专利名称：产生提高的免疫应答的手段和方法
产生提高的免疫应答的手段和方法本发明涉及免疫学领域，特别是针对由例如感染所引起的疾病或者癌 症对患者进行治疗的免疫接种方法。本发明涉及通过免疫原性組合物(特 别是疫苗)提高在体内产生的免疫应答的方法和组合物。常规免疫接种技术已久为人知，其包括向动物系统中引入抗原(如肽、 蛋白质)，该抗原可诱导免疫应答，从而对所述动物提供针对例如感染的 保护。这些技术还包括开发活疫苗及灭活疫苗。活疫苗一般是感染原的经 减毒的非病原性形式，能够引发针对该感染原的病原形式的免疫应答。近年来，重组疫苗、特别是重组活疫苗的开发取得了进展，其中载体 编码和表达目的外源抗原。其中，基于重组病毒的载体已显示很有前途， 并在新疫苗的开发中发挥重要作用。已对许多病毒研究了其表达来自外源 病原体或肿瘤组织的蛋白质的能力，以及在体内诱导针对这些抗原的特异 性免疫应答的能力。这些基于基因的疫苗一般能刺激高效的体液和细胞免 疫应答，病毒栽体可能对于递送抗原编码基因以及促进和增强抗原呈递而 言都是有效的策略。为了作为疫苗载体，理想的病毒载体应该是安全的， 并能向免疫系统高效呈递所需的病原体特异性抗原。此外，载体系统必须 满足使其能够大规^f莫生产的标准。因此，目前已经出现了一些病毒疫苗栽 体，它们根据所提出的应用均具有相对的优点和局P艮性(重组病毒疫苗的综述参阅如Harrop和Carroll, 2006， Front Biosci.， 11， 804-817 ; Yokoyama 等，1997， J Vet Med Sci"59， 311-322)。在二十世纪九十年代初期观察到质粒DNA载体可在体内直接转染动 物细胞之后，已经进行了大量的研究来开发通过直接向动物中引入编码抗 原的DNA而基于4吏用DNA质粒来诱导免疫应答的免疫接种技术。这些通 称为DNA免疫接种的技术目前已经用于在大量疾病模型中引发保护性免疫应答。DNA疫苗的综述参阅Reyes-Sandoval和Ertl， 2001 (Current Molecular Medicine, 1， 217-243)。然而，在疫苗领域的 一个一般性问题是鉴定在接种的个体中诱导足够 强的免疫应答以保护免于感染和疾病的手段。因此，近年来已进行了大量工作来发现通过刺激免疫系统的某些关键 方面来发挥作用的新药物化合物，用于提高疫苗诱导的免疫应答。多数这 些化合物(称为免疫应答调节剂(IRM)或佐剂)似乎都通过基础免疫系 统机制，经由Toll样受体(TLR)诱导多种重要细胞因子的生物合成(例如 干扰素、白介素、胂瘤坏死因子等。参阅如Schiller等，2006， Exp Dermatol., 15， 331-341 )发挥作用。这些化合物已显示刺激迅速释放某些树突细胞、 单核细胞/巨噬细胞衍生细胞因子，还能刺激B细胞分泌在IRM化合物的 抗病毒及抗肿瘤活性中发挥重要作用的抗体。或者，已经提出了免疫接种策略，其中多数是基于引发-加强免疫接 种的方案。根据这些"引发-加强"的免疫接种方案，首先通过对患者施用 引发组合物对免疫系统进行诱导，然后通过施用另一种加强组合物进行加 强(参阅如EP1411974或US20030191076)。本申请人现已鉴定出新的免疫接种策略。根据第一个实施方案，本发 明涉及通过施用含有至少 一种靶标抗原的免疫原性组合物来治疗患者的 人类疾病的方法，其中所述患者选自包括以下患者的患者群已引起了针 对抗原的低至中度免疫应答(即，在先的免疫应答)、并且未接受任何在 先外源提供的药物免疫原性组合物的患者，所述组合物包含(i)所述靶标 抗原的全部或一部分和/或(ii)至少一种编码所述靶标抗原的重组载体。因此，本发明涉及通过施用包含至少一种靶标抗原的免疫原性组合物 来治疗患者中的人类疾病的方法，所述方法包括以下步骤-在患者群中选择患者，所述患者群包括以下患者已引发了针对抗 原的低至中度免疫应答(即，在先的免疫应答)、并且未接受任何在先外 源提供的药物免疫原性组合物的患者，所述组合物包含(i)所述靶标抗原 的全部或一部分和/或(ii)至少一种编码所述靶标抗原的重组载体，-对所选患者施用所述免疫原性组合物。根据另 一 实施方案，本发明涉及通过施用免疫原性组合物而在患者中 产生对至少一种靶标抗原的免疫应答(即所产生的免疫应答)用于治疗人类疾病的方法，所述患者选自包括以下患者的患者群已引发了针对抗原 的低至中度免疫应答(即，在先的免疫应答)、并且未接受任何在先外源 提供的药物免疫原性组合物的患者，所述组合物包含(i)所述靶标抗原的 全部或一部分和/或(ii)至少一种编码所述靶标抗原的重组载体。因此，本发明涉及通过施用免疫原性组合物而在患者中产生对至少一 种耙标抗原的免疫应答(即所产生的免疫应答)用于治疗人类疾病的方法， 所述方法包括以下步骤-在患者群中选择患者，所述患者群包括以下患者已引发了针对抗 原的低至中度免疫应答(即，在先的免疫应答)、并且未接受任何在先外 源提供的药物免疫原性组合物的患者，所述组合物包含(i)所述靶标抗原 的全部或一部分和/或(ii)至少一种编码所述靶标抗原的重组载体，-对所选患者施用所述免疫原性组合物。根据一个具体实施方案，所述患者群中的所述"所产生的免疫应答"和 "低至中度的免疫应答，，是针对肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原和/或病毒 抗原的。根据一个实施方案，所述患者群中的所述"所产生的免疫应答"和 "低至中度的免疫应答"是针对不同抗原的。根据一个具体实施方案，所述 患者群中的所述"所产生的免疫应答"和"低至中度的免疫应答"是针对MUC1抗原的。才艮据另一个具体实施方案，所述患者群中的所述"所产生 的免疫应答"和"低至中度的免疫应答"是T细胞免疫应答以及优选的 CD8+ (细胞毒T淋巴细胞)免疫应答。本申请全文中无数量词修饰的名词以表示"至少一个"、"一个或多个" 或"多个，，所述化合物或步骤的含义使用，除非其上下文另有说明。例如， 术语"细胞"包括多种细胞，包括其混合物。更具体地，"至少一个"和"一个 或多个"等于或大于1的数，特别是l、 2或3。本文中使用的全部术语"和/或，，均包括"和"、"或"以及"所述术语所指代要素的全部或任何其他组合"的含义。本文使用的术语"约"表示在20%之内，优选在10%之内，更优选在5%之内。术语"患者"指脊椎动物，特别是多种哺乳动物物种，包括但不仅限于 家畜、竟技动物、灵长类(包括人)。本文使用的术语"治疗"包括预防和/或治疗。相应地，本发明的免疫原 性组合或方法不仅限于治疗应用，并且可用于预防应用。"预防"不仅限于 防止立即发生的疾病(如感染性疾病)，还包括预防这些感染的长期后果， 例如;更化或癌症。活性化合物的"有效量，，或"足量，，是足以实现有益或期望的结果(包括 临床结果)的量。有效量可在一次或多次给药中施用。"治疗有效量"是实 现有益临床结果的量，包括但不仅限于緩解与病毒感染相关的一种或多种 症状以及预防疾病(例如预防感染的一种或多种症状)。根据另 一实施方案，本发明涉及通过施用免疫原性组合物而在患者中 产生针对靶标抗原的免疫应答(即，所产生的免疫应答)用于治疗人类疾 病的方法，其中所述患者选自包括以下患者的患者群已引发了针对所述 靶标抗原的低至中度免疫应答(即，在先的免疫应答)、并且未接受任何 在先外源提供的药物免疫原性组合物的患者，所述组合物包含(i)所述靶 标抗原的全部或一部分和/或(ii)至少一种编码所述靶标抗原的重组栽体。因此，本发明涉及通过施用免疫原性组合物而在患者中产生针对靶标 抗原的免疫应答(即，所产生的免疫应答)用于治疗人类疾病的方法，所 述方法包括以下步骤-在患者群中选择患者，所述患者群包括以下患者已引发了针对抗 原的低至中度免疫应答(即，在先的免疫应答)、并且未接受任何在先外 源提供的药物免疫原性组合物的患者，所述组合物包含(i)所述靶标抗原 的全部或一部分和/或(ii)至少一种编码所述耙标抗原的重组载体，-对所选患者施用所述免疫原性组合物。本文使用的术语"免疫原性组合物"、"疫苗组合物"、"疫苗"或相似术语可互换使用，指这样的药剂，其适于刺激/诱导/提高受试者的免疫系统， 以緩解当前的病症或者保护免于或降低当前或将来的伤害或感染(包括病 毒、细菌、寄生虫感染)，例如降低肿瘤细胞增殖或存活、降低病原体在 受试者中的复制或传播，或者可检测地减少与病症相关的不想要的症状、 延长患者的存活率。所述免疫原性组合物可含有(i)至少一种靶标抗原的 全部或一部分，和/或(ii)至少一种在体内表达至少一种异源核苷酸序列 (特别是编码至少一种靶标抗原的全部或一部分的异源核苷酸序列)的重 组载体。根据备选实施方案，本发明的免疫原性组合物包含(iii)单独或 与(i)和/或(ii)组合的至少一种免疫应答调节剂。这些免疫应答调节剂(IRM )的实例包括CpG寡核苷酸(参阅如US 6,194,388; US2006094683; WO 2004039829 )、脂多糖、聚肌苷:聚胞苷酸复合体(Kadowaki，等，2001， J. Immunol. 166， 2291-2295)以及已知诱导树突细胞和/或单核细胞/巨噬细 胞产生细胞因子的多肽和蛋白质。这些免疫应答调节剂(IRM)的其他实 例是有机小分子，例如咪唑并查啉胺(imidazoquinolinamine)、咪唑吡 口定胺(imidazopyridine amines) 、 6，7-稠合的环烷基咪唑并吡啶胺( cycloalkylimidazopyridineamine )、咪唑并萘咬胺(imidazonaphthyridine amine )、鳴峻并奮淋胺(oxazoloquinoline amine )、 塞唑并奮啉胺(thiazoloquinoline amine)和1，2-桥接的咪唑并奮啉胺(imidazoquinoline amine)(参阅如US 4,689,338; US 5,389,640; US 6,110,929和US 6,331,539)。本文使用的术语"抗原"或"耙标抗原"指能作为免疫应答之靶标的任何 物质，包括复杂抗原(例如肿瘤细胞、病毒感染的细胞等)。例如，抗原 可以是患者所产生的细胞介导和/或体液免疫的靶标。术语"抗原"或"靶标 抗原"包括病毒抗原、肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原、细菌抗原、寄生虫 抗原、变应原等的全部或一部分-病毒抗原包括如来自以下的抗原甲、乙、丙、丁和戊型肝炎病毒、 HIV、疱渗病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱瘆、乳头瘤病毒、EB病毒、流 感病毒、副流感病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、细小RNA病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、痘病毒、鼻病毒、风渗病毒、乳多空病毒(papovirus)、 腮腺炎病毒、麻渗病毒；已知病毒抗原的一些非限制性实例包括如下来 自HIV画1的抗原，例如tat、 nef、 gpl20或gpl60、 gp40、 p24、 gag、 env、 vif、 vpr、 vpu、 rev或其部分和/或组合；来自人疱渗病毒的抗原，例如gH、 gL、 gM、 gB、 gC、 gK、 gE或gD或其部分和/或组合或者来自HSV1或 HSV2的立即早期蛋白例如ICP27、 ICP47、 ICP4、 ICP36;来自巨细胞病 毒(特别是人巨细胞病毒)的抗原，例如gB或其衍生物；来自EB病毒的 抗原，例如gp350或其衍生物；来自水痘-带状疱渗病毒的抗原，例如gpl、 11、 111和IE63;来自肝炎病毒的抗原，如乙型肝炎、丙型肝炎或戊型肝 炎病毒抗原(例如HCV的包膜蛋白El或E2、核心蛋白、NS2、 NS3、 NS4a、 NS4b、 NS5a、 NS5b、 p7或其部分和/或组合)；来自人乳头瘤病 毒的抗原(例如HPV6,11，16,18,如L1、 L2、 El、 E2、 E3、 E4、 E5、 E6、 E7或其部分和/或组合)；来自其他病毒病原体的抗原，例如呼吸道合胞 体病毒(如F和G蛋白或其衍生物)，副流感病毒、麻渗病毒、腮腺炎病 毒、黄病毒属(如黄热病病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病 毒)或流感病毒细胞(例如HA， NP， NA或M蛋白，或其部分和/或组合)； -肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原包括但不仅限于癌、淋巴瘤、胚细 胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌症的更具体实例包括乳腺癌、前列腺癌、结 肠癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶 质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、结肠直肠癌、子 宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和多种类型 的头颈癌、直肠癌、恶性黑素瘤、喉癌、前列腺癌。癌抗原是可以刺激明 显的肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码(但 不一定表达)。这些抗原可表征为在正常细胞中通常沉默(即不表达)的 抗原，仅在分化的某个阶段表达的抗原，以及时序表达的抗原，例如胚胎 抗原和胎儿抗原。另一些抗原由突变的细胞基因编码，例如癌基因(例如 活化的ras癌基因)、抑制基因(例如突变的p53)、由内部缺失或染色 体易位产生的融合蛋白。另一些癌抗原可由病毒基因编码，例如RNA和DNA肿瘤病毒上携带的抗原。肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的一些非限制性 实例包括MART-1/Melan-A、 gp100、 二肽基肽酶IV (DPPIV)、腺苷脱氨 酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b (cyclophilin b)、结肠直肠相关抗原 (CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和 CAP-2、 etv6、 amll、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、 PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、 T细胞受体/CD3-;链、 MAGE家族肿瘤抗原(例如MAGE-A1 、 MAGE-A2 、 MAGE-A3 、 MAGE-A4、 MAGE-A5、 MAGE-A6、 MAGE國A7、 MAGE-A8、 MAGE画A9、 MAGE-AIO、 MAGE-All、 MAGE-A12 、 MAGE-Xp2 (MAGE-B2)、 MAGE-Xp3 (MAGE-B3) 、 MAGE-Xp4 (MAGE-B4) 、 MAGE-C1 、 MAGE-C2、 MAGE國C3、 MAGE-C4、 MAGE画C5)、 GAGE家族肿瘤抗原 (例如GAGE-1、 GAGE-2、 GAGE-3、 GAGE 4、 GAGE-5、 GAGE画6、 GAGE-7、 GAGE-8、 GAGE-9)、 BAGE、 RAGE、 LAGE-1、 NAG、 GnT-V、 MUM-1、 CDK4、酪氨酸酶、p53、 MUC家族(例如MUC-1)、 HER2/neu、 p21ras、 RCAS1、甲胎蛋白、E-钙黏着蛋白、a-联蛋白、卩-联蛋白和Y-联 蛋白、pl20ctn、 gp鳳sup.Pme1117、 PRAME、 NY-ESO-l、 cdc27、腺瘤 性结肠息肉病蛋白(APC)、胞影蛋白、连接蛋白37、 Ig-独特型、p15、 gp75、 GM2和GD2神经节苷脂；病毒产物如人乳头瘤病毒蛋白、Smad家族肿 瘤抗原、lmp-l、 P1A、 EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸酶、SSX-1、 SSX-2 (HOM-MEL-40)、 SSX画1、 SSX画4、 SSX画5、 SCP画1和CT-7以及 c-erbB-2;
-细菌抗原包括如来自以下的抗原导致TB和麻风病、肺膨出的分 枝杆菌；需氧革兰氏阴性芽孢杆菌、支原体、葡萄球菌感染、链球菌感染、 沙门氏菌、衣原体、奈瑟菌；
-其他抗原包括如来自痴疾、利什曼病、锥虫病、弓形虫病、血吸虫 病、丝虫病的抗原；
变应原指可在敏感受试者中引发变应性或哮喘应答的物质。变应原的 列表十分广泛，可包括花粉、昆虫毒液、动物皮屑、真菌孢子和药物(如青霉素)。天然的动物和植物变应原的实例包括但不仅限于在以下属特异
性的蛋白犬科动物(家犬(Canis familiaris ));表皮螨属 (Dermatophagoides )(例如，粉尘螨(Dermatophagoides farinae ));猫 属(Felis )(家猫(Felis domesticus ) ); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; 黑麦草属(Lolium)(例如，多年生黑麦草(Lolium perenne )或多花黑麦 草(Lolium multiflorum ));杉p杉属(Cryptomeria )(日本杉卩杉(Cryptomeria japonica ));链格孢属(Alternaria )(链格孢(Alternaria alternata )); 赤杨；才岂木属(欧洲桤木(Alnus gultinoasa ));桦木属(Betula verrucosa); 栎属(Quercus )(白栎(Quercus alba ));木犀榄属(Olea )(油橄榄(Olea europa )); 蒿属(Artemisia)(艾蒿(Artemisia vulgaris)); 车前草属 (Plantago )(例如长叶车前(Plantago lanceolata ));墙草属(Parietaria ) (例如Parietaria officinalis或Parietaria judaica); 蜚嫌(Blattella )(例如 德国小蠊(Blattella germanica ));蜜蜂属(Apis )(例如Apis multiflorum); 柏木属(Cupressus )(例^(口地中海柏木(Cupressus sempervirens ), 绿干 柏(Cupressus arizonica )和大果柏木(Cupressus macrocarpa )); 刺柏 属(Juniperus )(例如Juniperus sabinoides、 Juniperus virginiana、 欧洲 糸'J柏(Juniperus communis )和阿希糸寸柏(Juniperus ashei) ); Thuya (例 :i口 Thuya orientalis); 扁4白属 (Chamaecyparis ) ( ，J ^口日本扁4白 (Chamaecyparis obtusa )); 大蠊属(Periplaneta )(例如美洲大蠊 (Periplaneta americana ));》K草属(Agropyron )(侈寸长口4匿麦草(Agropyron ));黑麦属(Secale)(例如黑麦(Secalecereale));小麦属(Triticum ) (例如普通小麦(Triticum aestivum ));鸭茅属(Dactylis )(例如鸭茅(Dactylis glomerata));羊茅属(Festuca )(例如牛尾草(Festuca elatior));早熟 禾属(Poa)(例如草地早熟禾(Poa pratensis)或加拿大早熟禾(Poa compressa)); 燕麦属(Avena)(例如燕麦(Avena sativa)); 绒毛草属 (Holcus)(例如绒毛草(Holcus lanatus ));黄花茅属(Anthoxanthum ) (例如黄花茅(Anthoxanthum odoratum)); 燕麦草属(Arrhenather扁) (例如燕麦草(Arrhenatherum elatius ));剪股颖属(Agrostis)(例如小糠草(Agrostis alba ));梯牧草属(Phleum )(例如梯牧草(Phleum pratense )); 草A属(Phalaris )"列吵口草,(Phalaris arundinacea ));雀牙年属(Paspalum ) (例如Paspalum notatum);蜀黍属(例如石茅高粱(Sorghum halepensis )); 和雀麦属(Bromus )(例如无芒雀麦(Bromus inermis ))。
根据一个具体实施方案，所述靶标抗原由异源核苷酸序列编码，并由 重组载体在体内表达。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的异源核苷酸序列编码一种或 多种以下革巴标抗原的全部或一部分HBV-PreSl、 PreS2和表面包膜蛋白、 核心及polHIV-gp120 gp40、 gpl60、 p24、 gag、 pol、 env、 vif、 vpr、 vpu、 tat、 rev、 nef;HPV画El、 E2、 E3、 E4、 E5、 E6、 E7、 E8、 Ll、 L2 (参阅 如WO 90/10459、 WO 98/04705、 WO 99/03885); HCV包膜蛋白El或E2、 核心蛋白、NS2 、 NS3 、 NS4a、 NS4b、 NS5a、 NS5b、 p7(参阅如WO2004111082、 WO2005051420); Muc-l(参阅如US 5，861，381; US6，054，438; WO98/04727; WO98/37095)。
根据本发明的 一 些变型，所述免疫原性组合物含有至少两种靶标抗 原，或者编码至少两种耙标抗原的异源核苷酸序列，或者编码至少两种靶 标抗原的至少两种异源核苷酸序列，或其任意组合。
根据另一具体实施方案，本发明的所述异源核苷酸序列编码HPV抗
原的全部或一部分，所述HPV抗原选自HPV的E6早期编码区、HPV的 E7早期编码区及其衍生物或组合。
本发明重组栽体所编码的HPV抗原选自HPV E6多肽、HPVE7多肽， 或者同时有HPV E6多肽和HPV E7多肽。本发明包括使用与p53之结合 发生改变或至少显著降低的任何HPV E6，和/或使用与Rb之结合发生改 变或至少显著降低的任何HPV E7多肽(Munger等，1989， EMBO J. 8， 4099-4105; Crook等，1991， Cell 67， 547-556; Heck等，1992， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 4442-4446; Phelps等，1992， J. Virol. 66， 2148-2427 )。 适用于本发明目的的一种非癌基因HPV-16 E6变体缺失了位于约118位至 约122位(+l代表天然HPV-16 E6多肽的第一个甲硫氨酸残基)的一个或多个氨基酸残基，尤其优选完全缺失118至122位残基(CPEEK)。适 用于本发明目的的一种非癌HPV-16 E7变体缺失了位于约21位至约26位 (+1代表天然HPV-16 E7多肽的第一个氨基酸)的一个或多个氨基酸残 基，尤其优选完全缺失21至26位残基(DLYCYE)。根据一个优选的实 施方案，用于本发明的一种或多种HPV-16早期多肽经进一步々务饰，以改 善I类MHC和/或II类MHC呈递，和/或刺激抗HPV免疫。HPVE6和 E7多肽是核蛋白，之前已显示膜呈递可以改善其治疗效力(参阅如 WO99/03885)。因此，将至少一种HPV早期多肽修饰成锚着在细胞膜上 是可取的。膜锚着可通过在该HPV早期多肽中掺入膜锚着序列(如果天 然多肽中缺少该序列，则掺入分泌序列，即信号肽)来容易地实现。膜锚 着序列和分泌序列为本领域已知。简言之，分泌序列存在于位于膜上或分 泌的多肽的N端，并起始其通过内质网(ER)。它们通常含有15至35 个基本为疏水性的氨基酸，其后通过位于ER上的特异性内肽酶除去，得 到成熟多肽。膜锚着序列通常为高疏水性质，并用于将多肽锚定在细胞膜 上(参阅如Branden和Tooze， 1991， Introduction to Protein Structure p. 202-214, NY Garland)。
可用于本发明上下文的膜锚着序列及分泌序列的选择十分广泛。它们 可得自任何包含它的膜锚着多肽和/或分泌多肽(例如细胞或病毒多肽)， 例如狂犬病糖蛋白、HIV病毒包膜糖蛋白和/或麻瘆病毒F蛋白，或者可 以是合成的。插入本发明所用早期HPV-16多肽中的膜锚着序列和/或分泌 序列可具有共同或不同的来源。优选插入分泌序列的位点是翻译起始密码 子的N端下游，膜锚着序列的则为C端，例如紧接终止密码子之后的上游。
本发明使用的HPV E6多肽优选地通过插入麻渗F蛋白的分泌和膜锚 着信号来进行修饰。任选地或与其组合地，本发明使用的HPVE7多肽优 选地通过插入狂犬病糖蛋白的分泌和膜锚着信号来进行〗务饰。
还可以通过使用一种或多种编码免疫促进剂多肽的核酸来提高重组 载体的治疗效力。例如，可以有利地将HPV早期多肽与诸如以下的多肽 连接钙网蛋白(Cheng等，2001，J. Clin. Invest 108,669-678)、结核分枝杆菌热休克蛋白(HSP70) (Chen等，2000, Cancer Res. 60， 1035-1042)、泛蛋白 (Rodriguez等，1997， J. Virol. 71， 8497-8503)或者细菌毒素的转运结构域， 例如铜绿假单胞菌外毒素A (ETA(dIII))(Hung等，2001 Cancer Res. 61， 3698-3703)。
根据另一优选的实施方案，本发明的重组载体包含编码上述一种或多 种早期多肽(特别是HPV-16和/或HPV-18早期E6和/或E7多肽)的核酸。
根据另一具体实施方案，本发明的所述异源核苷酸序列编码MUC1 抗原的全部或一部分或其衍生物。
根据另 一具体实施方案，本发明的所述异源核苷酸序列编码一种或多
种以下抗原的全部或一部分HCV包膜蛋白El或E2、核心蛋白、NS2、
NS3、 NS4a、 NS4b、 NS5a、 NS5b、 p7或其衍生物。根据另一具体实施方
案，本发明的所述异源核苷酸序列编码一种或多种融合蛋白，其中构型是
非天然的至少一个NS多肽以不同于天然构型的顺序出现。因此，如果
该融合蛋白包含NS3多肽、NS4A多肽和NS5B多肽，则天然构型将是
NS3-NS4A-NS5B， NS3在N端，NS5B在C端。相反，非天然构型可以
是NS5B-NS3-NS4A 、NS5B-NS4A-NS3 、NS4A-NS3-NS5B 、
NS4A-NS5B-NS3或NS3-NS5B-NS4A。具体地，本发明的融合蛋白包含以 下至少一种
o与NS3多肽的N端直接融合或通过接头融合的NS4A多肽； o 与NS5B多肽的N端直接融合或通过接头融合的NS3多肽； o与NS5B多肽的N端直接融合或通过接头融合的NS4B多肽A; o 与NS3多肽的N端直接融合或通过接头融合的NS4A多肽，所
述NS3多肽与NS4B多肽的N端直接融合或通过接头融合；和/
或
o 与NS4B多肽的N端直接融合或通过接头融合的NS3多肽，所
述NS4B多肽与NS5B多肽的N端直接融合或通过接头融合。 在本发明融合蛋白的这些特定部分中，每个NS多肽可独立地是天然的或修饰的。例如，NS4A-NS3部分中包含的NS4A多肽可以是天然的， 而NS3多肽包含下述修饰中至少一种。
必要时，用于本发明的核酸分子可以进行优化，以在特定宿主细胞或 生物(例如人宿主细胞或生物)中提供耙标抗原(如HPV早期多肽)的 高水平表达。密码子优化一般通过将哺乳动物宿主细胞中较少使用的一个 或多个"天然"(例如HPV)密码子替换为一个或多个更频繁使用的编码相 同氨基酸的密码子来进行。这可通过常规诱变或通过化学合成技术(例如 产生合成核酸)来实现。没有必要替换对应于较少使用密码子的所有天然 密码子，因为即使部分替换也可实现提高的表达。此外，可以产生与严格 遵从优化的密码子使用的一些偏离，用于适应限制性位点的引入。
本文使用的术语"重组载体"指病毒及非病毒的载体，包括染色体外(如 附加体)、多拷贝和整合型栽体(即，整合进宿主染色体中)。本发明中 特别重要的是用于基因治疗的载体(即，能将核酸递送至宿主生物的载体) 以及用于多种表达系统的表达载体。合适的非病毒载体包括质粒，例如 pREP4， pCEP4 (Invitrogene)， pCI (Promega)， pCDM8 (Seed, 1987， Nature 329， 840)， pVAX和pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi等，2002， J. Virol. 76， 12735-12746)。合适的病毒载体可来自多种不同病毒(例如逆转 录病毒、腺病毒、AAV、痘病毒、疱渗病毒、麻渗病毒、泡沫病毒等。本 文使用的术语"病毒载体，，包括载体DNA/RNA以及由其产生的病毒颗粒。 病毒载体可以有复制活性，或者可以在遗传上使其失去能力，从而成为复 制缺陷的或复制受损的。本文使用的术语"有复制活性"包括复制选择性及 条件性复制的病毒载体，它们被改造成在特定的宿主细胞(如肿瘤细胞) 中更好地复制或选择性复制。
在一个方面中，用于本发明的重组载体是重组腺病毒载体(综述参阅 "Adenoviral vectors for gene therapy", 2002, D. Curiel和J. Douglas编辑， Academic Press)。它可来自多种人或动物来源，并且从腺病毒血清型1至 51的任何血清型均可使用。特别优选的是人腺病毒2(Ad2)、 5(Ad5)、 6(Ad6)、 ll(Adll)、 24(Ad24)和35(Ad35)。这些腺病毒可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Md.)，并且已有大量文献描述其序列、组 织及产生方法，使得本领域技术人员能够应用它们(参阅如US6，133，028; US 6,110,735; WO 02/40665; WO 00/50573; EP 1016711; Vogels等，2003， J. Virol. 77， 8263-8271 )。
用于本发明的腺病毒可以有复制活性。有复制活性的腺病毒载体的多 种实例易于为本领域技术人员获得(参阅如Hernandez-Alcoceba等，2000， Human Gene Ther. 11， 2009-2024; Nemunaitis等，2001， Gene Ther. 8， 746-759; Alemany等，2000, Nature Biotechnology 18， 723-727)。例如，可 通过以下方法从野生型腺病毒基因组中改造它们缺失E1A CR2结构域 (参阅如WO00/24408)和/或将天然El和/或E4启动子替换为组织、肿 瘤或细胞状态特异性启动子(参阅如US 5,998,205， WO99/25860, US 5,698,443， WO00/46355, WO00/15820和WO01/36650 )。
或者，用于本发明的腺病毒栽体可以是复制缺陷型的(参阅如 W094/28152; Lusky等，1998， J. Virol 72， 2022-2032 )。优选的复制缺陷型 腺病毒载体为E1缺陷型(参阅如US 6，136，594和US 6,013,638) ， El缺 失大致从459位延伸至3328位，或大致从459位延伸至3510位(人5型 腺病毒的序列公开于GenBank登记号M73260以及Chroboczek等，1992， Virol. 186， 280-285 )。可以通过缺失腺病毒基因组的其他部分(非必需E3 区或其他必需E2、 E4区的全部或一部分)来进一步提高克隆容量。可以 如Chartier等(1996， J. Virol. 70， 4805-4810)所述通过同源重组在腺病毒 载体的任何位置插入核酸。例如，可将编码HPV-16 E6多肽的核酸替换 El区插入，并将编码HPV-16 E7多肽的核酸替换E3区插入，或反之亦然。
在另一优选的方面，用于本发明的载体为痘病毒载体(参阅如Cox等 "Viruses in Human Gene Therapy" Ed J. M. Hos， Carolina Academic Press)。根据另一优选的实施方案，其选自痘苗病毒，合适的痘苗病毒包 括但不仅限于哥本哈根毒林(Goebel等，19卯，Virol. 179， 247-266和 517-563; Johnson等，1993， Virol. 196， 381-401)、 Wyeth毒林以及由它们产 生的高度减毒的病毒，包括MVA(综述参阅Mayr， A.，等，1975， Infection 3，6-14)及其衍生物(例如MVA痘苗林575 (ECACC V00120707 - US 6,913,752)、NYVAC (参阅WO 92/15672 - Tartaglia等，1992， Virology, 188， 217-232)。对MVA基因组完整序列的测定以及与哥本哈根VV基因组的比 较使得可以精确地鉴定在MVA基因组中存在的7个缺失(I至VII) (Antoine等，1998， Virology 244， 365-396)，其中任何一个都可用于插入编 码抗原的核酸。该载体还可得自痘病毒科的任何其他成员，特别是禽痘(例 如TROVAC,参阅Paoletti等，1995， Dev Biol Stand., 84， 159-163);金丝雀 痘(例如ALVAC， WO 95/27780， Paoletti等，1995， Dev Biol Stand" 84, 159-163);鴒痘；猪痘等。例如，本领域技术人员可参考WO 92 15672 (通 过参考并入本文)，其描述了基于痘病毒产生能表达这些异源核苷酸序列
(特别是编码抗原的核苷酸序列)的表达载体。
在痘病毒基因组中插入核酸及表达所需相关调节元件的基本技术描 述于本领域技术人员可获得的大量文献中(Paul等，2002， Cancer gene Ther. 9， 470-477; Piccini等，1987， Methods of Enzymology 153， 545-563 ; US 4,769,330 ; US 4,772,848 ; US 4,603,112 ; US 5,100,587和US 5,179,993)。 一般通过病毒基因组与带有待插入核酸的质粒之间所存在重叠 序列(即，期望的插入位点)之间的同源重组来进行。
编码本发明抗原的核酸优选地插入痘病毒基因组的非必需基因座中， 以使重組痘病毒保留活性和感染性。非必需区是非编码的基因间区域，或 者是其失活或缺失不显著损害病毒的生长、复制或感染的任何基因。还可 以设想插入必需的病毒基因座中，只要缺陷功能在病毒颗粒的产生过程中 以反式提供即可，例如使用辅助细胞来提供，其带有对应于痘病毒基因组 中所缺失序列的补充序列。
在使用哥本哈根痘苗病毒时，抗原编码核酸优选插入胸苷激酶基因
(tk )中(Hruby等，1983， Proc. Natl. Acad. Sci USA 80， 3411-3415 ; Weir 等，1983， J. Virol. 46， 530-537)。然而，其他插入位点也是合适的，例如在 血凝素基因中(Guo等，1989， J. Virol. 63, 4189-4198)、在KIL基因座中、 在u基因中(Zhou等，1990, J. Gen. Virol. 71， 2185-2190)或者痘苗病毒基因组的左侧末端，这里已经在文献中报道了多种自发或改造的缺失
(Altenburger等，1989， Archives Virol. 105， 15-27; Moss等1981， J. Virol. 40， 387-395 ; Panicali等，1981， J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus等，1989, J. Virol. 63, 3829-3836; Perkus等，1990， Virol. 179， 276-286; Perkus等，1991， Virol. 180， 406-410)。
在使用MVA时，抗原编码核酸可插入已鉴定的缺失I至VII中的任 一个或插入D4R基因座，但插入缺失II或III中是优选的(Meyer等，1991， J. Gen. Virol. 72,1031-1038; Sutter等，1994， Vaccine 12， 1032-1040)。
使用禽痘病毒时，尽管可以考虑插入胸苷激酶基因中，但抗原编码核 酸优选导入ORF 7和9之间的基因间区域(参阅如EP 314 569和US 5,180,675)。
# 据一个具体实施方案，所述重组栽体是重组质粒DNA或重组表病 毒载体。
根据另一具体实施方案，所述重组病毒载体是重组腺病毒载体。 根据另一具体实施方案，所述重组病毒载体是重组牛痘载体。 根据另一具体实施方案，所述重组病毒载体是重组MVA栽体。 优选地，用于本发明的抗原编码核酸为适于在宿主细胞或生物中表达 的形式，这意味着，编码抗原的核酸序列处于其在宿主细胞或生物中表达 所需的一个或多个调节序列的控制之下。本文使用的术语"调节序列"指任 何序列，其允许、促进或调节核酸在给定宿主细胞中的表达，包括复制、 转录、剪接、翻译、稳定性和/或将核酸或其衍生物之一 (如mRNA)转 运进宿主细胞。本领域技术人员会理解，调节序列的选择可取决于各种因 素，例如宿主细胞、栽体和期望的表达水平。编码抗原的核酸与指导该抗 原核酸在真核细胞中表达的基因表达序列有效连接。基因表达序列是有利
如启动子序列或启动子-增强子组合。例如，基因表达序列可以是哺乳动物 或病毒的启动子，例如组成型或诱导型启动子。组成型哺乳动物启动子包 括但不仅限于以下基因的启动子次黄噤呤磷酸核糖基转移酶(HPRT )、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、b-肌动蛋白启动子和其他组成型启动子。发挥
组成型功能的示例性病毒启动子包括如来自以下的启动子巨细胞病毒 (CMV)、猿猴病毒(例如SV40)、乳头瘤病毒、腺病毒、人免疫缺陷 病毒(HIV)、劳斯肉瘤病毒、巨细胞病毒、莫洛尼白血病病毒和其他逆 转录病毒的长末端重复(LTR)，以及单純疱渗病毒的胸苷激酶启动子。 其他组成型启动子为本领域普通技术人员所知。可用作本发明基因表达序 列的启动子还包括诱导型启动子。诱导型启动子在诱导物存在下表达。例 如，金属硫蛋白启动子在某些金属离子存在下被诱导转录和翻译。其他诱 导型启动子为本领域普通技术人员所知。 一般地，如需要，基因表达序列 应包括分别涉及转录和翻译的起始的5，非转录和5，非翻译序列，例如 TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。特别地，这些5，非转录序列将包括 启动子区，其包括用于对有效连接的抗原核酸进行转录控制的启动子序 列。根据需要，基因表达序列任选地包括增强子序列或上游激活子序列。 用于痘病毒载体(见下文)的优选启动子包括但不仅限于牛痘启动子7.5K、 H5R、 TK、 p28、 pll和K1L，早期和晚期痘病毒之间的嵌合启动子以及 合成启动子，如Chakrabarti等(1997, Biotechniques 23， 1094-1097)、 Hammond等(1997， J. Virological Methods 66， 135-138)以及Kumar和 Boyle (1990， Virology 179,151國158)所述。
启动子特别重要，本发明包括使用指导核酸在许多宿主细胞类型中表 达的组成型启动子以及指导仅在某些宿主细胞中表达或应答于特定事件 或外源因素(如温度、养分添加、激素或其他配体)而表达的启动子。合 适的启动子广泛描述于文献中，值得一提的是病毒启动子，如RSV、 SV40、 CMV和MLP启动子。用于痘病毒载体的优选启动子包括但不仅限于牛痘 启动子7.5K、 H5R、 TK、 p28、 pll和K1L，早期和晚期痘病毒之间的嵌 合启动子以及合成启动子，如Chakrabarti等(1997， Biotechniques 23， 1094-1097)、 Hammond等(1997， J. Virological Methods 66， 135國138)以及 Kumar和Boyle (1990， Virology 179， 151-158)所述。
本领域技术人员会理解，控制本发明核酸分子表达的调节元件还可包含用于调节以下的元件宿主细胞或生物中的正确起始、调节和/或终止转 录(如多聚A转录终止序列)、mRNA运输(如核定位信号序列)、加工 (如剪接信号)、稳定性(如内含子和非编码5，及3，序列)、翻译(如肽 信号、前肽、三联先导序列、核糖体结合位点、Shine-Dalgamo序列等)。 或者，用于本发明的重组载体还可包含编码至少 一种细胞因子的至少 一种核酸。合适的细胞因子包括但不仅限于白介素(如IL-2， IL-7， IL-15, IL-18, IL-21)和干扰素(如IFN丫， INFa)，特别优选白介素IL-2。当本 发明的重组疫苗包含表达细胞因子的核酸时，所述核酸可由编码一种或多 种抗原的重组载体携带，或者由可为相同或不同来源的独立的重组栽体携 带。
包含上述重组病毒栽体的感染性病毒颗粒可通过常规方法产生。示例 性方法包括以下步骤
a. 将病毒载体引入合适的细胞系中，
b. 在适当条件下培养所述细胞系，以允许产生所述感染性病毒颗粒，
c. 从所述细胞系的培养物中回收所产生的感染性病毒颗粒，和
d. 任选地纯化所回收的感染性病毒颗粒。
适用于增殖腺病毒载体的细胞为例如293细胞、PERC6细胞、HER96 细胞或者WO 94/28152， WO 97/00326， US 6,127,175中公开的细胞。
适用于增殖痘病毒载体的细胞为禽类细胞，最优选由得自受精卵的鸡 胚制备的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)。
感染性病毒颗粒可从培养物上清液中回收或者在裂解后从细胞中回 收(例如通过化学方法、冻融、渗透压休克、机械休克、超声处理等)。 病毒颗粒可通过连续的斑点純化轮次来分离，接着使用本领域的技术纯化 (层析法、在氯化铯或蔗糖梯度上超速离心)。
根据一个具体实施方案，本发明涉及上述方法，其中所述人类疾病为 癌症。
根据一个优选的实施方案，所述癌症为例如乳腺癌、结肠癌、肾癌、 直肠癌、肺癌、头颈癌、肾癌、恶性黑素瘤、喉癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、非小细胞肺癌。
根据一个具体实施方案，本发明涉及上述方法，其中所述人类疾病为 感染性疾病。
根据一个优选的实施方案，所述感染性疾病为病毒诱发的疾病，例如
HIV、 HCV、 HBV、 HPV等诱发的疾病。
本文使用的术语"低至中度免疫应答，，为本领域技术人员所熟知。更具 体地，它指在给定的标准免疫测定中的定性和/或定量测量，所述测定为例 如增殖测定中的刺激指数、ELISA或流式细胞术中的细胞因子产生、CTL 测定、ELISPOT测定、通过ELISA测量的抗体产生、通过流式细胞术或 显微术评价的细胞表面标志物表达的调节。所述"低至中度免疫应答"或者 在施用于患者后i秀导免疫应答(如抗HPV或抗HCV或抗MUC1免疫应 答)的能力可在体外或在体内使用多种测定来评价，这些测定是本领域的 标准技术。对可用于评价免疫应答之发生和激活的技术的一般性描述可参 阅:i口 Coligan等(1992和1994， Current Protocols in Immunology ; J Wiley & Sons Inc， National Institute of Health)。对细月包免疫的测量可通过测量活 化的效应细胞所分泌的细胞因子镨(包括来自CD4+和CD8+T细胞的(例 如通过ELIspot定量产生IL-10或IFNy的细胞)来进行，所述测量通过 确定免疫效应细胞的活化状态(例如通过标准pH胸苷摄取进行的T细胞 增殖测定)、通过测定致敏受试者中的抗原特异性T淋巴细胞(例如细胞 毒性测定中的肽特异性裂解)来进行。刺激体液应当的能力可通过抗体结 合和/或补体结合来测定(参阅如Harlow， 1989， Antibodies, Cold Spring Harbor Press )。本发明的方法还可在以适当的肿瘤诱导剂(如表达HPV-E6 和E7的TCI细胞)攻击的动物模型中进行证实，以确定抗肿瘤活性，反 映对免疫应答的诱导或增强。
根据一个具体实施方案，所述"低至中度免疫应答"是体液免疫应答。 根据另一具体实施方案，所述"低至中度免疫应答"是细胞免疫应答， 更特别地是T细胞免疫应答，更特别地是CD8+ (细胞毒T淋巴细胞)免疫 应答。根据一个优选的实施方案，所述"低至中度免疫应答"是针对至少 一种 抗原(特别是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原和/或病毒抗原，在一个具体 实施方案中是所述靶标抗原)的特异性免疫应答。在一个具体情况下，所
述靶标抗原是MUC1。
在另一实施方案中，提供了包含靶标抗原的全部或部分的免疫原性组 合物用于制备药物的用途，所述药物用于在特定患者群中治疗患者的人类
(即在先的免疫应答)并且之前未接受过任何外源提供的药物免疫原性组 合物，其包含(i)该靶标抗原的全部或部分，和/或(ii)至少一种编码所 述靶标抗原的重组载体。
在另一实施方案中，提供了免疫原性組合物用于制备药物的用途，所 述药物用于在特定患者群中产生对靶标抗原的免疫应答(即，所产生的免 疫应答)用于治疗患者的人类疾病，其中所述群中的患者已引发了针对所 述抗原的低至中度免疫应答(即在先的免疫应答)并且之前未接受过任何 外源提供的药物免疫原性组合物，其包含(i)所述靶标抗原的全部或部分， 和/或(ii)至少一种编码所述靶标抗原的重组载体。
在另一实施方案中，提供了免疫原性组合物用于制备药物的用途，所 述药物用于在特定患者群中产生对靶标抗原的免疫应答(即，所产生的免 疫应答)用于治疗患者的人类疾病，其中所述群中的患者已引发了针对所 述革巴标抗原的低至中度免疫应答(即在先的免疫应答)并且之前未接受过 任何外源提供的药物免疫原性组合物，其包含(i)所述抗原的全部或部分， 和/或(ii)至少一种编码所述抗原的重组载体。
根据一个具体实施方案，所述患者群中的所述"所产生的免疫应答"和 "低至中度免疫应答"是针对肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原和/或病毒抗 原的。根据一个实施方案，所述患者群中的所述"所产生的免疫应答"和"低 至中度免疫应答"是针对不同抗原的。根据一个具体实施方案，所迷患者群 中的所述"所产生的免疫应答"和"低至中度免疫应答"均针对MUC1抗原。 根据另 一具体实施方案，所述患者群中的所述"所产生的免疫应答"和"低至中度免疫应答"均为T细胞免疫应答，优选为CD8+(细胞毒T淋巴细胞) 免疫应答。
看来，才艮据本发明鉴定的特定患者群中的患者实际上a)能自身产生针 对其疾病(例如针对与其疾病直接或间接相关的抗原(例如分别为HPV 或MUC1))的免疫应答(例如T细胞应答)，和b)与未如上述引发针对 抗原的低至中度免疫应答的受治患者相比，其后施用于所述患者的免疫原 性组合物有效增强该在先的免疫应答(即所产生的免疫应答)和/或延长受 治患者的存活率。
因此，本发明还涉及通过施用免疫原性组合物来延长进行人类疾病治 疗的患者的存活率的方法，所述方法包括以下步骤
-在患者群中选择患者，所述患者群包括以下患者已引发了针对抗 原的低至中度免疫应答，并且未接受任何在先外源提供的药物免疫原性组 合物的患者，所述组合物包含(i)所述靶标抗原的全部或一部分和/或(ii) 至少一种编码所述耙标抗原的重组栽体，
-对所选患者施用所述免疫原性组合物。
已经以说明性方式描述了本发明，应该理解，所用术语旨在以说明性 方式使用，而非限制。显然，从以上教导中可得到对本发明的许多修改和 改变。因此，应该理解，在所附权利要求书的范围内，本发明可以与上文 的具体描述不同的方式实施。
上文引用的专利、出版物和数据库的公开内容均明确地完整并入本文
作为参考，如同每个单个的专利、出版物或条目均具体地单独指出并入本 文作为参考一样。
图例
图1: II期临床研究TG4010.06 (肾癌)。TG4010免疫前MUCl-特 异性细胞免疫应答与患者更长期存活之间的相关性。虚线ELISpot证据 显示在TG4010免疫前有MUC1特异性T细胞应答的患者。实线ELISpot 显示在基线处无MUC1特异性T细胞应答的患者。圆圏代表死亡日期已知的完整数据。叉代表在分析时仍存活或者失去随访的患者的已检查数据。
图2: II期临床研究(肺癌)。TG4010免疫前MUCl-特异性细胞免 疫应答与患者更长期存活之间的相关性。虛线ELISpot证据显示在 TG4010免疫前有MUC1特异性T细胞应答的患者。实线ELISpot显示 在基线处无MUC1特异性T细胞应答的患者。圆圏代表死亡日期已知的 完整数据。叉代表在分析时仍存活或者失去随访的患者的已检查数据。在 此研究中，细胞运输和冷冻方面的技术困难导致细胞状况差于图l所用细 胞。为此，将每1()S个PBMC中5个点(1.5x背景对照)的水平接受为对 MUC1的阳性应答。阳性对照的标准与图1所用数据相同。
实施例
从参与免疫治疗性疫苗TG4010 (编码MUC1抗原的MVA)的II期临 床研究的转移肾癌患者中取得静脉血样。这些患者之前从未被施用MUC1 抗原或其编码核酸或任何相关抗原进行治疗。血样在TG4010免疫之前抽 取，并在最初的TG4010免疫后在患者处于研究中的多个时间点抽取。将 血样收集到Becton Dickenson CPT "管中，并送至中心实验室加工成外周 血单核细胞并在液氮中冷冻。接着将PBMC分批送至另 一中心实验室分析 MUC1特异性细胞免疫应答。
4吏用Diadone (Besoncon， France)系统，通过ELISpot(酶联免疫印迹)
测定来评估PBMC的MUC1特异性CD8+(细胞毒T细胞的表型)应答。
ELISpot是用于评估针对抗原的CD8+T细胞应答的7>知方法。简言之
将PBMC单独或与抗原(在此情况下为来自MUC1序列的肽)置于
ELISpot测定板的培养基中。所用的MUC1肽对患者的HLA型具有特异
性。还评估了 PBMC对来自普通病毒蛋白的阳性对照肽的ELISpot应答。
这确保了测定是有效的，并确保细胞处于在ELISpot测定中应答的合适状
态。将细胞在ELISpot板中孵育16小时。将ELISpot板的孔用对人Y干 扰素具有特异性的捕获抗体进行包被。这样，在16小时培养期后从板中洗去细胞时，应答于该肽而产生Y干扰素的细胞周围的区域将使干扰素附着 在孔底。接着加入另一种与酶偶联的Y干扰素抗体，并在洗涤后加入酶的
底物。结果是在存在与该肽反应的T细胞的地方出现有色点。接着对点进 行计数，计数是悬液中对该肽具有特异性的T细胞数。所有测定均以一式 三份进行。
MUC1是自身抗原，其应答预计会很弱。因此，在ELISpot测定之前， 首先在体外致敏步骤中将特异性T细胞在组织培养中扩增6天。在此时间 中，将患者PBMC与来自人MUC1序列的短合成肽一起培养，以辅助T 细胞增殖，该肽已鉴定为与HLA单倍型(EP 1210430)和白介素-2 (IL2)结 合。该孵育期之后，洗涤经致敏的淋巴细胞，如上述在ELISpot测定中评 估特异性T细胞活性，其中使用相同的肽，或者不使用肽作为背景对照。
在ELISpot测定中，如果每个孔(105个PBMC )中存在至少10个点 大于背景孔，并且点数是含有背景对照(无肽)的孔中的点数的至少1.5 倍，则认为应答是阳性的。此外，仅在同一标准下阳性对照为阳性时，才 认为对MUC1的应答为阳性。类似地，仅在对阳性对照的应答为阳性时， 才认为对MUC1的应答(每个孔少于IO个点)是阴性。
通过ELISpot对来自肾癌TG4010免疫治疗研究中患者的PBMC测 试MUC1特异性CD8+细胞免疫应答。测试了在TG4010前取自患者的 PBMC，以及在TG4010免疫后取自患者的PBMC。与可评价到MUC1 特异性ELISpot应答但没有这种基线MUC1特异性应答的患者相比，在 TG4010免疫之前有MUC1特异性ELISpot应答的患者与延长的患者存活 之间存在显著的相关性(图1)。此外，有基线(即在用免疫原性组合物 TG4010进行免疫之前)MUC1特异性ELISpot应答的所有患者均具有高 于19个月中值存活(基于研究中所包括的全部37名患者计算)的总体存 活。
图1所示数据得到了在重度非小细胞肺癌患者中进行的相似的 TG4010II期临床研究中所得数据的支持(图2)。在31名患者中可评估 到MUC1特异性ELISpot， 29名可评估到基线MUC1特异性ELISpot应答。11名患者的应答满足阳性对照标准。仅将这些数据示于图2。与图1 所示数据相似，在任何TG4010免疫之前的基线情况下所取血中PBMC显 示可检测的MUCl-特异性ELISpot应答的肺癌患者(即已引发对所述靶 标抗原(MUC1)的低至中度免疫应答并且未接受任何之前的外源供应的 药物免疫原性组合物的患者，所述免疫原性组合物包含(i)所述靶标抗原 的全部或部分，和/或(ii)编码所述粑标抗原的至少一种重组载体)比在 基线情况下所取血中PBMC未显示可检测MUC1特异性ELISpot应答的 患者存活得明显更长。此外，所有通过ELISpot测量为有MUC1特异性T 细胞应答之患者的存活都比该研究中全部65名患者的中值存活更长。中值 存活为13.7个月。
权利要求
1.通过施用免疫原性组合物在患者中产生对靶标抗原的免疫应答用于治疗人类疾病的方法，所述方法包括以下步骤-在患者群中选择患者，所述患者群由已引发了针对所述靶标抗原的低至中度免疫应答并且未接受任何在先外源提供的药物免疫原性组合物的患者组成，所述组合物包含(i)所述靶标抗原的全部或一部分和/或(ii)至少一种编码所述靶标抗原的重组载体，-对所选择的患者施用所述免疫原性组合物。
2. 权利要求l的方法，其中对所述患者施用的所述免疫原性组合物包含(i)所述靶标抗原的全部或一部分和/或(ii)至少一种编码所述靶标抗原的重組载体和/或(iii)至少一种免疫应答调节剂。
3. 前述权利要求任一项的方法，其中所述人类疾病是癌症。
4. 权利要求3的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌或肾癌。
5. 前述权利要求任一项的方法，其中所述靶标抗原是肿瘤特异性抗原。
6. 前述权利要求任一项的方法，其中所述低至中度免疫应答是体液免疫应答。
7. 前述权利要求任一项的方法，其中所述低至中度免疫应答是细胞免疫应答。
8. 权利要求8的方法，其中所述免疫应答是CD8+免疫应答。
9. 免疫原性组合物用于生产药物的用途，所述药物用于在患者中产生针对耙标抗原的免疫应答用于在特定的患者群中治疗人类疾病，其中所述群中的患者已引发了针对所述靶标抗原的低至中度免疫应答，并且未接受任何在先的外源提供的药物免疫原性组合物，所述组合物包含(i)所述抗原的全部或一部分和/或(ii)至少一种编码所述抗原的重组载体。
全文摘要
本发明涉及通过施用免疫原性组合物而在患者中产生对靶标抗原的免疫应答用于治疗人类疾病的方法，其中所述患者选自目的患者群。
文档编号A61K39/00GK101541342SQ200780044400
公开日2009年9月23日 申请日期2007年12月4日 优先权日2006年12月5日
发明者B·阿克尔, J-Y·博纳富瓦 申请人:特朗斯吉有限公司