专利名称：新型脂质体超声造影剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及超声造影剂，具体涉及由一种脂质体混合物成份以及包裹生物活性气体的含该脂质混合物的脂质体超声造影剂及其制备方法。
新一代超声造影剂多以含氟气体为微泡的核心，因含氟气体为惰性气体，分子量大，在血液中的溶解度和弥散性差，稳定性好。按包裹活性生物气体的材料不同而有白蛋白类、表面活性剂类、磷脂类、高分子聚合物类。就其在超声造影的增强显像上比较，脂类造影剂有更多的优势，原因在于脂类造影剂具有(1)靶向性。脂质体进入人体后，易优先被富含网状内皮细胞的组织如肝、脾及骨髓所摄取。(2)稳定性好。一方面脂类造影剂化学性质稳定，常温下可保存数月不变化，易于商品化；另一方面在血液循环中更能耐压，造影持续时间长；(3)安全。构成脂质体的磷脂膜可生物降解，对人体无害；而白蛋白类造影剂由于以人血白蛋白为载体，尚存有传播血液性疾病的危险。
中国发明专利公开说明书CN1306442A(申请号为99107622.8)公开了一种脂质为包裹材料的造影剂，该造影剂是以磷脂为包裹材料，微粒内包裹有生物活性的气体，其组合制剂为两种组合物，其中之一为含分散气体和用于稳定所述所气体的物质的可注射含水介质，另一为可注射的水包油乳液。且其在应用中组织增强显像有效时间只有5-20分钟，不能完全满足临床检查的需要；同时目前国内外相关文献报道的各类超声造影剂有效增强时间也普遍较短，造影微泡的产出率偏低，如美国发明专利(专利号6033646)公开说明书报道其微泡浓度为1×108～1.6×109/ml。且目前造影剂成本高，市售价格昂贵，如脂质体造影剂SonoVue每支售价为110美金。
本发明已经实现上述目的，表现在1.微泡产出率高，微泡浓度达7×109/ml，高于目前文献报道，而且微泡均一性好，直径2～6μm的微球占75～80％(见
图1)；2.造影剂在组织显影的有效增强时间长，大于30分钟；3.成本低，产品造价远低于国外同类产品。
为实现上述目的之一，本发明采用了以下的技术方案本发明的脂质体造影剂为由含脂质的成膜材料包裹生物活性气体构成，其中成膜材料包括脂质体、起泡剂、聚合物成份、高渗糖类或醇类；在所述的成份中，造影剂中脂质体占有的比例为0.1～5重量％，起泡剂的比例为0.01～5重量％，高渗糖或醇类比例为1-30重量％，高分子聚合物构成比为5-30重量％，生物活性气体为0.15～0.5ml，其余为溶剂。
上面所说的脂质体的构成为磷脂类分子，具体地说包括1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-钠盐(DPPG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸-钠盐(DPPA)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)。
前面所说的起泡剂为非离子的表面活性剂，具体地讲包括吐温80及司盘80；使用起泡剂的目的是为了增加在制备造影剂微泡时微泡的产出率，同时对脂膜起到稳定的作用。
所说的聚合物为高分子聚合物，具体应用时为聚乙二醇4000(PEG4000)，高分子聚合物的使用是为脂质成份及起泡剂在构成造影剂膜时提供一个支持结构。
使用的高渗糖为葡萄糖、果糖及其异构体、多聚糖；醇类为丙二醇、丙三醇，而应用高渗糖或醇类的目的是为了增加微泡在溶液中的粘滞度，减少造影微泡的相互融合倾向，同时糖上的氢键也直接与脂质的氢键相互作用，两者共同增强了造影微泡的稳定性。
生物活性气体在造影剂中的作用是与成膜材料共同为超声波提供一个声阻抗差较大的反射界面，所述的生物活性气体主要为氟化物气体，具体地讲包括有全氟化碳气体、氟化硫气体，在应用中主要为全氟丙烷、六氟化硫。
为实现上述目的之二，本发明采用了以下的制备工艺即所述脂质体造影剂的制备流程是将造影剂成膜材料经与水介质或非水介质接触分别形成水悬浮物或溶液-冷冻干燥-冷冻干燥所得的脂质固态物与水合液接触-声振或振荡处理同时将生物活性气体的导入-半成品的检测控制及分装-制成成品。在声振或振荡处理前进行消毒灭菌，以后的操作均在严格控制的无菌间里进行。步骤(a)
(1)将所述所需要的成膜材料(例如DPPG、DSPC及PEG4000)与水介质接触，使其成为一个悬浮状态体系。为使该系统内成膜材料更好地散布于水介质中，使用温度为45～55℃，时间为20～40分钟。
或(2)将所述所需的成膜材料(例如DPPG、DSPC及PEG4000)与非水介质接触，使其成为一个均匀的溶液体系。为使溶解得更为均匀，使用的温度为45～55℃，时间为20～40分钟。
在上述的步骤中所述的水介质为去离子水、蒸馏水或生理盐水。更优选的实施方案中所述的水介质为去离子水。上面所述的非水介质为叔丁醇、正叔丁醇。更优选的实施方案中所述的非水介质为叔丁醇。在上述做成膜材料散布于水介质及溶解于非水介质时所要求的温度为45～55℃，时间为20～40分钟。步骤(b)将消毒灭菌后的脂质悬浮物或脂质溶解物用负压冷冻干燥仪进行去溶液处理，冷冻干燥操作1～5次，即可进行反复冻融处理，进行冷冻干燥的时间为24～36小时，冷冻干燥中所述负压吸引压力为50～65×10-3mBar，冷冻干燥温度控制为-50～-70℃。步骤(c)在严格控制的无菌室内将冷冻干燥好的脂质固态物用水合液溶解。
所述的水合液为由高渗糖类和起泡剂配成，其中每毫升水合液中存在高渗糖0.9-0.99ml，存在0.01～0.2ml的起泡剂；或由丙二醇、甘油、生理盐水三者的体积以8∶1∶1的比例配制的混合液与起泡剂构成，由其构成的每毫升的水合液中，存在0.01～0.1ml的起泡剂，存在0.9-0.99ml的混合液。此步骤中为使脂质固态物能充分溶解可适当进行振荡。在此时高渗糖或醇类引入到造影剂的成膜材料中。步骤(d)(1)取步骤(c)溶解的脂质溶液，在严格控制的无菌室将所得的脂质溶液按0.5-1ml/s的速度导入超声波声振仪中进行声振处理，同时从底部导入全氟丙烷气体，速度为0.25-0.5ml/s；声振仪探头置于液面下0.5～2cm处，脂质溶液受超声振动产生空化作用，包裹具有生物活性的气体形成大量粒径不一的微球，将声振处理溶液按0.25-0.5ml/s的速度导出引入分液罐中，将分液罐中溶液充分混匀，所述的超声波声振仪是指频率为25KHz，功率为0～650W可调超声波振荡仪，在声振处理中使用的功率为160W～280W。声振时间为30s～90s。声振仪变幅杆选择为φ6、φ10或φ15，在更优的实施方案中变幅杆选择为φ6，声振时间为60s。测定溶液中微球的各项指标如微球浓度、平均粒径、粒径分布等并按现有的方法调整到要求值，然后将符合要求的溶液再次充分混匀，之后分装入小包装瓶中；
或(2)取步骤(c)溶解的脂质溶液，按生物活性气体与脂质溶液比为0.5～1.5∶1分装于经高温高压灭菌消毒的小安碚瓶或小管中，用机械振荡仪处理，然后测定溶液中微球的各项指标如微球浓度、平均粒径、粒径分布等并按现有的方法调整到要求值。所述的机械振荡仪为转速为4500±100转/秒的机械振荡仪，在振荡处理中温度控制在18～30℃，振荡时间为30～60s，更优化的实施方案中振荡时间为45s。步骤(e)将上述小瓶包装的微球移入冰冻干燥机内进行真空低温负压干燥，制成粉针剂，向瓶内注入与脂质内包裹的相同的生物活性气体，封盖即成。
附图2为造影剂对犬大脑进行经股静脉声学造影脑实质增强显像图像。图中显示的是以0.01ml/Kg的剂量分别在推注前、造影剂推注后10秒、30秒、1分钟脑实质显影情况。
附图3为造影剂对兔肝脏进行经耳缘静脉声学造影肝实质增强显像图像；图中显示的是以0.01ml/Kg的剂量分别在推注前(A)、造影剂推注后30秒(B)、3分钟(C)、10分钟(D)、20分钟(E)、40分钟(F)、50分钟(G)、60分钟(H)肝实质显影情况，在60分钟时肝实质显像灰阶强度高于未造影前。
附图4为造影剂对兔肾脏进行经耳缘静脉声学造影肾脏实质及髓质增强显像图像，图中显示的是以0.01ml/kg的剂量分别在推注前(A)、推注后10秒(B)、20秒(C)、40秒(D)肾脏显影情况。
具体实施实例实施实例1脂质体造影剂的制备称取DPPG 2g、DSPC 4g、聚乙二醇4000 300g，在50℃条件下共同散布于1.2L的去离子水中，将其悬浮物冷冻干燥过夜、解冻后再冷冻干燥过夜，制备得到成膜材料的固态混合物，将制备得到的固态混合物高温高压灭菌处理，在严格控制的无菌间里将上述灭菌处理过的固态混合物溶于经微孔滤膜处理的含有50％葡萄糖90％及吐温8010％的水合液中，配比浓度为600mg/ml，机械混匀后，将所得的脂质溶液按0.5ml/s的速度导入超声波声振仪中进行声振处理，同时从底部导入全氟丙烷气体，速度为0.25ml/s，声振功率为280W，将声振处理的液体按0.25ml/s导出分装，即制备得到液态状的造影剂，取样观察初检浓度为7.1×109/ml，粒径分布在2～10μm，调节好造影剂的微泡浓度及粒径分布，将调节好浓度及粒径的造影剂用小瓶分装，每瓶分装液态造影剂量为2ml，用低温负压干燥法制备得到造影剂的粉针剂。
实施实例2糖类对微球产出率和粒径的影响表1列出不同水合液中使用水相溶剂、50％果糖、50％葡萄糖三种情况下微球产率、粒径及粒径分布的结果
从表1中可以看出，糖类作为水合液较水相溶剂好，而果糖比葡萄糖好，可明显提高2～6μm范围内有效微球的百分比。
实施实例3吐温80对微球产率和粒径的影响表2列出了制备过程中加入不同浓度的吐温80对微球产率和粒径影响的结果
从表2中可以看出，吐温80的浓度以在0.02ml/ml脂质溶液时微泡产率最高，粒径也较好，吐温80浓度轻微的改变对微泡的产出率影响较大。
应用验证对兔、犬体内成像使用第二种水合液制备的造影剂对犬大脑进行声学造影，以0.01ml/kg的剂量进行经股静脉声学造影，脑实质在约10秒时即出现明显增强显像、30秒达到高峰(见图2)，彩色多普勒血流增强时间达50分钟；对兔肝脏、肾脏经耳缘静脉以0.01ml/kg的剂量进行声学造影，肝脏、肾脏有效增强时间超过50分钟，肝实质在60分钟时显像灰阶度仍高于未造影前(见图3、4)。
权利要求
1.一种脂质体超声造影剂，由含脂质的成膜材料包裹生物活性气体构成，其特征在于成膜材料包括脂质体、起泡剂、聚合物成份、高渗糖类或醇类；所述造影剂中，脂质体占有的比例为0.1～5重量％，起泡剂的比例为0.01～5重量％，高渗糖或醇类的比例为1-30重量％，高分子聚合物构成比为5-30重量％，生物活性气体为0.15～0.5ml，其余为溶剂。
2.一种脂质体超声造影剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤步骤(a)(1)将所述所需要的成膜材料与水介质接触，使其成为一个悬浮状态体系，使用温度为45～55℃，时间为20～40分钟；或(2)将所述所需的成膜材料(例如DPPG、DSPC及PEG4000)与非水介质接触，使其成为一个均匀的溶液体系，使用的温度为45～55℃，时间为20～40分钟；步骤(b)将消毒灭菌后的脂质悬浮物或脂质溶解物用负压冷冻干燥仪进行去溶液处理，冷冻干燥操作1～5次，进行冷冻干燥的时间为24～36小时，冷冻干燥中所述负压吸引压力为50～65×10-3mBar，冷冻干燥温度控制为-50～-70℃步骤(c)在严格控制的无菌室内将冷冻干燥好的脂质固态物用水合液溶解；步骤(d)(1)取步骤(c)溶解的脂质溶液，在严格控制的无菌室将所得的脂质溶液按0.5-1ml/s的速度导入超声波声振仪中进行声振处理，同时从底部导入生物活性气体，速度为0.25-0.5ml/s；声振仪探头置于液面下0.5～2cm处声振处理，将声振处理溶液按0.25-0.5ml/s的速度导出引入分液罐中，将分液罐中溶液充分混匀，测定溶液中微球的各项指标如微球浓度、平均粒径、粒径分布等并按现有的方法调整到要求值，然后将符合要求的溶液再次充分混匀，之后分装入小包装瓶中；或(2)取步骤(c)溶解的脂质溶液，按生物活性气体与脂质溶液比为0.5～1.5∶1分装于经高温高压灭菌消毒的小安碚瓶或小管中，用机械振荡仪处理，然后测定溶液中微球的各项指标如微球浓度、平均粒径、粒径分布等并按现有的方法调整到要求值；在振荡处理中温度控制在18～30℃，振荡时间为30～60s；步骤(e)将上述小瓶包装的微球移入冰冻干燥机内进行真空低温负压干燥，制成粉针剂，向瓶内注入与脂质内包裹的相同的生物活性气体，封盖即成。
3.根据权利要求1所述的脂质体超声造影剂，其特征在于脂质体的构成为磷脂类分子。
4.根据权利要求3所述的脂质体超声造影剂，其特征在于磷脂类分子包括1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-钠盐(DPPG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸-钠盐(DPPA)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)。
5.根据权利要求1所述的脂质体超声造影剂，其特征在于起泡剂为非离子的表面活性剂。
6.根据权利要求5所述的脂质体超声造影剂，其特征在于表面活性剂包括吐温80及司盘80。
7.根据权利要求1所述的脂质体超声造影剂，其特征在于所说的聚合物为高分子聚合物。
8.根据权利要求1所述的脂质体超声造影剂，其特征在于使用的高渗糖为葡萄糖、果糖及其异构体、多聚糖。
9.根据权利要求2所述的脂质体超声造影剂，其特征在于水合液为由高渗糖类和起泡剂配成，其中每毫升水合液中存在高渗糖0.9-0.99ml，存在0.01～0.2ml的起泡剂。
10.根据权利要求2所述的脂质体超声造影剂，其特征在于水介质为去离子水、蒸馏水或生理盐水。
全文摘要
一种脂质体超声造影剂，包括成膜材料包括脂质体、起泡剂、聚合物成份、高渗糖类；每毫升供使用的造影剂中，脂质体0.1～5重量％，起泡剂的比例为0.01～1重量％，高渗糖比例为，高分子聚合物构成比为70－90重量％，生物活性气体为0.15～0.5ml。所述脂质体造影剂的制备流程是将造影剂成膜材料经与水介质或非水介质接触分别形成水悬浮物或溶液－冷冻干燥－冷冻干燥所得的脂质固态物与水合液接触－声振或振荡处理同时将生物活性气体的导入－半成品的检测控制及分装－制成成品。所述的造影剂在小剂量使用时即可长时间增强组织显像，有效增强时间大于30分钟。本发明微球产出率高，微球均一性好，有效微球浓度高。
文档编号A61K49/18GK1404878SQ02133720
公开日2003年3月26日 申请日期2002年9月6日 优先权日2002年9月6日
发明者高云华, 谭开彬, 刘平, 刘政, 汪成远, 左松, 周世文, 夏红梅 申请人:中国人民解放军第三军医大学