L－脯氨酸4位羟基化酶的制备方法

专利名称：L－脯氨酸4位羟基化酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及工业上制造作为药品合成原料或食品添加剂的有用的反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法以及用于该方法的有用的新的L-脯氨酸4位羟基化酶。
使用微生物制造反式-4-羟基-L-脯氨酸地方法已经公知的有
1)使用属于大肠杆菌属(Escherichia)的微生物，从4-羟基-2-酮戊二酸制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法(特开平3-266995)，
2)使用霉菌类直接发酵生产的方法(欧洲专利申请EP0547898A2)
3)使用属于链霉菌属的微生物，从L-脯氨酸制造的方法〔Journal of Biological Chemistry(J.Biol.Chem)，254卷，6684-6690页(1979年)、Biochemical and Biophysical ResearchCommunication(Biochem.Biophys.Res.Comm.)，120卷，45-51页(1984年)〕。
上述(1)的方法中，4-羟基-2-酮戊二酸昂贵而且难以得到，生产率低，(2)的方法生产率也低，而(3)的方法中，涉及制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的酶的活性极其微弱，反应生成物是微量的，必须用放射性化合物才能检测出来，所以上述任何一种方法用在工业生产上都是困难的。
对于催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸羟基化反应的酶，在不离析出的状态下，使用来自属于指孢囊菌属或者Amgcolatopsis属的微生物作为催化从L-脯氨酸向反式-4-羟基-L-脯氨酸羟基化反应的酶源，制备 反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，目前尚未为人知。另外，曾有报导过从上述的链霉菌属的微生物精制L-脯氨酸4位羟基化酶〔(TetrahedronLetters)，34卷，7489-7492页(1993年)〕，但对于精制酶的方法，被精制酶的纯度以及酶的理化性质等均没有记载。总之，将游离的L-脯氨酸羟基化，催化生成反式-4-羟基-L-脯氨酸反应的L-脯氨酸4位羟基化酶，在此之前没有分离出，并且是理化性质不明确的酶。
以往的反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法有(1)原料昂贵，(2)反应工序多，(3)分离精制工序复杂，(4)生产率低等缺点，作为工业上的制造方法未必是满意的，所以需要一种在工业生产上有利的反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法。
本发明的目的在于提供一种利用发酵法将由糖源工业规模地生产出的L-脯氨酸作为原料，通过直接用微生物或酶进行羟基化处理后，工业规模地且方便地制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法及用于该方法的L-脯氨酸4位羟基化酶。
按照本发明，可以提供反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备方法及L-脯氨酸4位羟基化酶，其特征是将来自指孢囊菌属或Amycolatopsis属的微生物且能在L-脯氨酸的4位上催化羟基化反应的酶源、二价铁离子、2-酮戊二酸及L-脯氨酸存在于水溶性介质中，使得L-脯氨酸转化成反式-4-羟基-L-脯氨酸，而后从该水溶性介质中提取反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法以及L-脯氨酸4位羟基化酶。
本发明中所使用的酶源，只要是来自属于指孢囊菌(Dactylosporangium)属或Amycolatopsis属的微生物，且具有能羟基化L-脯氨酸，生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的活性，任何的微生物培养物、菌体、菌体处理物、精制酶或粗酶都可以。作为微生物的合适例子可举出指孢囊菌、(Dactylopsorangium sp.)RH1、Amycolattopsis菌(Amycolatopsis sp.)RH2或这些菌株的继代培养物、突变体或诱变体等。
RH1将是从东京都的树木、RH2株从埼玉县的土壤中由本发明者所分离出的微生物。以下说明RH1及RH2的菌学性质。
1.形态的性质
RH1及RH2在各种培养基上，在28℃下培养14天时的形态性质，表示在表1中
表1
形态的性质
2.培养的性质
RH1株在一般使用的合成及天然培养基上显示了普通程度或旺盛的生长。基生菌丝显示橙色。由于培养基的不同，也可能产生黄土色或淡红色的可溶性色素。
RH2株在一般使用的合成及天然培养基上显示了普通程度或旺盛的生长。基生菌丝显示淡黄色或褐色，气菌丝显示白色或灰色。由于培养基的不同，也可能产生褐色的可溶性色素。
RH1株及RH2株在各种培养基上，28℃下培养14天时的生长及颜色特征归纳在表2-(1)及表2-(2)中。另外颜色的表示是按Color Harmony Manual(Container Corporation ofAmerica)的颜色分类进行的。
表2-(1)
培养的性质
表2-(2)
培养的性质
3.生理学性质
RH1株及RH2株的生理学性质归纳在表3中。生长温度范围是用液体振盗培养7天后的温度，表中的其他项目是在28℃，2-3周后的结果。
表3
生理学的性质*基础培养基使用了布里特哈姆·戈特利布琼脂培养基。+表示可利用，-表示不可利用，而(+)表示怀疑是否可利用。
*基础培养基使用了布里特哈姆·戈特利布琼脂培养基。+表示可利用，-表示不可利用，而(+)表示怀疑是否可利用。
4.化学分类学的性质
RH1株及RH2株的化学分类学性质如表4所示。
表4
化学分类学的性质
以上，从RH1株在形态上不形成气菌丝、在基生菌丝上形成棒状的胞子囊，胞子囊中含有2-4个具有运动性的胞子，含在细胞壁中的二氨基庚二酸，化学分类上是3-羟基-二氨基庚二酸，作为全菌体加水分解物中的还原糖，含有阿拉伯糖及木糖这些事实，RH1株被分类在放线菌中的指孢囊菌属(Dactylosporangium)。
从RH2株，在形态上形成气菌丝；气菌丝和基生菌丝分断；作为细胞壁的二氨基庚二酸，化学分类上是间位(meso)庚二酸，但作为还原糖含有半乳糖及微量阿拉伯糖；作为全菌体加水分解物中的还原糖，含有阿拉伯糖及半乳糖；作为菌体成分不含有霉菌酸；作为磷脂质含有磷脂酰乙醇胺，但不含有磷脂酰胆碱及未知的带有葡糖胺的磷脂质；甲基苯醌类主要成分是MK-9(H4)，从以上事实RH2株被分类在放线菌中的Amycolatopsis等。
RH1株命名为指孢囊菌株(Dactylosporangium sp.)RH1，RH2株命名为Amycolatopsis菌株(Amycolatopsis sp.)RH2，根据布达佩斯条约，RH1株于平成5年9月1日寄存到工业技术院生物工程工业技术研究所，寄存号为FERM BP-4400，同样RH2株于平成6年2月22日也寄存到上述机构，寄存号为FERM BP-4581。
这些培养微生物的培养基，只要是含有微生物可利用的碳源、氮源、无机盐类等，并能高效地培养具有催化活性的微生物，即在羟基化L-脯氨酸后，可以催化生成反式-4-羟基-L-脯氨酸反应的活性，无论是天然培养基，合成培养基都可以。
作为碳源，可以培养各种微生物的就可以，如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖类的糖蜜、淀粉或者淀粉加水分解物等的碳水化合物、醋酸、丙酸等的有机酸、乙醇、丙醇等的醇类。
作为氮源可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等的各种无机酸和有机酸铵盐、其他的含氮化合物以及胨、肉汁、酵母浸汁、玉米粉浸汁、酪蛋白加水分解物、大豆渣子及大豆渣子加水分解物、各种发酵菌体及其消化物等。
作为无机物，可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸酮、碳酸钙等。
培养是在振盗培养或在深部道气搅拌培养等的好氧条件下进行。培养的温度是15-37℃，培养时间通常是16-96小时。
培养中的pH值保持在5.0-9.0。pH值的调节，可用无机或者有机的酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行调节。
作为菌体处理物可举出菌体的干燥物、冷冻干燥物、表面活性剂处理物、酶处理物、超声波处理物、机械的磨碎处理物、机械压力处理物、溶剂处理物、菌体的蛋白分离物、菌体及菌体处理物的固定化物等。
另外，作为酶源，可以使用从该菌体提取后得到的具有催化从L-脯氨酸向顺式-3-羟基-L-脯氨酸羟基化反应活性的酶、这些酶的精制品、固定化物等。作为具有该活性的酶源可举出有下述(1)-(10)理化性质的新的L-脯氨酸4位羟基化酶。
(1)作用及基质特异性
在2-酮戊二酸及2价铁离子的存在下，与游离的L-脯氨酸作用可生成反式-4-羟基-L-脯氨酸。
(2)最佳pH值
在30℃下，进行20分钟反应，具有pH6.0-7.0的最佳pH值。
(3)pH值的稳定性。
在4℃，进行24小时处理，在pH6.5-10.0的范围内保持稳定。
(4)最佳温度
在pH6.5下，反应15分钟，具有30-40℃的最佳温度。
(5)温度的稳定性
在pH7.5、50℃下处理30分钟后，失活。
(6)抑制剂
用Zn++、及Cu++的金属离子及乙二胺四乙酸(EDTA)可进行抑制。
(7)活化
活化时，不需要辅酶，向反应液中添加L-抗坏血酸可以促进反应。
(8)Km值
在80mM的2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液(pH6.5)中含有4mM L-抗坏血酸、2mM硫酸亚铁及酶标样的反应液中测定，对于L-脯氨酸的Km值是0.27mM，对于2-酮戊二酸的Km值是0.55。
(9)分子量
用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳法测定，分子量是32000±5000道尔顿，用凝胶过滤法测定分子量是43800±5000道尔顿。
(10)N末端氨基酸序列
具有用序列号1表示的N末端氨基酸序列(N末端)1Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr
11Arg Glu Ala Gly Tyr Leu Leu Ile Glu Asp
21Gly Leu Gly Pro Arg Arg Val
(序列 号1)
这些酶源的反应液中的酶活性量是根据所用的基质的量等确定的，一般是1.0-10,000,000U/l、优选的是1000-2,000,000U/l。
用于反应的L-脯氨酸的浓度是1mM-2M。
反应时，需要二价铁离子，通常使用1-100mM。作为使用的二价铁离子，只要所含的二价铁不抑制反应，使用任何种类都可以。例如可举出除了硫酸亚铁等的硫化物、氯化亚铁等的氯化物，碳酸亚铁等之外，柠檬酸盐、乳酸盐、富马酸盐等的有机酸盐。
另外，在反应中需要的2-酮戊二酸，可以向反应液中添加2-酮戊二酸或者使用通过所用菌体及菌体处理物的代谢活性可转换成2-酮戊二酸的化合物。这样的化合物可举出葡萄糖类的糖质、谷氨酸、琥珀酸等。这些化合物可单独使用，也可数种并用。
作为水溶性介质，可举出水、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、三羟甲基氨基甲烷等缓冲液(TRIS)、甲醇、乙醇等的醇类、醋酸乙酯等的酯类、丙酮等的酮类、乙酰胺等的酰胺类等。
反应可以在具有羟基化L-脯氨酸后，催化生成反式-4-羟基-L-脯氨酸反应活性的上述微生物培养物中进行，也可以在从该培养物中分离出的菌体、该菌体处理物或者精制酶和粗酶的水溶性介质中进行。
反应通常在温度15-50℃，pH6.0-9.0下进行1-96小时。必要时，在菌体处理或反应时添加表面活性剂和有机溶剂。
作为表面活性剂可举出聚氧乙烯·硬脂酰胺(如奈明(ナィミ-ン)S-215、日本油脂社制等)、十六烷基三甲基铵·溴化物、阳离子FB、阳离子F2-40E等的阳离子性表面活性剂、油酰胺硫酸钠、NurexT AB、腊披索尔80等的阴离子表面活性剂、聚氧乙烯山梨糖醇酐·单硬脂酸酯(如，非离子ST 221)等两性表面活性剂、其他叔胺PB、六癸基二甲胺等，只要是促进反应，任何都可以使用。使用的浓度通常为0.1-50mg/ml，优选的是1-20mg/ml的浓度。
作为有机溶剂可使用甲苯、二甲苯、脂肪族醇、苯、醋酸乙酯等。通常使用量为0.1-50μl/ml，优选的是1-20μl/ml的浓度。
从水溶性介质中回收反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法是使用离子交换树脂的柱色谱法或结晶析出法等通常的分离方法。回收了的反式-4-羟基-L-脯氨酸，可用13C-NMR谱、1H-NMR谱、质谱、比旋光度等的通常分析手段确认其结构。
以下，说明本发明的L-脯氨酸4位羟基化酶的制取方法。
该酶的制取方法是首先培养具有生产L-脯氨酸4位羟基化酶能力的微生物，在培养物中，生成积蓄了L-脯氨酸4位羟基化酶，从该培养物中提取L-脯氨酸4位羟基化酶。
只要是具有生产L-脯氨酸4位羟基化酶能力的微生物，无论是野生株、或其继代培养物、突变体、诱变体等任何一种微生物都可以用。适合的例子可举出指孢菌属(Dactylosporangium)的，且能生产L-脯氨酸4位羟基化酶的微生物。具体的是上述的指孢囊菌株(Dactylosporangium sp.)RH1(FERM BP-4400)，或者这些菌株的继代培养物、突变体、诱变体等。
培养这些微生物的培养基，只要含有微生物可利用的碳源、氮源、无机盐类等，并且有效地培养具有生成L-脯氨酸4位羟基化酶能力的微生物，无论是天然培养基，合成培养基都可使用。
作为碳源，只要各种微生物可以利用的碳源都可以，如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖类的糖蜜、淀粉或者淀粉加水分解物等的碳水化合物、醋酸、丙酸等的有机酸、乙醇、丙醇等的醇类。
作为氮源可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等的各种无机酸和有机酸的铵盐、其他的含氮化合物、以及胨、肉浸汁、酵母浸汁、玉米粉浸汁(コ-ンスチ-プリカ-)、酪蛋白水解物、大豆渣子及大豆渣子水解物、各种发酵菌体及其消化物等。
作为无机物，可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸酮、碳酸钙等。
培养是在振荡培养或在深部通气搅拌培养等的好氧条件下进行。培养的温度是15-37℃，培养时间通常是16-96小时。
培养中的pH值保持在5.0-9.0。pH值的调节，可用无机或者有机的酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、铵等进行调节。培养时，根据需要，也可以添加L-脯氨酸。
在这样培养得到的菌体中是否生成了L-脯氨酸4位羟基化酶，可通过向培养物中或在含有该菌体或菌体处理物的适合于酶反应的水性介质中加入L-脯氨酸、二价铁离子及2-酮戊二酸，进而根据需要时，添加表面活性剂和有机溶剂观察是否使L-脯氨酸转换成反式-4-羟基-L-脯氨酸加以确定。
用此反应来确认反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成，确认在菌体中生成的L-脯氨酸4位羟基化酶的活性，可用以下的方法测定。酶的活性，可用在下述条件下，把1分钟内生成1n mol的反式-4-羟基-L-脯氨酸的活性作为1个单位(U)来表示。
在含有4mM L-脯氨酸、8mM 2-酮戊二酸、2mM硫酸亚铁及4mM L-抗坏血酸的80mM的MES缓冲液(pH6.5)中，添加酶标样，合计250μl，在30℃下反应20分钟。在100℃下，加热反应液2分钟，停止反应后，用高效液相色谱定量在反应液中生成的反式-4-羟基-L-脯氨酸。
定量时，只要是可以定量反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，采用任何的方法都可以。例如，可举出使用高效液相色谱的后置柱衍生物化法或者先将反应液中的目的化合物NBD衍生物化，而后将其加在使用高效液相色谱的逆相色谱上，分离NBD衍生物后，用其荧光(激励波长503nm、荧光波长541nm)定量的方法(前置柱衍生物化法)等。另外，用前置柱法的检测可按照William J.Lindblad and Robert F.Diegelmann、Analytical Biochemistry，138卷，390-395页，(1984年)上的内容进行。
从培养液中离析精制酶时，可采用通常的酶的离析、精制法。例如，离心分离营养液，集菌充分洗净后，通过超声波破碎器和法式挤压机、曼特高林机(マントン·ガウリン)匀浆器、动力磨等机械破碎菌体，得到无细胞提取液。将得到的离心沉淀后的上清液，通过进行如用硫铵等的盐析、DEAE(二乙胺乙基)-琼脂糖等阴离子交换色谱层析、丁基纤维素、苯基纤维素等疏水性的色谱层析、红琼脂糖等色素亲和性色谱、使用分子筛的凝胶过滤法、等电点电泳等的电泳法等，可得到精制酶制品。得到的酶制品的理化特性，可用通常酶学的办法鉴定。
用这种方法得到的L-脯氨酸4位羟基化有下述(1)-(10)的理化学性质。
(1)作用及基质特异性
在2-酮戊二酸及2价铁离子的存在下，与游离的L-脯氨酸作用后可生成反式-4-羟基-L-脯氨酸。
(2)最佳pH值
在上述L-脯氨酸4位羟基化酶活性测定法中，pH3.5-5.5时用醋酸钠缓冲液、pH5.5-6.5时用MES缓冲液、pH7.0-7.5时，用TES缓冲液〔N-tris(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸〕、pH8.0-9.0时，用TAPS缓冲液〔N-tris(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸〕、pH9.5-11.0时，用CAPSO缓冲液置换反应液中的缓冲液成分，其结果是最佳pH值是pH6.0-7.0。
(3)pH值稳定性
将本发明的酶在50mM缓冲液〔pH3.5-5.5时，用醋酸缓冲液，pH5.5-6.5时，用MES缓冲液，pH7.0-7.5时，用TES缓冲液，pH8.0-9.0时，用TAPS缓冲液，pH9.5-11.0时，用CAPSO缓冲液〕中，在2mM二硫苏糖醇(DTT)及20％(V/V)甘油存在下，于4℃保温24小时。测定保温后的活性。在pH6.5-10.0范围内保持的酶具有保持前活性的90％以上的活性，pH在6.5-10.0范围内酶的活性保持稳定。
(4)最佳温度
在上述L-脯氨酸4位羟基化酶活性测定方法中，改变各种温度，测定活性的结果，pH为6.5，反应15分钟，在30-40℃为最佳温度。
(5)温度的稳定性
本发明的酶在pH9.0，50℃下处理30分钟，完全失活。
(6)抑制剂
本发明酶的活性受Zn++及Cu++的金属离子及EDTA的抑制。在上述L-脯氨酸4位羟基化酶活性测定中，各别加入1mM的Cu++和Zn++离子，酶活性分别下降到无添加剂时的13％及6％。另外，同样地添加5mM的EDTA，测定活性时，检测不出活性。
(7)活化
对于本发明的酶，用各种金属离子及辅酶类，观察不到活化，本发明酶的活化不需要辅酶。
向本反应液中加L-抗坏血酸可以促进反应。
(8)Km值
在含有80mM的MES缓冲液、pH6.5、4mM L-抗坏血酸、2mM硫酸亚铁及酶标样的反应液中测定，对于L-脯氨酸的Km值是0.27mM，对于2-酮戊二酸的Km值是0.55mM。
(9)分子量
用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳法(使用ATTO社制的丙烯酰胺凝胶PAGEL N PU-12.5L及BIORAD社制分子量标准SDS-PAGE Molecular Weight Standard，Broad Range)进行测定，计算出分子量32000±5000道尔顿。另外，使用高效液相色谱凝胶过滤法(柱G-3000 SW，21.5mm×60cm，以东方酵母社制HPLC用分子量标识器作为标准)进行测定，算出分子量是43800±5000道尔顿。
(10)N末端氨基酸序列
使用岛津制作所社制的PPSD-10型的蛋白测序仪分析的结果，本发明酶蛋白的N末端氨基酸序列的确定如下。(N末端)1 Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Glu Tyr
11 Arg Glu Ala Gly Tyr Leu Leu Ile Glu Asp
21 Gly Leu Gly Pro Arg Arg Val
(序列 号1)
以下是本发明的实施例。
实施例1
反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成
将SR3培养基〔含有葡萄糖1.0％，可溶性淀粉1.0％、酵母浸汁0.5％、胰化胨0.5％、肉浸汁0.3％及磷酸镁0.05％，用6NNaOH调节成pH7.2的培养基〕，分别以10ml加入到试管(直径25mm×200mm)中，在120℃下灭菌20分钟。在此培养基中用一铂环接种在HT琼脂平板培养基上〔含可溶性淀粉1％、NZ胺0.2％、酵母浸汁0.1％、肉浸汁0.1％及琼脂1.5％，用6N NaOH调节到pH7.2后，在120℃下灭菌20分钟的培养基〕生长的指孢囊菌·SP(Dactylosporangium sp)RH1，在28℃下振荡培养2天，作为种子培养液使用。
另一方面，将Df1培养基〔含有可溶性淀粉5％、大豆粉1.5％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁7水合盐0.05％及碳酸钙0.5％，用6N NaOH调节pH7.0培养基〕分别以10ml分注到试管中(直径25mm×200mm)，在120℃下灭菌20分钟。在此培养基上无菌地接种1ml的种子培养液，在28℃下振荡培养2天。将得到的培养液用7000×g在4℃下离心分离10分钟。将得到的菌体用80mM TES缓冲液(pH7.5)洗涤后，离心分离。得到的湿菌体150mg悬浮在1.5ml的反应液中〔在含有4mM L-脯氨酸、8mM2-酮戊二酸、4mM L-抗坏血酸及2mM硫酸亚铁的80mMTES缓冲液(pH7.5)中添加1.4％(V/V)奈明溶液而制成的，其中的奈明溶液是将4g奈明S-215(日本油脂株式会社制)溶解在10ml二甲苯中的溶液〕，而后在30℃下，反应2小时。
反应后，从菌体反应液离心除去菌体，对上清液中生成的反式-4-羟基-L-脯氨酸进行分析。
用高效液相色谱在以下条件下分析。检测是在把目的化合物从柱中洗脱出后，在送液线上进行NBD衍生物化，通过测定NBD衍生物的荧光进行测定。
〔1〕装置
岛津制作所制高效液相色谱
色谱纸CR6A
系统控制器SCL-6B
自动注入仪SIL-6B
送液泵LC-6A
柱烘箱CTO-6A
化学反应槽CRB-6A
荧光检测器RF-550A
〔2〕使用柱株式会社住化分析中心 制 SUMCHIRAL
OA5000(直径4.5mm×250mm)
〔3〕分析条件1)移动相1mM硫酸铜水溶液2)流速 1.0m/分3)柱温度38℃4)缓冲液0.3M硼酸缓冲液、pH9.625mM乙二胺四乙酸5)流速 0.2ml/分6)NBD氯化物溶液 0.5g/l甲醇溶液7)流速 0.5ml/分8)反应温度 60℃9)反应时间 约3分10)检测波长 激励波长503nm
荧光波长541nm11)试样 10μl
其结果，可以确认在反应液中生成了249μm(32.6mg/l)的反式-4-羟基-L-脯氨酸。
实施例2
反式-4-羟基-L-脯氨酸的精制
将SR3培养基200ml加入到2升三角烧瓶，进行实施例1中的种子培养。预先分注到5升的发酵罐中后，在120℃下灭菌20分钟的2升Df1培养基上，无菌地接种此种子培养物，在700rpm，1vvm条件，28℃下培养2天。在培养中不调节pH值。得到的培养液用7000×g、4℃下离心分离10分钟，每1升培养液得到75g湿菌体。在4℃下用生理盐水洗涤湿菌体，离心后至使用时要一直冷冻保存在-80℃下。将本湿菌体400g悬浮在实施例1的记载的2升反应液中，在3升烧杯中不断搅拌，30℃下进行4小时反应。
反应后，对于用离心分离除去菌体的菌体反应液的上清液中生成的羟基脯氨酸进行分析。其结果，可确认在反应液中生成了480μM(63.0mg/l)的反式-4-羟基-L-脯氨酸。
将反应上清液的pH值调节到4.5以后，通入到装有200ml迪阿翁(DIAON)SKIB(NH4+型、三菱化成社制)离子交换树脂的塔内。减压下浓缩含有反式-4-羟基-L-脯氨酸的馏分后，通入到装有20ml迪阿翁PA 412(OH-型、三菱化成社制)离子交换树脂的塔内。减压浓缩含有反式-4-羟基-L-脯氨酸馏分后，pH值调节到9.6，加入10％容量的邻苯二甲醛溶液(0.075g/ml乙醇溶液)及2％容量的β-巯基乙醇溶液(10％V/V水溶液)，在60℃下，保持5分钟，使夹杂的一级氨基酸进行邻位苯二甲醛化。此混合液再通过充填有10ml分离珠SP 207(三菱化成社制)离子交换树脂的塔内，分离邻位苯二甲醛化的夹杂直链氨基酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸。减压浓缩含有反式-4-羟基-L-脯氨酸馏分后，再次通入含有20ml迪阿翁离子交换树脂PA 412(OH-型、三菱化成社制)，得到含有反式-4-羟基-4-脯氨酸的馏分。浓缩干燥此馏分，得到78mg白色结晶的反式-4-羟基-L-脯氨酸(收率62％)。分析此白色结晶，其结果，13C-NMR谱、1H-NMR谱、质谱、此旋光度等与反式-4-羟基-L-脯氨酸的标准品(NAKARAITESK株式会社)一致。
实施例3
反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成
将SR3培养基，以10ml加入到试管(直径25m×200mm)，在120℃下，灭菌20分钟。在此培养基上用一铂环接种生长在HT琼脂培养基上的AmycolatopsisSP.属菌RH2，在28℃下，振荡培养2天，作为种子培养液使用。
另一方面，将Df1培养基以10ml加入到试管(直径25mm×200mm)，在120℃下，灭菌20分钟。在此培养基上，无菌地接种1ml种子培养液，28℃下振荡培养2天，得到的培养液在4℃下，用7000×g离心分离10分钟。得到的菌体用100mM TES缓冲液(pH7.5)洗涤后，离心分离。将得到的湿菌体100mg悬浮在1ml的反应液中〔在含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、5mM L-抗坏血酸及1mM硫酸亚铁的100mM TES缓冲液(pH7.5)中加入1.4％(V/V)奈明溶液，其中的奈明溶液是将4g的奈明S-215(日本油脂株式会社制)溶解在10ml二甲苯中而制成的〕，在30℃下，进行3小时反应。
反应后，对于从菌体反应液离心分离除去菌体的上清液中生成的羟基脯氨酸进行分析。
分析及检测按实施例1标准进行。
其结果，确认在反应液中生成了25μM(3.3mg/l)的反式-4-羟基-L-脯氨酸。
实施例4
反式-4-羟基-L-脯氨酸的精制
在加入200ml SR3培养基的2升三角烧瓶中，进行了实施例3的种子培养。预先加入到5l的发酵罐后，将种子培养物无菌地接种在经120℃下进行20分钟灭菌的2lDf1培养基上，在700rpm，1vvm的条件下，28℃下，培养2天。不调整培养物中的pH值。将得到的培养液在4℃下，以7000×g离心分离10分钟，每1升培养液得到75g湿菌体。此温菌体400g悬服在2升的实施例3记载的反应液中，在3升烧杯中，不断搅拌，在30℃下进行4小时的反应。
将反应上清液的pH值调到4.5后，通过充填有200ml迪阿翁SKIB(NH4+型、三菱化成社制)离子交换树脂的塔，减压浓缩含有反式-4-羟基-L-脯氨酸馏分后，通入充填20ml迪阿翁PA412(OH-型、三菱化成社制)离子交换树脂的塔。减压浓缩含有反式-4-羟基-L-脯氨酸馏分后，pH值调到9.6后，加入10％容量邻位苯二甲醛溶液(0.075g/ml乙醇溶液)及2％容量的β-巯基乙醇溶液(10％V/V水溶液)，60℃下，保持5分钟，使夹杂的直链氨基酸邻位苯二甲醛化。将此混合液通入到充填着10ml分离珠SP 207(三菱化成社制)的塔，分离邻位苯二甲醛化了的夹杂直链氨基酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸。减压浓缩含有反式-4-羟基-L-脯氨酸馏分后，再次通入充填有20ml迪阿翁PA 412(OH-型、三菱化成社制)离子交换树脂柱的塔，得到含有反式-4-羟基-L-脯氨酸的馏分。浓缩干燥此馏分，得到反式-4-羟基-L-脯氨酸的白色结晶4.8mg(收率62％)。
分析此白色结晶的结果，13C-NMR谱、1H-NMR谱、质谱、比旋光度等与反式-4-羟基-L-脯氨酸标准样品(NAKARAITESK株式会社)一致。
实施例5
L-脯氨酸4位羟基化酶的离析及精制
(1)无细胞提取液的配制
将实施例2得到的冷冻菌体600g溶解后，冰冷下悬浮在3升的缓冲液A中〔含有2mM的DTT、0.2mM的EDTA及20％(V/V)甘油的50mM的TAPS缓冲液(pH9.01)〕，用旋转磨(DYNO-MILL，WILLY ABACHOFEN MASCHINEN FABRIK，BASEL，瑞士)处理悬浮液，破碎菌体。此处理液用6500×g，4℃下离心分离30分钟，取出上清液。
次后的操作均在0℃至4℃下进行。
(2)用柱色谱分离及精制
(2)-1 STREAMLINE
将上述工序得到的上清液通入到充填着用缓冲液A平衡了的300ml DEAE吸附体的弗尔玛西亚社制STREAMLINE塔中，用含有0.3M NaCl的缓冲液A洗脱出L-脯氨酸4位羟基化酶的馏分。
(2)-2 DEAE琼脂糖柱色谱
将上述工序得到的活性馏分用缓冲液A稀释3倍后，通入预先用缓冲液A平衡了的DEAE琼脂糖柱(5cm×15cm)塔。用缓冲液A洗涤柱后，使用在缓冲液制成从0至0.3M的NaCl线性浓度梯度溶液，洗脱出含有此酶的馏分。
(2)-3丁基琼脂糖色谱
向上述工序得到的活性馏分中添加并溶解NaCl使其浓度为3M，把其加入在予先用含3M NaCl缓冲液A平衡了的丁基琼脂糖柱上(Butyl Sepharose 4 Fast Flow、2.6cm×13cm)。用含3M NaCl缓冲液A、含1.98M NaCl缓冲液A、含0.99M NaCl缓冲液A及只是缓冲液A的各种不同NaCl浓度4种缓冲液，从NaCl的高浓度向低浓度，阶段地洗脱出酶。
(2)-4苯基琼脂糖柱色谱
向上述工序得到的活性馏分中添加并溶解NaCl使其达到3M浓度，再将其通入预先用含3M NaCl缓冲液A平衡了的苯基琼脂糖柱塔(Phenyl Sepharose HPHiload 16/10，1.6cm×10cm)，用含3M NaCl的缓冲液A洗涤后，用含该馏分的缓冲液A洗脱该酶。
(2)-5色素亲和性柱色谱
将上述工序得到的活性馏分，用弗尔玛西亚社制PD-10柱进行脱盐后，通入到预先用缓冲液A平衡了的活性红120柱塔中(西格玛社制Reactive red 120，1cm×12.7cm)。用缓冲液A洗涤后，通过在缓冲液A中制成从0-1.5M的NaCl线性浓度梯度溶液，洗脱出含有此酶的馏分。
(2)-6 RESOURCE Q柱色谱
将上述工序得到的活性馏分使用用缓冲液B〔含有2mM DTT、0.11％(V/V)吐温20及20％(V/V)甘油的50mM TAPS缓冲液(pH8.0)〕平衡了的弗尔玛西亚社制PD-10柱脱盐后，通入预先用缓冲液B平衡了的RESOURCE Q柱塔(弗尔玛西亚社制RESOURCETM Q，1ml)。使用将缓冲液B制成从0-0.2M的NaCl的线性浓度溶液梯度洗脱出该酶。
L-脯氨酸4位羟基化酶的分离及精制的概要归纳在表5中，
实施例6
L-脯氨酸4位羟基化酶的性质
(1)用电泳法分析
使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳法(使用ATTO社制聚丙烯酰胺凝胶PAGEL NPU-12.5L及BIORAd社制分子量标准SDS-PAGE Molecular WeightStandard，Broad Range)分析实施例5得到的精制标样。其结果，本发明的酶是由分子量约32000±5000道尔顿的均一亚单位组成的。
(2)涉及酶反应的性质
使用以下反应液，进行反应成分的基质省略试验(omission test)及添加物试验来研究L-脯氨酸4位羟基化酶反应的必需化合物、促进化合物、抑制化合物。
基本反应液的组成是含有4mM L-脯氨酸、8mM 2-酮戊二酸、2mM硫酸亚铁、4mM L-抗坏血酸、过氧化氢酶2mg/ml及酶标样的80mM TES缓冲液(pH7.5)，总计液量500μl。通过添加酶开始反应，在30℃，进行15分钟。通过在100℃下，加热反应液2分钟而终止反应。反应液中生成的反式-4-羟基-L-脯氨酸量用前置柱衍生物化法定量。在100μl反应液中，添加0.3M硼酸缓冲液(pH10.7)100μl、10％(V/V)巯基乙醇水溶液4μl及5％(W/V)邻苯二甲醛的乙醇溶液16μl，在60℃下放置30秒。进而加入2％(W/V)NBD氯化物的乙醇溶液50μl，在60℃下反应40分钟。加入1N盐酸30μl停止反应后，用离心及过滤除去沉淀后，用高效液相色谱进行分析，定量生成的反式-4-羟基-L-脯氨酸。
高效液相色谱在以下条件进行。
移动相10mM柠檬酸(pH4.0)/甲醇＝3/1(V/
V)
流速1ml/分
柱YMC Pack ODS AQ-312(YMC社制，6×150mm)
柱温度50℃
检测荧光检测、激励波长503nm、荧光波长541nm。
其结果，在L-脯氨酸4位羟基化反应中，L-脯氨酸、2-酮戊二酸、Fe++离子是必须的，L-抗坏血酸有促进反应作用，另外，Zn++、Cu++离子及EDTA的添加可抑制反应。
结果如表6所示
表6
酶反应成分的研究反应液成分 添加物(+)2) 相对活性3)
无添加(-)标准反应液1) 100
- 酶样品0
- L-脯氨酸 0
- 2-酮戊二酸0
- Fe++ 0
- L-抗坏血酸51
- 过氧化氢酶93
+ 5mM EDTA 0
+ 1mM Zn++6
+ 1mM Cu++3
1)标准反应液成分是含有4mM L-脯氨酸、8mM 2-酮戊二酸、2mM硫酸亚铁、4mM L-抗坏血酸、过氧化氢酶2mg/ml及酶标样的80mM TES缓冲液，pH7.5，液量总计500μl。反应是在30℃下，进行15分钟。
2)添加物(+)表示在标准反应液中添加了表中用+表示的化合物进行反应。无添加(-)表示从标准反应液中除去表中用(-)表示的化合物进行反应。表中表示的浓度，是反应液中的浓度。
3)活性，是以标准反应液的活性作为100，用对其的相对值表示。
(3)最佳pH值
在L-脯氨酸4位羟基化酶的活性测定法中，pH3.5-5.5时，用醋酸钠缓冲液、pH5.5-6.5时，用MES缓冲液、pH7.0-7.5时，用TES缓冲液、pH8.0-9.0时，用TAPS缓冲液、pH9.5-11.0时，用CAPSO缓冲液，
换反应液成分中的缓冲液成分，而进行反应结果，在pH6.0-7.0时，显示了90％以上的最高活性。结果表示在表7中。
表7
反应的最佳pH
pH 相对活性
3.5 2.9
4.0 4.4
4.5 5.9
5.0 10.3
5.5 41.2
6.0 97.0
6.5 100
7.0 91.2
7.5 75.0
8.0 47.1
8.5 44.0
9.0 29.4
9.5 7.4
10.04.4
10.50
11.00
(4)pH值稳定性
将本发明酶在用50mM缓冲液〔pH3.5-5.5〕时，用醋酸钠缓冲液、pH5.5-6.5时，用MES缓冲液、pH7.0-7.5时用TES缓冲液、pH8.0-9.0时，用TAPS缓冲液、pH9.5-11.0时，用CAPSO缓冲液〕，在2mM DTT及20％(V/V)甘油存在下，4℃下保持24小时后测定活性。结果pH6.5-10.0的范围内保持的酶具有保持前活性的90％以上的活性，pH6.5-10.0的范围内活性保持稳定。
(5)最佳温度
L-脯氨酸4位羟基化酶活性测定法中，在15-50℃的温度范围内进行15分钟反应，其结果在30-40℃显示了90％以上的最高活性。结果表示在第8表中。
第8表
反应的最佳温度
反应温度(℃) 相对活性1)
15 28
20 41
25 60
30 91
35 100
40 96
45 68
50 32
1)活性是以相对活性表示的，这里将最高活性作为100。
(6)温度的稳定性
将本发明的酶保持在含有2mM DTT、0.1％(V/V)吐温20及20％(V/V)甘油的50mM TAPS缓冲液(pH9.0)中，在0-60℃温度范围内保持30分钟后，测定活性。结果为本发明的酶在50℃下，处理30分钟，完全失活。
(7)N末端氨基酸序列
使用岛津制作所社制的PPSQ-10型蛋白测序仪分析本发明酶蛋白的N末端氨基酸序列，结果如下。(N末端)1Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr
11Arg Glu Ala Gly Tyr Leu Leu Ile Glu Asp
21Gly Leu Gly Pro Arg Arg Val
(序列 号1)
实施例7
L-脯氨酸的羟基化
使用实施例5得到的精制酶标样，进行L-脯氨酸的羟基化。用含有20mM L-脯氨酸、20mM 2-酮戊二酸、5mM L-抗坏血酸、2mM硫酸亚铁及90U的精制酶标样的200mM MES缓冲液(pH6.5)50μl，在35℃下，进行30分钟反应。其结果在反应液中生成12.9mM(1.7g/l)的反式-4-羟基-L-脯氨酸。
本发明提供了对于用发酵法从糖源在工业规模上生产的L-脯氨酸，通过直接经微生物或酶的羟基化，在工业上有效地制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法以及用于该方法的有用的新的L-脯氨酸羟基化酶。
序列表
序列号1序列长度27序列类型氨基酸拓谱结构直链状序列的种类肽起源生物名指孢囊菌(Dactylosporangium sp.)株名RH1(FERM BP-4400)序列Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Glu Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu Leu 1 5 10 15Ile Glu Asp Gly Leu Gly Pro Arg Arg Val
20 25
本发明中使用的微生物指孢囊菌(Dactylosporangium sp.)RH1和Amycolatopsis菌(Amycolatopsis sp.)RH2已分别于1994年7月27日保藏于中国典型培养物中心，保藏编号分别为M94038和M94039。
权利要求
1.L-脯氨酸4位羟基化酶的制备方法，其特征在于培养属于指孢囊菌属(Dactylosporangium)或Amycolattopsis属，且具有生产L-脯氨酸4位羟基化酶能力的微生物，通过阴离子交换色谱层析和疏水性色谱层析组合精制方法，精制所说的微生物的细胞提取液。
全文摘要
L－脯氨酸4位羟基化酶的制备方法，其特征在于培养属于指孢囊菌属(Dactylosporangium)或Amycolattopsis属，且具有生产L－脯氨酸4位羟基化酶能力的微生物，通过阴离子交换色谱层析和疏水性色谱层析组合精制方法，精制所说的微生物的细胞提取液。
文档编号C12P13/24GK1392257SQ01137460
公开日2003年1月22日 申请日期2001年11月19日 优先权日1993年9月7日
发明者尾崎明夫, 森英郎, 柴崎刚, 安藤胜彦, 千叶繁 申请人:协和发酵工业株式会社