专利名称：一种脯氨酸异构酶在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于蛋白工程和医药领域，涉及一种脯氨酸异构酶的新用途。
背景技术：
Pinl是一类广谱表达的，具有脯氨酸异构酶活性的小分子，隶属于parvulin 亚家族，这个亚家族的成员和cyclophilin， FKBP亚家族的蛋白一起组成了脯氨 酸顺反异构酶家族。Pinl通过其氨基末端的WW结构域特异的结合被磷酸化的 Ser/Thr-Pro基序，而通过羧基末端的活性结构域催化磷酸化蛋白构象在这一位点 上发生顺反变化，进而改变蛋白整体构象，弓j发蛋白功能的转变[X.Z. Zhou,P丄 Lu, G. Wulf, K.P. Lu， Phosphorylation dependent prolyl isomerization: a novel signaling regulatory mechanism[J], Cell Mol. Life Sci. 1999, 56: 788—806.〗。能够被 Pinl催化发生构象变化的蛋白大部分是有丝分裂相关的蛋白，构象上的变化常常 会改变这类蛋白与其他蛋白之间的相互作用关系，引起细胞内定位的变化，以及 促使蛋白在细胞中丰度的改变等，进而影响细胞有丝分裂的进程[K.P. Lu, Y.C. Liou, X.Z. Zhou, Pinning down the proline-directed phosphorylation signaling [J], Trends Cell Biol. 2002, 12: 164-172.]。运用突变，缺失，RNA干扰，构建 dominant-negative突变株等一列方法抑制Pinl功能会引起肿瘤细胞有丝分裂进 程的阻滞以及细胞的凋亡，而过量的表达Pinl使得细胞无法正常的进入有丝分 裂期，表明了 Pinl是一个参与调节细胞有丝分裂过程的重要因子。
肝癌是世界范围内，尤其是在亚洲和非洲国家最常见且死亡率较高的恶性 肿瘤之一，我国每年新发肝癌患者在IO万以上，死亡率高，生存期短，严重威 胁人民健康。肝癌临床上手术切除率低，对放、化疗敏感性差，转移情况普遍， 预后极差[吴孟超.原发性肝癌的诊断和治疗进展[J].中华外科杂志， 1998,36(9):515 — 516; J丄.Murray, A.D. Lopez, Mortality by cause for eight regions
of the world: globalburden of disease study [J]， Lancet 1997, 349: 1269-1276.]。因此
研究抑制肝癌的药剂有着非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供脯氨酸异构酶pinl (NCBI登录号为AAX41625)的 一种新用途。
本发明提供了脯氨酸异构酶pinl在制备抗肿瘤药物中的应用。 本发明提供了脯氨酸异构酶Pinl在制备抗肝癌药物中的应用。 本发明中，该药物是片剂或者针剂。 本发明中，脯氨酸异构酶pinl是药靶。
本发明还提供了一种用脯氨酸异构酶Pinl筛选抗肿瘤药剂的方法，该
方法包括以下步骤
(1 ) 确定脯氨酸异构酶pinl的蛋白模拟结构；
(2 ) 模拟筛选与脯氨酸异构酶pinl活性部位相结合的物质；
(3 ) 在稳定表达脯氨酸异构酶pinl的细胞中加入(2 )所得到的
候选物质，并检测pinl的蛋白活性；
(4 ) 统计分析加入候选物质与pinl蛋白活性变化的对应关系； (5 ) 将使pinl蛋白活性变化显著的候选物质作为候选抗肿瘤药剂。
上述方法中，(3)所述的候选物质是核酸、蛋白或者小分子化合物。 上述方法中，(4)所述的蛋白活性变化是指蛋白活性降低。 上述方法中，(5)所指的变化显著是指加入候选物质后，pinl蛋白活 性变化具备统计学中的P〉0. 1。
上述方法中，确定蛋白模拟结构、模拟筛选与脯氨酸异构酶Pinl活性 部位相结合的物质都可以通过计算机系统完成。例如，对已有脯氨酸异构酶 家族成员的模拟结构根据Pinl的氨基酸序列进行修饰，从而得到Pinl的蛋 白模拟结构。确定了 pinl的蛋白模拟结构的模拟结构后，再用类似方法得 到候选物质的模拟结构，然后判断两者是否有结合的可能性，尤其是在pinl
的蛋白模拟结构的内部活性部位。也可以直接用pinl的蛋白模拟结构筛选 数据库中候选物质，以便从大批量的物质中搜索可与脯氨酸异构酶Pinl相 互作用的物质。
在获得了脯氨酸异构酶pinl的基本信息后，就可以确定筛选测试其蛋 白活性的方法，例如，通过抗体结合量、底物的结合数量等进行测试。还可 以配合各种显色剂，例如荧光蛋白、辣根过氧化酶等，以便更直接的观察和 便于检测。
此时，可以通过计算机进一步模拟筛选抑制脯氨酸异构酶pinl的物质， 也可以通过生化手段筛选。通过生物化学方法筛选候选物质时，可以在适当 的缓冲液中加入脯氨酸异构酶pinl、候选物质和蛋白活性检测试剂，记录候 选物质对pinl活性的影响。也可以利用表达pinl的蛋白作为反应载体。蛋 白活性检测试剂可以是通过蛋白抗体、显色剂等组合而成。显色剂可以是液 体、试纸等形式，显色可以是颜色或者荧光变化等。蛋白活性检测试剂一方 面不影响脯氨酸异构酶pinl与候选物质的结合，另一方面可以标记脯氨酸异 构酶pinl的数量或者标记脯氨酸异构酶pinl底物。
通过上述方法获得的候选抗肿瘤物质还可以在动物实验水平进行检验。 例如，对长有肿瘤的小鼠施用候选抗肿瘤物质，与相同培养条件下生长的小 鼠相比，如果肿瘤生长受到明显抑制，则所施用的抗肿瘤物质可以作为抗肿 瘤抑制剂。
举例而言，本发明的pinl可以与Survivin蛋白结合并增强Survivin蛋白 的激酶活性，如果某物质加入含有适当比例的pinl和Survivin蛋白的体系 中，而且能够抑制CDK4的激酶活性，那么该物质可以作为抗肿瘤药剂的候选 物质。
本发明还提供了一种筛选抗肿瘤药剂的试剂盒，该试剂盒包括脯氨酸异
构酶pinl和蛋白活性检测试剂。
本发明中，试剂盒中脯氨酸异构酶pinl可以固定在芯片上。 本发明的试剂盒中，除了脯氨酸异构酶pinl和蛋白活性检测试剂外，
还可以包括常规缓冲液、反应容器和移液器等。蛋白活性检测试剂可以是通
过蛋白抗体、显色剂等组合而成。显色剂可以是液体、试纸等形式，显色可 以是颜色或者荧光变化等。蛋白活性检测试剂一方面不影响脯氨酸异构酶 pinl与候选物质的结合，另一方面可以标记脯氨酸异构酶pinl的数量或者标 记脯氨酸异构酶pinl底物。
本发明的试剂盒可以分为两类 一种是芯片形式，另一种是单个检测形 式。单个检测形式试剂盒中，各种试剂分装于不同容器，使用时按照说明书 顺序反应。芯片形式中，若干脯氨酸异构酶pinl被固定于芯片上；使用时只 需在每份蛋白上加入候选物质，收集蛋白活性检测试剂变化数据，分析，加 入后使pinl蛋白活性变化具备统计学中的p>0. 1的物质即可以作为候选抗 肿瘤药剂。
本发明提供了脯氨酸异构酶Pinl在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明 的pinl在癌旁组织表达量上调，能促进肿瘤细胞增殖，能促进裸鼠肿瘤生 长，具有促进肿瘤生长的作用，可以作为筛选抑制肿瘤生长物质的靶标。
具体实施例方式
下列实施例中所用材料和试剂有
pMD18-T载体(PROMEGA公司) 大肠杆菌origamiDE3 (Novagen公司) pET32a载体(Novagen公司)
cDNA文库克隆用的人脑和睾丸的cDNA文库(GibcoBRL公司) Long PCR扩增试剂盒(大连TaKaRa公司)
DNA测序试剂盒自动测序采用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction。 (PE公司)
PCR产物纯化试剂盒(Roche产品)
质粒抽提试剂盒(Roche产品)
入DNA Hind III/EcoR I双酶切DNA标准分子量(上海华美生物工程
公司)
DNA连接试剂盒(Promega公司) 凝胶回收纯化试剂盒 (Boehringer公司) TRIZ0L RNA抽提试剂 (GIBC0BRL公司) DEPC (AMRESC0公司)
S叩erscriptTMII反转录酶 (GIBC0BRL公司) Oligo (dT)(Promega公司) 放射性a-32P-dCTP (AMERSHAM公司) 随机引物标记试剂盒(Promega公司) 显影液和定影液(上海冠龙照相器材厂)
异丙基-0-D硫代半乳糖苷(IPTG)(上海华舜生物工程公司) 250bp DNA Ladder标准分子量(上海博彩生物科技有限公司) 4%多聚甲醛(PFA) (Sigma公司) 多聚赖氨酸(华美公司)
山羊血清、羊抗地高辛(Digoxigenin)抗体、NBT/BCIP显色液，10 XDig腿
Labeling Mix (Roche公司)
cA裸小鼠，日龄35 40天，体重18 22 g,雌性，SPF级饲养，自由饮水，随 意进食。由中国科学院上海药物研究所提供，
下列实施例中所用仪器为
PCR扩增仪PTC-150及PTC-200型(美国MJ Research公司)；PE 9600 型(PE公司产品)
TGL-16台式离心机(上海医用仪器厂) M0DEL4001型DNA测序电泳仪(GIBCO BRL公司) MODEL SA型DNA测序电泳槽(GIBCO BRL公司) ABI377型全自动DNA测序仪(PE公司) 紫外检测仪(上海复生公司)
微量加样器1000ul 、 200ul 、 20ul规格各一支(法国Gilson公
凝胶成像装置UVP (上海复日公司)
HZ-C型台式恒温振荡器(江苏太仓科教器材厂)
GDS-800型凝胶成像系统及相应配制扫描仪(Bio-Rad公司)
杂交反应箱(HYBAID公司)
S叩rafuge 22型高速冷冻离心机(德国Heraeus公司) 匀浆器(Glas-Col公司) 紫外分光光度计(HITACHI公司)
AKTA explorer 100低压层析仪(美国Bio-Rad公司) SW-CJ-IFD型净化工作台(江苏太仓科教器材厂) Umi薩eter LB 9507 (Berthold公司)
所用常规试剂配制
5X甲醛凝胶电泳缓冲液将20. 6gM0PS (3- (N-玛琳代)丙磺酸)溶 于800ml经用DEPC处理的50 mmol/L乙酸钠溶液，2 mol/L Na0H调PH至 7.0，加10 ml经DEPC处理的O. 5 mol/L EDTA(PH 8.0)，加DEPC水定容至l L，经0.2 um微孔滤膜过滤灭菌，室温避光保存。
甲醛凝胶加样缓冲液含50%甘油，1 m mol/L EDTA 8.0) ， 0.25% 溴酚蓝，0.25%二甲苯青(灭菌并经DEPC处理)。
Northern(预)杂交液:50%甲酰胺，5XSSPE， 10XDenhardt液，2%SDS, CT DNA(100 ug/ml)。
20XSSC (3 M NaCl， 0. 3 M拧檬酸三钠，PH7.0)
LB液体培养基
Polypepton 10.0 g
Bacto-Yeast Extract 5.0 g
NaCl 10.0 g
加ddH20定容至1000 ml 灭菌条件为121。C，高压湿热灭菌20 min;
实施例一 在肝癌样本组织(由江苏启东肝癌防治研究所提供)中的表达
通过RT-PCR从mRNA水平检验pinl在癌症组织中的表达情况。从mRNA 水平上看Pinl在癌症组织中与癌旁组织比较起来大部分有不同程度的上调。
为了对Pinl基因在肝癌组织中的表达差异进行半定量分析，我们对图 中的电泳条带做扫描定量分析。每一个病理样品得到4个扫描值，即Pinl的 肝癌及癌旁扫描值，0-MG的肝癌及癌旁扫描值。最后我们按照(Pinl肝癌 /e-MG肝癌)/ (Pinl癌旁/e-MG癌旁)的计算公式得到一个反映Pinl基因 表达情况的DR值。我们规定DR值大于l. 5表示该基因上调表达，DR值小于O. 75 表示下调表达，0. 75〈DR<1. 5表示表达无显著变化。结果显示30例(7 5%) 的肝癌组织中比癌旁组织上调表达。
实施例二促进肝癌细胞增长
细胞复苏(1)从液氮罐中取出保存管，直接投入37。 C温水中，并不时 摇动令其尽快融化。(2)从37° C水浴中取出保存管，用吸管吸出细胞悬液，注 入离心管并加入IO倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液 洗一次。(3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37° C培养箱静置培养， 次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代(SK-H印l和H印G2细胞 培养在含10。/。胎牛血清的DMEM高糖培养基中)。
细胞传代培养每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中长至90%汇合 时传代，约每隔2-4天传代-一次。 一瓶传代成三瓶，或一个25 cm2传代于一个 75cm2的培养瓶中。方法(I)用IX磷酸缓冲液洗涤细胞一次。(2)加入2-3ml胰 酶消化液消化，置于37° C培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。 (3)用含10%的小牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶 中，继续培养。
细胞冻存(l)取培养至对数生长期的细胞，加入胰蛋白酶消化，收集于离 心管中并计数，离心。(2)弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养 液(含10°/。 DMS0或甘油)，冻存液中细胞的最终浓度为O. 5- 1X107/ml。用吸管 轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌保存管中，每管加l -1.5ml。 (3)将保存 管放入冻存盒置-70° C速冻，5小时后移入液氮罐中保存。
细胞瞬时转染转染前l天，细胞以4-8X 104/2X105 cells的密度接种
在24孔/6孔板中，第二天运用LIP0FECTIN转染方法将O. 5Pg/1^质粒转染入换
液后的细胞(具体转染步骤参照转染试剂盒所附说明)。转染时使用无血清培养 基，转染5小时候换成正常含10%小牛/胎牛血清的培养基继续培养48-72小时。 在96wel1细胞培养皿内种入l X 103 cells/well的SK-H印1细胞，并且按照 4.9的方法分别用LV-CYPJ-RNAi和LV-non-silencing病毒对细胞进行转染。对 照细胞中不加入慢病毒，用等量体积的PBS处理。
%小时后，用MTS试剂盒测定细胞存活率，测试方法为将细胞用无血清 培养基洗一遍，按照100W/well的量加入预先配制好的MTS显色溶液(10ml无 血清培养基中加入2 ml溶液1和100W溶液2，充分混匀)。将一个没有细胞的 孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继续培养 2 4小时，然后用酶标仪读取光吸收值(参考波长630-700 nm，测定波长490 nm)， 计算细胞存活率。
当测定Pinl对各种肝癌细胞生长的作用时，在96孔细胞培养皿内种入l X 103 cells/well的各种肝癌细胞株，包括H1299细胞，L02， H1299， Hep3B， HepG2 (均来源于ATCC) 。 37°C C02培养24 h后加入不同浓度的CsA，对照 孔加入等体积的PBS。 72小时后测定各个孔的光吸收，以测定孔光吸收值/对照 孔光吸收值作为细胞存活率的数值。
结果显示，Pinl能明显促进上述肿瘤细胞生长。
实施例三裸鼠致瘤实验
按前述方法大量培养检测过的稳定表达细胞株细胞，胰酶消化，离心收获所 培养的细胞，用PBS洗涤后计数,重悬于PBS,将两种细胞用一次性注射器对裸鼠 进行皮下注射，与对照分别注射于裸鼠左右两侧，每组注射^5只，(雌性，30-40 天)，每只裸鼠的细胞注射量为200W,约含2X106，一周后肿瘤长出，40天后处死 裸鼠剥离其皮下肿瘤,称量肿瘤并摄影。
结果显示，稳定表达Pinl的细胞株和对照细胞株都能使裸鼠长瘤，但 是，稳定表达Pinl的细胞株注射的裸鼠所得到的肿瘤平均瘤体体积大于对 照组。
权利要求
1.脯氨酸异构酶pin1在制备抗肿瘤药物中的应用。
2. 脯氨酸异构酶pinl在制备抗肝癌药物中的应用。
3. 如权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，该药物是片剂或者 针剂。
4. 如权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，脯氨酸异构酶pinl 是药靶。
5. —种用脯氨酸异构酶pinl筛选抗肿瘤药剂的方法，其特征在于，该方 法包括以下步骤-(1 )确定脯氨酸异构酶pinl的蛋白模拟结构；(2 )模拟筛选与脯氨酸异构酶pinl活性部位相结合的物质；(3 )在稳定表达脯氨酸异构酶pinl的细胞中加入(2 )中得到的候选物质，并检测pinl的蛋白活性； (4 )统计分析加入候选物质与pinl蛋白活性变化的对应关系； (5 )将使pinl蛋白活性变化显著的候选物质作为候选抗肿瘤药剂。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，(3)中所述的候选物质是核酸、蛋白或者小分子化合物。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，(4)中所述的蛋白活性变化 是蛋白活性降低。
8. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，(5)中所指的变化显著是加 入候选物质后，pinl蛋白活性变化具备统计学中的p〉0. 1。
9. 一种筛选抗肿瘤药剂的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括脯氨酸异 构酶pinl和蛋白活性检测试剂。
10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中脯氨酸异构酶 pinl固定在芯片上或者固定在硝酸纤维膜上。
全文摘要
本发明属于蛋白工程和医药领域，涉及一种脯氨酸异构酶的新用途。Pin1是一类广谱表达的，具有脯氨酸异构酶活性的小分子，隶属于parvulin亚家族。本发明提供了脯氨酸异构酶pin1在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的pin1在癌旁组织表达量上调，能促进肿瘤细胞增殖，能促进裸鼠肿瘤生长，具有促进肿瘤生长的作用，可以作为筛选抑制肿瘤生长物质的靶标。
文档编号A61K38/43GK101181634SQ200710171269
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月29日 优先权日2007年11月29日
发明者龙 余, 琳 张 申请人:复旦大学