专利名称：：壳寡糖在制备治疗非细菌性炎症药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及非细菌性炎症药物，具体地说是壳寡糖在制备治疗非细菌性炎症药物及抑制非细菌性炎症的功能性保健食品中的应用。技术背景一壳寡糖有很广泛的生物活性，如抗真菌[文献1.Hadwiger,L.A.,Ogawa,T.&Kuyama,H.(1994)Chitosanpolymersizeseffectiveininducingphytoalexinaccumulationandfungalsuppressionareverifiedwithsynthesizedoligomers.MolecularPlantandMicrobesInteraction7(4)，531-3.]，促进伤口愈合[文献2.Ueno，H.,Murakami,M"Okum扁，M.,Kadosawa，T.,Uede,T.&Fujinaga,T.(2001)Chitosanacceleratestheproductionofosteopontinfrompolymorphonuclearleukocytes.Biomaterials22(12),1667-73.]，i呆护月干脏[文献3.Yan,Y"Wanshun,L.,Baoqin,H.,Bing,L.&Che匿ei,F.(2006)Protectiveeffectsofchitosanoligosaccharideanditsderivativesagainstcarbontetrachloride-inducedliverdamageinmice.HepatologyResearch35(3),178-84.]，治疗糖尿病[文献4.Lee,H.W.,Park,Y.S.,Choi,J.W.,Yi,S.Y.&Shin,W.S.(2003)Antidiabeticeffectsofchitosanoligosaccharidesinneonatalstreptozotocin-inducednoninsulin-dependentdiabetesmellitusinrats.BiologyandPharmacologyBulletins26(8),1100-3.]，促进一些肿瘤细胞凋亡[文献5.HarishPrashanth,K.V.&Tharanathan,R.N.(2005)Depolymerizedproductsofchitosanaspotentinhibitorsoftumor-inducedangiogenesis.BiochimicaBiophysicaActa1722(1),22-9.]等。壳寡糖能促进静息中性粒细胞产生超氧阴离子，NO;同时可下调由佛波酯PMA激活的中性粒细胞的脱颗粒作用，粘附活性及超氧阴离子的含炎症发生组织会召集大量的中性粒细胞，释放炎症介质来杀伤入侵的细菌，但同时这些炎症介质的释放会对自身机体产生损害。炎症组织的缺氧环境使得中性粒细胞的半衰期大大延长。因此及时的清除炎症型中性粒细胞对炎症的治愈有着重要的意义。而这种清除最有效的途径就是通过吞噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞。因此研究药物对炎症型中性粒细胞的促凋亡作用，对炎症的治疗和缓解有着重要的意义。本发明是在国家科技部"九五"攻关项目的支持下，对壳寡糖在促进炎症型中性粒细胞凋亡上的研究。
发明内容本发明提出了壳寡糖在制备治疗非细菌性炎症药物及抑制非细菌性炎症的功能性保健食品中的应用。经过大量实验发现，聚合度为2-50壳寡糖能刺激体外培养的小鼠腹膜炎中性粒细胞产生超氧阴离子及过氧化氢，促进该细胞的凋亡，而且这种促凋亡作用是通过超氧阴离子的产生来实现的，并且刺激超氧阴离子产生这一功能是磷脂酶D和PI3K依赖的。此外壳寡糖还能降低炎症因子髓过氧化物酶的释放。本发明的技术方案为壳寡糖在制备治疗非细菌性炎症药物中的应用。壳寡糖在制备具有抑制非细菌性炎症的功能性保健食品中的应用。所述壳寡糖的聚合度最好为2-50，乙酰化程度〈5%。所述壳寡糖可与药剂学上可采用的辅料混合形成各种形式的丸剂、散剂、片剂、膏剂、粉剂、针剂、水剂，颗粒剂、胶囊或注射剂。其使用可以采取经口腔和非经口腔的投入方法，非经口腔的投入可以采取皮下和静脉注射，肛肠投入等。注射液的制作可以任意选用生理盐水，葡萄糖，安定剂，防腐剂，悬浮剂，乳化剂等。所述壳寡糖可以添加到各种食品当中，作为抗炎保健食品；食品的形态可以是液体的比如像清凉饮料，乳酸饮料，调味品，汤类，固体的奶酪，火腿，点心等。所述壳寡糖通过促炎症型中性粒细胞的凋亡来缓解非细菌性炎症，壳寡糖对中性粒细胞的促凋亡作用及其作用机制，包括如下方面1)壳寡糖可以促进体外培养的炎症型中性粒细胞的凋亡；当壳寡糖的浓度范围为10-10xl0Vg/ml时，具有显著促进炎症型中性粒细胞凋亡的作用。2)壳寡糖促进体外培养的炎症型中性粒细胞凋亡是通过超氧阴离子的产生来实现的；加入超氧阴离子的清除剂超氧化物歧化酶后，流式细胞仪检测聚合度为2-50的壳寡糖引起的体外培养的炎症型中性粒细胞的凋亡消失，证明壳寡糖的促凋亡作用是通过超氧阴离子的产生来实现的。3)磷脂酶D和PI3K参与了壳寡糖刺激中性粒细胞产生超氧阴离子的过程；利用磷脂酶D以及PI3K的抑制剂正丁醇和渥曼青霉素，证实了壳寡糖刺激小鼠炎症型的中性粒细胞产生超氧阴离子是依赖这两种的激活的。4)壳寡糖能降低炎症型中性粒细胞髓过氧化物酶的释放。5)壳寡糖刺激小鼠炎症型中性粒细胞过氧化氢产生。本发明具有如下优点1.原料价廉，已产业化。本发明的原料来源易得，壳聚糖的酶解方法操作简单，成本低。2.应用效果好。聚合度为2-50的壳寡糖，具有很好的促进炎症型中性粒细胞凋亡的作用。因此可以将壳寡糖作为抗炎症的治疗药物，或者作为食品添加剂加工制成保健品。3.具体操作时，可采用来源于虾蟹壳的几丁质，采用生物酶解法得到壳寡糖，安全性高，无毒副性，可作为抗炎药物，或者作为食品添加剂加工制成保健品长期使用，不产生耐药性。具体实施例方式下面通过实例对本发明的技术进一步说明小鼠炎症型中性粒细胞的分离小鼠在腹腔注射含质量浓度1%糖原的生理盐水4小时后，颈椎脱臼处死，取腹水，与PH7.4的PBS1:l混溶，离心，400g,10min,取沉淀细胞，90%以上为炎症型的中性粒细胞。小鼠中性粒细胞的培养条件为在RPMI1640培养液中添加体积浓度10%小牛血清、100u/ml青霉素、100/ml链霉素；37°C，通入(1)2体积含量为5%的空气培养.实施例1聚合度为2-10的壳寡糖对小鼠炎症型中性粒细胞的促凋亡作用体外培养的炎症型中性粒细胞(l5xl06/ml)与壳寡糖同时加入到RPMI1640培养液中，作用24或40小时后，PBS(120mMNaCl，5mMKC1，1.7mMKH2P04,8.3mMNa2HP04)洗涤，400g,5min离心，固定液(含质量浓度lc/。多聚甲醛的PBS)固定，细胞用PI染色，流式细胞仪检测。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2聚合度为2-10的壳寡糖依赖超氧阴离子对小鼠炎症型中性粒细胞的促凋亡作用细胞(l5xl0Vml)分为三组，对照，10-10Vg/ml壳寡糖处理组，10-105pg/ml壳寡糖与10-200U/mlSOD(超氧阴离子的清除剂)共处理组，于与RPMI1640培养液中培养16小时后，PBS洗涤，400g,5min离心，固定液固定，用PI染色，然后用流式细胞仪检测细胞的凋亡百分率。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>以上结果证明壳寡糖对小鼠炎症型中性粒细胞的促凋亡作用是通过超氧阴离子的产生来实现的。实施例3聚合度为2-10的壳寡糖剌激中性粒细胞产生超氧阴离子超氧阴离子的检测采用细胞色素C还原的方法。细胞与壳寡糖液混合，细胞用壳寡糖刺激30min后，PBS洗涤，400g,5min离心后，沉淀细胞用1m1KRG(120mMNaCl，5mMKC1,1.7mMKH2P04,8.3mMNa2HP04,lmMCaC12,1.5mMMgCL2，10mM葡萄糖)缓冲液重悬，质量体积比5%金胞色素C(溶在KRG中)37。C预热3min，550nm下检测吸光值。渥曼青霉素是PI3K的抑制剂，通过它的使用可以检测此酶在超氧阴离子产生中是否参与。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例4磷脂酶D在壳寡糖促进中性粒细胞产生超氧阴离子中的作用实验方法同实施例3，l-butanol(正丁醇)是磷脂酶D的抑制剂，通过正丁醇的使用可以检测PLD在超氧阴离子产生中的作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>以上结果说明，壳寡糖促进超氧阴离子产生是依赖磷脂酶D的。实施例5聚合度为2-10的壳寡糖能刺激体外培养的小鼠腹膜炎中性粒细胞产生过氧化氢。炎症型中性粒细胞与壳寡糖在PBS的缓冲体系中共孵育32小时，荧光染料DHR123标记，流式细胞仪检测D服123阳性的细胞即为产生过氧化氢的细胞<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例6聚合度为2-10的壳寡糖对小鼠炎症型中性粒细胞髓过氧化物酶释放的抑制作用髓过氧化物酶的释放通过酶与显色底物的反应来检测，在PBS的缓冲后，加入0.02%的TMB底物(过氧化物酶底物)，37°。反应10min。经过髓过氧化物酶的作用后由TMB由黄色变为蓝绿色，酶标仪检测450nm处的吸光值，可间接反应髓过氧化物酶的释放。组别浓度A450nm忌、単-1.828±0.22对照1.582±0.122壳寡糖组10-105|ig/ml1.3828±0.03结果证明壳寡糖还能减少炎症因子髓过氧化物酶的释放。实施例7聚合度为2-30的壳寡糖，浓度为10-l(TVg/ml对小鼠炎症型中性粒细胞的促凋亡作用。实验操作同实施例l。处理浓度时间凋亡百分率(°/。)对照16h10.78壳寡糖10-10Vg/ml16h18.21对照32h34.89壳寡糖10-l。Vg/ml32h53.13实施例8聚合度为2-30的壳寡糖，浓度为10-104|ig/ml对小鼠炎症型中性粒细胞的促超氧阴离子产生作用,氧阴离子的产生用NBT(硝基四氮唑蓝)还原的方法来检测，在PBS的缓冲体系中，壳寡糖处理细胞30min后，加入1。/。的NBT，37。C反应30min。NBT经还原后由黄色变为蓝色，在570nm处检测吸光度，间接反应超氧阴离子产生的量处理浓度A570nm对照0.174±0.009壳寡糖10-10Vg/ml0.226±0.01权利要求1.壳寡糖在制备治疗非细菌性炎症药物中的应用。2.按照权利要求l所述应用，其特征在于壳寡糖在制备具有抑制非细菌性炎症的功能性保健食品中的应用。3.按照权利要求l所述的应用，其特征在于所述壳寡糖的聚合度为2-50，乙酰化程度〈5%。4.按照权利要求l所述的应用，其特征在于所述壳寡糖可与药剂学上可采用的辅料混合形成各种形式的丸剂、散剂、片剂、膏剂、粉剂、针剂、水剂，颗粒剂、胶囊或注射剂。5.按照权利要求l所述的应用，其特征在于所述壳寡糖通过促炎症型中性粒细胞的凋亡来缓解非细菌性炎症。全文摘要本发明涉及壳寡糖在制备治疗非细菌性炎症药物中的应用，本发明应用现代分离纯化技术对壳聚糖进行酶解，获得聚合度为2-50之间的壳寡糖，并对小鼠炎症型中性粒细胞的作用进行深入研究，结果表明，壳寡糖具有很好的促进炎症型中性粒细胞凋亡的作用。因此可以将壳寡糖作为抗炎症的治疗药物，或者作为食品添加剂加工制成保健品。文档编号A61P29/00GK101416980SQ200710157669公开日2009年4月29日申请日期2007年10月24日优先权日2007年10月24日发明者曲天明,李曙光,杜昱光,白雪芳,窦江丽,谭成玉申请人:中国科学院大连化学物理研究所