专利名称：：一种含复合佐剂的疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及动物疾病的预防技术，特别是一种使用复合佐剂的疫苗及其制备方法，采用该复合佐剂制备的疫苗可以大幅度提高疫苗诱导的特异性免疫反应强度。
背景技术：
：传染病是危害动物健康的一类重要疾病，给畜牧业造成的经济损失十分严重。给动物注射疫苗是许多国家预防传染病发生的一个常规方法。佐剂可以提高疫苗的免疫效果，油佐剂是组成许多动物传染病疫苗(如口蹄疫疫苗)的一个重要成分。但是，目前一些商品油佐剂疫苗的免疫效果不十分理想。比如谢琴等人的调査表明，注射了含油佐剂的口蹄疫疫苗后仅有20.9%的仔猪产生了足够强的免疫反应，其余的仔猪仍然存在感染的危险。郝大丽等人在分析了91份注射了含油佐剂的口蹄疫疫苗仔猪血清后发现，仅有31.9。/。的血清所含的抗体达到了保护性水平。
发明内容本发明的目的是针对现有的一些油佐剂疫苗注射动物后诱导的免疫反应弱，不能有效地保护被免疫动物的问题，提供更有效的免疫佐剂加工的疫苗以及这种疫苗的制备方法。为了克服一些油佐剂疫苗免疫效果差的缺点，本发明提供了一种新的疫苗配方，采用该配方制备的疫苗可以大幅度提高疫苗诱导的免疫反应强度，增强免疫动物抵抗传染病感染的能力。本发明的技术方案是使油佐剂疫苗中含人参皂甙。人参皂甙的含量为201000ng/ml，即每毫升疫苗中含有人参皂甙201000微克。本发明的一种含复合佐剂疫苗的特征是所述疫苗中含有油佐剂和人参皂甙佐剂，每毫升疫苗中人参皂甙佐剂的含量为201000微克，油佐剂占疫苗体积的二分之一。本发明一种含复合佐剂疫苗的制备方法为以下步骤(1)将人参皂甙溶解于少量生理盐水；(2)将人参皂甙溶液和抗原混合均匀，然后将该混合物和油佐剂在乳化剂的作用下充分乳化混合；或将油佐剂和人参皂甙溶液乳化混合，然后和抗原乳化混合或在常规油佐剂疫苗中加入人参皂甙溶液后乳化混合。本发明的有益效果在于由于一种疫苗中同时含油佐剂和人参皂甙，使疫苗诱导的免疫反应强度大幅度提高。其原因可能是两种作用方式不同的佐剂在一起产生了协同作用油佐剂可以使抗原在注射部位缓慢释放，使抗原持久的刺激动物的免疫细胞，人参皂甙是一种免疫刺激物，可以提高动物免疫细胞对抗原的反应能力。图1为含人参皂甙和白油的复合佐剂(人参皂甙含量每毫升20微克)与使用一种佐剂的疫苗免疫效果图。给小鼠(『6/组)肌肉免疫注射1)FMDV(0型)抗原(对照组)，2)FMDV(0型)抗原+人参皂甙(4iig)，3)FMDV(0型)抗原+白油(100ul)，4)FMDV(0型)抗原+人参皂甙(4yg)+白油(100yl)。3周后用同样方法和剂量加强免疫1次。于加强免疫后的第2周采血，制备血清，用间接夹心ELISA检测血清FMDV特异性IgG。用平均值±标准差(SD)表示检测结果。上标字母不同者表示有统计学差异(P〈0.05)。图2为每毫升含500lag人参皂甙的复合佐剂猪口蹄疫疫苗免疫效果图。将1个剂量(2ml)的猪口蹄疫疫苗(0型)和人参皂甙(1000吗)混合后免疫仔猪(10头/组)。于免疫前和免疫后3周后采血，制备血清。用间接血凝法测定血清IHA滴度。同一检测时间里上标字母不同者表示有统计学差异(P<0.05).上标星号(*)者表示显著高于同一组动物免疫之前的水平(P〈0.05)。图3为每毫升含IOOO吗人参皂甙的复合佐剂猪口蹄疫疫苗免疫效果图。将1个剂量(2ml)的猪口蹄疫疫苗(0型)和人参皂甙(2000叱)混合后免疫仔猪(11头/组)。于免疫前和免疫后3周后采血，制备血清。用间接血凝法测定血清IHA滴度。同一检测时间里上标字母不同者表示有统计学差异(P<0.05).上标星号(*)者表示显著高于同一组动物免疫之前的水平(P〈0.05)。具体实施例方式为验证本发明的复合佐剂疫苗的使用效果，用口蹄疫(FMD)疫苗为实施例进行动物试验。实例1:人参皂甙和白油结合对口蹄疫(FMD)疫苗免疫的增强作用。一材料和方法1.实验动物雌性ICR小鼠24只，购自上海实验动物中心。2.抗原和佐剂抗原为灭活O型口蹄疫病毒(FMDV)，由中国农业科学院兰州兽医研究所(LVRI)提供。白油，购自杭州化工原料有限公司。人参皂甙为宏久公司产品。3.疫苗制备首先将用少量生理盐水溶解人参皂甙，再和灭活的O型口蹄疫病毒(FMDV)抗原溶液混合，然后和油佐剂充分混合，即得。4.免疫方法24只小鼠随机分成4组，每组6只。每只小鼠每次肌肉注射疫苗0.2ml，注射2次，间隔3周。佐剂及抗原剂量见表l。表l动物分组及处理<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>5.血样采集二免后2，4，6周采血。血样静置于4。C冰箱过夜，600g，离心，吸取血清，分装于0.2ml塑料离心管中，-20。C保存。6.特异性IgG检测(1)在ELISA板上每孔加入50(il经碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释的牛抗O型口蹄疫病毒抗体(1:1000)(中国农科院兰州兽医研究所)，封板，4。C过夜。(2)用洗涤液洗涤5次，每次300^1，拍干。每孔加入300^1磷酸盐缓冲液(含5%脱脂奶+0.05%吐温-20)封闭，37。C孵育2小吋。(3)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300^1，拍干。每孔加入50|^1经1:3稀释的O型口蹄疫病毒抗原，振荡混匀，4T孵育2小时。(4)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次30(^1，拍干。每孔加入5(^1经磷酸盐缓冲液(含0.05%吐温-20)l:50稀释的待检血清，37。C孵育1小时。(5)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次30(^1，拍干。每孔加入经1:1000稀释的山羊抗小鼠IgG(h+l)抗体(美国BetheylLaboratory公司)。37°C孵育1小时。(6)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次30(^1，拍干。每孔加入经1:10000兔抗山羊IgGFC-HRP,37。C孵育1小时。用洗涤液洗涤5次，每次300^1，拍干。(7)每孔加入100nlTMB底物溶液。室温孵育15分钟，每孔加入50ial2MH2SO4终止反应，并轻轻振荡混匀。在15分钟内，用酶标仪测定在450nm波长的OD值。二结果含人参皂甙和油双佐剂的疫苗比只含一种佐剂的疫苗诱导出更高的抗FMDV抗体(见图1)(P<0.05)。实例2:含人参皂甙(500微克/毫升)的油佐剂口蹄疫疫苗(0型)免疫仔猪的试验一材料和方法1.实验动物..40日龄仔猪20只。2.疫苗和佐剂O型口蹄疫疫苗，由中国农业科学院兰州兽医研究所(LVRI)提供。人参皂甙(GS)由宏久公司提供。3.疫苗制备首先将用少量生理盐水溶解人参皂甙，然后在疫苗中加入人参皂甙溶液，充分混合，使每毫升疫苗中的人参皂甙含量分别为O(作对照)和500微克。4.免疫方法20只仔猪随机分成2组，每组10只。每只猪一次肌肉注射疫苗2ml，于免疫注射前后采血，分离血清，分装于塑料离心管中，-20。C保存。5.间接血凝试验(IHA):将被检血清置56°C30分钟灭活。在血凝试验板上每孔加入50pl稀释液，再在第1列加被检血清50pl，然后从左至右作2倍稀释。每孔加入25^1致敏的绵羊红细胞，37°C，孵育2小时后判定结果。二结果含ECMS和油的复合佐剂疫苗比油佐剂疫苗诱导出更高的抗IHA抗体(P〈0.05),见图2。实例3:含人参皂甙(1000微克/毫升)的油佐剂口蹄疫疫苗(0型)免疫仔猪的试验一材料和方法1.实验动物40日龄仔猪22只。2.疫苗和佐剂O型口蹄疫疫苗，由中国农业科学院兰州兽医研究所(LVRI)提供。人参皂甙(GS)由宏久公司提供。3.疫苗制备首先将用少量生理盐水溶解人参皂甙，然后在疫苗中加入人参皂甙溶液，充分混合，使每毫升疫苗中的人参皂甙含量分别为O(作对照)和1000微克。4.免疫方法22只仔猪随机分成2组，每组11只。每只猪一次肌肉注射疫苗2ml，于免疫注射前后采血，分离血清，分装于塑料离心管中，-20。C保存。5.间接血凝试验(IHA):将被检血清置56°C30分钟灭活。在血凝试验板上每孔加入50pl稀释液，再在第1列加被检血清50pl，然后从左至右作2倍稀释。每孔加入25^1致敏的绵羊红细胞，37°C，孵育2小时后判定结果。二结果含ECMS和油的双佐剂疫苗比油佐剂疫苗诱导出更高的抗IHA抗体(P〈0.05)，见图3。权利要求1、一种含复合佐剂的疫苗，其特征在于所述疫苗中含有油佐剂和人参皂甙佐剂，每毫升疫苗中人参皂甙佐剂的含量为20～1000微克，油佐剂占疫苗体积的二分之一。2、如权利要求1所述一种含复合佐剂疫苗的制备方法，其特征在于以下步骤(1)将人参皂甙溶解于少量生理盐水；(2)将人参皂甙溶液和抗原混合，然后将该混合物和油佐剂在乳化剂的作用下充分乳化混合；或先将油佐剂和人参皂甙溶液乳化混合，然后和抗原乳化混合；或在常规油佐剂疫苗中加入人参皂甙液体后乳化混合。全文摘要本发明公开了一种含复合佐剂的疫苗及其制备技术，属于生物
技术领域：
，涉及动物疾病的预防。所述疫苗中含有油佐剂和人参皂甙佐剂组合成的复合佐剂，每毫升疫苗中人参皂甙佐剂的含量为20～1000微克，油佐剂占疫苗总体积的二分之一。含复合佐剂疫苗的制备方法为以下步骤将人参皂甙溶解于少量生理盐水中；将该人参皂甙液体和抗原混合，然后将该混合物和油佐剂在乳化剂的作用下充分乳化混合；或先将油佐剂和人参皂甙溶液乳化混合，然后和抗原乳化混合；或在常规油佐剂疫苗中加入人参皂甙溶液后乳化混合。通过以灭活口蹄疫病毒为模式抗原的动物免疫试验证明，本发明的复合佐剂疫苗比使用单一佐剂的疫苗可以诱导更高的免疫反应强度。文档编号A61K39/39GK101185757SQ20071015601公开日2008年5月28日申请日期2007年10月9日优先权日2007年10月9日发明者胡松华申请人:浙江大学