专利名称：一种关节软骨生物支架材料及制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料制备技术领域，涉及一种新型共混的关节软骨生物支架材料的制备方法及由该方法制备得到的产品。
背景技术：
软骨缺乏再生能力，外伤或疾病引起的软骨缺损需利用软骨或其它材料修复。自体软骨来源有限，且容易造成供区缺损，应用受到限制。异体软骨曾广泛应用，由于可引起免疫排斥反应，导致细胞死亡及功能丧失。骨膜移植曾风行一时，但其存在远期效果不稳定的缺陷，使得人们不断探索更完善的修复方法。体外软骨细胞培养成功，引发人们尝试直接用软骨细胞修复软骨缺损。1968年，Chertman等将软骨细胞悬液注射到关节软骨缺损部位，结果表明缺损为滑膜成纤维组织修复，镜下仅见少量新生软骨细胞结节。1977年，Green等人以脱钙骨作为支架，并接种上软骨细胞，移植到缺损部位。虽未成功，可喜的是他第一次提出如能找到一种合适的支架材料，将软骨细胞接种于其上，即有可能形成良好的软骨组织修复。当前，在组织工程中开发为细胞培养支架的生物材料主要分为两类，即人工合成的材料和天然生物材料。天然生物材料具有细胞信号识别，促进细胞的粘附、增殖和分化、良好的生物相容性及良好的生物降解性等优点，显示出人工合成材料无可比拟的优势。
细胞外基质是由细胞自身分泌组成的并围绕在细胞周围主要含有胶原蛋白、纤维蛋白粘连素、层粘连蛋白，层连素等。细胞外基质不仅为细胞提供了一个支持结构和附着位点，而且对细胞的粘附、迁移、增殖、分化以及基因表达的调控有重要作用和显著影响。天然脱细胞生物材料主要利用同种或异种器官/组织，经脱细胞、去除抗原处理得到脱细胞基质材料。脱细胞基质材料具有多种天然细胞外成分和大量的活性细胞因子，有利于细胞的吸附，增殖和分化并具有一定的力学强度，可作为组织填充物而长期存在；并且它还具有较好的组织亲和性和相容性，可诱导软骨细胞向其中生长而重建软骨，在未来组织修复中它们将拥有广泛的应用前景。我们前期的研究表明脱细胞的天然软骨基质能够促进软骨细胞黏附、生长和功能表达，但是这种只脱去细胞和除去抗原成分的天然软骨基质材料，具有一些无法弥补的缺点，如孔隙率低，孔隙小，接种的软骨细胞无法进入材料深层；降解速度慢等[孔清泉，杨志明，项舟，等《离心力在体外构建组织工程软骨中的作用》中华实验外科杂志，2005，22(3)281-283]。II型胶原由于含有特别的识别信号，有利于软骨细胞粘附、增殖、分化，可作为良好的材料包埋添加剂。缺点是缺乏一定的机械强度，难于塑形，支架材料在体内降解过快。体内细胞生长的基质非常复杂，单一材料较难适应细胞培养的要求，通过共混调整不同材料之间的比例，可以使共混材料具有更适合细胞培养的力学性能、降解性和生物学性质等。
发明内容
针对上述天然生物材料的缺陷，本发明的第一个目的是提供一种兼具天然软骨细胞外基质材料和II型胶原优点，同时改善两种材料自身所固有缺点的关节软骨生物支架材料。发明的第二个目的是提供一种制备上述材料的方法。
第一个目的的实现是通过将脱细胞、去抗原、脱I型和X型胶原的天然软骨基质成分与II型胶原共混实现的，将两种材料以按一定重量比(10～3∶1)共混(最佳比例为4∶1)。第二个目的是通过如下步骤实现的①取新鲜猪关节软骨，尽量不要取到软骨下骨部分，将取下的软骨用绞碎机绞成大小平均约为3mm×3mm的碎屑，然后通过脱钙、脱脂、脱细胞、去垢、除去I型和X型胶原等混杂基质成分、去抗原、盐析和干燥等步骤制备提取出→脱钙、脱细胞、去抗原、脱I型和X型胶原的天然软骨基质成分；②II型胶原制备，可以按照已有的方法自己提取，方法可以参见[李斯明，邹海燕，叶春婷等《猪软骨II型胶原的制备及理化性能分析》，生物医学工程与临床，2001年03期]，也可以购买商品化的成品；③将材料1(天然软骨基质成分)和材料2(II型胶原)按一定重量比例(10～3∶1)混合；④应用乙酸溶解上述混合物，盐析提纯后加入致孔剂氯化钠；然后置于模具，加压冻干，无离子水中漂洗去除氯化钠，再一次置于模具中干燥处理，施加较小的压力(＜1Mpa)，置于-40℃～-10℃下冷冻条件下干燥处理后封装、环氧乙烷消毒；其中步骤①中的关键步骤详述如下取猪关节软骨部分，尽量不要取到软骨下骨部分，将取下的软骨用绞碎机绞成大小平均约为3mm×3mm，然后进行以下流程处理。(1)脱钙0.5M的HCl溶液浸泡72小时，蒸馏水浸洗干净；(2)脱细胞和脱脂在35～38℃下，用35％的过氧化氢持续振荡清洗36小时，蒸馏水漂洗；应用脱脂剂(氯仿-甲醇溶液)进行脱脂，然后加入无水乙醇去除氯仿，蒸馏水漂洗；(3)去垢和去残余细胞成分应用1～5％TritonX-100，在4℃下持续振荡72小时，蒸馏水浸洗干净；(4)去I型和X型胶原组织捣碎机捣碎后，应用I型和X型胶原酶37℃下持续振荡消化6～12小时，离心去除I型和X型裂解产物；应用Tris-HCl(pH＝7.5)缓冲液浸泡3小时，去离子水漂洗3次，离心沉淀所需要的产物；(5)消化将0.25％胰蛋白酶(蛋白酶总量是需要消化蛋白产物量的4％)加入到上述离心沉淀产物中，37℃下持续振荡消化18～36小时；在反应体系中加入Tris-HCl(pH＝7.5)缓冲液，继续持续搅拌1小时；(6)盐析应用氢氧化钠溶液和盐酸溶液将溶液调成中性，然后加入氯化钠，直到其浓度为3mol/1；持续搅拌2小时，静置盐析10～36小时；(7)漂洗用去离子水透析12小时，每3小时换一次水，直至检测不到氯离子为止；(8)干燥离心收集沉淀物，置于-40℃～-10℃下冷冻条件下干燥处理；其中步骤④的关键步骤详述如下(1)用0.2～0.8M乙酸缓冲液溶解混合物，在37℃下持续振荡搅拌；(2)通过氢氧化钠溶液中和上述混合溶液，使溶液成中性(pH＝7.0)后加入氯化钠，最终浓度到达3mol/l；持续搅拌2小时，静置盐析10～36小时；(3)将盐析得到的成分在去离子水中透析12小时，每3小时换一次水；(4)离心后，置于无水乙醇脱水，再次离心，离心后的物质置于4～10℃下10小时，让乙醇和其他残余有机物自然挥发掉，将氯化钠与离心后的乳状物质混匀；(5)将混合物置于特制的金属塑性模具内(形状可根据需要自行设计)，置于加压装置上，置于-40℃～-10℃下冷冻条件下，在5Mpa～10Mpa压力下进行模塑，冻干后取出材料；将塑形后的材料浸泡于去离子水中，使材料中的氯化钠晶体溶解析出，3小时换一次水，直至蒸馏水中检测不到氯离子为止，即形成多孔结构的复合软骨支架材料；(6)再一次置于模具中施加较小的压力(＜1Mpa)，置于-40℃～-10℃下冷冻条件下干燥处理后封装、环氧乙烷消毒；其中氯化钠的重量与孔隙率密切相关，可以根据实验所需要的孔隙率来调控需要加入的氯化钠的重量，一般情况下控制在总重量的50％～90％，在这种情况下孔隙率范围在45％～95％；氯化钠的大小与孔隙大小相关，根据实验要求选择氯化钠的大小，一般情况下控制在20～80目，在这种情况下，孔隙大小在50μm～250μm。
本发明选用猪来源的关节软骨是因为猪与人在遗传背景上同源性达到了96％以上，比牛羊等动物更接近人类。所以猪关节软骨更适于作为软骨组织工程和软骨缺损修复的材料。另外猪来源的生物材料取得容易，价钱便宜，适于将来大规模采集应用。
总之，与现有的材料和技术相比本发明具有如下特点1、材料组成结构和成分与人的关节软骨结构更加接近，因为其中的大部分材料是来源于猪的关节软骨，只是这种关节软骨进行了相应的理化处理。去除了细胞、抗原和有可能混杂有的I型和X型胶原成分。基本上无抗原性，对植入受体的全身及局部免疫基本无影响，组织相容性好。
2、材料中添加了提纯的II型胶原成分，这种成分单独存在降解速度稍快；而提取的天然关节软骨基质成分，因为其成分仍是以复合结构存在(即各种成分之间相互交联缠绕)，因此降解速度稍慢；两种材料共混后，相互之间互相弥补，我们提供的两种材料的重量比是10～3∶1(天然关节软骨基质成分占主要部分)，这种情况下能为我们提供较佳的降解速度，能够满足临床实际应用的需要。
3、可以随意调控材料的孔隙率和孔隙的大小，满足不同实际应用情况下对材料的不同要求。
4、所述材料中具有天然的关节软骨基质成分，而这些成分是以相互交联的复合结构存在的，因此材料也具有了一定的力学强度，可以一定程度上弥补II型胶原结构力学强度不足的缺点。
5、天然的关节软骨基质成分和II型胶原均有利于软骨细胞黏附、增殖和表型表达。
6、如上所述，所述材料具有较佳的孔隙率和孔隙大小，具有较好的力学强度，具有较佳的降解速度，这些都会使接种的软骨细胞更好的发挥功能，会今后实现修复软骨缺损提供可能。
7、原料来源丰富，易于获得；原料无毒性及致瘤性；制备材料所需的条件简单，可以在材料中添加TGFβ和(或)bFGF等活性因子成分，材料可以方便的加工成其他组织工程材料，在临床上具有广泛的用途。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作更为详细的描述。
实施例天然软骨基质成分与II型胶原重量比为4∶1，孔隙率为90％，平均孔径为100μm的关节软骨生物支架材料的具体制备方法。
1.提取关节软骨细胞外基质成分，按照以下流程提取处理1)取新鲜猪关节软骨，尽量不要取到软骨下骨部分，重量大约200g，应用车床绞碎成平均大小约3mm×3mm的碎屑。
2)将软骨碎屑置于盛有0.5M的HCl溶液的大烧杯中浸泡72小时，脱去可能混杂的骨组织成分中的无机物质，蒸馏水浸洗干净3)取出软骨碎屑，放入盛有35％的过氧化氢溶液的大烧杯中，在35～38℃下持续振荡清洗36小时，蒸馏水漂洗干净；4)取出软骨碎屑，放入盛有1升氯仿-甲醇溶液(3∶1)的大烧杯中进行脱脂，在37℃下持续振荡36小时，然后加入无水乙醇去除氯仿，蒸馏水漂洗；5)取出软骨碎屑，放入盛有1升1～5％TritonX-100的大烧杯中进行去垢和去残余细胞成分，在4℃下持续振荡72小时，蒸馏水浸洗干净；6)取出软骨碎屑，组织捣碎机将其捣碎，然后加入20mg I型胶原酶和20mgX型胶原酶，同时加入磷酸盐缓冲液(PBS液)1升，37℃下持续振荡消化6～12小时，离心去除I型和X型裂解产物；应用Tris-HCl(pH＝7.5)缓冲液浸泡3小时，去离子水漂洗3次，离心沉淀所需要的产物7)将0.25％胰蛋白酶(蛋白酶总量是需要消化蛋白产物量的5％)加入到上述离心沉淀产物中，37℃下持续振荡消化18～36小时；在反应体系中加入Tris-HCl(pH＝7.5)缓冲液，继续持续搅拌1小时；6)应用氢氧化钠溶液和盐酸溶液将溶液调成中性，然后加入氯化钠，直到其浓度为3mol/l；4℃～10℃持续搅拌2小时，静置盐析10～36小时；用去离子水透析提取的软骨基质成分12小时，每3小时换一次水，直至检测不到氯离子为止；离心收集沉淀物，置于-40℃～-10℃下冷冻条件下干燥处理；2.称量出4g上述提取物备用；3.购买II型胶原(Sigma)，称出1g备用；4.将两种材料混合后，按照以下的流程处理；1)用0.2～0.8M乙酸缓冲液溶解混合物，在37℃下持续振荡搅拌；2)通过氢氧化钠溶液中和上述混合溶液，使溶液成中性(pH＝7.0)后加入氯化钠，最终浓度到达3mol/l；持续搅拌2小时，静置盐析10～36小时；3)将盐析得到的成分在去离子水中透析12小时，每3小时换一次水；离心后，置于无水乙醇脱水，再次离心，离心后的物质置于4～10℃下6小时，让乙醇和其他残余有机物自然挥发掉，将30g氯化钠(大小为20～60目)与离心后的乳状物质混匀；4)将混合物置于特制的金属塑性模具内(形状可根据需要自行设计)，置于加压装置上，-40℃～-70℃条件下，在5Mpa～10Mpa压力下进行模塑，冻干后取出材料；将塑形后的材料浸泡于去离子水中，使材料中的氯化钠晶体溶解析出，3小时换一次水，直至蒸馏水中检测不到氯离子为止，即形成多孔结构的复合软骨支架材料；5)再一次置于模具中，施加较小的压力(＜1Mpa)，置于-40℃～-10℃下冷冻条件下干燥处理后封装、环氧乙烷消毒，4℃保存备用，产品为一种乳白色的海绵样结构。
从上述制备方法的实施例中，即揭示了制备提取方法，揭示了又产品特征。因此，关于“关节软骨生物支架材料”的发明就不再累述了。
除了猪关节软骨外，其他动物来源的关节软骨，同样可以依照本发明所述的方法提取出相应的天然关节软骨基质成分，并制备出相应的共混支架材料。另外，除了II型胶原外，我们同样可以应用其他的天然材料和人工合成材料与关节软骨提取物进行混合，用来制备关节软骨的支架材料。
权利要求
1.一种关节软骨生物支架材料，其特征在于含有天然猪关节软骨细胞外基质成分提取物和II型胶原。
2.根据权利要求1所述的关节软骨生物支架材料，其特征在于天然猪关节软骨细胞外基质成分提取物是由以下方法制得取猪关节软骨部分，尽量不要取到软骨下骨部分，将取下的软骨用绞碎机绞成大小平均约为3mm×3mm，然后通过以下流程进行处理(1)脱钙0.5M的HCl溶液浸泡72小时，蒸馏水浸洗干净；(2)脱细胞和脱脂在35～38℃下，用35％的过氧化氢持续振荡清洗36小时，蒸馏水漂洗；应用脱脂剂进行脱脂，然后加入无水乙醇除去氯仿，蒸馏水漂洗；(3)去垢和去残余细胞成分应用TritonX-100，在4℃下持续振荡72小时，蒸馏水浸洗干净；(4)去I型和X型胶原组织捣碎机捣碎后，应用I型和X型胶原酶37℃下持续振荡消化6～12小时，离心去除I型和X型裂解产物；应用Tris-HCl缓冲液浸泡3小时，去离子水漂洗3次，离心沉淀所需要的产物；(5)消化将0.25％胰蛋白酶加入到上述离心沉淀产物中，37℃下持续振荡消化18～36小时；在反应体系中加入Tris-HCl缓冲液，继续持续搅拌1小时；(6)盐析应用氢氧化钠溶液和盐酸溶液将溶液调成中性，然后加入氯化钠，直到其浓度为3mol/l；持续搅拌2小时，静置盐析10～36小时；(7)漂洗用去离子水透析12小时，每3小时换一次水，直至检测不到氯离子为止；(8)干燥离心收集沉淀物，置于-40℃～-10℃下冷冻条件下干燥处理。
3.根据权利要求1～2任一项所述的关节软骨生物支架材料，其特征在于II型胶原为提纯的天然组织成分，可以是来源于同种异体生物体，也可以是来源于猪的提取物。
4.根据权利要求1～3任一项所述的关节软骨生物支架材料，其特征在于所述的支架材料上可以再添加TGFβ和/或bFGF活性因子成分，或者接种上软骨细胞。
5.根据权利要求1～4任一项所述的关节软骨生物支架材料，其特征在所述的支架材料可以用于体内构建组织工程软骨和体外构建组织工程软骨、修复关节软骨缺损、修复其他结构的软骨组织缺损。
6.一种制备关节软骨生物支架材料的方法，其特征在将提取的天然软骨基质成分和II型胶原按重量比10～3∶1混合，然后经以下流程处理(1)用0.2～0.8M乙酸缓冲液溶解混合物，在37℃下持续振荡搅拌；(2)通过氢氧化钠溶液中和上述混合溶液，使溶液成中性后加入氯化钠，最终浓度到达3mol/l；持续搅拌2小时，静置盐析10～36小时；(3)将盐析得到的成分在去离子水中透析12小时，每3小时换一次水；(4)离心后，置于无水乙醇脱水，再次离心，离心后的物质置于4～10℃下6小时，让乙醇和其他残余有机物自然挥发掉，将氯化钠与离心后的乳状物质混匀；(5)将混合物置于特制的金属塑性模具内，置于加压装置上，置于-40℃～-10℃下冷冻条件下，在5Mpa～10Mpa压力下进行模塑，冻干后取出材料；将塑形后的材料浸泡于去离子水中，使材料中的氯化钠晶体溶解析出，3小时换一次水，直至蒸馏水中检测不到氯离子为止，即形成多孔结构的复合软骨支架材料；(6)再一次置于模具中施加较小的压力，置于-40℃～-10℃下冷冻条件下干燥处理后封装、环氧乙烷消毒。
7.根据权利要求6所述的关节软骨生物支架材料制备方法，其特征在于致孔剂氯化钠的大小为20～80目；氯化钠的重量应占总重量的50％～90％。
全文摘要
本发明涉及一种关节软骨生物支架材料及制备方法将脱细胞、去抗原、去I型和X型胶原的天然软骨基质成分与II型胶原共混，以氯化钠晶体颗粒作为致孔剂，通过一系列理化处理，制成一种多孔的关节软骨支架材料。该支架材料不但具有天然软骨的组成成分、较好的生物力学强度、较佳的孔隙率和较适宜的降解速度，而且具有应用方便，植入后对受体的全身和局部免疫无影响。相容性好，来源丰富，制作简便，价廉。可以应用于临床关节软骨缺损的修复和组织工程软骨的体内、外构建。
文档编号A61L27/38GK101020080SQ20071009096
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月29日 优先权日2007年3月29日
发明者孔清泉, 项舟, 李锋 申请人:孔清泉