专利名称：：一种含木鳖子皂甙的油佐剂疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明属于生物
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，涉及动物疾病的预防，具体为一种含有木鳖子皂武的油佐剂疫苗及其制备，采用该佐剂的疫苗可以大幅度提高动物的特异性免疫反应强度。技术背景传染病是危害动物健康的一类重要疾病，给畜牧业造成的经济损失十分严重。给动物注射疫苗是许多国家预防传染病发生的一个常规方法。佐剂可以提高疫苗的免疫效果，油佐剂是组成许多动物传染病疫苗(如口蹄疫疫苗)的一个重要成分。但是，目前一些商品油佐剂疫苗的免疫效果不十分理想。比如谢琴等人的调查表明，注射了含油佐剂的口蹄疫疫苗后仅有20.9%的仔猪产生了足够强的免疫反应，其余的仔猪仍然存在感染的危险。郝大丽等人在分析了91份注射了含油佐剂的口蹄疫疫苗仔猪血清后发现，仅有31.9。/。的血清所含的抗体达到了保护性水平。
发明内容针对现有的一些油佐剂疫苗注射动物后诱导的免疫反应弱，不能有效地保护被免疫的动物的问题。本发明的目的是提供含有增强动物免疫效果佐剂的疫苗，以及该疫苗的制备方法。为了克服一些油佐剂疫苗对动物疾病的预防免疫效果差的缺点，本发明提供了一种新的疫苗及其制备，采用该配方制备的疫苗可以大幅度提高疫苗对动物诱导的免疫反应强度，增强免疫动物抵抗传染病感染的能力。本发明的技术方案是使油佐剂疫苗含木鳖子皂甙。加入木鳖子皂甙的方法有以下三种(1)将木鳖子皂甙用少量的生理盐水溶解后和抗原混合，然后将该混合物和油佐剂在乳化剂(如吐温)的作用下充分乳化混合，即得。(2)将油佐剂和木鳖子皂甙混合，然后和抗原混合，即得。(3)在常规油佐剂疫苗中加入木鳖子皂甙，混合，即得。本发明为一种含木鳖子皂甙的油佐剂疫苗，所述疫苗中含有油佐剂和木鳖子皂甙佐剂，每毫升疫苗中木鳖子皂甙佐剂的含量为0.52.5毫克，油佐剂占疫苗总体积的30%50%。上述一种含木鳖子皂甙的油佐剂疫苗的制备方法为以下步骤(1)将木鳖子皂武溶解于少量的生理盐水；(2)将木鳖子皂武溶液和抗原混合，然后将该混合物和油佐剂在乳化剂的作用下充分乳化混合；或先将油佐剂和木鳖子皂甙溶液乳化混合，然后和抗原乳化混合；或在常规油佐剂疫苗中加入木鳖子皂甙溶液乳化混合。本发明的有益效果是，由于一种疫苗中同时含油佐剂和木鳖子皂甙，使疫苗诱导的免疫反应强度大幅度提高。其原因可能是两评巾作用方式不同的佐剂在一起产生了协同作用油佐剂可以使抗原在注射部位缓慢释放，使抗原持久的刺激动物的免疫细胞，木鳖子皂武是一种免疫刺激物，可以提高动物免疫细胞对抗原的反应能力。图1:含木鳖子皂甙(ECMS)和油双佐剂的疫苗对抗体亚类的影响，即以FMDV疫苗为例，含ECMS和油双佐剂疫苗与含一种佐剂疫苗的免疫效果的比较。含3幅图。其中图1-1为含ECMS和油双佐剂的疫苗比只含一种佐剂的疫苗诱导出更高的抗FMDVIgG抗体。图1-2含ECMS和油双佐剂的疫苗比只含一种佐剂的疫苗诱导出更高的抗FMDVIgGl抗体。图1-3含ECMS和油双佐剂的疫苗比只含一种佐剂的疫苗诱导出更高的抗FMDVIgG2抗体。图1—1.给豚鼠(『6/组)肌肉免疫注射1)FMDV(0型)抗原+ECMS(100ug)，2)FMDV(0型)抗原+ECMS(100Pg)+白油，3)FMDV(0型)抗原+白油，4)FMDV(0型)抗原和5)生理盐水。3周后用同样方法和剂量加强免疫1次。于首免前和加强免疫后的第2、4、6周采血，制备血清，用间接夹心ELISA检测血清FMDV特异性TgG。用平均值±标准差(SD)表示检测结果。同一检测时间里上标字母不同者表示有统计学差异(P<0.05)。上标星号(*)者表示显著高于同一组动物免疫之前的水平(P<0.05)。图1一2.给豚鼠(『6/组)肌肉免疫注射1)FMDV(O型)抗原+ECMS(100ug)，2)FMDV(0型)抗原+ECMS(100yg)+白油，3)FMDV(0型)抗原+白油，4)FMDV〔0型)抗原和5)生理盐水。3周后用同样方法和剂量加强免疫1次。于首免前和加强免疫后的第2、4、6周采血，制备血清，用间接夹心ELISA检测血清FMDV特异性IgGl。用平均值±标准差(SD)表示检测结果。同一检测时间里上标字母不同者表示有统计学差异(P<0.05)。上标星号(*)者表示显著高于同一组动物免疫之前的水平(P<0.05)。图1—3.给豚鼠(『6/组)肌肉免疫注射1)FMDV(0型)抗原十ECMS(100ug)，2)FMDV(0型)抗原+ECMS(100ug)十白油，3)FMDV(0型)抗原-Q油，4)FMDV(0型)抗原和5)生理盐水。3周后用同样方法和剂量加强免疫1次。于首免前和加强免疫后的第2、4、6周采血，制备血清，用间接夹心ELISA检测血清FMDV特异性IgG2。用平均值±标准差(SD)表示检测结果。同一检测时间里上标字母不同者表示有统计学差异(P<0.05)。上标星号(*)者表示显著高于同一组动物免疫之前的水平(P<0.05)。图2:含木鳖子皂甙(ECMS)和油双佐剂的疫苗对FMDVVP1抗体亚类的影响，即以FMDV疫苗为例，含ECMS和油双佐剂疫苗与含一种佐剂疫苗的免疫效果的比较。含3幅图。其中图2-1为含ECMS和油双佐剂的疫苗比只含一种佐剂的疫苗诱导出更高的抗FMDVVPll:gG抗体。图2-2含ECMS和油双佐剂的疫苗比只含一种佐剂的疫苗诱导出更高的抗FMDVVPlIgGl抗体。图2-3含ECMS和油双佐剂的疫苗比只含一种佐剂的疫苗诱导出更高的抗FMDVVPlIgG2抗体。图2—1.给豚鼠(n二6/组)肌肉免疫注射1)FMDV(0型)抗原十ECMS(100ug)，2)FMDV(0型)抗原+ECMS(100yg)+白油，3)FMDV(0型)抗原+白油，4)FMDV(0型)抗原和5)生理盐水。3周后用同样方法和剂量加强免疫1次。于首免甜和加强免疫后的第4周采血，制备血清，用间接夹心ELISA检测血清FMDVVP1特异性IgG。用平均值±标准差(SD)表示检测结果。同一检测时间里上标字母不同者表示有统计学差异(P〈0.C)5)。卜.标星号(*)者表示思著高于同一组动物免疫之前的水平(P<0.05)。图2—2.给豚鼠(『6/组)肌肉免疫注射1)FMDV(0型)抗原+ECMS(100Ug)，2)FMDV(0型)抗原+ECMS(100ug)+白油，3)FMDV(0型)抗原+白油，4)FMDV(0型)抗原和5)生理盐水。3周后用同样方法和剂量加强免疫1次。于首免前和加强免疫后的第4周采血，制备血清，用间接夹心ELISA检测血清FMDVVPl特异性IgGl。用平均值±标准差(SD)表示检测结果。同一检测时间里上标字母不同者表示有统计学差异(P〈0.0S)。上标星号(*)者表示显著高于同一组动物免疫之前的水平(P<0.05)。图2—3.给豚鼠(n二6/组)肌肉免疫注射1)FMDV(0型)抗原十ECMS(100ug)，2)FMDV(0型)抗原+ECMS(100yg)+白油，3)FMDV(0型)抗原+白油，4)FMDV(0型)抗原和5)生理盐水。3周后用同样方法和剂量加强免疫1次。于首免前和加强免疫后的第4周采血，制备血清，用间接夹心ELISA检测血清FMDVVH特异性IgG2。用平均值±标准差(SD)表示检测结果。同一检测时间里上标字母不同者表示有统计学差异(P<0.05)。上标星号(*)者表示显著高于同一组动物免疫之前的水平(P<0.05)。图3:含不同剂量木鳖子皂甙的油佐剂口蹄疫疫苗免疫仔猪后的抗体水平。将1个剂量(2id)的猪口蹄疫疫苗(0型)和木鳖子皂甙(0，1，2和4mg)混合后免疫仔猪(6头/组)。于免疫前和免疫后3周后采血，制备血清。用间接血凝法测定血清IHA滴度。同一检测时间里上标字母不同者表示有统计学差异(P〈0.05)。上标星号(*)者表示显著高于同一组动物免疫之前的水平(P<0.05)。图4:含木鳖子皂甙(4mg/剂量)的油佐剂口蹄疫疫苗免疫仔猪后的抗体水平。将l个剂量(2ml)的猪口蹄疫疫苗(0型)和木鳖子皂甙(4mg)混合后免疫仔猪(12头/组)。十免疫前和免疫后3周后采血，制备血清。用间接血凝法测定血清IHA滴度。同一检测时间里上标字母不同者表示有统计学差异(P〈0.05)。上标星号(*)者表示显著高于同一组动物免疫之前的水平(P<0.05)。具体实施方式实例l木鳖子皂甙(ECMS)和白油结合对口蹄疫(FMD)疫苗免疫的增强作用一材料和方法1.实验动物雌性DHP花豚鼠30只，购自浙江大学实验动物中心。2.抗原和佐剂抗原为灭活O型口蹄疫病毒(FMDV)，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。白油，购自杭州化工原料有限公司。木鳖子皂甙(ECMS)由本实验室制备。3.疫苗制备首先将用少量生理盐水溶解木鳖子皂甙，再和灭活的O型口蹄疫病毒(FMDV)抗原溶液混合，然后将此混合物与等体积白油佐剂充分混合，即得。4.免疫方法30只豚鼠随机分成5组，每组6只。每只豚鼠每次肌肉注射疫苗0.5ml，注射2次，间隔3周。佐剂及抗原剂量见表。表1动物分组及处理<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>5.血样采集二免后2，4，6周采血。血样静置于4。C冰箱过夜，600g，离心，吸取血清，分装于0.2ml塑料离心管中，-20。C保存。6.特异性IgG检测(1)在ELISA板上每孔加入50ri经碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释的牛抗0型口蹄疫病毒抗体(1:1000)(中国农科院兰州兽医研究所)，封板，4。C过夜。(2)用洗涤液洗漆5次，每次300W，拍干。每孔加入300W磷酸盐缓冲液(含5%脱脂奶+0.05%吐温-20)封闭，37。C孵育2小时。(3)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300)4，拍干。每孔加入50W经1:3稀释的0型口蹄疫病毒抗原，振荡混匀，4°C孵育2小时。(4)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300[4，拍干。每孔加入经磷酸盐缓冲液(含0.05%吐温-20)1:50稀释的待检血清，37°C孵育1小时。(5)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300W，拍干。每孔加入经1:IOOO稀释的山羊抗豚鼠IgG(h+l)抗体(美国BetheylLaboratory公司)。37°C孵育1小时。(6)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300)4，拍干。每孔加入经1:10000兔抗山羊IgGFC-服P，37。C孵育1小时。用洗涤液洗涤5次，每次300ri，拍干。(7)每孔加入10(MTMB底物溶液。室温孵育15分钟，每孔加入5(M2M貼(^终止反应，并轻轻振荡混匀。在15分钟内，用酶标仪测定在450nm波长的0D值。7.特异性IgG亚类检测(1)在ELISA板上每孔加入50W经碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释的牛抗0型口蹄疫病毒抗体(1:1000)(中国农科院兰州兽医研究所)，封板，4。C过夜。(2)用洗涤液洗涤5次，每次300W，拍干。每孔加入300W磷酸盐缓冲液(含5%脱脂奶+0.05%吐温-20)封闭，37。C孵育2小时。(3)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次30014，拍干。每孔加入经磷酸盐缓冲液(含0.05%吐温-20)l:3稀释的0型口蹄疫病毒抗原，振荡混匀，4。C孵育2小时。(4)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300W，拍干。每孔加入50ri经l:50稀释的待检血清，37。C孵育1小时。(5)用洗涤液洗涤5次，每次300W，拍干。每孔加入经1:1000稀释的山羊抗豚鼠IgGl或者IgG2抗体(美国BetheylLaboratory公司)。室温孵育1小时。(6)用洗漆液洗涤5次，每次300rt，拍干。每孔加入经1:10000兔抗山羊IgGFO服P，室温孵育1小时。(7)用洗涤液洗涤5次，每次300W，拍干。每孔加入TMB底物溶液。室温孵育15分钟，每孔加入5(M2M貼04终止反应，并轻轻振荡混匀。在15分钟内，用酶标仪测定在450nm波长的0D值。8.抗VP1IgG检测(1)在口蹄疫病毒VP1包被板(UnitedBiomedical公司)，每孔加入经磷酸盐缓冲液(含0.05%吐温-20)释稀(1:800)的待检血清lOOu1，置37。C孵育1小时。(2)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300u1，拍干。每孔加入100y1稀释的兔抗豚鼠服P-IgG抗体(1:800稀释)(美国BetheylLaboratory公司)，置37。C孵育30分钟。(3)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300y1，拍干。每孔加入100u1TMB底物溶液，置37。C下孵育15分钟，每孔加入lOOy11MH2S(X终止反应，并轻轻振荡混匀。在15分钟内，用酶标仪测定在450nm波长下的0D值。9.抗VP1IgG亚类检测(1)在口蹄疫病毒VP1包被板(UnitedBiomedical公司)，每孔加入经磷酸盐缓冲液(含0.05%吐温-20)释稀0:1000)的待检血清100ul，置37。C下孵育1小时。(2)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300ul，拍千。每孔加入100ul经l:1000稀释的山羊抗豚鼠IgGl抗体或者山羊抗豚鼠lgG2抗体。(3)置37'C下孵育半小时，用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300y1，拍干。每孔加入100u1经1:10000稀释的服P标记的兔抗山羊IgG-Fc抗体，置37。C下孵育半小时。(4)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300n1，拍干。每孔加入100u1TMB底物溶液，置37'C下孵育15分钟，每孔加入100y11MH2S04终止反应，并轻轻振荡混匀。在15分钟内，用酶标仪测定在450nm波长下的0D值。二结果1.含ECMS和油双佐剂的疫苗比只含一种佐剂的疫苗诱导出更高的抗FMDV抗体。见图l。二免后第2、4、6周检测的血清IgG、IgGl和IgG2以注射含ECMS和油双佐剂疫苗的豚鼠为最高，其中IgGl在第4和第6周，IgG2在第4周显著高于其它各组(P<0.05)。2.含ECMS和油双佐剂的疫苗比只含一种佐剂的疫苗诱导出更高的抗FMDV-VP1抗体。见图2。二免后第4周检测的血清抗FMDV-VP1IgG、IgGl和IgG2以注射含ECMS和油双佐剂疫苗的豚鼠为最高，其中IgG显著高于其它各组(P<0.05)。实例2含不同剂量木鳖子皂甙的油佐剂口蹄疫疫苗免疫仔猪的试验一材料和方法1.实验动物40闩龄仔猪24只。2.疫苗和佐剂0型口蹄疫疫苗，由中国农业科学院兰州兽医研究所(LVRI)提供。木鳖子皂甙(ECMS)皂甙有本实验室制备。3.疫苗制备首先将用少量生理盐水溶解木鳖子皂甙，然后在疫苗中加入木鳖子皂甙溶液充分混合，使每毫升疫苗中的木鳖子皂甙含量分别为0(对照组)、0.5、l和2毫克。4.免疫方法24只仔猪随机分成4组，每组6只。每只猪一次肌肉注射疫苗2ml，于免疫注射前后采血，分离血清，分装于塑料离心管中，一20。C保存。5.间接血凝试验(THA):将被检血清置56。C30分钟灭活。在血凝试验板上每孔加入50ul稀释液，再在第1列加被检血清50Pl，然后从左至右作2倍稀释。每孔加入25ul致敏的绵羊红细胞，37°C，孵倉—2小时后判定结果。一结果含ECMS和油双佐剂的疫苗比油佐剂疫苗诱导出更高的抗IHA抗体，见图3。含ECMS比不含ECMS的油佐剂疫苗诱导出更高的IHA效价，其中一次注射剂量含2mg和4mg组显著高于对照组(P<0.05)。实例3含木鳖子皂甙(4mg/剂量)的油佐剂口蹄疫疫苗免疫仔猪的试验一材料和方法1.实验动物40日龄仔猪24只。2.疫苗和佐剂0型口蹄疫疫苗，由中国农业科学院兰州兽医研究所(LVRI)提供。木鳖子皂甙(ECMS)皂甙有本实验室制备。3.疫苗制备首先将用少量生理盐水溶解木鳖子皂甙，然后在疫苗中加入木鳖子皂甙溶液充分混合，使每毫升疫苗中的木鳖子皂甙含量分别为0(作对照)和2毫克。4.免疫方法24只仔猪随机分成2组，每组12只。每只猪一次肌肉注射疫苗2ml，于免疫注射前后采血，分离血清，分装于塑料离心管中，-20。C保存。5.间接血凝试验(IHA):将被检血清置56°C30分钟灭活。在血凝试验板上每孔加入50u1稀释液，再在第1列加被检血清50y1，然后从左至右作2倍稀释。每孔加入25y1致敏的绵羊红细胞，37UC，孵育2小时后判定结果。二结果含ECMS和油的双佐剂疫苗比油佐剂疫苗诱导出更高的抗IHA抗体(P<0.05),见图4。权利要求1、一种含木鳖子皂甙的油佐剂疫苗，其特征在于所述疫苗中含有油佐剂和木鳖子皂甙佐剂，每毫升疫苗中木鳖子皂甙佐剂的含量为0.5～2.5毫克，油佐剂占疫苗总体积的30％～50％。2、如权利要求1所述一种含木鳖子皂甙的油佐剂疫苗的制备方法，其特征在于以下歩骤(1)将木鳖子皂甙溶解于少量的生理盐水中成为溶液；(2)将木鳖子皂甙溶液和抗原混合，然后将该混合物和油佐剂在乳化剂的作用下充分乳化混合；或将油佐剂和木鳖子皂甙溶液乳化混合，然后和抗原乳化混合；或在常规油佐剂疫苗中加入木鳖子皂甙溶液乳化混合。全文摘要一种含木鳖子皂甙的油佐剂疫苗及其制备方法，疫苗中含有油佐剂和木鳖子皂甙佐剂，每毫升疫苗中木鳖子皂甙佐剂的含量为0.5～2.5毫克，油佐剂占疫苗总体积的30％～50％。其制备方法为先将木鳖子皂甙溶解于少量的生理盐水中成为溶液；再将木鳖子皂甙溶液和抗原混合，然后将该混合物和油佐剂在乳化剂的作用下充分乳化混合；或将油佐剂和木鳖子皂甙溶液乳化混合，然后和抗原乳化混合；或在常规油佐剂疫苗中加入木鳖子皂甙溶液乳化混合。通过以灭活口蹄疫病毒为模式抗原的动物免疫试验证明，本发明的含木鳖子皂甙的油佐剂疫苗比使用单一佐剂的疫苗可以诱导更高的免疫反应强度。文档编号A61K39/39GK101152571SQ20071015601公开日2008年4月2日申请日期2007年10月9日优先权日2007年10月9日发明者肖琛闻,胡松华申请人:浙江大学