专利名称：蝉花免疫抑制活性有效部位isp提取物的提取分离方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体的说是涉及中草药有效部位的制备方法，更具体的说是涉及中药蝉花免疫抑制活性有效部位总长脂链氨基酸类化合物(ISP)的 提取分离方法。
背景技术：
(一)蝉花的研究概况蝉花(Cora^e/wc/cacfae)属虫生性药用真菌，是我国传统名贵中药材，具有广泛的生物活性。传统中医药学家认为其具有疏散风热、透疹、熄风止痉、明目退翳之功效。现代医学研究表明其具有免疫调节、改善机体营养状况、改善肾功能、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮等作用。因其与冬虫夏草一样同属虫菌复合体，且含有相近的化学成分，所以医家常作冬虫夏草的代用品。蝉花中活性成分ISP-1是由Fujita等(Fujita T， et al. Fungal metabolites. Part II.A potent immunosuppressive activity found in Zsw/a w'wc/a!W metabolite. J.Antibiotics, 1994, 47(2): 208-215)通过免疫抑制活性筛选细胞模型从蝉花菌的培 养滤液中分离得到。ISP-1分子内有ct-氨基酸部分和不饱和脂肪链部分，与鞘氨 醇结构相似，结构式如下所示。多种药理实验研究表明，ISP-1具有显著的双向免疫调节作用，其免疫抑制活性表现在(1) ISP-l能阻断白介素-2受体以下的途径，抑制丝氨酸棕榈酰转 移酶，从而特异性抑制T细胞的增殖，其作用机制与环孢菌素A不同；(2) ISP-1 对异体小鼠混合淋巴细胞反应和同种反应性T细胞再生有强的抑制活性，在这些 方面比CsA强10倍至100倍(Miyake Y， et al. Serine palmitoyltransferase is the primary target of a sphingosine-like immunosuppressant, ISP-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 1995， 211(2): 396-403)。从无孢菌6V/ece"asfen'〃〖a)、多球菌(岭nVja ccw附fl/6o附j/ces)及木霉多 孢菌(rn'c/io(fewia;w/"; on/m)等微生物的培养物中亦分离得到ISP-1及类似物， 药理实验表明这些化合物均具有显著的免疫抑制作用(Sasaki S， et al. Fungal metabolites. Part II. Novel potent immunosuppressants, mycestericins， produced by J^K^'fl他hZia. J. Antibiotics, 1994， 47(4): 420-433)。因此，我们推测蝉花中ISP 类似物与ISP-1具有相似的物理特性和生物活性。经文献检索，蝉花中以ISP-1为主要成分的总长脂链氨基酸类化合物(ISP) 作为蝉花免疫抑制活性有效部位提取物，其含量定量测定方法和提取分离方法均 未见报道。发明内容本发明的目的是提供一种分离终产物中ISP含量为50-95%的蝉花免疫抑制 活性物的提取分离方法。本发明中的蝉花发酵滤液来自蝉花菌的液体培养，蝉花菌丝体来自蝉花菌液 体培养或固体培养。 (一)技术构思免疫抑制剂是一类具有免疫抑制活性的药物，临床主要用于抑制各种对机体 不利的免疫反应，如用于器官移植和自身免疫性疾病如风湿性关节炎、肾炎、牛 皮癣、哮喘、全身性红斑狼疮、再生障碍性贫血等的治疗。免疫抑制剂的发展使 器官移植达到了相当成功的水平，但由于目前免疫抑制剂药物价格昂贵及毒副作 用限制了在临床上的广泛应用。某些真菌寄生在昆虫体内而不会被昆虫免疫机能所杀死，表明其成分中具有 抑制昆虫免疫的物质，因此有可能成为免疫抑制剂的重要来源。蝉花是由虫草属真菌蝉拟青霉寄生于蝉类若虫的复合体。现代医学研究表明蝉花中ISP-1具有显 著的免疫抑制作用，其免疫抑制力比环孢菌素A强，且副作用小。因此，蝉花 中以ISP-1为主的长脂链氨基酸类组分有望开发为新型的免疫抑制剂。 (二)蝉花免疫抑制活性有效部位ISP的测定方法 基于ISP组分为长脂链a-氨基酸，与茚三酮共热时生成蓝紫色的酮茚胺，在 一定范围内吸光度和氨基酸含量成正比，因而采用茚三酮比色法定量测定蝉花 ISP类物质的含量。在建立测定方法时，为了排除其他类氨基酸对测定的干扰，进行了薄层层析检测，结果如图l所示，下面结合附图作进一步说明图1是丝氨酸、样品和发酵液的薄层层析色谱图，图中1是丝氨酸(先茚三酮显色后展开)，2是样品(先茚三酮显色后展Jf) ， 3是样品，4是发酵 液。从图1可见，丝氨酸对照品和样品经茚三酮显色后，均生成红紫色物质，薄 层展开后具有相同的Rf值。发酵液中含有大量极性较大的物质，在薄层上显示 为靠近原点处的紫红色带。而经过分离的样品仅接近前沿有红色斑点，排除了样 品中有其他极性氨基酸物质的干扰。而通过HPLC-MS鉴定了提取物中主要成分 之一为ISP-1,表明样品中显色的为ISP类弱极性物质，为茚三酮比色法测定ISP 提供了依据，从而确保该法测定ISP的准确性。具体操作步骤如下.-吸取一定量丝氨酸对照溶液或样品溶液于具塞刻度试管中，不足l.Oml则用 去离子水补足，依次加入l.Oml乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH5.4) , l.Oml 1%茚三 酮乙二醇甲醚溶液，0.1ml0.m抗坏血酸溶液，摇匀，盖上塞，于90。C水浴加热 30分钟，取出冷水冷却15分钟，加入3ml60o/。乙醇稀释，摇匀，以试剂空白为 参比，在567nm处测量其吸光度A567鹏。样品测定时，将测得的八567肌对应标准 曲线可计算得ISP含量。(三)蝉花免疫抑制活性有效部位ISP的制备方法本发明所说的蝉花免疫抑制活性有效部位ISP的制备方法包括以下步骤 (1)蝉花上柱液的制备① 对于蝉花菌发酵滤液，可以原样使用亦可以浓縮后使用。浓縮率没有特别 的限定，例如可以是容积比为20-80%。另外，该浓縮可以在常压下或减压下的 任一条件下进行，但优选在减压下进行。② 对于蝉花菌丝体或野生蝉花药材，取若干，直接加入提取溶剂，亦可烘干 粉碎，再加入提取溶剂，混合，提取，过滤。提取滤液可以原样使用，但为了降低使用的乙醇的量并高效地得到分离物， 可以浓縮该提取液后使用。浓縮率没有特别的限定，例如可以是容积比为 20-80%，优选25%-60%。另外，该浓缩可以在常压下或减压下的任一条件下进 行，但优选在减压下进行。为了通过大孔吸附树脂柱高效的得到分离物，可在上柱前向提取液中加入水 进行稀释，亦可直接将滤液作为上柱液。加入水的量没有特别的限定，例如可以 是提取液容积比0.5-2.0倍的量，优选0.5-1.2倍。提取溶剂是包括水、甲醇、乙醇等中的一种或多种，优选乙醇水溶液。所采用的溶剂提取法中，提取方法优选超声提取法、渗漉提取法、煎煮提取 法或加热回流提取法等中的一种或多种；提取次数可以为一次或多次。(2) 采用分离柱进行分离 制备好的上柱液上分离柱。所使用的分离柱是包括离子交换树脂柱、硅胶柱或大孔吸附树脂柱中的一种 或多种。优选大孔吸附树脂柱。可以采用多种型号的大孔吸附树脂，包括D101、 D520、 H103、 AB-8、 NKA 或XAD-2等非极性及弱极性树脂中的一种或多种，也可为其它在性能上可以取 代上述树脂的填料，优选NKA等非极性大孔吸附树脂。上柱前，应按照说明书对树脂进行预处理；树脂使用后，经过再生处理后可 反复使用。(3) 用洗脱剂对分离柱进行洗脱首先用水对大孔吸附树脂进行洗脱至水洗脱液无色，将大孔吸附树脂上的糖 类、粘液汁等水溶性物质洗脱掉，水洗脱液弃之。继而用低浓度的乙醇水溶液洗柱，例如可以是20%-50%浓度的乙醇水溶液， 直至洗脱液无茚三酮反应为止，洗脱液弃之。再用较高浓度的乙醇水溶液对大孔吸附树脂进行洗脱，例如可以是60%-95% 浓度的乙醇水溶液，收集具茚三酮反应的洗脱液，直至洗脱液无茚三酮反应为止， 即得富含ISP的乙醇水洗脱液。(4) 对洗脱液进行浓縮浓縮率没有特别的限定，优选浓縮至无乙醇残留。另外，该浓縮可以在常压 下或减压下的任一条件下进行，但优选在减压下进行。(5) 采用溶剂萃取法进行萃取将浓縮后的乙醇水溶液洗脱液，加水稀释，稀释率没有特别的限定，优选1: l稀释。再采用正丁醇萃取，萃取次数可以是一次或多次。分取正丁醇层，减压 浓縮、千燥，即得蝉花免疫抑制活性有效部位ISP提取物。
图1是丝氨酸、样品和发酵液的薄层层析色谱图 鼎雄力《下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是限制本发 明的范围。实施例l:蝉花菌经液体发酵结束后，发酵液经抽滤后得菌丝体，于6(TC烘箱烘干至 恒重。取烘干菌丝体10g研磨粉碎后，加入100ml95y。乙醇溶液加热回流提取， 每次2小时，回流提取3次，将每次所得滤液合并，浓縮一定体积，加入水l: l进行稀释，混合均匀作为上柱液。将NKA大孔吸附树脂在95%乙醇溶液中浸泡4小时以上，装柱，然后用95% 的乙醇溶液清洗，直至流出液不浑浊，再用水洗柱至无醇味、流出液加水稀释不 浑浊。将制备的上柱液上柱。首先用水对大孔吸附树脂柱进行洗脱，直至流出液无色。然后，采用50% 的乙醇水溶液洗脱，直至流出液无色。再采用95%的乙醇溶液进行洗脱，直至洗脱液通过TLC检测无茚三酮反应为止，即得富含ISP的乙醇水洗脱液。洗脱液 减压浓缩至无醇味，加水稀释至lOOml，采用正丁醇萃取，分取正丁醇层，减压 浓缩、干燥，即得富含蝉花免疫活性有效部位ISP的提取物。使用茚三酮比色法 测得其中免疫抑制活性有效部位ISP含量为59%。 实施例2:蝉花菌经液体发酵结束后，将发酵液经抽滤后得发酵滤液，不浓缩直接作为 上柱液。将XAD-2大孔吸附树脂在95n/。乙醇溶液中浸泡4小时以上，装柱，然后用 95%的乙醇溶液清洗，直至流出液不浑浊，再用水洗柱至无醇味、流出液加水稀 释不浑浊。将制备好的上柱液2L上柱。首先用水对大孔吸附树脂柱进行洗脱，直至流出液无色。然后，采用50% 的乙醇水溶液洗脱，直至流出液无色。再采用95%的乙醇溶液进行洗脱，直至洗 脱液通过TLC检测无茚三酮反应为止。洗脱液减压浓縮至不含乙醇，加水稀释 至200ml,采用正丁醇萃取，分取正丁醇层，减压浓縮、干燥，即得富含蝉花免 疫活性有效部位ISP的提取物。使用茚三酮比色法测得其中免疫抑制活性有效部 位ISP含量为72%实施例3:取从药材市场购买的野生蝉花药材100g研磨粉碎后，加入1000 1190%乙醇 溶液加热回流提取，每次2小时，回流提取3次，将每次所得滤液合并，浓縮一 定体积，加入水"l进行稀释，混合均匀作为上柱液。将NKA大孔吸附树脂在95%乙醇溶液中浸泡4小时以上,装柱,然后用95% 的乙醇溶液清洗，直至流出液不浑浊，再用水洗柱至无醇味、流出液加水稀释不 浑浊。将制备的上柱液上柱。首先用水对大孔吸附树脂柱进行洗脱，直至流出液无色。然后，采用50% 的乙醇水溶液洗脱，直至流出液无色。再采用90。/。的乙醇溶液进行洗脱，直至洗 脱液无茚三酮反应为止，即得富含ISP的乙醇水洗脱液。洗脱液减压浓縮至无醇 味，加水稀释至500mL，采用正丁醇萃取，分取正丁醇层，减压浓缩、干燥，即得富含蝉花免疫活性有效部位ISP的提取物。使用茚三酮比色法测得其中免疫 抑制活性有效部位ISP含量为55%。
权利要求
1. 一种中药蝉花免疫抑制活性有效部位ISP提取物，其特征在于，该提取物为蝉花总长脂链氨基酸类化合物，它包括ISP-1及其类似化合物，其中主要成分为ISP-1。ISP-1的化学结构式如下id="icf0001" file="A2007100786680002C1.gif" wi="98" he="44" top= "59" left = "51" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>
2. 根据权利要求1所述的蝉花免疫抑制活性有效部位提取物，其特征在于， 该提取物中含有50-95% (重量百分比)的ISP。
3. 根据权利要求2所述的蝉花免疫抑制活性有效部位ISP提取物的提取分 离方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1) 蝉花上柱液的制备蝉花菌发酵滤液可直接或经一定浓縮后作为上柱 液；蝉花菌丝体或野生蝉花药材经溶剂提取后，提取液经过滤可直接或加一定水 稀释后作为上柱液。(2) 分离柱分离蝉花上柱液上分离柱，用洗脱剂对分离柱进行洗脱，收 集含ISP的洗脱液，浓縮。(3) 萃取采用溶剂萃取法对上述浓縮液进行萃取，含ISP萃取相浓縮、 干燥，即得蝉花免疫抑制活性有效部位ISP提取物。
4. 根据权利要求3所述的提取分离方法，其特征在于，在蝉花上柱液的制备步骤中，所述蝉花菌丝体或野生蝉花药材的提取可采用超声提取法、渗漉提取法、煎煮提取法或加热回流提取法中的一种；提取次数是一次或多次。
5. 根据权利要求3所述的提取分离方法，其特征在于，在蝉花上柱液的制备步骤中，所述的蝉花菌丝体或野生蝉花药材提取溶剂包括水、甲醇、乙醇的一 种或多种，优选乙醇水溶液。
6. 根据权利要求3所述的提取分离方法，其特征在于，在分离柱进行分离 步骤中，所使用的分离柱是硅胶柱、离子交换树脂柱或大孔吸附树脂柱中的一种 或多种，优选大孔吸附树脂柱，进一步优选非极性大孔吸附树脂柱。
7. 根据权利要求3所述的提取分离方法，其特征在于，在用洗脱剂对分离 柱进行洗脱步骤中，收集60-95%乙醇洗脱部位。
8. 根据权利要求7所述的提取分离方法，其特征在于，在用洗脱剂进行洗 脱时，先用水对大孔吸附树脂柱进行洗脱至洗脱液无色，随后用20-50%的乙醇 水溶液洗脱，再用60-95%的乙醇水溶液洗脱。
9. 根据权利要求3所述的提取分离方法，其特征在于，在溶剂萃取步骤中， 先将过柱后的60-90%乙醇洗脱液减压浓縮至无醇味，加水稀释，再采用正丁醇 萃取，分取正丁醇层减压浓縮、干燥，即得蝉花免疫抑制活性有效部位ISP提取 物。
全文摘要
本发明公开了蝉花免疫抑制活性有效部位ISP提取物的提取分离方法。该提取物包括蝉花中总长脂链氨基酸类化合物，其中主要成分为ISP-1。本发明方法制得的提取物含ISP以重量计为50-95％。该提取物的提取分离方法通过以下步骤实现(1)蝉花上柱液制备；(2)分离柱分离；(3)溶剂萃取；(4)含ISP萃取相浓缩干燥，即得蝉花免疫抑制活性有效部位ISP提取物。
文档编号A61P37/06GK101230012SQ200710078668
公开日2008年7月30日 申请日期2007年6月29日 优先权日2007年6月29日
发明者余佳文, 朱华李, 杨明静, 毛先兵, 钟国跃, 马开森 申请人:重庆市中药研究院