双带细胞核分裂产生的一对细胞核。图13D显示每个合胞体 包含一组钟形物，在其线性中点处有单对钟形物，且如在图13C那样， 开口相对。这些图像显示一 系列对称分裂形成自中心对推开的细胞核。 图14A和B显示结肠腺瘤(图14A)和腺癌(图14B)中的细胞核形 态型。癌发生的形态型显示围绕椭圆形细胞核长轴的 一条或两条相似 的带。
图15A-C显示人类着丝粒的FISH染色。图15显示人类12周胎 儿结肠组织的球形(图15A)、"雪茄，，形(图15B)和钟形(图15C)细胞 核的着丝粒(明亮的)。
发明详述本发明涉及意料之外的发现肿瘤干细胞例如分裂形成肿瘤的细 胞会进行不对称的核分裂。未在除胂瘤组织之外的成体组织中发现的 钟形细胞核会经历基因组以单链DNA (ssDNA)为代表的时期。钟形细 胞核不对称分裂的特点允许专门耙向待鉴定和破坏、包含这种细胞核 的细胞例如胂瘤干细胞。人类肺瘤中，具有钟形细胞核的结构具备类 干细胞性质(stem cell-like qualities)。
本文描述的是基于这一意料之外的发现所建立的方法在人类结 肠和胰腺胂瘤中，钟形细胞核通过非有丝分裂分裂过程进行对称和不 对称分裂(Gostjeva " a/., 2005， C朋cer Gewe"cs C,gewe"cs, in press )。在5-7周胚胎后肠和肿瘤组织中出现大量这样的钟形细胞核， 其中在5-7周胚胎后肠中，钟形细胞核被管状合胞体包围并占总细胞核 的30%,而在肿瘤组织中，钟形细胞核在"未分化的"生态位中有很 多。它们具有一些类干细胞性质，尤其不对称分裂的"口令"和核分 裂频率，该核分裂频率与人结肠肿瘤形成前及肿瘤性组织的生长速率 一致(Herrero-JimenezeM/., 1998, 2000)。这些以前未发现的细胞核 形式均是肿瘤生成和分化的来源，因而是癌症治疗策略的靶标。
包含钟形细胞核的结构(例如细胞、类细胞结构或合胞体)代表 肿瘤干细胞。它们核分裂的无丝分裂方式需要分子机制，所述分子机 制对不在似乎通过有丝分裂而分裂的胚胎(嚢胚球)和成体维持干细 胞中表达的分子靶标进行了限定。例如，这些钟形细胞核会经历基因 组以ssDNA为代表的阶段这一观察结果将允许其耙向并破坏。对于钟 形细胞核空间组织如何、染色质怎样分散在细胞核中、特定染色体是 否在整个核纤层内部占有特定区域的探讨，将暗示更多的特异性治疗 靶标研究并提供对其他关于细胞核形态型(形状)和基因表达间关系 的了解。
本文公开的是，在胎儿后肠、结肠腺瘤和腺癌中发现的一系列特 殊的闭合细胞核形式，其看来似乎开始由钟形细胞核的不对称核分裂 产生但是随后通过有丝分裂分裂并死于细胞凋亡。胚胎和不存在于成 体组织的肿瘤中共有的细胞核形式支持了十九世纪肿瘤是成体器官中 的胚胎生长的假说(Cohnheim， J.， F^c/zov^」rc/z., 65: p.64， 1875; Sell, S., Owe. , 51: 1-28, 2004)。
本文描述的方法使得本领域技术人员可基于现有技术的高分辨率显微术和定量图像分析技术对具有不同形态的细胞核进行细胞生成终 点的体内分析，特别强调结肠、胰腺、肾、卵巢及其他肿瘤中的钟形 细月包核。
细胞和合胞体的钟形细胞核中的核结构、DNA含量和染色体的空 间分布可通过本领域技术人员已知的方法表征，例如通过定量图像细 胞计数和共聚焦显微镜检术。例如，这样的技术使得本领域技术人员 可以确定总的DNA含量，可以使用特定试剂例如吖咬橙或链特异的 DNA杂交探针来区分ssDNA和双链DNA (dsDNA)。这些信息可用于 区分肿瘤中具有不同形态、肺瘤型(结肠vs.胰腺)和生态位的钟形细 胞核。这样的技术还可以用来表征DNA合成进程并检测相关蛋白质的 存在情况，例如，与在钟形细胞核对称和一些不对称核分裂形式过程 中的DNA合成和分离相关的蛋白质。
分离具有钟形细胞核的细胞和合胞体为均质样本
本文和其他地方(PCT/US2005/021504, 2005年6月17日提交；和 美国申请No.11/156，251, 2005年6月17日提交；本文引用其全部内 容全文作为参考)描述的肿瘤组织制备的方法可适合于"弹射"压力 激活激光显微解剖的要求，以产生细胞核形态均质的细胞样本，该细 胞样本可应用于代谢物和大分子分析。这样的方法使得本领域技术人
员可鉴定在人类肿瘤中减緩分裂或者破坏包含钟形细胞核的结构的合 理耙标。
本发明的方法部分基于在不固定的肿瘤标本中识别细胞核形态的 方法，因此可在体外研究具有钟形细胞核的活细胞和合胞体的均质标 本。研究活的钟形细胞核以更好地了解它们的特殊DNA合成和分离机 制，并提出在癌症治疗中干扰这些过程的方法。
癌症治疗中的"干细胞靶标"
现有癌症治疗方法的主要靶标是通过细胞周期的细胞 (Gomez-Vidal, J. A., C匿7bp.她t/. C/ze附.，4: 175-202, 2004;
Fischer, P.和Gianella-Borradori, A., ExpeW /wveW/g. ZVwgs, 14: 457-477, 2005 )。在成体维持干细胞和肿瘤干细胞间的转换细胞间没有 区別，所述成体维持干细胞分裂来提供过渡细胞以替换细胞程序死亡导致的末端细胞损失。治疗目的在于窄的用药窗，所述用药窗会杀死 全部的肺瘤干细胞而不杀死患者。但是，预计成体维持干细胞在逻辑 上具有零细胞生长的性质，然而肺瘤干细胞如胎儿干细胞很明显涉及 快速的净细胞生长。成体维持干细胞分裂似乎在本质上必然是不对称 的，这产生新的维持干细胞和一个最初分化的过渡细胞。肿瘤干细胞 需要连续的对称的核分裂以支持肿瘤净生长。正是在肿瘤中的钟形细
胞核会经历对称的"c叩-from-cup"核分裂这一发现中发现抑制细胞生长 的或者杀细胞的疗法的特异靶标。
与这些化学疗法的杀细胞策略无关的假说是可通过阻止血管生成 寸吏肿瘤窒息，例如Folkman和Ingber Omcw^o/., 3: 88-96，
1992)。其他人提出通过阻断细胞分化的癌症治疗方法。但是所产生的 缺氧就所涉及的干细胞来说重新形成早期胚胎发生的条件，并可解释 抗血管生成策略的减轻效果而不是治疗效果(Warburg， O., S;oc/^m. Zetoc/zn/" 152: 479, 1924)。阻断肿瘤分化可阻断伴有不良后果的正 常组织分化。由于在较短一段时间内干细胞会重新集中于肿瘤中，因 此现有的癌症疗法有效性有限，这一理解已经成为寻找肿瘤干细胞而 非成体维持干细胞所特有的分子和生物化学特征的有力刺激(Otto， W.,人尸W/zo/., 197: 527-535, 2002; Sperr, W.等人，￡wr. /"veW.，
34 (增子'J 2》31-40, 2004; Venezia, T.爭乂，尸Z^S編.,2: e301, 2004)。 肿瘤干细胞这样的分子和/或生物化学特性，可作为癌症治疗中的耙标。 在结肠肿瘤而不是成体结肠上皮中的钟形细胞核会经历对称和不对称
纟田胞(Gostjeva， E.爭乂， C匿w C声炉".，164: 16-24, 2006)。
胚胎、干细月包系和肺瘤中干细胞的细胞遗传学
新和分化的不对称分裂。s而:在胚胎和肺瘤的干、细胞中^括核分裂
时DNA合成和分离的细胞周期发展机制仍基本上未探究过的。这些成 果的缺乏是可以理解的，原因在于在人类或者组织范围内一直没有直 接的鉴定干细胞的细胞学标记。已对鼠科动物结肠和细胞株的成体干 细胞中的不对称分裂进行了探讨，所述不对称分裂极其重要的证据在 于假定的干细胞中亲代DNA链的选择性泛子(pangenomic)分离(potten, C.爭乂， Ce〃Sc/., 115: 2381-2388, 2002; Merok， J.爭 乂， C騰wto.， 62: 6791-6795， 2002)。这种干细胞特异性的染色体 基因转移模式非随机方式的识别领先于现有的似乎是干细胞特异性细 胞核形态和分裂才莫式的识别几十年(Cairns， J., A^wm, 255: 197-200, 1975 )。
实施例
实施例1. 确定组织和胂瘤的来源。
由和来自麻萨诸塞族综合医院病理科合作者的外科手术废弃物获 得成人组织和肿瘤样品(Gostjeva， E.等人，C朋cer Q^ogewe/.,
164: 16-24， 2006)。由W. G. Thilly教授的实验室利用匿名的废弃肿瘤 和组织切片已经通过利用人类作为实验对象的MIT委员会批准。
开发用于组织切除、固定、展片和DNA染色的方法。
以下方法容许组织和肿瘤样品细胞核的可—见化，使染色体和细胞 核的结构和定量观察结果达到所希望的清晰度。关键因素是利用外科 手术30分钟内固定的新鲜肿瘤样本，并避免标准的薄切片过程。显然 钟形细胞核是组织和肿瘤样本中自溶作用(autolysis)的早期牺牲品，并 在切除大约45分钟后不再可辨别。标准5微米切片仅通过所发现的几 种细胞核形式进行切片，几乎所有的细胞核具有大于5微米的最小直 径。设计的具体技术是重要进程的证明
切除后30分钟内将薄片(~ 1 cm勺诸如条带状的结肠粘膜，或者腺 瘤、腺癌或者转移性病灶~ lmm厚的切片置于至少三倍体积的新近配 制的4。C卡诺固定液(甲醇:冰醋酸=3:1 )。用新鲜的固定液更换三次(每 45分钟一次)然后更换为4。C的700/。甲醇将样本贮存在-20。C。在蒸馏 水中漂洗固定的切片，并为了部分水解大分子和DNA脱噪呤将其置于 2mL60 。C的1NHC1中8分钟。在冷的蒸馏水中漂洗以终止水解反应。 将漂洗后的样本浸渍于45%乙酸中(室温)达15到30分钟进行"组 织浸渍"，这使得可通过对显微镜用盖玻片施加较小的压力，从而将植 物和动物组织切片进行展片并观察。将每个浸渍后的切片平分为~ 0.5x1 mm的碎片，并利用5 ju 1乙酸转移到载玻片上的盖玻片下。为了组织展片，将5层滤纸置于盖玻片上。利用轻的均衡的压力沿着滤 纸的一个方向稳稳地移动镊子柄。在良好展片的结肠组织中，没有受 到损坏的细胞核，而隐窝基本上被压成单层。在干水冷冻后移去盖玻 片，并干燥载玻片1小时。在室温下将载玻片置于装满Schiff试剂的 科普林缸一小时来对去嘌呤DNA进行部分染色(福尔根染色)，在同 一科普林缸中利用2xSSC (柠檬酸三钠8.8 g/ L、氯化钠17.5 g/L )漂 洗两次， 一次漂洗30秒， 一次快速漂洗。然后用蒸馏水漂洗载玻片， 漂洗后的载玻片适于核的图像分析(Gostjeva, E., C^o/. 32: 13-16, 1998)。为了达到更好的分辨率，可进一步将载玻片利用吉姆萨 试剂染色。在2xSSC漂洗后立即将载玻片置于1。/。吉姆萨溶液(Giemsa， Art. 9204, Merck)5分钟，然后快速漂洗，第一次用SOrenssen緩冲液 (二水合磷酸氪二钠物U.87 g/L、磷酸二氢钾9.07 g/L)，然后用蒸馏 水漂洗。将载玻片于室温干燥一小时，然后将其放入装满二曱苯的科 普林缸中至少3小时以除去脂肪。在高分辨率扫描前，利用DePex封 固剂将盖玻片胶着在载玻片上并干燥3小时。
做为选择，可通过暴露于蛋白水解酶例如胶原酶II实现浸渍，从 而实现具有确定细胞核形态的活细胞的分离。
显微镜和图像处理系统。
本文所使用的定量图像分析软件利用由早期卫星监视系统改造而 来的背景抑制方法。该技术由德国Kontron公司获得此后其本身由Zeiss 公司获得。利用专用的KS-400图象分析系统TM3.0版本(Zeiss,德国) 采集所有图像，该系统由连接到个人电脑的电动光学显微镜、 AxioscopeTM、彩色CCD照相机、AxioCamTM(Zeiss,德国)组成。当仅 使用福尔根染色时，利用可见光和560 nm (绿色)滤光片，由1.4/100 放大倍数的平面消多色差物镜从显微镜传输图像。当使用福尔根-吉姆 萨染色时，不利用滤光片。在每次扫描前，调整帧接收器和最佳曝光 量。以像素大小0.0223x0.0223微米记录细胞核图像。
胚胎肠管
在整个胎儿肠管样品中发现七种不同的细胞核形态型(大的球形、 凝聚的球形、椭圆形、菜豆形、雪茄形、香肠形和钟形)(图1A)。钟形细胞核看来是由类似凝聚染色体的凝聚的染色质形成开口的(图
1B)。钟形细胞核在~ 20-50微米管或者合胞体内部以线形"从头到脚" 排列方向组织(图2)。钟形细胞核的"从头到脚，，模式存在于所有被 观察的胚管中，但是胚管前后迂回前进，从而使得平行的胚管具有局 部反平行方向的钟形细胞核。
观察到钟形细胞核仅仅在合胞体内部经历对称和不对称无丝分裂 (图3)。钟形细胞核的对称无丝分裂类似两个堆叠纸杯的简单分离。 在最高分辨率下，类似成对染色体的凝聚染色质看起来形成将钟"口" 维持在开启状态的环。在管状合胞体之外，经常观察到几种"闭合的" 细胞核形态型的每一种的有丝分裂。特定的"闭合的"细胞核形态存 在于早前期，如图1所示。
正常的结肠上皮
从隐窝基底到腔表面均可观察到隐窝中几乎全部的细胞核(图 4A)。许多隐窝都以个体细胞核形状可辨别这样的方式展开。具有椭圆 形或者球形细胞核的细胞沿基底正上方到延伸到腔内的上皮排列成为
隐窝。(图4C)。在隐窝基底的笫一个~25个细胞中， 一种可能不同、 占九分之一细胞核形态型的特征在于为盘形，厚~2-3微米且直径为~ IO微米(图4B)。在不足1%其中细胞被良好分离的所有隐窝基底中， 从明显为盘形的细胞核中辨认出唯一的钟形细胞核(图4A和4B)。已 在成体肝脏标本中观察到类似低频率的钟形细胞核。在没有任何肿瘤 形成或肿瘤形成前的病理征兆的成体结肠中，对超过一千个良好展片 的隐窝的细胞-细胞扫描中没有观察到其他细胞核形态学变体。
腺瘤
腺瘤包含许多隐窝，这些隐窝与各具有~2000个细胞的正常结肠 隐窝没有区别。常常发现这些隐窝是如图5A所示的分支形式。隐窝壁 与正常结肠隐窝有着相同的球形和椭圆形细胞核，但是比正常结肠中 更常见的是，在隐窝基底存在一个或两个钟形细胞核。也观察到含最 高达~ 8000个细胞的不规则的小叶结构，这些细胞更容易通过组织浸 渍展开。在几乎所有不规则结构中，有两个或更多个钟形细胞核，其 钟形开口在结构主体方向上(图5B)。另外，许多不同的细胞和群体分散于隐窝和不规则结构中(图5C)。 一些规则结构仿佛朝着完整尺寸 的正常隐窝生长，这些隐窝包含~ 250个、~ 500个或者~ 1000个细胞。 许多细胞群体看起来是刚好8个、16个、32个、64个和128个细胞的 "环"，其中每个细胞具有一个钟形细胞核(图5D)。
较高放大倍数的检查显示大部分隐窝样结构的壁的细胞具有与正 常成体结肠隐窝 一样的球形或者椭圆形细胞核。在不规则的小叶结构 中出现的具有椭圆形、雪茄形或者子弹形细胞核的细胞群体表明几个 不同群体的融合。已经在胚胎后肠中观察到具有椭圆形和雪痴形细胞 核的群体，但是仅仅在腺瘤和腺癌中发现子弹形细胞核形态型(图5E)。
钟形细胞核产生。发现具有子弹形细胞核的小群细胞，这些群体包含 进行普通有丝分裂的细胞，除了从前期到后末期(anatelophase)在某 种程度上保持特有的细胞核形态这一有趣的事实。
钟形细胞核虽然在正常成体结肠中很少，但经常出现在多个腺瘤 中。发现有一些钟形细胞核在隐窝样结构之间的空间为 一个到十个或 更多个的"钟"(图5D)。发现其他钟形细胞核在多细胞环状结构中为 一个"钟"，其中经常在具有球形或其它形态型的(2n-l)个细胞的环 中观察到一个钟形细胞核(图5C和5D)。
在隐窝样结构基底杯内钟形细胞核表现为单个钟，更通常为 一对 钟或者偶而为4个或者8个钟。在大得多的不规则小叶结构中，在解 剖学上钟形细胞核整合至与具有其它细胞核形态的细胞混合的异常结 构的壁中。好像这些大的不规则的隐窝样结构是多个各种各自具有自 己细胞核形态型的群体的镶嵌物。估计大的腺瘤(~1厘米)包含约 1000个钟形细胞核。在每个多发腺瘤中都已经观察到数百个钟形细胞 核，但在通常存在于胚胎切片的对称形式细胞核分裂的任一腺瘤中观 察到单个钟形细胞核；然而已经在腺瘤中观察到几个不对称细胞核分 裂的实例。
腺癌
同腺瘤 一 样腺癌也包含隐窝、大的不规则结构和隐窝内 (inter-cryptal)的16个、32个、64个和128个细胞群的混合物。还 在隐窝的基底杯中发现钟形细胞核为单一、成对或者数量较多，且这些钟形细胞核嵌入大的不规则小叶结构的壁中的复杂斗形紋中(图6 )。 腺癌中的 一 系列细胞核形态型与在腺瘤中发现的系列 一样，包括子弹 形的形态型。
腺瘤和腺癌间可辨别的差异是隐窝样结构随机定位于肿瘤表面。 在瘤内部也不经常发现隐窝和不规则结构，这被更好地表征为较小的 局部组织的结构折中而非混乱的的集合。
腺癌不同于腺瘤最显著的差异是多于数百个钟形细胞核明显有组 织的群体的频繁出现，其中有许多经常(~ 1%)涉及对称的核分裂。后 来确定这些对称分裂包括凝聚的细胞核物质。钟形细胞核具有正常单 倍体细胞一样的DNA量。当钟形细胞核开始经历"cupfrom cup"的对称 分裂时，DNA含量增加到单倍体基因组所含DNA量的1.05倍(若着 丝粒复制预期增加约一倍)。DNA含量维持在该水平， 一直到"cupfrom cup"过程晚得多的时间，此时这两个细胞核包含2倍量的DNA物质。 正是在可能仅有着丝粒被复制且基因组的链被分开的阶段，基因组基 本上被组织为ssDNA。直到该过程复制后，基因组才又变成dsDNA。
低放大倍数时，这些结构出现在隐窝样结构间的空间，并且看来 像蜘蛛网或者叶脉骨架。较高放大倍数时，发现该薄叶脉是具有钟形 细胞核的细胞的部分有序排列链，这些钟形细胞核具有开口朝向同一 方向(自叶脉轴90° )这一不寻常的特征(图6C)。在胚胎的肠管而 不在腺瘤观察的局部有边界的合胞体中也发现"从头到脚"方向的钟 形细胞核(图6C)。估计腺癌块中有数百万的钟形细胞核，且具有频繁 的对称和不对称的无丝分裂(图6D和6E)。结肠直肠瘤至肝脏的转移 重新形成了细胞核形态型的模式，隐窝和不规则结构似乎与在腺癌中 观察到的那些没有区别。
对3D保存的单个钟形细胞核和成对对称分裂的钟形细胞核进行共聚焦
显微木
为了对3D保存的单个钟形细胞核和成对对称分裂的钟形细胞核 执行共聚焦显微术，使用Delta Vision RT Restoration Imaging System at Imaging Center, Whitehead Institute。该系统提供用于细胞核成4象恢复 的实时2D重叠合法和3DZ投影法。
应用细胞核细胞质(FITC-毒伞素)和细胞核(DAPI)复染来研究钟形细胞核的内部结构。按照与福尔根染色相同的方法通过"水解" 浸渍将细胞铺在载玻片上。区别是应用两种不同的固定液固定以比4交 结果卡诺固定液(4。C)和3.7%的曱醛固定15分钟，在含2% BSA(2g)、 0,20/。脱脂奶粉(0.2g)、 0.4Q/otritonX画100 (400juL)的lOOmLPBS封闭液 中封闭2小时(室温)，后者推荐用于活组织细胞的固定。在将其上铺 有组织的显微镜用载玻片用PBS冲洗两次之后，将该载玻片转入湿度 试验容器，将100 mL利用封闭液适当稀释的第一抗体液滴滴到载玻片 并覆盖整个铺片区域，利用橡胶胶水密封盖玻片顶部，置于贴箔的容 器中并放入冷房间中的湿度试验容器过夜。然后将未密封的载玻片在 PBS中洗涤三次。取出载玻片，将lOOiiL利用封闭液适当稀释的第二 抗体和/或细胞染色剂(例如，FITC-毒伞素、DAPI)液滴滴到载玻片 并覆盖含有细胞展开物的区域，并转入容器中的湿度试验容器。密封 容器/湿度试验容器，用铝箔包裹并置于室温2小时。载玻片在PBS中 洗涤五次并以每个有2-5 juL封固剂(抗脱色57owFa&、 recto幼"7d 或者液滴的方式制备。盖玻片被封片以确定过量PBS被除 去(在纸巾上轻敲盖玻片的角)。通过在将盖玻片完全降下前将其边缘 放入封固剂以减少封固时形成的气泡数目。利用指曱油用盖玻片封闭 载玻片并将该载玻片在4'C避光保存(或者-2(TC更长时间)。利用 Delta Vision RT复原成像系统观察该栽玻片。
利用Feulgen-Schiff方法的方案测量细胞核DNA含量，已证明该 方法可对于DNA的细胞化学定位和化学计算是精确的。通过测量 Feulgen-DNA (染料-配体)复合体分子的吸光度来测量单个细胞核中 的DNA含量(Kjellstrand， P., /. A^cm co;^, 119: 391-396, 1980; Andersson, G.和Kj ell strand, P., ///W0c/2謹'e, 27: 165-200， 1971)。 利用由^S400成像分析系统(ZeissInc，德国)所改进的软件，通过测量 每个细胞核个体的全部区域的光密度积分(IOD )来测量不分裂(间期) 和分裂的钟形细胞核。
这些特殊成像分析工作站(参见图9D)由耦联有与电脑连接的 AxioCam彩色CCD相机(Zeiss)的显微镜Axioscop 2 MOT(Zeiss)组成， 由Carl Zeiss公司的工程师装配，是能获得高分辨率的细胞核和细胞结 构图像的显微术，也就是说在早前期染色体测量中每个像素有1000 bp 的DNA。所以，能精确测量间期细胞核中~ 1 Mb的凝集染色质区域。在常值参数的放大率、曝光量和定阈值(作等值线)下利用560 nm绿 色滤光片扫描细胞核图像。选择这样的DNA含量测量方法有望得到最 精确的结果(Biesterfeld.S.等人，爿朋/. 0^抓Q^ /. ///Wo/.,23: 123-128, 2001; Hardie， D.等人，J.历W Cy r/^肌，50: 735 — 749, 2002;
Gregory和Hebert, 2002; Gregory, 2005 )。
荧光原位杂交以确定间期和细胞核分裂期间钟形细胞核中全部24条人 染色体的空间分布。
利用FISH确定看起来像是钟形细胞核顶部的"环"、参与凝聚 的全部染色体。本质上，"环"中的染色体标记被预测为分析钟形细胞 核产生具有不同形态的细胞核(如图10B所示)时转换的工具，以及 开发通过除细胞核形态之外的其他方式识别这些细胞核的焚光标记的 工具。
将每张载玻片不多于1-5乂107个细胞的胂瘤细胞铺在载玻片上。通 过两种不同的细胞铺片方式固定载玻片 一种用于福尔根反应DNA图 像细胞计数，另一种由Gibson提出，用于分离来自结肠镜检查活检标 本的上皮细胞(Gibson, P.等人，G赠固詢/ogy, 96: 283-291, 1989)。 后者基本在外科手术30分钟内取胂瘤组织并立即将其置于50 mL冷的 Hank's平衡盐溶液中，然后洗涤。然后用解剖刀刀刃切碎样品并在4 mL 胶原酶-分散酶培养基中消化1.5小时(培养基包含1.2 U/ml的分散酶 1(5oe/ n'/ ger A/"wwAez'/ 7 5/oc/ze附/ca/s, /"<^/"""/70// ， /"t/.)和50 U/ml月交
原酶IV型(Worthington, Biochemical Corp., Freehold, N丄)。通过在 盖玻片上施加温和的滑动压将沉淀铺在显微用载玻片的表面。对于细 胞铺片，"水解"浸渍铺片作为阳性对照以检测钟形细胞核形态是否在 施加胶原酶-分散酶处理之后有任何变形。使制备得到的载玻片干透并 置于37%过夜。然后，将载玻片顺次置于水冷的70%、 80%、室温的 100%乙醇中脱水，每次2分钟并完全干燥，在72 。C的70%甲酰胺/2xSSC 中变性2分钟并立即以相同的次序脱水及完全干燥。制备得到的杂交 混合物包含7juL杂交緩沖液、2mL无菌水和1 juL探针。将混合物在 72。C变性8到12分钟并立即添加到载玻片，随后将该载玻片盖上盖玻 片，用橡胶胶水密封，并置于37。C的黑暗湿润箱中过夜。
然后，将载玻片在冷的70%乙醇、冷的80%乙醇，室温的100%乙醇中脱水，每次2分钟；在72。C的70。/。甲酰胺/2xssc中变性50-60秒， 取决于乙酸的变性程度。将载玻片在冷的70%乙醇、冷的80%乙醇及 室温的100%乙醇中再一次脱水，每次2分钟。杂交混合物包括包含7 HL杂交緩冲液、2juL无菌水和1.5juL。应用具有橙色光谱或者绿色 光谱荧光染料的整个染色体颜料探针(^w力。杂交混合物在72X:变性 5-10分钟并随后完全干燥。将杂交混合物添加到载玻片，盖上盖玻片 并用橡胶胶水密封。然后将载玻片置于37。C湿润箱中孵育过夜。第二 天，将载玻片于42。C的50%甲酰胺、2xSSC中洗涤两次，每次8分钟。 然后将载玻片在37。C的2xSSC中洗涤8分钟，再在室温下的 lxPBD(0.05。/oTween、4xSSC)中洗涤三次，每次1分钟。然后添加10jaL 的DAPIII抗褪色剂，125ng/mL (Vysis)并盖上盖玻片。吸去过量的DAPI II抗褪色剂并利用橡胶胶水密封载玻片。在图象扫描操作前将载玻片 在-2(TC保存于黑暗中。
在钟形细胞核核分裂之前、期间、之后利用定量DNA细胞计数追踪DNA 合成
本文描述的技术可检测人类细胞培养物中差异低到2%的任何两 个细胞核或者有丝分裂时后末期的姐妹细胞核。利用这些技术来确定 包含钟形细胞核的细胞或者合胞体中何时合成DNA。这涉及扫描好象 处于核分裂过程的细胞核。注意到通常，与在同一染色载玻片上的人 类淋巴细胞DNA含量相比，胎儿钟形细胞核包含预计的人类二倍体细 胞的DNA量。另外，注意到人类肿瘤发生前的病变和肿瘤的钟形细胞 核中的DNA量表现出围绕一平均值有较大变化，该平均值平均大于二 倍体DNA量。测定结果已揭示了另一个完全意外的发现对于涉及钟 形细胞核的对称和不对称核分裂，DNA合成同步于而不是先于核分裂 过程。在明显检测到单个细胞核数量中总DNA含量增加前，细胞核在 "cup-from-cup"分离过程中似乎很好。DNA总量在细胞核明显开始分 裂中从接近单个肿瘤细胞核的平均值这一低值开始增加，并在细胞核 似乎刚刚完成分裂约达到平均细胞核含量的两倍。
实施例2.胎儿器官发生中合胞体的钟形细胞核
在产生钟形细胞核的人类胎儿标本中鉴定出 一 系列以前未被识别的细胞核形式。这些形式发现于第五周，为第一个管状合胞体，含有
钟形细胞核。图13A-D显示这些实例。这作为一项重要发现，标志着 形态从早期胚胎发生的有丝分裂球形细胞核过渡到后来的无丝分裂钟 形细胞核，该钟形细胞核代表净生长和分化的有生殖力的"干"细胞 谱系。
这些发现在组织类型间是一致的，因为已经在一系列组织标本中 观察到该发现，组织标本包括例如肌肉、发育中的肢体、神经组织和 内脏器官(包括胃、胰腺、膀胱、肺和肝脏)。所发现的合胞体为在发 育中的器官块内部规则分布的~ 16-24个合胞体的簇，每个合胞体都具 有~16个钟形细胞核。合胞体在可得到的最少发育的人类材料中是明 显的(~5周)并在第十三周消失。笫十二周后，钟形细胞核以各器官 所特有的方式在三维空间中规则分布。
图13A显示由~ 10。/o总DNA含量凝聚成围绕在球形或略椭圆形细 胞核的长轴的"带"。图13B显示这样的细胞核其中两条浓缩细胞核 "带"看起来是分离的但仍是单一细胞核的一部分。图13C显示看来 像是由图13B的两条带细胞核分裂产生的一对细胞核。图13D显示每 个合胞体包含一组钟形物，同图13C —样，单对钟形物在其线性中点 处，且开口相对。这些图像表明一系列对称分裂形成自中心对推开的 细胞核。在各组中4全测到的合胞体结构与四个钟形细胞核大小相当。
在癌发生的细胞核形态型的研究中，在结肠腺瘤(图14A)和腺 癌(图14B)中有少数细胞核显示相似的带_ 一条或者两条围绕椭圆形 细胞核的长轴。该发现证实并进一步支持了一般假说，该一般假说为 肿瘤形成同样具有所存在的个体发育的很多关键表型转换步骤，不过， 出现的顺序相反。
人类着丝粒的特异FISH染色
事实上合胞体外的钟形细胞核包含人类DNA。胎儿样本中，大多 数的着丝粒与钟形细胞核开口处的凝聚DNA区域相关。有趣地，标准 的FISH方法不能对合胞体内的钟形或者其他形状的细胞核染色，这表 明含有收缩元件的合胞体鞘膜可阻止FISH试剂的进入。图15显示人 12周胎儿结肠组织的球形(图15A)、"雪茄"形(图15B)和钟形(图15C) 细胞核的着丝粒(绿色)。也观察到姐妹细胞核的DNA含量等同于胎儿无丝分裂的钟形细胞 核，但是在多组织来源的人类胂瘤钟形细胞核的无丝分裂中，它们表 现出显著程度的不相等DNA分离。虽然没有在结肠胂瘤发生前的息肉 的中性细胞核中发现无丝分裂的实例，但注意到每个息肉中发现的几 十个钟形细胞核中DNA含量的明显分散，表明不相等的DNA分离是 在胂瘤前期和瘤形成中而不在胎儿的钟形细胞核分裂中起作用的现 象。这些观察结果支持了 Virchow和Cohnheim的肺瘤组织和胚胎组织 具有相似的组织学特点这一观察结果，同时还支持Boveri的有丝分裂 中的胂瘤细胞显示出大部分所有胂瘤细胞所共有的畸变染色体这一观 察结果-表明在不稳定的染色体形成或者分离中有较早的共有来源。
小鼠中的细胞核形态
尤其包括钟形细胞核在内的所有不同形式的细胞核，在形态上几 乎与图13A-D相同的前合胞体和合胞体形式发现于小鼠胎儿组织中， 且前合胞体形式最初发现于12.5天，然后发现于与小鼠胎儿中器官确 定期相密切对应的14.5-16.5天。考虑到在人中的观察结果，在小鼠中 的这些发现并不令人吃惊，但是它们为在非人类物种器官发生研究的 可能性开辟了一个广阔领域，而该器官发生研究在人类中不是伦理或 合理的。
在高质量固定的第五到第十六周妊娠的胎儿丢弃样本中，合胞体 已不明显但是钟形细胞核却在全部发育的器官中以规律的模式分布。
实施例3
对原始消化管的大量合胞体和钟形细胞核应用 一 系列组织化学方 法，包括用来确定染色体及染色体元件、各种收缩分子(例如肌动蛋 白)及其他包括通常被称为"干细胞标记"在内的可鉴定标记的位置 的FISH。本文描述的技术用来利用ZEISS-P.A丄.M.显微解剖仪器完成 收集合胞体和个体细胞核的工作。成功的标准在于收集到一系列在合 月包体形式和细力包核形态型方面均一、数目等于或大于10,000个细胞核 等同物的样本，该数目足以对细胞mRNA、最常见的蛋白质和糖胺聚 糖进行扫描。
尽管本发明已经参照其优选的实施方案特别示出并得到描述，但是本领域技术人员应该理解的是，在不背离本发明所附权利要求的范 围下，可在形式和细节方面作出各种改变。
权利要求
1. 抑制肿瘤干细胞的方法，包括利用对肿瘤干细胞特异分子进行化学修饰的试剂或处理来靶向所述肿瘤干细胞，从而阻止肿瘤干细胞的增殖。
2. 权利要求1的方法，其中所述肿瘤干细胞特异分子被合成并分 离入子代钟形细胞核。
3. 权利要求1的方法，其中所述肿瘤干细胞特异分子是单链 DNA(ssDNA)。
4. 权利要求l的方法，其中所述试剂是化学试剂。
5. 权利要求1的方法，其中所述试剂是酶。
6. 权利要求1的方法，其中所述处理是辐射。
7. 抑制患者肿瘤生长的方法，包括利用对肿瘤干细胞特异分子进 行化学修饰的试剂或处理来耙向所述患者的肿瘤干细胞，从而阻止肿 瘤干细胞的增殖。
8. 权利要求7的方法，其中所述肿瘤干细胞特异分子被合成并分 离入子代钟形细胞核。
9. 权利要求7的方法，其中所述肿瘤干细胞特异分子是单链 DNA(ssDNA)。
10. 权利要求7的方法，其中所述试剂是化学试剂。
11. 权利要求7的方法，其中所述试剂是酶。
12. 权利要求7的方法，其中所迷处理为辐射。
全文摘要
本文描述的是抑制肿瘤生长的方法，包括利用在化学性质上改变肿瘤干细胞特异分子的试剂或处理来靶向患者的肿瘤干细胞，从而阻止肿瘤干细胞的增殖。
文档编号A61K45/06GK101426903SQ200680052588
公开日2009年5月6日 申请日期2006年12月8日 优先权日2005年12月9日
发明者E·V·戈斯特杰瓦, W·G·蒂利 申请人:麻省理工学院