专利名称：沙眼衣原体的一种重组主要外膜蛋白及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及沙眼衣原体的一种重组主要外膜蛋白及其编码基因与制备方法 和应用，特别是涉及沙眼衣原体的一种重组主要外膜蛋白及其编码基因与制备 方法及在疫苗制备和衣原体检测中的应用。
背景技术：
沙眼衣原体(CWa历jY^atrsc/ CT7 stis， Ct)有15个血清型，可引起人类多种 疾病，其中A C型是引起沙眼的主要病原体，D4型引起人的泌尿生殖道感染，在 男性表现为非淋菌性尿道炎、前列腺炎、直肠炎等；在女性表现为子宫颈炎、输 卵管炎、异位妊娠和不孕等疾病，L1 L3型主要引起性病淋巴肉芽肿。研究表明， Ct感染引起的性传播疾病(STD)不仅增加HIV感染的几率(Kilmarx PH， Mock PA, Levine WC. Effect of CW柳j^/i3 z^rsc力湖atis coinfection on HIV shedding in genital tract secretions. Sex Transra Dis, 2001, 28:347-348),而且使宫 颈癌的发病率增力口(Smith JS, Mu膨N, Herrero R, et al. Evidence for trac力o鹏tisas a human papillomavirus cofactor in the etiology of invasive cervical cancer in Brazil and the Pilippines. J Infect Dis， 2002， 185: 324-3331.)。由于Ct感染病程隐匿，临床表现轻或无症状，以致感染反复迁延造 成进行性、不可逆性病理变化以及耐药性菌株的产生等，给衣原体感染的治疗带 来困难。因此，对Ct感染的快速准确诊断，具有十分重要的意义。
衣原体实验室诊断主要有以下3种方法①衣原体分离与培养；②免疫学检 测；③聚合酶链反应(PCR)。在所有方法中，细胞培养是最特异的，但其敏感 性差异大；直接免疫荧光(DFA)和酶免疫测定法(EIA)对临床标本作抗原检测 是快速且特异性均较好的方法。DFA法，针对沙眼衣原体主要外膜蛋白或脂多糖 的单克隆抗体与相应的抗原结合,单克隆抗体标有荧光素,在荧光显微镜下，阳性 者可见到亮苹果绿的原体和始体。此法的缺点是在低感染率的人群中敏感性差， 易受实验人员的主观影响，优点是快速，价廉,操作简便，标本的贮存和运送方便，
标本中的沙眼衣原体不必是活的或是有感染性的。
预防Ct感染最有效的方法是疫苗，随着分子生物学的发展，人们对Ct抗原的 结构和功能有了深入的了解，Ct主要外膜蛋白(Major outer membrane protein, MOMP)是衣原体外膜复合物上的主要成分，占外膜蛋白总量的60%以上，为属特 异性抗原，又是其最主要的保护性抗原。进一步研究发现Ct的MOMP能够刺激机体 产生细胞免疫和体液免疫，以阻止或削弱衣原体的感染。用天然结构的外膜复合 物(富含M0MP)制备疫苗可防止绵羊、豚鼠及小鼠患衣原体的感染。有人用M0MP-霍乱毒素-CpG佐剂联合疫苗经皮肤接种小鼠，不但能使生殖道粘膜产生特异性 IgG、 IgG抗体，且可生成分泌Y干扰素的Thl细胞，使细胞内外的衣原体得到彻 底清除(Berry LJ, Hickey DK, Skelding KA， et al. Transcutaneous immunization with combined cholera toxin and CpG adjuvant protects against CW柳j^/is 孤riokr證genital tract infection. Infect Immun, 2002， 70: 4812-4916.)。
发明内容
本发明的发明人对Ct M0MP保护性抗原进行了克隆表达，获得了较高的产物 表达率。
本发明的目的是提供Ct的一种重组MOMP及其编码基因。
本发明所提供的Ct重组M0MP，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质， 或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添 加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2的蛋白质由394个氨基酸残基组成，在实际应用中，优选的是 序列表中序列2的蛋白质。
Ct重组M0MP的编码基因，是下列核苷酸序列之一
1) 序列表中序歹U1的DNA序列；
2) 与序列表中序列l限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且编码相同功能蛋 白质的DNA序列。
序列表中序列l编码Ct重组M0MP的基因由1185个核苷酸组成，其中自5'到 3'端第67位到1185位核苷酸为该基因的读码框。
含有序列1DNA序列的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供Ct重组主要外膜蛋白的制备方法。 制备Ct重组MOMP，包括以下步骤
1) 扩增序列l的基因；
2) 将目的片段与表达载体相连转入大肠杆菌；
3) 筛选阳性克隆；
4) 诱导表达得到目的蛋白。
利用本发明提供的基因，可以得到较高的表达产物收获率，每100ml培养液 可收获重组蛋白15mg，该重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。本发明另外的 目的是提供一种能够有效预防衣原体引起STD的疫苗和检测衣原体感染的试剂。
为实现这个目的，本发明采用以下技术方案 一种预防衣原体感染的疫苗， 其活性成分是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的 氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2 的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
在实际应用中，优选的是以序列表中序列2的蛋白质为活性成分的疫苗。为 了使疫苗的效果更好，所述疫苗中还可以加有佐剂。加入的佐剂可以是10号矿物 油佐剂或福氏佐剂。
本发明疫苗的免疫剂量一般为O. 5-lmg/kg体重。
用本发明Ct重组MOMP为活性成分的疫苗免疫的大耳白家兔产生了对Ct的特 异性抗体，说明其具有较好的免疫原性，市场应用前景非常广阔，下面结合具体 实施例对本发明做进一步说明。
附图l Ct重组MOMP的诱导与纯化
1:诱导前重组菌，2:诱导后重组菌，3:包涵体沉淀，4:超声上清，5: 纯化的包涵体，M:标准分子量蛋白Marker。 附图2 Ct重组MOMP的抗原性鉴定 M:标准分子量蛋白Marker, 1: 1%BSA， 2:重组MOMP
具体实施例方式
实施例一、Ct M0MP的制备
1、 利用PCR方法对MOMP全DNA进行扩增，其引物是 1: 5， -CATGCCATGGTGCCTGTGGGGAATCCTGCT-3，； 2: 5， -ACGCGTCGACTTAGAAGCGGAATTGTGCAT-3'。
2、 将目的片段从T载体上切下，与经相同酶切的pET32a(+)载体相连，转入 表达型菌体BL21(DE3)中。
3、 挑取阳性菌落，菌液和培养液的比例为1:50，同时加入Amp (1:1000)， 37°C、 250rpm摇床培养4小时，至菌液006()()=0. 7 - 0. 9,加入IPTG至终浓度lmM， 继续培养5小时，离心集菌。
4、 用含30%蔗糖，50mMTris-HC1， 1 mM EDTA pH8. 0的溶液重悬，冰浴30min， 离心集菌。
5、 用超声缓冲液(50mM NaH2P04pH7. 8， 300mMNaCl)重悬菌体沉淀至适当 浓度，超声破碎60分钟，30秒间歇18秒，超声次数40次，功率35%。
6、 10000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃 掉)，沉淀即为包涵体。
7、 生理盐水重悬沉淀，10000rpm离心15分钟，.弃上清(需经SDS-PAGE证实 不含目的蛋白后再弃掉)。
8、 生理盐水重悬沉淀8000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不 含目的蛋白后再弃掉)。
9、 生理盐水重悬沉淀，超声破碎60分钟，10000rpm离心15分钟，弃上清(需 经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。
10、 将沉淀用10% Triton x-100重悬，磁力搅拌器搅拌30min， 8000rpm离 心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。
11、 用含8M尿素的缓冲液(NaH2P04 0. 1M， Tris-HCl pH8. 0， 0. 01M) 溶 解沉淀。
12、 12000rprn离心15分钟，上清即为含重组蛋白的缓冲液，置含6M尿素的 复性液(lOOmM Tris-HCl， 2 raM EDTA pH8. 0， 0. 2M盐酸精氨酸，0. 004M氧化型谷 胱甘肽，0.002M还原型谷胱甘肽)中透析4小时以上。
13、 转置含4M尿素的复性液中透析4小时以上。
14、 转置含2M尿素的复性液中透析4小时以上。15、 转置含1M尿素的复性液中透析4小时以上。
16、 转置蒸馏水中中透析4小时以上。
17、 获得复性的Ct重组MOMP。
实施例二、以本发明Ct重组MOMP为活性成分的疫苗对家兔的免疫评价 将实施例1所得的Ct重组MOMP稀释至0.25mg/ml后用以作双扩测定血清效 价。取血清检测为阴性的大耳白家兔6只，随机分成实验组和对照组。大耳白家 兔,30日龄，雄性，体重相近约2kg/只，由本院实验动物中心提供。实验组用本 发明Ct重组MOMP免疫，将制备的Ct重组MOMP与福氏佐剂充分搅拌混匀，制成乳 胶溶液，腹部皮下多点注射家兔3只，每只注射2mg,间隔20d同样剂量和部位 追加1针，30d时再追加l针，共追加2针，对照组大耳白家兔3只，仅注射福氏佐 剂，共免疫3次。比较实验组及对照组大耳白家兔血清的效价。对照组的动物均 为阴性，实验组的动物均为阳性，其效价可达1:16。说明本发明的Ct重组MOMP 可以在家兔体内诱导产生体液免疫反应。
实施例三、免疫印迹法检测Ct重组MOMP抗原性
(一) 蛋白质样品经纯化的Ct重组MOMP。
(二) 电泳制备凝胶，进行SDS-PAGE电泳。
(三) 转移
1、 电泳结束后将胶条切割至合适大小，用转膜缓冲液(39 mM甘氨酸，48mM Tris碱，0.037% SDS， 20%甲醇)平衡，5minX3次。
2、 膜处理预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。
3、 转膜转膜装置从下至上依次按阳极碳板、4层滤纸、NC膜、凝胶、4层滤 纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡。接通 电源，230mA，转移1.5h。转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免 疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中染色后，在50%甲醇中多次 脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果 作对比。
(四) 免疫反应
1、 用0.01M PBS洗膜，5minX3次。
2、 加入包被液(5%脱脂奶)，平稳摇动，室温2h。
3、 弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5minX3次。
4、 加入一抗(沙眼衣原体免疫兔制备的多抗血清，用0.01M PBS按1:500稀 释)，4'C放置过夜。阴性对照，以i。/。BSA取代一抗，其余歩骤与实验组相同。
5、 弃一抗和P/。BSA，用O. 01M PBS分别洗膜，5minX4次。
6、 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(用0.01MPBS按1:5000稀释)，平稳摇 动，室温2h。
7、 弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5minX4次。
8、 加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。 (五)结果
见附图2，在约50KDa处有特异条带出现，阴性对照没有条带出现，说明重组 M(MP具有很好的抗原性。
实施例四、利用本发明Ct重组MOMP制备的免疫兔血清间接免疫荧光法检测衣 原体
1、 用提纯的沙眼衣原体制备抗原片，甲醛固定15min，用滤纸吸干水分。
2、 用生理盐水倍比稀释抗Ct重组MOMP兔多抗血清，滴加抗体覆盖抗原片。 将玻片置于湿盒内，37'C保温30min。生理盐水和正常兔血清作阴性对照，用抗 衣原体单抗作阳性对照。
3、 取出玻片，置于玻片架上，用0.01M， pH7.4的PBS冲洗3-4次。
4、 用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴荧光标记的抗兔球蛋 白抗体。
5、 将玻片平放在湿盒内，37'C保温30min。
6、 重复操作3。
7、 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴伊文思兰(Evans Blue)衬染。
8、 重复操作3。
9、 用滤纸吸去多余水分，滴加一滴蒸馏水，置荧光显微镜下观察，判定结果。
10、 结果荧光显微镜下见发亮苹果绿荧光的边界清晰的亮点为衣原体。
序列表
<160>2
<210〉1
<211>1185
〈212〉画
〈213〉沙眼衣原体(C/ Ja历.K力'a trac/ o顶atis， Ct)
<400〉1
tcttgaaatcggtattagtgtttgccgctttgagttctgcttcctccttg60
caagctctgcctgtgggg犯tcctgctgaaccaagccttatgatcgacggaattctatgg120
g犯ggtttcggcgg卿tccttgcgatccttgcaccacttggtgtg3CgCtatC3gC3tg180
cgtatgggttactatggtgactttgttttcgaccgtgttttgc犯acagatgtgaataaa240
gaattccaaatgggtgccaagcctacaactgctacaggcaatgctgc3gctccatccact300
tgtacagc犯gagagaatcctgcttacggccgacatatgcgatgtttaca360
aatgctgcttacatggcattgaatatttgggatcgttttgatgtattctgtacattagga420
gccaccagtgaggaaattcagcatctttcaacttagttggcttattcgga■
accatgctacagtttcagattaccaaatatgagcttagaX540
caatctgttgttgagttgtatacagstactacttttgcttgg兆tgctggagctcgtgca600
gctttgtggg犯tgtggstgcgcgactttaggcgcttctttcc犯tacgctc犯tccaag660
cctaaagtcgcgttctctgtaacgcagctgagtttactatcaataagcct720
tagggca卿attccctcttgatcttaaagcaggaacagatggtgtgaca780
gg咖t卿gatgcctctattgattaccatg組ggcaagcaagtttagctctctcttac840
agactgaatatgttceictccctacattggagttaaatggtctcg3gca^gttttgatgca900
gacacgattcgtattgctcagccgaagtcagctacaactgtctttgatgttaccactctg960
aacccaactaUgctggagctggcgatgtgaaa_gcta_gcgcagagggtcagctcggageit1020
accatgcaaatcgtttccttgc犯ttg犯caagatg'3犯tttgCggt3tt1080
gC8gt3gg犯caactattgtggatgcagacgactcgcttg1140
atcgatgagagagctgctcacgtaaatgcacaattccgcttctaa1185
<210〉2
<211〉394
〈212〉PRT
〈213〉沙眼衣原体(C/^a/nyA'a trac/w/mg"'s，
〈400〉2
Met Lys Lys Leu Leu Lys Ser Val Leu Val Phe
1 5 10
Ser Ala Ser Ser Leu Gin Ala Leu Pro Val Gly
20 25 Pro Ser Leu Met lie Asp Gly lie Leu Trp Glu
35 40 Asp Pro Cys Asp Pro Cys Thr Thr Trp Cys Asp
50 55 Arg Met Gly Tyr Tyr Gly Asp Phe Val Phe Asp
65 70 Thr Asp Val Asn Lys Glu Phe Gin Met Gly Ala
80 85 Ala Thr Gly Asn Ala Ala Ala Pro Ser Thr Cys
95 100 Asn Pro Ala Tyr Gly Arg His Met Gin Asp Ala
110 115 Asn Ala Ala Tyr Met Ala Leu Asn lie Trp Asp
125 130 Phe Cys Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly Tyr Leu
140 145 Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu Phe Gly Asp
155 160 Ala Thr Val Ser Asp Ser Lys Leu Val Pro Asn
170 175 Gin Ser Val Val Glu I>eu Tyr Thr Asp Thr Thr
185 190 Ala Gly Ala Arg Ala Ala Leu Trp Glu Cys Gly
200 205 Gly Ala Ser Phe Gin Tyr Ala Gin Ser Lys Pro
215 220 Leu Asn Val Leu Cys Asn Ala Ala Glu Phe Thr
230 235 Lys Gly Tyr Val Gly Gin Glu Phe Pro Leu Asp 245 250
Ct)
Ala Ala Leu Ser 15
Asn Pro Ala Glu 30
Gly Phe Gly Gly 45
Ala lie Ser Met 60
Arg Val Leu Gin 75
Lys Pro Thr Thr 90
Thr Ala Arg Glu 105
Glu Met Phe Thr 120
Arg Phe Asp Val 135
Lys Gly Asn Ser 150
Asn Glu Asn His 165
Met Ser Leu Asp 180
Phe Ala Trp Ser 195
Cys Ala Thr Leu 210
Lys Val Glu Glu 225
lie Asn Lys Pro 240
Leu Lys Ala Gly 255
Thr Asp Glu Trp Thr Pro Asp Thr Asp Val Lys Ala Ser Leu Ala Val Val Glu Gin Phe
Gly Gin Tyr lie Thr Ser Gin Gly Thr Arg
Val
Ala
lie
Arg
Thr
Ala
Leu
Thr
Arg
Phe 394
Thr Gly 260
Ser Leu 275
Gly Val 2恥
lie Ala 305
Leu Asn 320
Glu Gly 335
Asn Lys 350
Thr lie 365
Leu lie 380
Thr Ala Lys Gin Pro Gin Met Val Asp
Lys Leu Trp Pro Thr Leu Lys Asp Glu
Asp
Ser
Ser
Lys
lie
Gly
Ser
Ala
Arg
Ala Ser 265
Tyr Arg 280
Arg Ala 295
Ser Ala 310
Ala Gly 325
Asp Thr 340
Arg Lys 355
Asp Lys 370
Ala Ala 385
lie Asp Leu Asn Ser Phe Thr Thr Ala Gly Met Gin Ser Cys Tyr Ala His Val
Tyr
Met
Asp
Val
Asp
lie
Gly
Val
Asn
His 270 Phe 285 Ala 300 Phe 315 Val 330 Val 345 lie 360 Thr 375 Ala 390
权利要求
1、沙眼衣原体的一种重组主要外膜蛋白，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2、 根据权利要求l所述的蛋白，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的 蛋白质。
3、 沙眼衣原体一种重组主要外膜蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一1) 序列表中序列1的DNA序列；2) 与序列表中序歹iJl限定的DNA序列具有9(n以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4、 根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述沙眼衣原体重组主要外膜蛋白的编码基 因是序列表中序列1的DNA序列。
5、 含有权利要求3所述基因的表达载体。
6、 含有权利要求3所述基因的细胞系。
7、 沙眼衣原体一种重组主要外膜蛋白的制备方法，包括以下歩骤1) 扩增序列l的基因；2) 将目的片段与表达载体相连转入大肠杆菌；3) 筛选阳性克隆；4) 诱导表达得到目的蛋白。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于；扩增序列1基因所用的引物是1:5' -CATGCCATGGTGCCTGTGGGGAATCCTGCT-3' ;2:5' -ACGCGTCGACTTAGAAGCGGAATTGTGCA T-3';诱导表达得到沙眼衣原体重组主要外膜蛋白的具体步骤是将目的片段从T载体 上切下，与经相同酶切的pET32a(+)载体相连，转入表达型菌体BL21(DE3)，挑取阳 性培养，经IPTG诱导表达得到目的蛋白。
9、 一种预防沙眼衣原体感染的疫苗，其活性成分是权利要求l所述的重组主要外膜蛋白 保护性抗原。
10、 根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于其活性成分是权利要求2所述的重组主要 外膜蛋白保护性抗原。
全文摘要
本发明公开了沙眼衣原体的一种重组主要外膜蛋白及其编码基因与制备方法。本发明所提供的沙眼衣原体重组主要外膜蛋白，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。沙眼衣原体重组主要外膜蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的抗原具有非常好的免疫原性，具有广阔的市场应用前景。
文档编号A61K39/118GK101113167SQ20071012979
公开日2008年1月30日 申请日期2007年7月27日 优先权日2007年7月27日
发明者君 何, 刘光桥, 宋立华, 左庭婷, 虹 朱, 华 檀, 青 端 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所