专利名称：在体反应式微气泡超声造影剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及超声造影剂，具体涉及由高分子聚合物或磷脂类囊膜材料与包裹酸源和碱源颗粒粉末混合物以及表面靶向抗体组成的能在体内液体环境中自发反应产生微气泡的超声造影剂及其制备方法。
背景技术：
超声造影剂(ultrasound contrast agent，UCA)是一类在人体微小血管和组织灌注检测与成像方面，能够显著增强医学超声检测信号的诊断药剂。理想的UCA应该是无毒，可静脉注射，能通过肺部毛细血管，能足够稳定以获得在超声检测过程中的增强作用。为满足检测费用低的要求，UCA不仅要能够多普勒增强也要能普通二维灰度图象增强。目前超声造影剂的研究主要集中在获得具有与计算机层析成像(CT)或磁共振成像(MRI)造影剂类似的组织增强特异性造影剂，主要利用微气泡在超声场中的非线性特征，增强信号密度的反射，提高各种模式多普勒分析和特定灰度影像回声结构的影像。微气泡超声造影剂作为超声诊断药剂，开创无创伤超声医学崭新领域的同时，还具有分子成像、促进血栓溶解、促进基因转染及药物体内运输定点释放的作用。
血管比组织的声学阻抗低2～3个数量级，这种低的血液/组织信号比使小血管直接超声显影时难以观察。超声造影剂，尤其是0.1～8μm的微气泡能显著增强血管甚至毛细血管的超声检测，目前研究的种类主要有三种普通微气泡型；脂质体型和全氟化碳纳米颗粒乳剂型，尤以包裹气体的微气泡反射回声最强，但大部分游离的或外包裹囊膜的微气泡由于稳定性差导致超声显影的持久性和检测效率有限。稳定的微气泡应具有良好的安全性和优良的显影效率，显影增强持续时间足够长以便能够完成一次完整的超声检测过程。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种在体反应式微气泡超声造影剂及其制备方法，1)将制备含气体的微气泡超声造影剂改进成在体内自发反应产生微气泡；2)将酸源、碱源颗粒粉末混合物装载到囊膜材料上，制备体外稳定的能在水溶液环境下反应产生微气泡的超声造影剂；3)延长微气泡超声造影时间。通过本发明能够提高强回声反射微气泡造影剂的稳定性和有效性，一方面降低了超声造影微气泡的制备难度和成本，另一方面可提高病人的顺应性和超声影像诊断的准确性。
技术方案本发明的在体反应式微气泡超声造影剂由含修饰后的高分子聚合物或脂质体囊膜材料与酸源、碱源颗粒粉末混合物以及靶向抗体和磷酸缓冲液组成，高分子聚合物囊膜包括聚乳酸“PLA”、或聚丙交酯/乙交酯“PLGA”；脂质体囊膜成分主要包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、脑磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、胆固醇乙酰酯中的一种或几种混合；酸源主要包括柠檬酸、酒石酸、富马酸、己二酸、苹果酸中的一种；碱源主要包括碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钙中的一种；靶向抗体主要包括Rb40.34抗P-选择性蛋白抗体和生物素和抗生物素蛋白链霉素。该造影剂中，囊膜材料占造影剂的比例是8～20％质量/体积百分比，酸源、碱源颗粒粉末混合物占造影剂1～10％质量/体积百分比，靶向抗体的比例为1～5％质量/体积百分比，其余为磷酸缓冲液溶剂。
所述的在体反应式微气泡超声造影剂的制备方法包括以下步骤步骤a将囊膜材料与乙醚或氯仿等有机溶剂接触，溶解形成液体状态，温度为室温，维持时间为5～10分钟；步骤b将酸源和碱源分别湿法制粒后压片、粉碎，过100目筛备用；或在酸源和碱源分别湿法制粒过程中加入治疗药物后压片、粉碎，过100目筛备用；步骤c在囊膜溶液中加入步骤b颗粒粉末，搅拌均匀后在减压旋转下除去溶剂，使囊膜材料在器壁上形成薄膜；步骤d1)在步骤c的薄膜容器中加入预热至55～65℃的磷酸缓冲液，再在55～65℃下振摇30～60min，即得在体反应式微气泡超声造影剂溶液；其中磷酸缓冲液“PBS”，pH＝7.4±0.1；或2)在步骤c的薄膜容器中加入含聚乙烯醇的磷酸缓冲液，再在室温下搅拌60～120min，即得不带靶向抗体的在体反应式微气泡超声造影剂溶液；步骤e取步骤d的溶液经磷酸缓冲液少量多次洗涤后，加入抗生物素蛋白链霉素，在0℃振荡30min，再经磷酸缓冲液洗涤后，加入生物素耦合的p-选择性蛋白抗体Rb40.34，在0℃振荡30分钟，经磷酸缓冲液少量多次洗涤后，制备得表面带p-选择性蛋白的具有靶向性的在体反应式微气泡超声造影剂溶液。
有益效果为克服目前微气泡超声造影剂体内外不稳定性和造影持续时间短的缺点，拟将能在水溶液环境下自发产生二氧化碳气体的酸源和碱源包裹在脂质或聚合物囊膜内，制备囊膜包裹酸源和碱源颗粒粉末混合物的注射超声造影剂。该制剂进入体内后，当到达特定靶向部位，囊膜破裂后，内部的颗粒粉末释放出来接触水溶液环境后自发产生大量的二氧化碳微气泡，从而可显著增强超声影像图形。该包裹在体反应式微气超声造影剂具有如下特点(1)靶向性囊膜材料表面经过特异性修饰，可靶向特定组织器官；(2)制备工艺相对简单在制备过程中不直接引入不稳定的气体，而直接进行固体、液体的常规剂型制备方法进行即可；(3)稳定性好无需在体外制备含气泡的不稳定制剂，在体外时是常规的注射剂，稳定性相对好；(4)持续时间长只有当脂质体到达特定组织并破裂释放出酸源、碱源颗粒粉末后才持续产生微气泡，能满足完成一次完整的超声检测过程；(5)安全性选择的囊膜材料本身对人体毒性小且对人体无免疫抑制作用；(6)功能性将治疗药物和酸源、碱源颗粒粉末混合制备成载药混合颗粒后再装载到囊膜材料中，可以在超声显影增强的同时释放治疗药物，起到诊断并治疗的作用，从而提高疾病诊断的效率。
具体实施例方式
在体反应式微气泡超声造影剂由含修饰后的高分子聚合物或脂质体膜材与酸源、碱源颗粒粉末混合物以及靶向抗体和磷酸缓冲液组成。高分子聚合物囊膜包括聚乳酸(PLA)、或聚丙交酯/乙交酯(PLGA)等；脂质体囊膜成分主要包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、脑磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、胆固醇乙酰酯中的一种或几种混合；酸源主要包括柠檬酸、酒石酸、富马酸、己二酸、苹果酸等的其中一种；碱源主要包括碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钙等其中一种；靶向抗体主要包括Rb40.34抗P-选择性蛋白抗体和生物索和抗生物素蛋白链霉素。该造影剂中，囊膜材料占造影剂的比例是8～20％质量/体积百分比，酸源、碱源颗粒粉末混合物占造影剂1～10％质量/体积百分比，靶向抗体的比例为1～5％质量/体积百分比，其余为磷酸缓冲液溶剂。
在体反应式微气泡超声造影剂的制备方法包括以下步骤步骤(a)(1)将囊膜材料与乙醚或氯仿等有机溶剂接触，溶解形成液体状态，温度为室温，维持时间为5～10分钟；步骤(b)(1)将酸源和碱源分别湿法制粒后压片、粉碎，过100目筛备用；或(2)在酸源和碱源分别湿法制粒过程中加入治疗药物后压片、粉碎，过100目筛备；步骤(c)在囊膜溶液中加入步骤(b)颗粒粉末，搅拌均匀后在减压旋转下除去溶剂，使囊膜材料在器壁上形成薄膜；步骤(d)1)在步骤(c)的薄膜容器中加入预热至55～65℃的磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.4±0.1)，再在55～65℃下振摇30～60min，即得不带靶向抗体的在体反应式微气泡超声造影剂溶液；或2)在步骤c的薄膜容器中加入含聚乙烯醇的磷酸缓冲液，再在室温下搅拌60～120min，即得不带靶向抗体的在体反应式微气泡超声造影剂溶液；步骤(e)取步骤(d)的溶液经磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.4±0.1)少量多次洗涤后，加入抗生物素蛋白链霉素，在0℃振荡30min。再经磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.4±0.1)洗涤后，加入生物素耦合的p-选择性蛋白抗体Rb40.34，在0℃振荡30分钟，经磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.4±0.1)少量多次洗涤后，制备得表面带p-选择性蛋白具有靶向性的在体反应式微气泡超声造影剂溶液。
步骤(f)将步骤(e)制备的超声造影剂溶液充分混匀后，测定溶液的各项指标浓度、粒径及粒径分布、稳定性、包封率、体内外超声影像等并按现有方法调整到最佳值。最后将符合要求的造影剂溶液分装入小包装瓶中。
实验材料(1)聚乳酸(PLA)、聚丙交酯/乙交酯(PLGA)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、脑磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、胆固醇乙酰酯
(2)柠檬酸、酒石酸、富马酸、己二酸、苹果酸等酸源(3)碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钙等碱源(4)Rb40.34抗P-选择性蛋白抗体(5)生物素(6)抗生物素蛋白链霉素(7)乙醚或氯仿具体实施实例1在体反应式脂质体微气泡超声造影剂的处方组成处方组成1(上限组成)卵磷脂 150g胆固醇 50g酸源、碱源颗粒粉末 100g乙醚 适量Rb40.34抗P-选择性蛋白抗体30mg生物素 10mg抗生物素蛋白 10mg磷酸缓冲液(pH＝7.4±0.1) 总1000ml处方组成2(下限组成)卵磷脂 60g胆固醇 20g酸源、碱源颗粒粉末 10g乙醚 适量Rb40.34抗P-选择性蛋白抗体6mg生物素 2mg抗生物素蛋白 2mg磷酸缓冲液(pH＝7.4±0.1) 总1000ml处方组成3(最佳点组成)卵磷脂 90g胆固醇 30g酸源、碱源颗粒粉末 50g乙醚 适量
Rb40.34抗P-选择性蛋白抗体 18mg生物素6mg抗生物素蛋白 6mg磷酸缓冲液(pH＝7.4±0.1) 总1000ml具体实施实例2在体反应式脂质体微气泡超声造影剂的制备称取卵磷脂90g、胆固醇30g于烧杯中，完全溶解后加入泡腾片颗粒粉末50g均匀搅拌后转入旋转蒸发器中，旋转除去溶剂使脂质在器壁上形成薄膜，然后加入预热至55～65℃的磷酸缓冲液，并在相同温度下振摇搅拌30～60min(溶液体积减少，补加PBS溶液)，即制备得不带靶向抗体的超声造影剂溶液。经磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.4±0.1)少量多次洗涤后，加入抗生物素蛋白链霉素，在0℃振荡30min。再经磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.4±0.1)洗涤后，加入生物素耦合的p-选择性蛋白抗体Rb40.34，在0℃振荡30分钟，经磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.4±0.1)少量多次洗涤后，制备得表面带p-选择性蛋白具有靶向性的在体反应式脂质体微气泡超声造影剂溶液。取样观察粒径分布为1～5μm，控制该造影剂的浓度及粒径分布，最后将符合要求的超声造影溶液分装入小包装瓶中。
具体实施实例3在体反应式聚合物微气泡超声造影剂的处方组成处方组成1(上限组成)聚乳酸 200g酸源、碱源颗粒粉末 100g氯仿 适量聚乙烯醇 50gRb40.34抗P-选择性蛋白抗体30mg生物素 10mg抗生物素蛋白 10mg磷酸缓冲液(pH＝7.4±0.1) 总1000ml处方组成2(下限组成)聚乳酸 100g酸源、碱源颗粒粉末 10g氯仿 适量聚乙烯醇 5g
Rb40.34抗P-选择性蛋白抗体6mg生物素 2mg抗生物素蛋白 2mg磷酸缓冲液(pH＝7.4±0.1) 总1000ml处方组成3(最佳点组成)聚乳酸 150g酸源、碱源颗粒粉末 50g氯仿 适量聚乙烯醇 10gRb40.34抗P-选择性蛋白抗体18mg生物素 6mg抗生物素蛋白 6mg磷酸缓冲液(pH＝7.4±0.1) 总1000ml具体实施实例4在体反应式聚合物微气泡超声造影剂的制备称取聚乳酸150g于烧杯中，加入适量氯仿完全溶解后加入泡腾片颗粒粉末50g，均匀搅拌后转入旋转蒸发器中，旋转除去溶剂使在器壁上形成聚合物薄膜，然后加入含10g聚乙烯醇的磷酸缓冲液，并在室温下搅拌60～120min，即制备得不带靶向抗体的超声造影剂溶液。经磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.4±0.1)少量多次洗涤后，加入抗生物素蛋白链霉素，在0℃振荡30min。再经磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.4±0.1)洗涤后，加入生物素耦合的p-选择性蛋白抗体Rb40.34，在0℃振荡30分钟，经磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.4±0.1)少量多次洗涤后，制备得表面带p-选择性蛋白具有靶向性的在体反应式脂质体微气泡超声造影剂溶液。取样观察粒径分布为1～5μm，控制该造影剂的浓度及粒径分布，最后将符合要求的超声造影溶液分装入小包装瓶中。
权利要求
1.一种在体反应式微气泡超声造影剂，其特征在于该造影剂由含修饰后的高分子聚合物或脂质体囊膜材料与酸源和碱源颗粒粉末混合物以及靶向抗体和磷酸缓冲液组成；该造影剂中，囊膜材料占造影剂的比例是8～20％质量/体积百分比，酸源、碱源颗粒粉末混合物占造影剂1～10％质量/体积百分比，靶向抗体的比例为1～5％质量/体积百分比，其余为磷酸缓冲液溶剂。
2.根据权利要求1所述的在体反应式微气泡超声造影剂，其特征在于所述的高分子聚合物囊膜包括聚乳酸“PLA”、或聚丙交酯/乙交酯“PLGA”与聚乙烯醇“PVA”。
3.根据权利要求1所述的在体反应式微气泡超声造影剂，其特征在于所述的脂质体囊膜成分主要包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、脑磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、胆固醇乙酰酯中的一种或几种混合。
4.根据权利要求1所述的在体反应式微气泡超声造影剂，其特征在于所述的酸源主要包括柠檬酸、酒石酸、富马酸、己二酸、苹果酸中的一种或几种混合。
5.根据权利要求1所述的在体反应式微气泡超声造影剂，其特征在于所述的碱源主要包括碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钙中的一种或几种混合。
6.根据权利要求1所述的在体反应式微气泡超声造影剂，其特征在于所述的靶向抗体主要包括Rb40.34抗P-选择性蛋白抗体和生物素和抗生物素蛋白链霉素。
7.一种如权利要求1所述的在体反应式微气泡超声造影剂的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤步骤a将囊膜材料与乙醚或氯仿等有机溶剂接触，溶解形成液体状态，温度为室温，维持时间为5～10分钟；步骤b将酸源和碱源分别湿法制粒后压片、粉碎，过100目筛备用；或在酸源和碱源分别湿法制粒过程中加入治疗药物后压片、粉碎，过100目筛备用；步骤c在囊膜溶液中加入步骤b粉末颗粒，搅拌均匀后在减压旋转下除去溶剂，使囊膜材料在器壁上形成薄膜；步骤d1)在步骤c的薄膜容器中加入预热至55～65℃的磷酸缓冲液，再在55～65℃下振摇30～60min，即得在体反应式脂质体微气泡超声造影剂溶液；其中磷酸缓冲液“PBS”，pH＝7.4±0.1；或2)在步骤c的薄膜容器中加入含聚乙烯醇的磷酸缓冲液，再在室温下搅拌60～120min，即得在体反应式聚合物微气泡超声造影剂溶液；其中磷酸缓冲液“PBS”，pH＝7.4±0.1；步骤e取步骤d的溶液经磷酸缓冲液少量多次洗涤后，加入抗生物素蛋白链霉素，在0℃振荡30分钟，再经磷酸缓冲液洗涤后，加入生物素耦合的p-选择性蛋白抗体Rb40.34，在0℃振荡30分钟，经磷酸缓冲液少量多次洗涤后，制备得表面带p-选择性蛋白的具有靶向性的在体方应式微气泡超声造影剂溶液。
全文摘要
在体反应式微气泡超声造影剂及其制备方法涉及超声造影剂，具体涉及由高分子聚合物或磷脂类囊膜材料与包裹酸源和碱源颗粒粉末混合物以及表面靶向抗体组成的能在体内液体环境中自发反应产生微气泡的超声造影剂及其制备方法。在体反应式微气泡超声造影剂由含修饰后的高分子聚合物或脂质体囊膜材料与酸源和碱源颗粒粉末混合物以及靶向抗体和磷酸缓冲液组成；该造影剂中，囊膜材料占造影剂的比例是8～20％质量/体积百分比，酸源、碱源颗粒粉末混合物占造影剂1～10％质量/体积百分比，靶向抗体的比例为1～5％质量/体积百分比，其余为磷酸缓冲液溶剂。
文档编号A61K49/22GK101015701SQ20071002054
公开日2007年8月15日 申请日期2007年3月12日 优先权日2007年3月12日
发明者顾宁, 杨芳, 吉民 申请人:东南大学