专利名称：：用于治疗纤维化的ccr2拮抗剂的制作方法第l/39页用于治疗纤维化的CCR2拮抗剂
背景技术：
：发明领域本发明涉及使用拮抗CCL2结合于CCR2的拮抗剂(例如抗-CCL2抗体)预防和控制肺纤维化尤其是寻常性间质性肺炎的方法。相关技术描述寻常性间质性肺炎(UIP)是一种以肺部蜂窝状为特征并据此常规诊断的使人虛弱的慢性间质性肺病。发生蜂窝状的原因是胶原沉积增加，因此降低肺弹性并导致正常肺泡结构的退缩和最终萎陷。肺内蜂窝状和纤维化程度非常不均匀，其中过量胶原密集区经常与正常肺实质或富含单核细胞浸润的间质性组织邻接。大多数患者在诊断时患有中期至晚期的临床疾病，即使治疗也会恶化。cxc趋化因子家族是一种细胞因子的多效家族，其参与促进多种白细胞运输、调节血管生成和血管重构、促进间质祖细胞例如纤维细胞即肺纤维化中的循环间质祖细胞(也称为纤维细胞)的动员和运输。在正常肺中，大量固有成纤维细胞群持续产生并降解月交原，从而使肺在感染、炎症或其它病理生理症状后以及损伤后重塑。成纤维细胞响应多种生长因子例如TGFbl而产生胶原。而且，TGFbl诱导成纤维细胞分化为成肌纤维细胞，其常见于UIP肺组织中。成肌纤维细胞是能产生胶原、具有a-平滑肌肌动蛋白并因此具有收缩性的分化细胞。因此成肌纤维细胞可能会促进肺泡萎陷。在正常伤口愈合的过程中，成纤维细胞产生胶原和生长因子引导伤口闭合。一旦组织结构复原，成纤维细胞胶原产生减少并且细胞走向凋亡，从而预防过量瘢痕形成。在UIP患者的肺中存在显著成纤维细胞增殖。因此UIP成纤维细胞存留在纤维化部位，持续增加异常的过量胶原沉积。UIP患者通常是普通肺移植的受体，在这些患者中移植物可能最终纤维化。先前研究已显示分离自纤维化部位的成纤维细胞与分离自非-纤维化组织的成纤维细胞相比存在表型差异。举例而言，分离自UIP患者肺的成纤维细胞中IL-13受体亚基表达增加。CCR2在肺成纤维细胞中表达并且CCR2可在呼吸器官损伤后调节这些细胞的募集和活化。通过受体敲除小鼠或配体中和抑制体内CCR2信号转导可减少多种动物纤维化模型中的胶原沉积。CCL2(CC-趋化因子配体2、单核细胞趋化蛋白1、MCP1)与CCR2结合。CCR2主要在单核细胞、上皮细胞和内皮细胞上表达。已发现UIP患者中MCP1水平增加。小鼠CCR2受体的配体包括CCL2(又称JE或单核细胞趋化蛋白[MCP]-1)、CCL7(MCP-3)和CCL12(MCP-5)，因此，基于小鼠模型数据的假设未必能就趋化因子和趋化因子受体分布而言准确反映人的肺部环境。单核细胞趋化蛋白1(MCP1、CCL2、CCR2配体、GenBankNP_002973)，含76个氨基酸残基的8.6kDa的蛋白质，是细胞因子的趋化因子(3(或C-C)家族成员。MCP-1由多种细胞型表达包括单核细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、成骨细胞以及人肺2-型上皮样细胞。据信，MCP-1通过促进单核细胞流入和随后在组织内的激活在炎性疾病的起始和进程中发挥重要作用。MCP-1是单核细胞而不是中性粒细胞的趋化性剂。它能诱导名为CHAK(CC-趋化因子激活的杀伤细胞)的杀伤细胞(类似于IL-2激活的细胞)的增殖和激活。它可调节细胞表面抗原(CDllc、CDllb)的表达和细胞因子IL1和IL6的表达。MCP-1是人嗜碱粒细胞的有效活化剂，诱导脱颗粒和组胺释放。因此，医疗领域需要检测和控制表现出导致肺动脉瓣关闭不全(又称UIP)病理生理学特征的患者，可以避免肺移植需求至少能提高同种异体移植物使用的安全性和存活率并能理解和治疗其中MCP-1的病理学作用的方法。发明概述本发明提供预防、减緩或逆转患者纤维化的方法，其包含接触或给予包含有效量的下列物质的组合物至少一种分离的CCR2拮抗剂，其可在显示本文所定义受体的细胞中阻止与CCR2(其亚型或变异体包括CCR2A或CCR2B)相关的生物学功能或生物活性，或与MCP-1/CCL2或CCR2结合的拮抗剂或阻止CCR2与其同源配体结合的拮抗剂并藉此抑制CCR2在哺乳动物患者的细胞、组织、器官中的生物学功能。在本发明方法的一方面，受试者为具有与间质性特发性肺炎相关的间质性病理学和肺泡纤维化的患者，更具体地，患者被诊断为寻常性间质性肺炎。本发明方法可与在显示本文所定义的受体的细胞中阻止与CCR2活性的CCR2拮抗剂一起应用。在本发明的一方面，CCR2拮抗剂包括能结合MCP-l/CCL-2或CCR2或者能阻止CCR2与其同源配体结合并藉此抑制CCR2生物学功能的抗体、合成或天然序列肽和小分子拮抗剂。本文也提供了在细胞、组织、器官或动物中诊断MCP-1相关间在一个实施方案中，抗体的配体结合部分包含SEQIDNO:27和28。在一方面，本发明提供至少一种分离的哺乳动物抗MCP-1抗体，其包含至少一种包含SEQIDNO:27或28的可变区。在另一方面，本发明提供至少一种分离的哺乳动物抗MCP-1抗体，其包含(i)IDNO:6、7和9的全部重链互补决定区(CDR)氨基酸序列；或(ii)SEQIDNO:13、14和16的全部轻链CDR氨基酸序列。本发明进一步提供至少一种抗MCP-1抗体方法或组合物，如本领域所知和/或本文所述用于给予治疗有效量以在细胞、组织、器官、动物或患者中和/或在相关病症之前、之后或期间调节或治疗至少一种MCP-1相关病症。在另一方面，本发明提供至少一种分离的哺乳动物抗MCP-1抗体，其包含(i)SEQIDNO:6、7和8或9的全部重链互补决定区(CDR)氨基酸序列；或(ii)SEQIDNO:13、14和15或16的全部轻链—CDR氨基酸序列。本发明还提供给予治疗或预防有效剂量的至少一种依据本发明的抗MCP-1抗体的至少一种组合物、装置和/或方法。本发明进一步提供本文所述任何发明。附图简迷图1所示柱形图中各柱形代表与分离自非-纤维化肺組织的成纤维细胞(标准化至数值1)相比，与UIP成纤维细胞中纤维化相关的下列基因表达的倍数增加aSMA:PC0L1;PCOL3;CTGF;TGF(3-1;TGF(3R1;TGF卩R2;IL13Ral;IL13Ra2。图2所示柱形图显示了TGF卩1、PDGF和CCL2对衍生自非纤维化和纤维化肺组织的成纤维细胞中aSMA表达的影响。图3所示两个柱形图显示了通过衍生自非-纤维化和纤维化肺组织的成纤维细胞TGF(31、PDGF和CCL2对溶胶原I(A)和溶胶原III(B)基因表达的影响。图4所示柱形图显示了通过书于生自非-纤维化和纤维化肺组织的成纤维细胞TGF(31、PDGF和CCL2对TGFbl基因表达的影响。图5所示柱形图显示了通过衍生自非-纤维化和纤维化肺組织成纤维细胞TGF(31、PDGF和CCL2对CTGF基因表达的影响。图6所示两个柱形图显示了通过衍生自非-纤维化和纤维化肺组织成纤维细胞TGFpi、PDGF和CCL2对TGFPRI(A)和TGF卩RII(B)基因表达的影响。图7所示两个柱形图显示了通过^f汙生自非-纤维化和纤维化肺组织成纤维细胞TGFbl、PDGF和CCL2对IL13Ral(A)和IL13Ra2(B)基因表达的影响。序列表简述<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Abs抗体，多克隆或单克隆；Ig免疫^^蛋白；Mab单克隆抗体；V抗体可变域；C抗体恒定域；H抗体重链；L抗体轻链；HRCT高分辨率计算机体层摄影术；PDGF-AB血小板衍生的生长因子a/卩；CTGF:结締组织生长因子；CXCCXC亚类的趋化因子；aSMAa平滑肌肌动蛋白；PC0L1溶胶原I;PCOL3:溶胶原III;TGF卩1转化生长因子(31;TGF(3R11类TGF卩受体；TGF卩R2:II类TGF卩受体；IL13Ral:白介素13受体al亚基；IL13Ra2:白介素13受体a2亚基。定义本文术语"抗体"以其最广泛意义使用。如本文所使用，"抗体"包括完全抗体和其任何抗原结合片段或单链。因此，抗体包括任何包含一种分子的蛋白质或肽，该分子包含至少部分免疫球蛋白分子，例如但不限于可合并入本发明抗体的至少一种重《连或轻4连互补决定区或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区或其任意部分，或至少一部分结合蛋白。术语"抗体"进一步涵盖抗体、消化片段、特定部分及其变异体，包括才莫拟抗体，或包含模拟抗体或其特定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分，包括单链抗体及其片段。功能片段包括预选目标的抗原结合片段。包含于术语抗体的"抗原结合部分"的结合片段的实施例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH域组成的单价片段；(ii)F(ab，)2片段，包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546);以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分离的基因编码，但是可使用重组方法通过可将它们制成单个蛋白质链(其中VL和VH区配对形成单价分子(称做单链Fv(scFv))的合成接头将它们连接起来；参见，例如Bird等1988Science242:423-426,和Huston等1988Proc.Natl.AcadSci.USA85:5879-5883。这些单链抗体也涵盖于术语抗体的"抗原结合部分，，中。可用本领域技术人员熟知的常规技术获得抗体片段，以与完整抗体相同的方式筛选应用的片段。"CCR2，，意指人CCR2A(MCP-1RA,NP—000638)和/或人CCR2B(MCP-1RB,NP—000639)和与天然或内源性对应的哺乳动物CCR2蛋白质(例如，重组蛋白质)具有相同氨基酸序列的蛋白质。CCR2A归因于导致移码的编码区内选择性剪切和下游终止密码子的使用(Charo，等1994.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91(7):2752-2756)。如本文定义，CCR2包括成熟受体蛋白质、多态或等位变异体、哺乳动物CCR2的亚型(例如，由选择性剪接或其它细胞操作产生)和前者的修饰或未修饰形式(例如糖基化，去糖基化)。例如可从天然产生哺乳动物CCR2的来源中回收或分离该类蛋白。"CCR2拮抗剂"可在显示如本文定义的CCR2A或CCR2B或其它亚型或变异体的细胞中阻止与CCR2A或CCR2B相关的生物学功能或生物活性。包括在本发明范围内的拮抗剂包括可结合MCP-1/CCL2功能的抗体、合成或天然序列多肽和小分子拮抗剂。因此，抑制剂指包括结合受体(例如抗体、天然配体突变体、小分子量有机分子、其它配体结合的竟争性抑制剂)的拮抗剂的物质和不与其(例如抗独特型抗体)结合即可抑制受体功能的物质。"寻常性间质性肺炎"或"UIP"在临床和组织学上又称作"特发性肺纤维化"或"IPF，和"隐源性纤维化肺泡炎"。它是特发性间质性肺炎(IIP)的六个组织学亚型中最常见的。其它IIP为非特异性间质性肺炎(NSIP)、闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎(BOOP)、呼吸性细支气管炎伴间质性肺病(ILD)、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎(AIP)。"MCP-1"指NCBI记录登记号NP—002973中引用的76个氨基酸的序列，又称为MCP(单核细胞趋化蛋白)、SMC-CF(平滑肌细胞趋化因子)、LDCF(淋巴细胞衍生趋化因子)、GDCF(神经胶质瘤衍生趋化因子)、TDCF(肿瘤衍生趋化因子)、HC11(人细胞因子11)、MCAF(单核细胞趋化活化因子)。基因符号为SCYA2，即位于人染色体17的JE基因，最新命名为CCL2(Zlotnik,Yoshie2000.Immunity12:121-127)。JE为人MCP-1/CCL2的小鼠同源物。MCP-1拮抗剂小分子指可抑制MCP-1活性并可用作潜在治疗药的任何适当化合物。这些化合物为本领域熟知，例如可阻止CCL2结合于CCR2B和/或抑制CCR1或CCL2本身的吲咮衍生物、环胺衍生物、脲基衍生物、杂环化合物、酰基苯胺以及功能性吡咯，如PCT公开说明书WO9905279(1999)、WO9916876(1999)、WO9912968、WO9934818、WO9909178、WO9907351、WO9907678、WO9940913、WO9940914、WO0046195、WO0046196、WO0046197、WO0046198、WO0046199、WO9925686、WO0069815、WO0069432、WO9932468、WO9806703、WO9904770、WO99045791所公开，各以其完整内容并于本文作为参考。如本文所使用，本发明所用"治疗"指包含"控制，，和"逆转，，慢性排斥反应的功能或组织学征兆的治疗。本发明可治疗的哺乳动物包括家畜类哺乳动物例如牛、马等，家养动物例如狗、猫、鼠等以及人，优选人。引用本文引用的所有出版物或专利整体并入本文作为参考，因为它们展现出本发明所在时期本领域的状态和/或提供本发明描述和可实施性。出版物涉及任何科学或专利出版物，或以任^可4某介形式可获得的任和其它信息，包括所有记录的、电子的或印刷形式。以下参考文献整体合并入本文作为参考Ausubd等编辑，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY，NY(1987-2006;Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarbor,NY(1989);HarlowandLane,antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY(1989);Colligan等编辑，CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,Inc.，NY(1994-2006;Colligan等，CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,NY，(1997-2006。本发明的寻常性间质性肺炎(UIP)和特发性肺纤维化化合物已知MCP-l结合趋化因子受体CCR2并经其进行信号转导。CCR2是在多种细胞包括单核细胞、T细胞、B细胞和嗜;成粒细胞上表达的7跨膜-跨越G蛋白偶联受体。现已克隆出两种MCP-l特异性受体，CCR2A和CCR2B，其响应纳摩尔UM)浓度的MCP-l进行信号转导。CCR2A(CC-CKR2A)和CCR2B(CC-CKR2A)表示编码两个具有选择性剪接羧基尾部的MCP-l特异性受体的两个cDNA。MCP-l以高亲和力与两个亚型结合。MCP-l诱导表达CCR2B的细胞而不是表达CCR2A的细胞钙流出。与表达CCR2A的细胞相比小于5倍的MCP-1诱导表达CCR2B的细胞中的趋化性。已知其它与人MCP-1序列具有某些功能和序列同源性的蛋白质。与MCP-l(GenBankNP—002973)尤其相似的是MCP-2(GenBankNP—005614)和嗜酸细胞活化趋化因子(GenBankP—51671);MCP-2与MCP-1有百分之61.8的序列一致性，嗜酸细胞活化趋化因子-1与MCP-1的序列一致性为百分之63.2。对这些蛋白在人体内环境稳定机制和病理学中的活性范围和参与广度的了解还比不上对MCP-1同源物的了解。例如，MCP-2(又名CCL8)与MCP-1和MCP-3(又名CCL7，GenbankNP—006264)紧密相关并以CCR1和CCR2B二者作为其功能受体。MCP-3与命名为D6的受体结合。MCP-3也与CCR10和CCR1结合。MCP-3蛋白质(97个氨基酸)序列显示出与MCP-1百分之74的一致性，与MCP-2百分之58的同源性。分泌型MCP-3与MCP-1的差异在于它是N-糖基化的。MCP-4(又名CCL13,GenbankNP—005399)与三种已知的单核细胞趋化蛋白有百分之56-61的序列一致性，与嗜酸细胞活化趋化因子-1有百分之60的一致性。MCP-4的功能看来与MCP-3和嗜酸细胞活化趋化因子的功能高度相似。与MCP-3—样，MCP-4是单核细胞和T淋巴细胞的强效化学趋化剂。它对中性粒细胞无效。在单核细胞上，MCP-4与识别MCP-1、MCP-3、RANTES(CCL5)和嗜酸细胞活化趋化因子的受体、CCR1和CCR3受体结合，并显示出与嗜酸细胞活化趋化因子-1的完全交叉脱敏。MCP-5为鼠CC-趋化因子并与人MCP-1最紧密相关(66%氨基酸一致性)。MCP-5的基因符号为SCYA12(又名CCL12)。用趋化因子受体CCR2转染的细胞显示可响应MCP-5。细胞因子和趋化因子的一般信息可自万维网获得，当前分类系统参见ZlotnikA.,Yoshie0.2000.趋化因子一种新的分类系统及其在免疫中的作用(Chemokines:anewclassificationsystemandtheirroleinimmunity.)Immunity12:121-127。前述讨论用于强调拮抗剂可通过直接作用于CCR2或其配体CCL2、CCL7、CCL8之一阻止CCR2结合的生物学功能。在本发明的一个实施方案中，拮抗剂结合MCP-1/CCL2并中和其结合CCR2的能力。US6084075、US6458353和US6696550中公开了抗-CCR2抗体。在本发明方法的一个实施方案中，抑制含哺乳动物CCR2的细胞与趋或其功能片段接触，该抗体或功能片段结合CCR2或部分所述受体。在一个实施方案中，该抗体为单克隆抗体(mAb)LS132.1D9(1D9)或可与1D9竟争与人CCR2或部分人CCR2结合的抗体。也可设计前述抗体的功能片段。已报导了可结合MCP-1的抗体JP9067399公开从分离血细胞中获得的抗体，JP05276986公开分泌IgM抗-人MCP-l的杂交瘤。最近，公开了可结合多种(3趋化因子包括MCP-1的抗体(WO03048083)和也可结合嗜酸细胞活化趋化因子的MCP-1结合抗体(US20040047860)。选择性结合并中和人MCP-1/CCL2的鼠同源物或人MCP-1/CCL2的抗体公开于共同未决专利申请美国序列号11/170,453和60/682,654，其内容和教导并入本文作为参考。在本发明的一个实施方案中，CCR2拮抗剂为命名为C775的抗-人MCP-1/CCL2抗体，其可如共同未决专利申请美国序列号11/170,453所公开通过命名为C1142的细胞系生产，其变体例如人源化或重构形式、截短形式或其结合片段，如本文所定义。在另一个实施方案中，CCR2拮抗剂为命名为CNT0888的抗-人MCP-1/CCL2抗体的变体、截短形式或其结合片段，如本文所定义和如共同未决专利申请WO2006125202所公开，其内容和教导合并入本文作为参考。在一个实施方案中，MCP-1抗体包含重链和轻链可变区二者，其包含SEQIDNO:27和28。抗体可包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述抗体包含SEQIDNO:6、7、9、13、14和16的所有重链和轻链互补决定区(CDR)氨基酸序列。抗体包含至少一个包含至少一个重^T连和至少一个轻^1的可变区，所述MCP-1抗体包含含有SEQIDNO:27和28的重链和轻链可变区。抗体可包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述抗体包含SEQIDNO:6、7、9、13、14和16的所有重链和轻链互补决定区(CDR)氨基酸序列。抗体可包含至少一个具有至少SEQIDNO:6、7、9、13、14和16之一的氨基酸序列的重链或轻链CDR。抗体可任选包含至少SEQIDNO:2-5之一的重链或轻链可变区，其进一步包含选自SEQIDNO:6-26的重链或轻链的互补决定区(CDR)或其配体结合部分；任选与框架区功能性相关，进一步任选包含至少人免疫球蛋白的CH1、铰链、CH2或CH3。也可使用可结合CCR2并具有拮抗活性的MCP-1/CCL2截短形式、变异体、突变蛋白质或"突变体"实施本发明方法。同型二聚体形成趋化因子的变异体，例如CCL2，其在二聚体形成界面具有改变氢键类型的单个氨基酸替换，从而得到与受体结合并具有体外拮抗活性的专性单体(obligatemonomer),但如WO05037305A1所教导可拮抗天然趋化因子并具有体内抗炎活性，均为可用于实施本发明的变异体。MCP-1的肽拮抗剂为截短MCP-1(9-76)，其显示可在关节炎小鼠模型中预防发病并减轻疾病症状(Jiang-HongGong等，J.Exp.Med.1997，186:131)。CCR2/CCL2表达的调节拮抗CCR2和其配体相互作用的可选方法为使用例如RNA沉默方法敲减CCR2或其配体尤其是MCP-1/CCL2的表达。这样，在另一个实施方案中，可用于实施本发明方法的化合物为靶向MCP-1序列并千扰MCP-1基因表达的核酸或靶向CCR2并干扰CCR2基因表达的核酸，包括正义或反义方向的寡核苷酸和多聚核苷酸，单链或双链核酸分子(例如siRNA)。可以多种不同途径调节基因表达，包括使用siRNA、shRNA、反义分子和DNA酶。siRNA和shRNA均通过RNAi途径起作用，并已成功用于抑制基因表达。RNAi首先在蠕虫中发现，Fire和Mdlo(Fire等，1998.Nature391:806)首次报道植物中dsRNA相关基因沉默现象并被认为是植物细胞抵抗RNA病毒的途径。在这一途径中，切酶(DICER)样酶将长链dsRNA病毒产物加工成21-25bp的小片段，然后展开双链分子并导入RNA诱导的沉默复合物(RISC)。在哺乳动物细胞中已鉴别出相似的途径，其显著的差异为dsRNA分子的长度必须小于30bp以避免所谓干扰应答的诱导，其非基因特异并可导致细胞中的蛋白质合成完全停止。可设计合成siRNA以特异靶向一个基因并且可轻松在体外或体内将它们传递至细胞。shRNA为siRNA分子的DNA等同物，具有能合并入细胞基因组然后在每次有丝分裂周期复制的优点。DNA酶也用于调节基因表达。DNA酶为可剪切单链RNA的催化性DNA分子。它们对目标RNA序列具有高度选纟奪性，这样可通过靶向信使RNA用于下调特异基因。RNA干扰是指短干扰RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默过程(Zamore等，2000,Cell,101,25-33;Fire等，1998，Nature,391，806;Hamilton等，1999,Science,286,950-951;Lin等，1999，Nature,402,128-129;Sharp，1999,Genes&Dev.,13:139-141;及Strauss,1999，Science,286,886)。细胞中存在的dsRNA通过尚未完全鉴定的机制触发RNAi应答。这一机制似乎不同于其它涉及双链RNA特异性核糖核酸酶的已知机制，例如由蛋白激酶PKR的dsRNA-介导活化引起的千扰应答和引起核糖核酸酶！^对111^八非特异性剪切的2，，5'-寡腺苷酸合成酶(参见，例如，美国专利号6107094;5898031;Clemens等，1997,J.Interferon&CytokineRes.,17,503-524;Adah等，2001，Curr,Med.Chem.，8,1189)。细胞中存在的长链dsRNA可激发被称为切酶的核糖核酸酶III酶的活性(Bass,2000，Cell,101,235;Zamore等，2000,Cdl，101,25-33;Hammond等，2000,Nature,404,293)。切酶参与了将dsRNA加工成18被称做短链干扰RNA(siRNA)的dsRNA短链片段(Zamore等，2000，Cell,101，25-33;Bass，2000,Cell,101,235;Berstein等，2001,Nature,409，363)。衍生自切酶活性的短链干扰RNA通常长约21至约23个核苷酸并包括约19个碱基对双链体(Zamore等，2000，Cell,101,25-33;Elbashir等，2001，GenesDev,15,188)。切酶也参与了从涉及转录控制的保守结构的前体RNA切除21-、22-核苷酸小时序RNA(stRNA)(Hutvagner等，2001，Science,293,834)。RNAi应答的另一特征为核酸内切酶复合物(通常称做RNA诱导的沉默复合物(RISC))，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA剪切。目标RNA的剪切发生在与siRNA双链体反义链互补的区域的中部(Elbashir等，2001,GenesDev.,15，188)。siRNA为包括目标序列及其互补序列的双链RNA。RNA的3，末端加入两个尿嗜咬核苷残基(Elbashir等2001Nature411:494-498)。目前RNA干扰(RNAi)常规用于哺乳动物细胞以研究减少特定基因表达的功能性结果。通过转染与所关注基因互补的小型干扰RNA(siRNA)诱导RNAi，该小型干扰RNA包括长约2lnt并在3，有2nt突出端的双链RNA分子(Elbashir等2001上文)或可形成发卡的45-50聚体(shRNA)分子(Paddison，PJ,等，2002.Genes&Development16:948-958)。当转染入哺乳动物细胞后，siRNA表达质粒显示可降低外源性和内源性基因产物水平。尽管与化学合成或体外转录siRNA相比它们的制备更费力，但是当与选择性标记共表达时siRNA载体可提供目标基因表达的长期降低(Brummelkamp，TR,等，2002.Science296:550-553)。非蛋白质、非寡核苷酸拮抗剂小分子药物和拟肽也可为CCR2拮抗剂。例如，WO04069809、WO04069810、WO05118574、WO06015986教导巯基咪唑作为CCR2受体拮抗剂。可使用如本文所述的方法筛选选择其它显示出所需生物学特性的小分子，这些小分子会具有预防慢性排斥反应和延长移植物存活的性质。抗体制备方法可任选通过各种技术包括KohlerandMilstein(1975)Nature256:495的标准体细胞杂交技术(杂交瘤方法)生产本发明CCR2拮抗剂抗体。在一种杂交瘤方法中，如本文所述免疫小鼠或其他适当的宿主动物例如仓鼠或猕猴以诱导生产或可以生产与用于免疫的蛋白特异结合的抗体的淋巴细胞。或者，可体外免疫淋巴细胞。接着使用合适的融合剂例如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤纟田月包(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第59-103页(AcademicPress,1986))。也可如本文所述和/或如本领域已知任选通过免疫可生产人类抗体所有组成成分的转基因动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、非人类灵长类等)生成CCR2拮抗剂抗体。生产例如人抗-MCP-l抗体的细胞可分离自该类动物并4吏用适当的方法例如本文所迷方法使其永生化。应用在它们的种系构型中携带人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠可提供针对多种靶标包括正常人类免疫系统可耐受的人自身抗原的高亲和力全长人单克隆抗体的分离(Lonberg,N.等，US5569825、US6300129和1994，Nature368:856-9;Green,L.等，1994,NatureGenet.7:13-21;Green,L.&Jakobovits,1998，Exp.Med.188:483-95;Lonberg，NandHuszar，D.,1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93;Kucheriapati,等，US6713610;Bruggemann,M.等，1991，Eur.J.Immunol.21:1323-1326;Fishwild，D.等，1996,Nat.Biotechnol.14:845-851;Mendez，M.等，1997,Nat.Genet.15:146-156;Green,L.,1999,J.Immunol.Methods231:11-23;Yang,X.等，1999,CancerRes.59:236-1243;Briiggemann，M.andTaussig,MJ"Curr.Opin.Biotechnol.8:455-458,1997;Tomizuka等，WO0204347S)。可断裂或删除该类小鼠中的内源性免疫球蛋白基因座以去除动物生产由内源基因编码的抗体的能力。此外，一些公司Y列:i口Abgenix，Inc.(Freemont,Calif.)andMedarex(SanJose，Calif.)可使用上文所述技术提供针对所筛选抗原的人类抗体。可使用任何适当的技术例如重组蛋白生产进行免疫原性抗原的制备和单克隆抗体的生产。可以纯化蛋白或包括完整细胞或细胞或组织提取物的蛋白混合物形式给予动物免疫原性抗体，或者可在动物体内从编码所述抗原或其部分的核酸从头形成该抗原。可任选加入佐剂例如完全弗氏佐剂与抗原一起免疫。可在免疫方案过程中通过眼眶取血获得的血浆样品监控免疫应答。可通过ELISA(如下文所述)筛选血浆，具有足够滴度的抗-MCP-l免疫球蛋白的小鼠可用于融合。可在处死和去除脾脏前3天用抗原静脉内强化免疫。预计各抗原需要进行2-3次融合。各抗原将免疫若干小鼠。为了生成可产生单克隆CCR2拮抗剂抗体的杂交瘤，可从经免疫小鼠分离脾细胞和淋巴结细胞并与适当的永生化细胞系融合，例如小鼠骨髓瘤细胞系。筛选所得杂交瘤用于生产抗原特异性抗体。不能生产免疫球蛋白链的适当永生细胞系选自融合配偶体，例如杂交瘤细胞系，例如但是不限于Sp2/0和衍生细胞系，NS1和衍生物，尤其是NSO工程化NSO系例如GS-NSO、AE-l、L.5、P3X63Ag8.653、U937、MLA144、ACTIV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH3T3、HL陽60、MLA144、NAMAIWA、NEUR02A、CHO、PerC.6、YB2/0等，或异源骨髓瘤，其融合产物或从其衍生的任何细胞或融合细胞，或任何本领域已知的适当细胞系(Birch等，1994.Biologies22:127-133)。可使用选择性培养条件或其他适当的已知方法分离融合细胞(杂交瘤)或重组细胞并通过限度稀释或细胞分选或其他已知的方法克隆。可通过适当的测定法(例如，ELISA)检测可生产具有预期特异性的抗体的细胞并筛选用于梯:作。可使用其他适当的生成或分离具有必需特异性的抗体的方法，包括但不限于从肽或蛋白质文库中筛选重组抗体的方法(例如但不限于噬菌体、核糖体、寡聚核苷酸、RNA或cDNA等展示文库；例如，可自CambridgeantibodyTechnologies,Cambridgeshire,UK;21MorphoSys,Martinsreid/Planegg,DE;Biovation,Aberdeen,Scotland,UK;Biolnvent,Lund,Sweden;DyaxCorp.,Enzon,Affymax/Biosite;Xoma,Berkeley,CA;Ixsys获得。参见，例如EP368684,PCT/GB91/01134;PCT/GB92/01755;PCT/GB92/002240;PCT/GB92/00883;PCT/GB93/00605;US08/350260(5/12/94);PCT/GB94/01422;PCT/GB9衡662;PCT/GB97/01835;(CAT/MRC);WO90/14443;WO90/14424;WO90/14430;PCT/US94/1234;W092/18619;WO96/07754;(Scripps);EP614989(MorphoSys);WO95/16027(Biolnvent);WO88/06630;WO90/3809(Dyax);US4704692(Enzon);PCT/US91/02989(Affymax);WO89/06283;EP371998;EP550400;(Xoma);EP229046;PCT/US91/07149(Ixsys);或如本领域已知和/或如本文所述可生产人类抗体所有组成成分的随才几生成的肽或蛋白-US5723323、5763192、5814476、5817483、5824514、5976862、WO86/05803、EP590689(Ixsys,现为AppliedMolecularEvolution(AME)，其完整内容均以参考形式并于本文)。该类技术包括但不限于核糖体展示(Hanes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94:4937-4942(May1997);Hanes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:14130-14135(Nov.1998));单细胞抗体生产技术(例如，筛选'淋巴细胞抗体法("SLAM")(美国专利号5627052，Wen等，J.Immunol.17:887-892(1987);Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7843-7848(1996));凝胶点滴法和流式细胞计量法(Powell等，Biotechnol.8:333-337(1990);单细胞系统，Cambridge,MA;Gray等，J.Imm.Meth.182:155-163(1995);Kenny等，Bio/Technol.13:787-790(1995));B-细胞筛选(Steenbakkers等，Molec.Biol.R印orts19:125-134(1994);Jonak等，ProgressBiotech,第5巻，InVitroImmunizationinHybridomaTechnology,Borrebaeck,编辑，ElsevierSciencePublishersB.V"Amsterdam,Netherlands(1988))。可使用肽展示文库方便地做到筛选可特异结合至相似蛋白或片段的抗体。这一方法涉及筛选大量的肽得到具有期望功能或结构的单个成员。使用肽展示文库的抗体筛选为本领域已知。所展示的肽序列长度可为3-5000或更多个氨基酸，通常为5-100个氨基酸，经常约8-25个氨基酸。肽展示文库、载体和筛选试剂盒可自例如Invitrogen(Carlsbad,CA)和CambridgeantibodyTechnologies(Cambridgeshire,UK)这样的公司获得。参见，例如，美国专利号4704692、4939666、4946778、5260203、5455030、5518889、5534621、5656730、5763733、5767260、5856456,转让给Enzon;5223409、5403484、5571698、5837500，转让给Dyax、5427908、5580717，转让给Affymax;5885793、转让给CambridgeantibodyTechnologies;5750373,转让给Genentech;5618920、5595898、5576195、5698435、5693493、5698417，转让给Xoma,CoUigan,上文；Ausube,上文;或Sambrook,上文,各上述专利和出版物的完整内容以参考形式并于本文。抗体片段抗体片段可衍生自蛋白质水解消化完整抗体(参见，例如，Morimoto等，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992);以及Brennan等，Science,229:81(1985》。但是现在可直接通过重组宿主细胞生产这些片段。F(ab')2、Fab、Fv和ScFv抗体片段均可表达于并分泌自哺乳动物宿主细胞或大肠杆菌，因此易于生产大量的这些片段。抗体片段可分离自上文讨论的抗体噬菌体文库。或者，可从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段并化学偶联形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。在其他实施方案中，所述抗体为单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185;美国专利号5571894和美国专利号5587458。Fv和sFv具有完整结合位点，即VH和VL结构域，其缺乏恒定区。通常克隆VH和VL结构域并再工程化(re-engineered)^吏其位于单个多肽中间并由柔性接头连接，该接头足够长使得单个多肽中的两个结构域可相互作用。或者，可构建融合蛋白以得到在sFv的氨基端或羧基端与效应蛋白的融合。参见AntibodyEngineering,1995.ed.Borrebaeck。鉴定拮抗剂的方法可使用如下文示例的适当体外测定法和体内;f莫型鉴定CCR2生物活性拮抗剂。可使用结合抑制测定法鉴定与CCR2结合并抑制另一种化合物例如配体(例如，MCP-1、MCP-2、MCP-3和/或MCP-4)与CCR2或功能变异体结合的抗体或其片段。举例而言，可进行结合测定，其中检测到或测量到与不存在抗体下配体的结合相比CCR2配体结合降低(存在抗体)。可将包含分离的和/或重组哺乳动物CCR2或其功能变异体的组合物与配体和抗体同时接触，或以任一顺序先后接触。抗体存在下配体结合程度的降低指示抗体的结合抑制。例如，配体的结合可减少或消除。在一个实施方案中监测了抗体或其片段对配体(例如趋化因子如MCP-1/CCL2)与哺乳动物CCR2或其变异体的结合的直接抑制。举例而言，可监测抗体抑制^I-标记MCP-1、^I-标记MCP-2、1251-标记MCP-3或1251-标记MCP-4与哺乳动物CCR2结合的能力。可使用包含CCR2或其功能变异体的适当细胞例如分离的血细胞(例如，T细胞、PBMC)或天然表达CCR2的适当细胞系或包含编码哺乳动物CCR2的核酸的细胞系或所述细胞的膜部分进行该测定。鉴定结合CCR2的抗体存在的其他方法是可用的，例如其它适当的结合测定法，或可监测受体结合触发事件包括信号转导功能和/或细胞应答(例如白细胞运输)刺激的方法。应理解的是可在结合抑制测定法中评价本发明抗体的抑制作用。也可在该方法中评价用于受体结合的抗体之间的竟争。可进一步评价以这种方式鉴定的抗体，以确定在结合之后它们是否抑制CCR2的其它功能和/或以评价他们的治疗用途。信号转导测定法24配体或促进剂例如激动剂与CCR2的结合可引起经这一G-蛋白-偶联受体的信号转导，G蛋白和其他胞内信号转导分子的活性被激发。可使用任何适当方法监测一种化合物(例如抗体或其片段)对信号转导功能的诱导。这一测定法可用于鉴定CCR2的抗体激动剂。可使用测定法中的配体或促进剂测定抗体或其功能性片段或其他候选CCR2激动剂化合物的抑制活性并评价该抗体对配体或促进剂诱导的活性的抑制能力。可通过本领域已知方法或其他适当方法(参见，例如，Neote,K.等，Cell，72:415-4251993);VanRiper等，J.Exp.Med.,177:851-856(1993);Dahinden,C.A.等,J.Exp.Med"179:751-756(1994))测定G蛋白活性，例如水解GTP形成GDP或之后由受体结合触发的信号转导事件例如诱导胞内(细胞质的)游离钙离子[Ca2+]I浓度的快速和瞬间升高。例如，使用杂交G蛋白偶联受体的Sledziewski等的功能测定法可用于检测配体或促进剂结合受体并激活G蛋白的能力(Sledziewski等，美国专利号5284746,其教导以参考形式并于本文)。可在待评价抗体或其片段存在下进行该类测定，使用已知方法和抑制能力。趋化性和细胞激发测定法趋化性测定法也可用于评价抗体或其功能片段作为CCR2拮抗剂的能力。在这一方面，抗体或其功能片段或其他候选CCR2拮抗剂化合物阻断配体与哺乳动物CCR2或其功能变异体结合并抑制趋化性(与配体结合至受体相关的函数)的抑制活性是可用的。这些测定法基于由化合物诱导的体内或体外细胞功能性迁移，在这种情况下或CCL2或另一可活化CCR2的配体。例如在使用96孔趋化性测定板性。例如，Springer等(Springer等，WO94/20142，1994年9月15日出版，其教导以参考形式并于本文；也可参见Berman等，Immunol.Invest.17:625-677(1988))描述了体外跨内皮趋化性测定法的使用。也描述跨越内皮组织至胶原的迁移(Kavanaugh等，J.Immunol.,146:4149-4156(1991))。例如，小鼠Ll-2前-B细胞或其他具有趋化性的适当宿主细胞的稳定转化子可用于趋化性测定法中。通常，趋化性测定法监测适当细胞(例如白细胞(如淋巴细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞))定向运动或迁移入或通过障碍(例如内皮、滤器)，朝向水平提高的化合物方向，从障碍的第一表面至相对的第二表面。膜或滤器提供方便的障碍，这样可监测适当细胞定向运动或迁移入或通过障碍，朝向水平提高的化合物方向，从障碍的第一表面至相对的第二表面。在一些测定法中，用适当物质涂溃膜以辅助粘附，例如ICAM-1、纤维结合素或胶原。该类测定法提供白细胞"归巢"的体外近似值。例如，可在适当容器(包含工具)中检测或测量细胞迁移的抑制，从第一室迁移入或通过微孔膜进入包含待测抗体的第二室，由膜将其与第一室分开。筛选具有用于监测响应化合物的特异迁移的适当孔径的膜，包括例如纤维素、聚碳酸酯。例如，可使用约3-8微米的孔径，优选约5-8微米。滤器上的孔径可一致或在适当的孔径范围内。为了评价迁移和迁移抑制，可使用标准技术(例如，显微镜检查法)测定迁移入滤器内的距离，穿过滤器仍然粘附在滤器的第二表面的细胞数量和/或聚积在第二室中的细胞数量。在一个实施方案中，用可检测标记物(例如，放射性同位素、荧光标记、抗原或表位标记)标记细胞，可4吏用适当的方法(例如，通过^r测》文射性、荧光、免疫测定法)通过测定粘附至膜和/或存在于第二室的标记的存在在存在和不存在抗体或片段的情况下评价迁移。可相对于适当的对照(例如，与不存在抗体下测定的迁移对比，与第二化合物(即标准)诱导的迁移程度相比、与抗体诱导的未转染细胞的迁移相比)测定由抗体激动剂诱导的迁移程度。在一个实施方案中，尤其对于T细胞、单核细胞或表达哺乳动物CCR2的细胞而言可监测跨内皮迁移。在这一实施方案中，评价透过内皮细胞层的跨越迁移。为制备细胞层，可在微孔滤器或膜上培养内皮细胞，任选涂渍例如胶原、纤维结合素或其他胞外基质蛋白的物质以辅助内皮细胞的附着。优选地，培养内皮细胞直至形成汇合单层。许多哺乳动物内皮细胞可用于单层形成，包括例如静脉、动脉或微血管内皮，例如人脐静脉内皮细胞(CloneticsCorp,SanDiego,Calif.)。为了评价响应具体哺乳动物受体的趋化性优选相同哺乳动物的内皮细胞；然而也可使用来自异源哺乳动物种或属的细胞。一般而言，通过4企测细胞进入或通过膜或滤器向化合物水平增加的方向的定向迁移进行检测，其从滤器的第一表面朝向相对的滤器第二表面，其中该滤器在第一表面包含内皮细胞层。定向迁移从第一表面附近的区域发生，进入膜内或通过膜，朝向置于滤器相反面的化合物。存在于第二表面附近区域的化合物的浓度大于第一表面附近区域的浓度。在一个用于检测抗体抑制剂的实施方案中，可将包含可迁移并表达哺乳动物CCR2受体的细胞的组合物置于第一室。将包含可诱导第一室细胞(具有化学趋化功能)趋化性的一个或多个配体或促进剂的组合物置于第二室中。优选在将细胞置于第一室前不久或与这些细胞同时，将包含待检测抗体的组合物优选置于第一室。可结合受体并通过配体或促进剂抑制该测定法中表达哺乳动物CCR2的细胞的趋化性诱导的抗体或其功能片段为受体功能的抑制剂(例如，刺激作用的抑制剂)。在抗体或片段存在下由配体或促进剂诱导的迁移程度的降低可指示抑制活性。可进行单独的结合试验(见上文)测定抑制是否由抗体与受体的结合引起或通过不同的机制发生。监控响应在组织中注射化合物(例如趋化因子或抗体)的组织的白细胞浸润的体内测定法为体内归巢模型并测定细胞通过迁移响应配体或促进剂的能力以及向炎症部位的趋化性并评价抗体或其片段阻断该迁移的能力。除所描述方法之外，可通过监测由活性受体诱导的细胞应答使用其它配体和哺乳动物CCR2功能抑制剂的鉴定上述可用于测定本发明抗体和片段的结合和功能的测定法可适用于鉴定与哺乳动物CCR2或其功能变异体结合的其它配体和其他物质，以及哺乳动物CCR2功能的抑制剂和/或促进剂。例如，可通过与所述抗体或其部分的竟争测定法鉴定与本发明抗体或其功能部分具有相同或相似结合特异性的物质。因此，本发明也涵盖鉴定受体的配体或与哺乳动物CCR2蛋白结合的其他物质以及受体功能的抑制剂(例如拮抗剂)或促进剂(例如激动剂)的方法。在一个实施方案中，将具有哺乳动物CCR2蛋白或其功能变异体(例如，白细胞、细胞系或经设计表达由引入所述细胞中的核酸编码的哺乳动物CCR2蛋白或其功能变异体的适当的宿主细胞)的细胞用于鉴定和评价与受体结合的配体或其他物质(包括受体功能的抑制剂或促进剂)的效能的测定法中。该类细胞也可用于评价已表达受体蛋白或多肽的功能。根据本发明，可在适当的测定法中鉴定配体和与受体结合的其他物质、受体功能的抑制剂和促进剂，并进一步评价其疗效。受体功能抑制剂可用于抑制(诱导或阻止)受体活性，配体和/或促进剂可用于诱导(触发或增强)所指示的正常受体功能。因此，本发明提供、;厶疗移植物排斥的方法，其包含给予个体(例如，哺乳动物)受体功能抑制剂。包含CCR2拮抗剂的药用组合物本发明包括制备用于调节CCR2转录、表达和活性的药用组合物的方法。该类方法包括将药学可接受的载体与可调节CCR2表达和活性的物质一起配制。该类组合物可进一步包括附加活性物质。因此，本发明进一步包括通过将药学可接受载体与可调节CCR2表达和活性的物质以及一种或多种附加活性化合物配制在一起制备药用组合物的方法。药学可接受载体、辅料或稳定剂在所应用的剂量和浓度下对与其接触的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理学可接受载体为含水pH緩沖溶液。生理学可接受载体的实例包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA;糖醇例如甘露醇或山梨醇；成盐平衡离子例如钠；和/或非离子表面活性剂例如WEEN、聚乙二醇(PEG)、PLURONICS⑧和透明质酸(HA)。可设计制剂以优化CCR2拮抗剂的稳定性或允许将活性成分緩释或延释至血液。各类型CCR2拮抗剂的适当制剂和给药途径可参见例如"Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy",A.Gennaro编辑，第20版，Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,2000。为了使制剂可用于体内给药，它们必须是无菌的。可通过在低压冻千和复溶解之前或之后经无菌滤膜过滤使制剂无菌。本文的治疗组合物一般置于具有无菌进入孔的容器中，例如静脉内注射液袋或具有可被皮下注射针刺透的塞子的管形瓶。可用本领域已知的医疗器械给予治疗组合物。治疗方法
技术领域：
：本发明的方法用于治疗受试者中纤维化，包括器官特异纤维化或系统纤维化。器官特异纤维化至少与肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心脏纤维化、血管纤维化、皮肤纤维化、眼纤维化、骨髓纤维化或其他纤维化之一相关。肺纤维化至少与特发性肺纤维化、药物诱导肺纤维化、哮喘、肉状瘤病或慢性阻塞性肺病之一相关。肝纤维化可至少与肝硬化、血吸虫病或胆管炎之一相关。肝硬化可选自酒精性肝硬化、丙型肝炎后肝硬化、原发性胆汁性肝硬化。胆管炎为硬化性胆管炎。肾纤维化可至少与糖尿病肾病或狼裔肾小球硬化症之一相关。心脏纤维化可至少与一种类型的心肌梗塞相关。血管纤维化可至少与血管成形术后动脉狭窄或动脉粥样硬化之一相关。皮肤硬化可至少与烧瘢痕、肥厚性瘢痕、瘢痕瘤或肾源性纤维性皮肤病之一相关。眼纤维化可至少与眶后纤维化、白内障手术后或增殖性玻璃体^L网膜病之一相关。骨髓纤维化可至少与特发性骨髓纤维化或药物诱导骨髓纤维化之一相关。其它纤维化可选自帕荣雷氏病(Peyronie，sdisease)、掌腱膜挛缩症(contracture)或皮肌炎。系统纤维化可选自系统硬化和移植物4元宿主病。患者评价间质性肺病(ILD)涵盖多种纤维变性病症，其由于相似的临床、放射学、生理学、病理学表现而归为一类。弥漫性实质性肺疾病这一更准确的术语误导性更小，因为绝大多数这些病症影响末端细支气管、间质和肺泡。虽然IPF被称作一种"肺炎"，但是炎症的作用似乎相对较小。环境的、遗传的或其他未知因素被认为最初诱发了肺泡上皮细胞损伤，但是自身延续以及异位间质成纤维细胞和间质细胞增殖被认为与临床疾病的发展有关。关键的组织学发现为具有成纤维细胞增殖位点(成纤维细胞集落)和密集瘢痕化的胸膜下纤维化，与正常肺组织区域交替(不均一性)。分散间质炎症与淋巴细胞、浆细胞和组织细胞浸润一起发生。外周肺泡的嚢性扩张(蜂窝样)存在于所有患者中并且f遺着疾病力口重而土曾力口。参见MerckManualofDiagnosisandTherapy(第18版)，Section:PulmonaryDisorders,Subject:InterstitialLungDiseases,Topic:IdiopathicInterstitialPneumonias.2006。弥漫性肺病例如慢性阻塞性肺病和肺动脉高血压排除于ILD分类。严重ILD患者遭受长期呼吸困难并最终死于呼吸衰竭。间质性肺病包括导致许多患者呼吸功能不全和死亡的不同种类的病症。肺移植是可选候选中一个治疗选^奪。一般人群中ILD的准确发病率和患病率仍然未知。人们认为ILD要比之前所冲艮道(每100000人5例)的更加流行。BernalilloCounty,NewMexico的人群研究报导男性中每100000人80.9例和妇女中每100000人67.2例的发病率。特发性肺纤维化(IPF)是最常见的ILD形式，占这一研究中全部案例的约45%。可引起呼吸衰竭的其他弥漫性肺病包括肉状瘤病、淋巴管肌瘤病、朗格汉斯细胞组织细胞增生症或嗜酸细胞性肉芽肺、脱屑性间质肺炎(DIP)、非特异性间质性肺炎(NSIP)以及与结締组织疾病相关的肺纤维化。可使用本领域技术人员已知的方法在疾病的症状表现之前、同时或之后进行间质性特发性肺纤维化患者(UIP/IPF或NSIP患者)对抗-CCR2疗法需要的评价。通常诊断肺病的方法包括严重度，例如机械通气的需要；症状，例如咳嗽、呼吸困难、发热、咯血；发病类型，渐进、急性或亚急性；隐晦疾病，免疫缺陷、胶原血管病、血管炎；环境暴露，石棉、鸟抗原、毒性烟雾；用药史，皮质激素、细胞毒性药剂、抗生素；实验室异常，贫血、血清嗜酸细胞计数升高、抗中性白细胞胞质抗体，抗曲霉血清沉淀素、类风湿因子；放射照相检查结果，正常、弥散或局部阴影，结节性或斑块实质变化，间隙性(airspace)或间质性，上或下叶突出；放射照相术(HRCT)可发现的胸膜渗漏，磨玻璃样阴影、支气管扩张、气道疾病的迹象、下叶、胸膜下、微嚢的(microcystic)或蜂窝样变化，两侧上叶嚢肿和小瘤，两侧弥散性嚢变。最后对病人进行肺功能检测以确定该病理生理学是否为梗阻性、限制性、混合梗阻性或限制性或正常。IPF(UIP)中的组织学发现包括不规则线性阴影(网状型)。然而，这一观察可存在于胶原血管病、石棉沉着病和慢性过敏性肺炎中。UIP的远端肺实质将以^^窝样型式纤维化。其它形式的间质性纤维化可由以下原因引起淋巴细胞间质性肺炎、胶原血管病、药物反应、肺尘症(石棉沉着病、铍中毒、矽肺、硬金属尘肺和其他)、慢性肉芽肿感染、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(嗜酸细胞性肉芽肿)、慢性肉芽肿感染、慢性误吸、慢性过敏性肺炎、机化性慢性嗜酸细胞性肺炎、机化性和机化中(organizing)弥漫性肺泡损伤、慢性间质性肺水肺/被动淤血，放射(慢性)，已痊愈的感染性肺炎。UIP的典型HRCT型包括具有蜂窝样和牵拉性支气管扩张的双基底外周网织化(bibasilarperipheralreticulation)。磨玻璃浑浊4b不是该疾病的特点，如果存在的话，通常很少，其中一些实际上是由纤维化引起的。IPF的两个最具特征性的特点为下叶蜂窝样，其对于IPF诊断的优势比为5.36，以及所谓的"上叶不规则索条影"，对于IPF诊断的优势比为6.28(Hunninghake2003.Chest.124:1215-1223)。成肌纤维细胞相对不存在于非纤维化组织中。成肌纤维细胞包含使这些细胞具有收缩表型的平滑肌肌动蛋白纤维，用于使伤口闭合。a-平滑肌肌动蛋白(aSMA)为成肌纤维细胞的标记。TGFbl为原型促纤维化生长因子，其之前显示可诱导aSMA表达(Desmouliere等，1995ExpNephrol3(2):134-9)。使用经培养的来自UIP患者的成纤维细胞和来自非纤维化肺的成纤维细胞，申请人已发现TGFbl可在非纤维化和纤维化成纤维细胞二者中诱导aSMA,但是，诱导的强度在纤维化成纤维细胞中更大。用PDGF刺激成纤维细胞可诱导aSMA表达的中等增加(小于IO倍)，但是仅在纤维化成纤维细胞中。在这三者中，申请人的数据显示仅CCL2在纤维化成纤维细胞中诱导大于10倍的aSMA表达增加。胶原沉着是纤维化的关键标志并且溶胶原I和溶胶原III这两个基因之前已显示与uip相关。溶胶原i和溶胶原m蛋白已显示在uip样本中在肺和全身均升高(Low等，1992AmRevRespirDis146(3):701-6;Strieter等，2004AmJRespirCritCareMed170(2):133-40;Bensadoun等，1996.AmJRespirCritCareMed154(6Pt1):1819-28.)。申请人:已证明了CCL2在UIP成纤维细胞中诱导溶胶原I和溶胶原III二者。而且，CCL2的基因诱导强度与两个促纤维化细胞因子TGFpl和PDGF-AB产生的作用具有可比性。已详细描述了TGFpl在多种组织和器官中的促纤维化作用。TGFpl作用可经自分泌机制进一步放大。申请人在用TGF(31刺激的非纤维化和纤维化肺成纤维细胞中均观察到这一放大机制，两种细胞类型均表现出TGFP1存在下TGF(31增加。也发现CCL2可增强TGF卩1基因表达，并且如同TGFP1的情形一样，CCL2的TGFpl基因诱导程度在纤维化成纤维细胞中更大。之前已发现硬皮病患者的皮肤成纤维细胞中TGFP受体增力口(Kubo等，2002JRheumatol29(12):2558-64;Kawakami1998.JInvestDermatolll0(l):47-51)。虽然与TGFpi、PDGF两种TGFp受体亚基均增加，但是TGFpl主要增加TGFPRI，CCL2诱导两种亚基表明该作用不仅仅归因于CCL2对TGFpi的诱导。结締组织生长因子(CTGF)已显示可介导许多TGFpi作用包括胶原产生。TGFbl在纤维化和非纤维化成纤维细胞二者中诱导CTGF基因表达增加。而且，PDGF和CCL2在UIP成纤维细胞中诱导CTGF基因表达增加。申请人的数据显示TGFpl、PDGF和CCL2增强UIP成纤维细胞中的IL13Ral表达。IL-13为Th2-型细胞因子，其在UIP患者的肺中水平升高。IL-13为体外和体内促纤维化模型。IL-13诱导胶原生成和成纤维化纟田胞增殖(Saito2003.IntArchAllergyImmunol2003;132(2):168-76;Ingram2004FasebJ18(10):1132-4)。许多鼠类肺纤维化模型数据表明IL13和经IL13Ra2的信号转导可促纤维化并且也可能经TGF(31诱导发挥作用(Fichtner-Feigl2006.NatMed12(1):99-106)。因此，申请人数据显示在IL13Ra2表达中TGF卩1、PDGF-AB和CCL2均上调，这表明CCL2可直接或间接使成纤维细胞对IL-13介导的应答更^:感。标志并区分了来自非纤维化肺的成纤维细胞与UIP成纤维细胞的应答。之前的研究已表明CCR2表达于硬皮病患者皮肤的成肌纤维细胞的动物才莫型已显示分离自纤维化、Th2-型环境成纤维细胞上CCR2的上调以及这些细胞对CCR2配体的功能性增加(Hogaboam1999.JImmunol1999;163(4):2193-201.)。但是这是第一个表明CCR2对病变肺成纤维细胞的促纤维化、功能性作用的研究。CCR2-CCL2抑制已显示在纤维化体内模型中是有益的。就机制而言，动物模型中纤维化抑制归因于纤维细胞募集减少和炎症反应减弱，其可能或不能转换至人类疾病。本发明基于申请人使用人类成纤维细胞证明CCR2配体CCL2可驱动纤维化应答并且UIP成纤维细胞对CCL2具有高反应性。因此，该数据表明尤其通过拮抗CCL2与CCR2结合的阻断、抑制、下调或拮抗CCR2生物活性的方法可有效緩解呆滞肺功能丧失的对间质肺组织快速并且目前不可逆的损伤，鉴于申请人已建立了CCL2对病变肺成纤维细胞的直接促纤维化作用。在本发明方法中，可在本文公开的可检测标记的起始时间给予UIPCCR2拮抗剂，包括但不限于CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF。本领域目前与IIDs尤其是IPF诊断和治疗相关的认识表明引起纤维化的原因和起始事件如细胞病理学中一样多种多样(Chapman2004JClinInvest113(2):148-157)。为了确定哪一经诊断的患者亚组可受到抗-CCL2疗法的帮助，鉴定与CCL2介导疾病相关的生物标记是有价值的。来自IPF组织的研究显示对MMP-7在基因表达水平上调的差异调节并且已显示若干蛋白在支气管灌洗液和/或血清中上调，包括KL-6、ENA-78、IP-IO、CCL7、IL-2、IL-8、IL-10和IL-12(p40)。但是，目前为止未发现这些蛋白与CCL2减弱之间的相互关系。除CCL2之外的数个细胞因子，例如IL-1、PDGF、骨桥蛋白(Osteopontin)、TNF、TGF、CCL3、CXCL8、CXCL5、CXCL12、CXCL9、CXCLIO、CXCLll，已显示参与了IPF发病。但是，与CCL2的关系仍不清楚并且目前为止不同实验室对来自IPF患者的成纤维细胞的基因表达分析得到了不同的结果(为全面了解，见Studer等，2007.ProcAmerThoracicSoc.4(1):p.85-9)培养的成纤维细胞具有可检测基础水平的CCL2并且近期研究显示外源加入的CCL2可调节IL-6产生(Liu，X等，207AmerJRespirCellMolecBiol.37(1):121-8)。因此CCL2作为中心介导因子发挥作用，并且IPF成纤维细胞环境中的CCL2的中和可调节其它基因和/或蛋白的表达。使用来自纤维化患者的分离固有成纤维细胞，申请人已确定来自IPE患者的肺成纤维细胞比非纤维化成纤维细胞表达更高水平的CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF。申请人也确定了CNT088(中和性CCL2抗体)可阻断表达最高水平的细胞中这些蛋白的生产。IPF的准确诊断涉及肺活组织检查和罕见间质性肺炎的组织学分析。由于这一操作的侵入性，对于初次诊断之后常规监控疾病进展不实用。其它非-侵入性诊断可用但是变化无常。因此需要相对非侵入性的定量诊断工具。可以比手术组织活检更小的侵入性取样组织液例如血清或支气管肺泡灌洗液。来自所收集细胞的可溶蛋白和细胞表面标记或基因表达均可使用现有技术进行定量以诊断并监测疾病进展。监测组织的这些基因和/或蛋白可用于测定CNTO888对CCL2的中和程度。因此对来自可获得外周组织的CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF的基因和/或蛋白测定将提供新颖并相对非侵入性的疾病生物标记和目标中和。在一个评价患者的实施方案中，将5名或更多患者的血样采集至用于核酸分析的试管中例如PAXgeneBloodRNA试管(SystemPreAnalytiX)并且可分离总RNA并通过本领域已知的任何方法分析基因表达，这些方法包括特异于至少CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF之一的特异探针。如果任何或所有这些基因的表达水平高于来自未表现特发性间质性肺炎患者的症状的年龄和性别匹配样本的两倍即可选择患者进行治疗。在另一个实施方案中，可基于与年龄和性别相匹配的正常志愿者相比任何或所有这些基因的表达的变化为2倍或更多来调节所选治疗患者的剂量选择。在本发明方法的另一个实施方案中，可基于与年龄和性别相匹配的正常志愿者相比任何或所有这些基因的表达的变化为2倍或更多来监测对疗法的响应。在另一个实施方案中，可/人表现特发性间质性肺炎症状的患者采集5ml的血液至血清收集管中。使用可商业购买的multiplex或ELISA试剂盒检测血清中的CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF之一或全部。如果任何或所有蛋白的表达水平大于年龄和性别匹配的正常志愿者的2倍即可选择患者进行治疗。另一方面，可基于与年龄和性别相匹配的正常志愿者相比CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF之一或全部的表达变化为2倍或更多来调节所选治疗患者的剂量选择。在另一方面，可基于与年龄和性别相匹配的正常志愿者相比CXCL5、IL-6、CCL2、IL13RA2、VEGF、IL-8和G-CSF之一或全部的表达变化为2倍或更多来监测对疗法的响应。给药途径给药途径根据已知和可接受的方法，例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、通过门静脉注射或输注，通过緩释或延释方式局部给药；通过透粘膜或透皮给药皮下注射，通过局部应用，鼻喷雾剂、栓剂等，或口服给药。在本发明的另一方面，可通过至少一个选自以下的方式给药肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、嚢内、软骨内、腔内、体腔内、脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜腔内、胸廓内、子宫内、膀胱内、损伤内、推注、阴道的、直肠的、口颊的、舌下的、鼻可凭经验寻找适合预防、緩解、逆转或停止有需要的患者中慢性排斥反应进程的抗-CCR2拮抗剂的剂量并取决于活性药剂的药效、制剂的浓度和给药后该药剂在受者体内有效水平的持续时间。疗程可为与急性方式相反的以持续方式进行的慢性或持续给药以将起始疗效(活性)维持更长的时间。或者，该治疗可为间断的或周期性的以提供急性拮抗剂活性阶段，之后为患者体内拮抗剂活性较低或无拮抗剂活性阶段。因此，剂量方案可以不同，这样可每周一次、两次、三次或更多次给予抗体并且持续任意周或者以每周一次，每两周一次，每三、四、五、六、七、/v、九或十周一次，多次(例如，二、三、四、五、六、七次)纟会予该抗体。就CCR2生物活性的单克隆抗体拮抗剂而言，通常以基于受者体重的量(例如每疗程O.l至100mg/kg之间)给予该药剂。根据本发明方法给予的抗体的治疗或预防有效量的示例性并非限制性范围为0.1-20mg/kg,更优选1-10mg/kg。在一个实施方案中，可以小于10mg/min，优选小于或等于5mg/min的速度静脉输注给予抗-CCR2或抗-CCL2抗体直至达到约1至500mg/m2的剂量，优选约10至400mg/m2,约18至350mg/m2,更优选约250-280mg/m2。可以单剂量或多剂量给予抗-CCR2或抗-CCL2抗体。组合疗法治疗没有具体的治疗证明对IPF有效。支持疗法由02治疗低氧血和抗生素治疗肺炎组成。后期疾病可使所选患者有资格进行肺移植。通常凭经验给予IPF患者皮质激素和细胞毒药物例如环磷酰胺(CYTOXAN)、硫唑嘌呤(IMURAN)以试图停止炎症进程，但是仅有限数据支持他们的功效。然而，通常用泼尼松(例如DELTASONE)(0.5至1.0mg/kg口服，每日一次持续3个月，在之后的3至6个月中逐渐减少至0.25mg/kg每日一次)与环磷酰胺或硫唑噤呤(l至2mg/kg口服每日一次)组合进行治疗。一年中每三个月评价临床的、放射照相的和生理学响应并且相应地增加或降低剂量。如果没有客观响应(objectiveresponse)则孑亭止治疗。抗纤维化剂曱苯吡啶酮可稳定化肺功能并减少恶化。抑制胶原合成(松弛素)、促纤维化生长因子(苏拉灭)和内皮素-1(血管紧张素受体阻断剂)的抗纤维变性药物被证明仅在体外有效。干扰素-y-lb与泼尼松组合在小组患者中显示出希望，但是更大规模的双盲多国随机化试验发现对无进展生存期、肺功能或生活质量没有作用。虽然已简要描述了本发明，仍在以下实施例中进一步公开本发明的实施方案。实施例1:纤维化和非-纤维化成纤维细胞为了表征与来自组织病理学的非纤维化肺组织的成纤维细胞相比的来自UIP患者的成纤维细胞的固有性质，评价来自一类或其它类型组织的原代成纤维细胞在未受激状态下和对已知纤维化病变介导因子，例如TGFbeta、PDGF-AB和CCL2响应下的标记。成纤维细胞分离和純化细胞系由密西根大学的CoryHogaboam博士提供。如之前所述分离所有的原代成纤维细胞系(Hogaboam等，1999JImmunol163(4):2193-201)。从取自UIP患者(『4)的肺活組织检查物分离肺成纤维细胞并将这些细胞称作"纤维化成纤维细胞"。也从肺肿瘤切除术(11=5)中取样的肺组织分离成纤维细胞并通过组织学分析确认这些样品为非纤维化的。这些衍生自非纤维化组织的成纤维细胞被称作"非纤维化成纤维细胞"。成纤维细胞基因表达NY)中并使其吸附8小时。然后用PBS洗涤细胞并在无血清培养基(含有l-谷氨酰胺的DMEM,青霉素/链霉素)中培养过夜。接着在存在或不存在TGFb-l(1或10ng/mL)、PDGF-AB(20或200ng/mL)或CCL2(1或10ng/mL)的条件下刺激细胞24小时。TGFbl、PDGF-AB和CCL2购自R&DSystems。去除上清并接着使用RNeasyPlusMini-Kits(QIAGEN，Valencia,CA)根据操作说明分离RNA并使用TaqMana逆转录试剂(AppliedBiosystems，FosterCity,CA)将RNA逆转录为cDNA。通过实时PCR4吏用TaqmanaUniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems)和预研发的Taqmana基因表达测定法(AppliedBiosystems)根据操作说明测定促纤维化基因表达。使用比较性CT法计算定量基因表达，其中CT值限定为第一次检测到基因表达的阈值循环数。首先将所关注基因的基因表达的倍数变化对管家基因18S标准化，得到ACT值。纤维化和非纤维化成纤维细胞表达的倍数变化按下式计算ACT(非纤维化)-ACT(纤维化)=AACT，其中非纤维化基因表达作为校准因子(calibrator)。归因于体外刺激的基因表达的倍数变化按下式计算AACT=ACT(未受激)-ACT(受激)，其中未受激样品作为校准因子。然后计算2-AACT得到与校准因子相比的最终倍数变化的相对值。为了测定与非纤维化(n-4)成纤维细胞相比UIP成纤维细胞(11=3)中的促纤维化基因表达中的基线表达是否存在差异，比较来自两组患者的未受激细胞之间的基因表达。如图1所示，衍生自UIP患者的成纤维细胞在所有被分析的基因中具有更高的基线纤维化基因表达。TGFbl在非纤维化和纤维化成纤维细胞中诱导aSMA,但是纤维化成纤维细胞中的诱导强度更大(图2)。PDGF仅在纤维化成纤维细胞中诱导aSMA表达的中度增加。CCL2也仅在纤维化成纤维细胞中诱导aSMA表达增加。为了测定UIP成纤维细胞是否表现水平增强的胶原基因表达，用CCL2刺激细胞。图3A和B显示CCL2在UIP成纤维细胞中诱导溶39胶原I和溶胶原III二者。此外，CCL2的基因诱导程度与TGFbl和PDGF-AB产生的作用具有可比性。已详细描述了TGFbl的促纤维化作用。TGFbl、PDGF和CCL2诱导TGFbl基因表达(图4)。自分泌环的TGFbl诱导是已知的并由非纤维化和纤维化成纤维细胞的现有数据支持。该实验进一步证明了CCL2也可增强TGFbl基因表达。如同TGFbl的情况一样，CCL2对TGFbl的基因诱导程度在纤维化成纤维细胞中更大。TGFbl、PDGF和CCL2诱导CTGF基因表达(图5)。TGFbl在纤维化和非纤维化成纤维细胞二者中诱导CTGF基因表达增加。此外，低剂量PDGF和CCL2诱导UIP成纤维细胞中CTGF基因表达增力口。TGFbl、PDGF和CCL2-诱导的TGFbRI和TGFbRII二者亚基基因表达显示于图6A和B。TGFbl对TGFbRI具有更大的作用而CCL2可诱导二者并且TGFbRII的增加更大。TGFbl、PDGF和CCL2-诱导的IL13Ral和IL13Ra2基因表达显示于图7A和B。TGFbl、PDGF和CCL2上调UIP成纤维细胞中的IL13Ral表达。经IL13Ra2的信号转导最近被证明可通过TGFbl的诱导而促纤维化。所有三种介导因子诱导IL13Ra2表达上调，藉此有可能使这些细胞对IL-13介导的应答更l文感。实施例2将来自IPF和非纤维化患者的肺组织切碎并放入含有20ml培养基(DMEMw/15%FCS，1%PSA,&L-谷氨酰胺)的T75cm组织培养瓶中。每周更换两次培养基直至形成细胞集落。将细胞分离并传代。第5次传代后进行试验。RNA分离在DMEM15%FCS1%Glutamax,1%青霉素链霉素中以lx105细胞在500ul/孔的24孔板中过夜培养成纤维细胞。在无血清DMEM中将细胞培养24小时。将培养基换成添加了人血清白蛋白的DMEM并将培养物温育24和/或48小时。为了收获RNA，使用RNeasymini试剂盒(Qiagen，Inc.Valencia,CA)根据操作说明裂解所培养细胞。使用2100BioAnalyzer(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)测定RNA的质和量。RT-PCR4吏用TaqMan试剂(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)才艮氺居方案进行逆转录反应，25。C反应10分钟，48。C反应30分钟，95。C反应5分钟。使用带有ABIPrism7900序列检测系统的定制ABI低密度阵列(一式两份根据试验需要的引物和探针(duplicateAssays-on-Demandprimersandprobes))进4亍实日于PCR。在AmpliTaqGoldDNA聚合酶(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)存在下，将反应物于50°C温育2分钟然后95°C温育10分钟。接着进行40个循环的反应，每个循环95。C15秒，60。Cl分钟。内源对照GAPDH用于使用DCT方法标准化样品以进行相对定量。免疫检测如上所述过夜培养成纤维细胞。取样上清使用LINCOplex人细胞因子/趋化因子30plexpanel(Millipore)、ENA-78Quantikine试剂盒和IL-13RA2ELISA试剂盒(R&D系统)进行冲企测。结果由RT-PCR在24小时评价来自7个IPF肺成纤维细胞系和5个非纤维化肺成纤维细胞系的cDNA以得出CXCL5、CCL2、IL13ra2和IL-6的相对表达。表1显示了各IPF细胞系对于非纤维化细胞系的平均dCt(靶Ct-GAPDHCt)的相对倍数表达。IPF细胞系126具有CXCL5、IL13ra2和IL-6的最高表达。7个细胞系中的6个CCL2表达大于或等于非纤维化细胞的两倍。5个细胞系的CXCL5和IL6表达水平大于或等于非纤维化细胞的两倍并且4个细胞系的IL13ra2表达大于或等于非纤维化细胞的两倍。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>蛋白质分析通过ELISA或multiplex检测5个UIP细胞系和5个非纤维化细胞系上清的IL-6、IL-8、CCL2、CXCL5、G-CSF和VEGF的蛋白质表达。表2和3以pg/ml显示了所有被检测细胞系的蛋白水平。纤维化细胞系148具有IL-6、IL-8、G-CSF、CCL2和VEGF的最高水平表达。细胞系126的CXCL5(16430pg/ml)最高。IL-8表达大于或等于所有5个细胞系非纤维化表达中值的2倍。CCL2和L-6表达大于或等于5个细胞系中4个非纤维化表达中值的2倍。G-CSF表达大于或等于2个细胞系非纤维化表达中值的2倍。VEGF表达大于或等于3个细胞系非纤维化表达中值的2倍。CXCL5表达大于或等于2个细胞系非纤维化表达(对于数值大于O者)中值的2倍。比较纤维化和非纤维化细胞系的中值表明纤维化和非纤维化细胞之间中值差异的相对强度方面IL8>IL6^CCL2>VEGF。表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>为了进一步确定这些介导因子之间的关系，用CCL2-中和抗体CNT0888(分别由SEQIDNO,27和28给出的重链和轻《连可变区组成)或无关同种型匹配的抗体处理纤维化细胞系126，并且将基因和蛋白表达水平与相同细胞系不存在抗体时相比。基因表达结果见表4，蛋白表达见表5。表4.<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表5.<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>抗-CCL2抗体(CNT0888)存在下不能准确检测CCL2，尽管可在治疗中监测抗-CCL2的存在。使用CNTO888的蛋白质减少的最高倍数为G-CSF(6803倍)。最低倍数为VEGF(4倍)G-CSF〉IL6=CXCL5>IL8〉VEGF。在多个时间点通过肺活组织检查监测疾病进程是不实际的。一组由CCL2减弱的促纤维化标记已得到鉴定并可于活体外加以测定以评价CCL2活性。使用已鉴定的标记作为替代标记，使得能够在治疗中监测抗体活性以辅助确定治疗选项例如剂量和时间。其次，我们已确定了IPF肺成纤维细胞种群中促纤维化基因/蛋白表达谱的大幅度差异性，其可指示对抗-CCL2疗法具有潜在响应性的患者亚群。使用促纤维化组的基因/蛋白作为疾病替代标记可提供疾病进程的定量和相对非侵入性量度标准。权利要求1.使用至少一种MCP-1拮抗剂在具有至少一种形式纤维化的患者中抑制至少一种人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的方法，其包括给予MCP-1抑制有效量的至少一种MCP-1拮抗剂。2.权利要求1的方法，其中所述MCP-1拮抗剂选自小分子和蛋白质。3.权利要求2的方法，其中所述小分子选自能阻断CCL2结合至CCR2B或抑制CCR1或CCL2自身的吲哚衍生物、环胺衍生物、脲基衍生物、杂环化合物、酰基苯胺或功能性吡咯。4.权利要求2的方法，其中所述蛋白选自可溶受体、抗体、肽、其片段或其融合蛋白。5.权利要求4的方法，其中所述蛋白进一步包含可增加所述蛋白血浆半衰期的化合物或蛋白。6.权利要求4的方法，其中所述抗体包含至少一个包含至少一个重链可变区和至少一个轻链的可变区，所述MCP-1抗体包含重链和轻链可变区二者，其包含SEQIDNO:27和28。7.权利要求4的方法，其中所述抗体包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述抗体包含SEQIDNO:6、7、9、13、14和16的所有重链和轻链互补决定区(CDR)氨基酸序列。8.权利要求4的方法，其中所述抗体包含至少一个包含至少一个重链和至少一个轻链的可变区，所述MCP-1抗体包含重链和轻链可变区二者，其包含SEQIDNO:27和28。9.权利要求4的方法，其中所述抗体包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述抗体包含SEQIDNO:6、7、9、13、14和16的所有的重链和轻链互补决定区(CDR)氨基酸序列。10.权利要求4的方法，其中所述抗体包含至少一条重链或轻链CDR,其具有至少SEQIDNO:6、7、9、13、14和16之一的氨基酸序列。11.权利要求4的方法，其中所述抗体包含至少SEQIDNO:2-5之一的重链或轻链可变区，其进一步包含重链或轻链的互补决定区(CDR)或选自SEQIDNO:6-26的其配体结合部分；并且4壬选与框架区功能性相关，进一步任选包含至少人免疫球蛋白的CH1、铰链、CH2或CH3。12.权利要求4的方法，其中所述抗体以选自至少1(T9M、至少1(T1QM、至少10"1M或至少l(T12M的至少之一的亲和力与MCP-1结合。13.权利要求4的方法，其中所述抗体实质上调节至少一个MCP-1多肽的至少一种活性。14.权利要求l的方法，其中所述小分子或蛋白以进一步包含至少一种药理学可接受载体或稀释剂的组合物形式提供。15.权利要求l的方法，其中所述方法进一步包括给予选自至少以下之一的至少一种化合物或多肽可检测标记或受体、TNF拮抗剂、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、体液或电解质平衡药物、血液学药物、抗肿瘤药、免疫调节药物、目艮、耳或鼻药物、局部用药物、营养产品、细胞因子或细胞因子拮抗剂。16.权利要求1的方法，其中所述抑制有效量为0.001-50mg/所述细胞、组织、器官或动物的公斤数。17.权利要求l的方法，其中所述给药通过至少一种选自以下的方式进行肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、嚢内、软骨内、腔内、体腔内、脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心月几内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜腔内、胸廓内、子宫内、膀胱内、损伤内，推注、阴道的、直肠的、口颊的、舌下的、鼻内的或经皮的。18.权利要求1的方法，其中所述纤维化为器官特异纤维化或系统纤维化。19.权利要求18的方法，其中所述器官特异纤维化至少与肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心纤维化、血管纤维化、皮肤纤维化、眼纤维化、骨髓纤维化或其他纤维化之一相关。20.权利要求19的方法，其中所述肺纤维化至少与药物诱导的肺纤维化、哮喘、肉状瘤病或慢性阻塞性肺病之一相关。21.权利要求19的方法，其中所述肝纤维化至少与肝^/f匕、血吸虫病肝硬变或胆管炎之一相关。22.权利要求21的方法，其中所述肝硬化选自丙型肝炎后肝硬化、原发性胆汁性肝硬化。23.权利要求22的方法，其中所述胆管炎为硬化性胆管炎。24.权利要求19的方法，其中所述肾纤维化与狼疮肾小球硬化症相关。25.权利要求19的方法，其中所述心纤维化与至少一种类型的心肌梗塞相关。26.权利要求19的方法，其中所述血管纤维化至少与血管成形术后动脉再狭窄或动脉粥样硬化之一相关。27.权利要求19的方法，其中所述皮肤纤维化至少与瘢痕瘤或肾原性纤维组织形成皮肤病之一相关。28.权利要求19的方法，其中所述眼纤维化至少与眶后纤维化、白内障手术后或增殖性玻璃体视网膜病变之一相关。29.权利要求19的方法，其中所述骨髓纤维化至少与特发性骨髓纤维化或药物诱导的骨髓纤维化之一相关。30.权利要求19的方法，其中所述其它纤维化选自帕荣雷氏病、杜氏掌腱膜挛缩症或皮肌炎。31.权利要求18的方法，其中所述系统纤维化选自系统硬化病和移纟直物抗宿主病。32.本文所述任何发明。全文摘要提供抗-MCP-1/CCR2拮抗剂疗法用于控制或逆转纤维化相关疾病，包括但不限于例如用于调节与纤维化进程包括胶原基质沉积和肺泡萎陷相关的促纤维化标记的MCP-1/CCR拮抗剂疗法。文档编号A61K39/395GK101616689SQ200780044419公开日2009年12月30日申请日期2007年10月5日优先权日2006年10月5日发明者A·达斯,F·塞德,L·默里申请人:森托科尔奥索生物科技公司