草药组合物及其制备方法

专利名称：：草药组合物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种单独包含作为活性成分的治疗有效量的蒌叶(P^w6"/e)叶子提取物，或者还包含药学上可接受的赋形剂的草药组合物。所述草药组合物适于治疗对伊马替尼(imatinib)(格列卫(gleevec或glivec))的治疗显示出耐药性的慢性髓样白血病(chronicmyeloidleukemia)(CML;慢性骨蘧'l"生白血病(chronicmyelogenousleukemia))。本发明还涉及制备所述草药组合物的方法以及对显示伊马替尼耐药性的CML患者施用该组合物的方法。
背景技术：
：慢性髓样白血病也被称为慢性骨髓性白血病(下文称为CML),是一种恶性骨髓癌症，其特征在于骨髓中主要的髓样细胞的增加的、不受控制的克隆产生。根据国家癌症研究所(NCI)的研究(ChronicMyeloidLeukemia:Treatment:HealthProfessionalVersion:GeneralInformation2006),CML的特征在于染色体相互易位9:22，从而产生了费城染色体(Ph)。该事件发生在多能造血千细胞中，并且9号染色体上的编码酪氨酸激酶(PTK)蛋白质的c-abl原癌基因转座到22号染色体上Bcr基因的第二个外显子下游的新位置上。这种易位产生了一个新的融合基因Bcr-Abl,该基因编码嵌合蛋白质p210Bcr-Abl，与c-abl相比,该蛋白质的PTK活性调节异常。Bcr-Abl融合蛋白质引发了一系列不恰当的造血细胞增殖，因此导致了白血病转化(DruckerBJ等人；Chronicmyelogenousleukaemia.Hematology.Jm.Soc./fema^/.尸rog厂am,111-135(2002))。jl匕夕卜，在寿争基因小鼠中表达p210Bcr-Abl显示可以引发CML样骨髓增生性疾病。因此，p210Bcr-Abl似乎作为CML的主要病因起重要的作用(ClarksonBD等人；丄ew&m&.:11:1404-1428(1997))。CML的发展分为三个阶段。大部分患者在第一阶段被诊断出来，该阶段被称为慢性期，持续时间的中位数为4-6年。随着时间的推移，CML可以发展到被称为加速期的第二阶段，以及最终发展到了被称为急变期或原始细胞危象(blastcrisis)的第三阶段。在慢性期，血液和骨髓中的白细胞高于正常值。此时，大部分白细胞为可以正常工作的成熟细胞。随着疾病的緩慢发展，会经过一个加速期，此时的特征为在血液、骨髓和脾脏中出现未分化的母细胞(未成熟的白细胞)。随后，加速期发展至疾病最终的原始细胞危象期。在这个阶段中，患者存活时间的中位数为18周。急变期的特征为血液和骨髓细胞中存在多于30%的母细胞。患者经诊断为CML后的存活时间的中位数为4-6年，范围为不到1年至多于10年(NationalCancerInstitute:ChronicMyeloidLeukemia:Treatment:HealthProfessionalVersion:GeneralInformation2006)。CML患者的治疗选择非常有限，并且取决于白血病的发展阶段以及患者的年龄和健康水平。该疾病可以通过骨髓移植(BMT)或药物进行治疗。BMT治疗包括给予患者一种或多种极高剂量的药物来杀死骨髓中的大部分癌细胞，并使用来自捐献者的健康细胞代替毁坏的干细胞，该捐赠者的组织类型需要与患者的组织类型几乎完全匹配。但是，使用这种治疗受限于是否有捐献者以及与治疗相关的发病率和死亡率。CML患者的第二种治疗选择是药物治疗。已经证明包括使用羟基脲或白消安的口服骨髓抑制性化疗可以控制CML患者的血细胞计数并改善症状，但是对于生存时间的影响较小(HehlmannR等人；Blood:82:398-407(1993))。干扰素-a已经成为治疗CML的一种治疗选择，并已显示出可以延长CML患者的生存时间。但是，有报导称有些患者对干扰素-a的治疗显示耐药性(KuhrT等人，i仏27(5):405-411(2003))。相对较新的药物伊马替尼(格列卫(gleevec或glivec))是目前治疗CML的最特效的药物，并被认为是非常有效的治疗药物。上面已经讨论了Ph染色体产生了Bcr-Abl融合蛋白质，因而产生了具有组成型活性并且不受调控的酪氨酸激酶蛋白质。伊马替尼通过抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶来发挥作用(BuchdungerE.等人；说oc/^m.爿da1551,Ml1-M18(2001))。该药物具体通过竟争性抑制酶上的ATP结合位点来发挥作用，因而导致了表达Bcr-Abl的细胞的生长停滞或细胞凋亡(RadfordIR等人；CurrentOpinionInvestigationaldrugs3，492-499(2002))。伊马替尼对CML患者的有效性是基于总的血液和细胞遗传响应率。尽管有明显的血液和细胞遗传响应，但是在CML患者中也观察到了对伊马替尼的耐药性，特别是在那些已经发展到加速期或急变期的患者中。美国专利申请公布No.20030158105("美国105专利申请")描述了关于CML患者的伊马替尼耐药性的可能的机理，并公开了一些与伊马替尼耐药性相关的Bcr-Abl突变。人们已经尝试寻找预防或克服这种耐药性的治疗新策略。最近发现两种实验性药物，即尼罗替尼(nilotinib,AMN-107)和达沙替尼(dasatinib,BMS-354825)，可以有效地避免一些但不是全部形式的伊马替尼耐药性。发现尼罗替尼对CML患者的治疗是有效的；但是，携带T315I突变的患者对该药物耐药(BocchiaM等人EmergingdrugsinCML;C^Z".￡mwgZ"gZ>w^(2006)11(4):651-664)。T315I突变是在伊马替尼耐药的患者中较为普遍的一种突变。已经显示T315I突变可以保留激酶活性，从而使得伊马替尼与Bcr-Abl的结合无效。已发现，另外一种还处于临床前阶段的药物ON-0122380既能够抑制野生型也能够抑制伊马替尼耐药的T315I突变体，但是，由于该药还没有进入临床试验阶段，其安全性和防止出现伊马替尼耐药性的有效性还有待评价。但是，尽管有了这些进展，人们仍需要寻找能够有效对抗伊马替尼耐药性CML的药物。本发明人已经进行了广泛的研究，旨在发现能够解决CML患者对伊马替尼治疗耐药问题的解决方案。本发明人意外地发现含蒌叶叶子提取物的组合物对伊马替尼耐药性Bcr-Abl突变细胞系显示出强烈的抗增殖活性。本发明的优势在于，通过简单的制备方法即可获得该草药混合6物。最重要的是，该组合物不仅显示出理想的功效，同时还具有非常高的安全性。
发明内容一方面，本发明涉及一种单独包含治疗有效量的蒌叶叶子提取物，或者还包含至少一种药学上可接受的赋形剂的草药组合物，该组合物适于治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病(CML)。另一方面，本发明涉及一种包含治疗有效量的蒌叶叶子提取物和至少一种药学上可接受的赋形剂的草药组合物，其中，当被用于治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病(CML)时，该组合物由于较高的安全性水平而具有优势。另一方面，本发明涉及一种用于治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病(CML)的单独包含治疗有效量的蒌叶叶子提取物，或者还包含至少一种药学上可接受的赋形剂的组合物，其中，伊马替尼耐药性是由Bcr-Abl突变引起的。再一方面，本发明涉及一种制备包含治疗有效量的蒌叶叶子提取物和至少一种药学上可接受的赋形剂的草药组合物的方法。再一方面，本发明涉及一种本发明的组合物的给药方法，该组合物适于治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病。另一方面，本发明涉及一种单独包含治疗有效量的蒌叶叶子提取物作为活性成分，或者还包含至少一种药学上可接受的赋形剂的草药组合物，其中，所述组合物被配制用于口服、肠胃外、腹膜内、皮下、静脉内或关节内给药。再另一方面，本发明涉及一种治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病的方法，该方法包括给需要这种治疗的患者施用治疗有效量的草药组合物。再另一方面，本发明涉及所述草药组合物在制备治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病的药物中的用途。图1示出了蒌叶叶子提取物对K-562细胞系的体外活性，证明了该提取物抑制Bcr-Abl激酶的活性。图2示出了在伊马替尼耐药性Bcr-Abl突变细胞系中，蒌叶叶子提取物诱导的细胞凋亡。图3a示出了在SCID小鼠的野生型Ba/F3Bcr-Abl/p210WT异种移植物模型中，蒌叶叶子提取物显示出与伊马替尼相当的体内有效性(第一套)。图3b示出了在抑制SCID小鼠中最主要的突变Bcr-Abl形式(即Ba/F3Bcr-Abl/T315I)异种移植模型方面，蒌叶叶子提取物显示出比伊马替尼更高的体内有效性(第二套)。具体实施例方式本发明是基于一种包含治疗有效量的蒌叶叶子提取物作为活性成分的草药组合物能够有效对抗伊马替尼耐药的Bcr-Abl突变细胞系的发现，因此，本发明是癌症(尤其是白血病)领域的重要发明。具体而言，本发明的意义在于其提供了解决目前出现的伊马替尼(一种用于治疗可怕的疾病CML的创新药物)耐药性的解决方案。以下是本发明中所使用的术语的定义的列表。除非在特殊情况下另外限定，在整个说明书中使用时，这些定义适用于这些术语。此处所使用的术语"药学上可接受的"是指赋形剂、稀释剂和/或它们的盐必须与制剂中的其它成分兼容，并对接受者无害。此处所使用的术语"药学上可接受的赋形剂"是指无毒性的、惰性的固体、半固体、稀释剂、包封材料或任何类型的配制助剂。可作为药学上可接收的赋形剂使用的材料的一些例子有糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧曱基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；麦芽；明胶；滑石；以及其它无毒性的兼容性润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂；根据配制者的判断，该组合物中还可以含有防腐剂和抗氧化剂。此处所使用的术语"治疗有效量"是指足以显著引起待调控或治疗的疾病状况改善的组合物(例如蒌叶叶子提取物)的量，但是在可靠的医学判断范围内，该量又足够低而不会引起副作用(如果有的话(以合理的利益/风险比))。化合物或组合物的治疗有效量根据所治疗的具体疾病、最终使用者的年龄和身体状况、所治疗/预防的疾病状况的严重性、治疗的持续时间、同时进行的治疗的性质、具体使用的化合物或组合物、具体使用的药学上可接受的赋形剂等因素而变化。术语"蒌叶叶子的提取物"和"蒌叶叶子提取物"可互换使用。此处所使用的术语"提取物"是指蒌叶叶子的提取物。术语提取物或蒌叶叶子提取物是指蒌叶植物的叶子中存在的化合物的混合物。使用本领域公知的提取方法来制备提取物(例如使用有机溶剂(例如低级醇类、烷基酯类、烷基醚类、烷基酮类、氯仿、石油醚、己烷)和/或无机溶剂(例如水))。术语"草药组合物"或"组合物"可互换使用，可以指单独包含治疗有效量的蒌叶叶子提取物或者还包含至少一种药学上可接受的赋形剂的组合物。术语"单独"可以进一步指该组合物仅包含蒌叶叶子提取物，而不添加任何药学上可接受的赋形剂。此处所使用的术语"大约，，是指一个特定值±20%的范围。例如，用语"大约20，，包括20±20%,即16至24。除非另外明确说明，说明书和附加的权利要求书中所使用的单数形式"一个"、"一种"和"该"包括所指对象的复数形式。蒌叶(尸/p^6e"eL)是植物betelvine的植物学名。蒌叶植物的心形绿叶在印度被广泛称为。蒌叶属于胡椒科(i^^rac^e),即黑胡椒科(GuntherE.:T7^五^e""a/o&，5:160-161(1952))。蒌叶植物的叶子也通常被称为蒌叶(betelleaf)。已经报导了使用蒌叶提取物(下文称为"提取物")治疗不同的疾病日本公布的专利申请JP2001098267公开了使用该提取物作为抗氧化剂；JP2002212086/>开了该提取物具有极好的抗细菌活性；JP9278666教导了该提取物可用于杀灭口腔内的微生物和消除对龋齿病因的影响；JP200130685报告了使用该提取物作为抗过敏药；PCT公布的专利申请WO0245730公开了利用该提取物的抗单核细胞活性；WO0245731教导了该提取物在治疗内脏利什曼病或黑热病中的有效性，以及美国专利No.6967034教导了该提取物在治疗CD33+急性和慢性髓样白血病中的应用。本发明涉及单独包含作为活性成分的蒌叶叶子提取物或者还包含药学上可接受的赋形剂的草药组合物。蒌叶的叶子选自下述类型野生型、Climber型、Bangla型和Sweet型。一方面，根据本发明的草药组合物单独包含治疗有效量的蒌叶叶子提取物("提取物")作为活性成分，或者还包含至少一种药学上可接受的赋形剂。该组合物中包含的提取物的治疗量为组合物总重量的大约5%至大约50%(w/w)。本发明的组合物可以根据药学领域公知的任何方法进行制备。所有的方法都包括将活性成分(即提取物)与适当选择的药学上可接受的赋形剂相结合的步骤。本领域技术人员知道或明白用于制备可施用的组合物的实际方法和受试者给药所需的调节，例如在《Remington:TheScienceAndPracticeOfPharmacy》,Gennaro,A.，Lippincott,Williams&Wilkins，Philadelphia(2000)(以前称为《RemingtonsPharmaceuticalSciences》)中有更详细的描述。根据本发明的一方面，提供了一种制备该草药组合物的方法，包括以下步骤(a)制备蒌叶叶子提取物；(b)将步骤(a)中的提取物与至少一种药学上可接受的赋形剂混合以获得所述组合物。10本发明所使用的蒌叶叶子提取物是根据常规提取方法制备的。制备蒌叶叶子提取物的一般程序如下所述。本发明的草药组合物可被配制用于口服给药，即通过将活性成分(即提取物)与普通无毒性的药学上可接受的赋形剂配制成为片剂、丸剂、颗粒剂、胶嚢剂、溶液、乳剂、悬浮剂和其它任何适宜使用的形式。本发明的制剂包括固体、半固体或液态形式的含有滑石、水、葡萄糖、乳糖、阿拉伯树胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、玉米淀粉、角蛋白、胶态氧化硅、马铃薯淀粉、尿素和其它在制造制剂过程中适宜使用的赋形剂，此外，还可以使用助剂、稳定剂、增稠剂和着色剂。为了制备固体组合物(例如片剂或胶嚢剂)，该提取物与药物赋形剂(例如常规制片成分，例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和其它药物稀释剂(例如水)相混合以制成固体组合物。该固体组合物再被分成包含有效量的本发明组合物的单元提供具有延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内剂量和外剂量组分，后者为前者上的包封的形式。这两个组分可由肠衣层进行分隔，肠衣层可以起到防止在胃中崩解并可以使内组分完整地穿过十二指肠或延迟释放的作用。许多材料可被用于这样的肠衣层或包衣中，包括许多聚合酸以及聚合酸和诸如虫胶、十六烷醇和醋酸纤维素等材料的混合物。用于口服或注射的可添加所述提取物的液体形式包括水溶液、适当增香的糖浆、水性或油状悬浮液、含食用油的香味乳化剂以及酏剂和类似药物形式。用于水性悬浮液的合适的分散剂或悬浮剂包括合成天然树胶，例如黄蓍胶、阿拉伯树胶、藻酸盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、曱基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。口服液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或者它们也可以是干品，在使用之前再用水或其它合适的载体重新配制。这样的液体制剂可以通过常规方式与以下辅剂一起制备药学上可接受的添加剂，例如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、曱基纤维素或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水性载体(例如杏仁油、油状酯或乙醇)；防腐剂(例如对羟基苯曱酸甲酯或对羟基苯曱酸乙酯或山梨酸)；和人造或天然色素和/或甜味剂。本发明中包含蒌叶叶子提取物的组合物还可被配制用于肠胃外注射给药，包括使用常规导管插入技术或输注。用于注射的制剂可为单元剂量形式，例如存在于安瓿中，或存在于多剂量容器中，添加有防腐剂。或者，活性成分可以为粉末形式，使用之前再使用合适的载体(例如灭菌无热原水)重新配制。水性注射悬浮剂可以包含能够增加其粘性的物质，例如，羧曱基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，悬浮剂还可以包含稳定剂。还可以使用脂质体包封药物，用于递送至细胞内。实施本发明时，可以单独使用包含作为活性成分的蒌叶叶子提取物的组合物，或者还可以与其它治疗剂联合使用。在某些实施方式中，根据公认的医学实践，本发明的组合物可以与用于癌症化疗的其它典型药物共施用。根据本发明，组合物的理想剂量根据受试者的状况和体重、严重性、药物形式、给药途径和给药时间而不同，而熟练的开业医生能够^f艮容易地确定该剂量。但是，为了获得理想的效果，一般推荐按照每天lg至20g的剂量，以单剂量形式或分开的多剂量形式施用本发明的组合物。根据本发明，该草药组合物适于治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病(CML)。实验结果已经证明，本发明的组合物可有效治疗伊马替尼耐药的CML。该组合物不仅容易制备，而且还对现有的昂贵的药物、手术或这两者提供了一个更优的替代手段。更重要的是，该组合物不会产生常用的抗癌药物都会产生的严重的不良反应。本发明在其范围内提出了一种用于治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病的方法，包括给需要这种治疗的患者施用治疗有效量的草药组合物。根据本发明，在用于治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病的方法中，推荐以单剂量形式或分开的多剂量形式、以每天lg至20g的剂量施用该组合物。12本发明人通过体外研究对本发明的草药组合物的有效性进行了评价，观察到本发明的组合物对Bcr-Abl突变的伊马替尼耐药性细胞系具有强烈的抑制活性。更加有意思的是，该组合物还显示出对表达人Bcr-Abl/T315I的细胞系具有强烈的抗增殖活性，Bcr-Abl/T315I是伊马替尼耐药性Bcr-Abl的最常见的突变形式。这是本领域中一个显著的进步，因为Bcr-Abl/T315I突变显示耐受两种最有前途的实验性药物尼罗替尼(AMN-107)和达沙替尼(BMS-354825)。这使得本领域的科学家一直在寻找解决该问题的方案。本发明人对此问题提供了一个实际的解决方案，即包含治疗有效量的蒌叶叶子提取物的草药组合物。在对Bcr-Abl/野生型(Bcr-Abl/WT)阳性K-562细胞系(来自慢性髓样白血病患者的红白血病细胞系)的体外有效性测试中，本发明人观察到含蒌叶叶子4是取物的本发明的组合物是Bcr-Abl酪氨酸激酶的直接抑制剂，如图1中的自磷酸化研究所示。该组合物对K-562细胞系中的激酶活性显示剂量依赖性的明显抑制作用。本发明人测试了该组合物对五种临床观察的伊马替尼耐药性细胞系的作用，并与伊马替尼进行了对比。据观察，该组合物有效地抑制突变的伊马替尼耐药性细胞系。该研究的结果将会在下文中进行详述。表4中的结果表明该组合物的剂量保持恒定，而伊马替尼的剂量会显著变化。为了证明本发明组合物的有效性，本发明人在SCID小鼠的异种移植模型中使用表达全长野生型Bcr-Abl和突变Bcr-Abl/T3151细胞的细胞系Ba/F3转染体(transfectants),测试了蒌叶叶子提取物的体内抗肿瘤有效性。当^f吏用与表达野生型Bcr-Abl的异种移ti:物(即BAF3Bcr-Abl/p210WT)相同的剂量进行测试时，观察到蒌叶叶子提取物在抑制绝大多数的Bcr-Abl突变形式(即T315I)方面显示出比依马替尼显著更强的体内有效性。图3a和3b中的曲线证明了对野生型Bcr-Abl异种移植物有效的提取物剂量与对T315I突变异种移植物有效的提取物剂量一致。相反，依马替尼显示对野生型Bcr-Abl异种移植物具有显著的活性，但是发现在相同剂量下对T315I突变异种移植模型是无效的。此外，蒌叶提取物还显示对其它人类白血病细胞系(例如HL-60和Molt-4)具有抗增殖活性。参考下述用于说明本发明而不是限制其范围的实施例，将会更加容易地理解本发明。实施例实施例l:用于制备蒌叶叶子提取物的一般过程。在避免太阳直射的庇荫条件下制干蒌叶植物的叶子。使用适当的碾磨机将叶子碾磨成6/8目颗粒大小的粉末。将大约100Kg的粉末置于合适的反应器皿中，并添加8倍量的溶剂(80%的@|)。叶子粉末浸泡于溶剂混合物中一个小时，并频繁搅动。使用合适的加热装置(蒸汽)并使用回流机构在70。C±5。C下(在达到该温度后)持续搅拌4个小时来提取内容物。然后将内容物冷却至室温，使用离心机、压滤机、篩网或尼龙布过滤，得到澄清的滤液。去除滤渣并保留滤液。对过滤去除的滤渣重复上述过程。合并提取物并处理以进行溶剂回收。将澄清的滤液转移至相同的反应器皿中，并通过溶剂回收在70。C±5。C和25mm±5mm真空下蒸镏浓缩，以获得具有蜜样稠度的软提取物。该软提取物可能包含最小或可忽略量的醇。然后将所得到的软提取物转移到一个合适的真空烤箱中，内容物在70。C±5。C、25mm±5mm真空下进行干燥，得到稠的糊状物。完全去除提取物中的溶剂(水和醇)。该提取物可以储存在25。C/4(T/。相对湿度(RH)的条件下。实施例2:含蒌叶叶子提取物的草药组合物的制备颗粒剂的制备该组合物包含下表1中所列出的含量的成分。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>步骤1:在一合适的容器中称量特定量(如上表l所示)的蒌叶叶子提取物、甘露醇和异丙醇成分。均匀混合这些成分得到悬浮液。使用流化床干燥法进一步干燥该悬浮液。步骤2:在一合适的容器中称量特定量(如上表所示)的硅胶、一水合柠檬酸、对羟基苯曱酸甲酯钠、对羟基苯曱酸丙酯钠、苯曱酸钠、溴硝丙二醇、树莓香料、焦糖色素、天冬甜素和薄荷醇成分。这些成分经过充分混合后经过40目大小的筛网。然后再均匀混合该混合物。步骤3:将步骤1所得的悬浮液和步骤2所得的混合物混合在一起，以获得颗粒，并装入小袋中。用于填装颗粒的小袋可以具有下述规格。层压材料玻璃纸(40gsm/铝(9pm/Poly(150号)小袋的类型褶边的(Gusseted)尺寸70x70mm±2mm封闭三边为5mm士lmm,进行填装的第四边为5mm±1mm重量1.200gms±0.100gms。实施例3:含蒌叶叶子提取物的草药组合物的制备悬浮剂的制备该组合物包含下表2中所列出的含量的成分。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>步骤1:在一合适的容器中精确称量特定量(如表2所示)的丙二醇、甘露醇、树莓香料和薄荷醇成分。通过持续搅拌均匀混合这些成分得到悬浮液。步骤2:在一合适的容器中精确称量特定量(如表2所示)的对羟基苯曱酸曱酯钠、对羟基苯曱酸丙酯钠、苯曱酸钠、溴硝丙二醇、软化水和柠檬酸成分。充分混合这些成分得到溶液。步骤3:在一合适的容器中精确称量特定量(如上表所示)的CMC钠和DM水成分。通过持续搅拌均匀混合这些成分得到凝胶。步骤4:在一合适的容器中精确称量特定量(如上表所示)的天冬甜素和DM水成分。充分混合这些成分得到溶液。步骤5:在一合适的容器中精确称量特定量(如上表所示)的蒌叶叶子提取物、焦糖色素和DM水成分。通过持续搅拌均匀混合这些成分得到悬浮液。步骤6:将步骤1至步骤5所得到的所有内容均匀混合，并填装至琥珀色小瓶中。实施例4:提取物的体外抗增殖活性的测定细胞增殖分析七种造血细胞系来自不同的来源，具体信息在下述表3中给出。将这些细胞系维持在供应商建议的最优生长条件下。表3:不同造血细胞系的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*Ba/F3细胞仅包含载体(Ba/F3-pSRa),FBS是指胎牛血清。来源OHSU:美国俄勒冈健康与科学大学，ATCC:美国典型培养物保藏中心表3中的细胞系用于测试蒌叶叶子提取物的抗增殖活性。在依马替尼耐药性细胞系中使用^-胸苷摄入法，将该提取物作为抗增殖药物的潜力与依马替尼进行了对比。3H-胸苷掺入法是一种用于细胞增殖分析的方法。311-胸苷掺入与培养液中分裂细胞的数目成正比。方法在透明的96孔组织培养板(NUNC,美国)上接种细胞，密度为每孔3至5x103个(在0.09mL体积内)，在37。C、5%(:02的培养箱中培养2-6小时。依马替尼购买于印度NatcoPharma。制备10mmol/L的依马替尼的DMSO储备液，用该储备液的稀释液进行实验。该提取物和依马替尼以各种浓度在合适的培养基中进行稀释，向每个孔中添加O.OlmL的IOX储备液，一式三4分。该培养板在37°C、5%0)2的培养箱中培养72小时，间断地每隔24小时通过显微镜对其进行观察。培养72小时之后，使用培养板离心机在1000rpm的转速下对该培养板进;f亍离心10分钟。小心吸出上清夜，向所有孔内添加311-胸苷，浓度为每孔0.5iaCi,在0.100mL完全培养基中。该培养板继续在37。C、5%(:02的培养箱中培养6-14小时。培养结束后，使用细胞收集器(美国Packard)将96孔板中的细胞收集到96孔玻璃滤板(美国Packard,Cat#6005177,Unifilter-96,GF/B)上。该滤板在60°C下彻底干燥1小时或室温下过夜干燥。干燥之后，板底被密封起来，并向每个孔添加0.05mL的闪烁液(Af/crajc/W-O,PacA:"niO。从板的上部密封该板，在闪烁计数器(TopCount，Packard)上读数，与对照值进行比较，计算抑制百分比和IC5。。结果如表4所示。表4:蒌叶叶子提取物对Bcr-Abl野生型细胞系和依马替尼耐药性突变细胞系的体外活性<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>上述表2中的结果显示蒌叶叶子提取物对依马替尼耐药性Bcr-Abl突变细胞系(T315I、E255K、H396P、M351T和F359V)具有显著的抗增殖活性。从这些数据中值得注意的是本发明组合物的IC50值是一致的，而依马替尼的IC5。值变化相当大。实施例5:蒌叶叶子提取物在另外的依马替尼耐药性Bcr-Abl突变细胞系中的细胞毒性的测定表5:其它的依马替尼耐药性Bcr-Abl突变细胞系的描述和生长条件序号细胞系来源Ph状态增殖培养基(FBS。/。)1Ba/F3Bcr-Abl/E255VOHSU+ve野生型RPMI-1640(10%)2Ba/F3Bcr-Abl/F317VOHSU+ve突变RPMI-1640(10%)3Ba/F3Bcr-Abl/H396ROHSU+ve突变RPMI-1640(10%)4Ba/F3Bcr-Abl/M284VOHSU+ve突变RPMI-1640(10%)Ba/F3Bcr-Abl/Q252HOHSU+ve突变RPMI-1640(10%)6Ba/F3Bcr-Abl/Y253FOHSU+ve突变RPMI-1640(10%)7Ba/F3Bcr-Abl/Y253HOHSU+ve野生型RPMI-1640(10%)依马替尼耐药性细胞系的来源所有细胞系均来自美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学癌症研究院的霍华德.休斯医学院的BrianDruker博士的实验室。细胞毒性分析使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)研究该提取物的细胞毒性。CCK-8通过使用Dojindo的高水溶性四唑盐可以进行非常方便的分析。在存在电子介体的情况下，WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑单钠盐]在还原后产生水溶性甲賸染料。在透明的96孔组织培养板(美国NUNC)上接种细胞，密度为每孔3至5x103个(0.09mL体积)，在37。C、5。/。C02的培养箱中19培养2-6小时。样品在培养基中稀释为不同的浓度，向每个孔中添加0.01mLIOX储备液，一式三份。培养板在37。C、5%032的培养箱中培养72小时，间断地每隔24小时通过显微镜对其进行观察。培养72小时之后，向每个孔中添加10|iLCCK-8溶液，该板在相同的培养条件下继续培养4小时，然后使用读板器在450nm处读取分光光度吸收值。结果示于表6。表6:蒌叶叶子提取物对不同的Bcr-Abl野生型细胞系和依马替尼耐药性突变细胞系的细胞毒性的作用伊马替尼敏感或耐药状态伊马替尼蒌叶叶子提取物序号细胞系IC50一R/S比ic50(ig/mLR/S比1敏感Ba/F3Bcr-AblAVT0.917.412耐药Ba/F3Bcr-Abl/T315I20.823.15.60.76耐药Ba/F3Bcr-Abl/E255K10.011.15.20.704耐药Ba/F3Bcr-Abl/E255V13.615.15.80.78耐药Ba/F3Bcr-Abl/F317V2.42.75.00.686耐药Ba/F3Bcr-Abl/F359V3.84.27.91.077耐药Ba/F3Bcr-Abl/H396P1.61.84.40.598耐药Ba/F3Bcr-Abl/H396R2.83.14.60.629耐药Ba/F3Bcr-Abl/M284V4.65.15.00.6810耐药Ba/F3Bcr-Abl/M315T2.22.45.00.6811耐药Ba/F3Bcr-Abl/Q252H4.95.46.60.8912耐药Ba/F3Bcr-Abl/Y253F8.69.69.61.3013耐药Ba/F3Bcr-Abl/Y253H14.315.95.00.68R/S=耐药性与敏感性的比值上述图6中的结果显示，依马替尼对所有依马替尼耐药性Bcr-Abl突变细胞系比野生型细胞系的活性要差。然而，蒌叶叶子提取物对所有耐药性Bcr-Abl突变细胞系都显示出显著的活性。实施例6:蒌叶叶子提取物对Bcr-Abl激酶活性的作用Bcr-Abl激酶分析为此目的，将来自K-562细胞裂解产物中的Bcr-Abl酪氨酸激20酶进行免疫沉淀。这些免疫复合物用于使用32P-ATP的激酶反应中，并进一步经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳)和然后的放射自显影进行表征。在存在或不存在提取物的情况下培养K-562细胞之后，在1000rpm的转速下离心10分钟进行收集。使用0.2mL的细胞裂解緩冲液(CelLyticM细胞裂解试剂，SIGMA)在冰上裂解细胞。裂解产物在4°C和10000g下离心30分钟，并收集上清夜。使用Bradford蛋白质估算方法估计蛋白质。向200-400pg蛋白质中添加3pg针对c-abl的单克隆抗体，在4。C下温育1至2小时。再向其中每)ig单克隆抗体添加3-5|il(1:1浆液)的蛋白A-琼脂糖稀释緩冲液，4。C下维持过夜。离心并使用0.5mL激酶分析缓冲液(激酶分析緣冲液50mMHEPES(pH7.5)，1mMDTT,2.5mMEGTA，10mM(3匿甘油磷酸，1mMNaF，10mMMgCl2)洗J朱子两遍。由Bcr-Abl蛋白质包裹的珠子重新悬浮于30iil激酶緩冲液中。使用(力"P-ATP、4X磷酸酶抑制剂(PI)在室温下进行激酶分析30-40分钟。对该反应混合物进行SDS-PAGE，并使用放射自显影进行检测。图l证明，在Bcr-Abl+veK-562细胞中，经过24小时后，蒌叶叶子^是取物显示出对Bcr-Abl激酶活性的剂量依赖性抑制。实施例7:使用流式细胞分析法测定蒌叶叶子提取物对依马替尼耐药性Bcr-Abl突变细胞系的细胞周期和细胞凋亡的作用用于流式细胞分析的细胞以10x104细胞/毫升的密度接种，并与该提取物/依马替尼在37°C、5。/。C02的培养箱中培养24小时。培养结束后，通过在lOOOrpm的转速下离心IO分钟来收集细胞，然后再使用磷酸盐緩冲液(PBS)洗涤细胞两次。将最后一次洗涤之后的细胞沉淀緩慢地重新悬浮于70%水冷的乙醇中，以利于菌株的透化。在使用碘化丙啶(PI)染色之前，最少储存细胞悬浮液4小时。在存在RNaseA(50pg/mL)的条件下，使用PI(80(ig/mL)对固定好的细胞进行染色，在BDFACS检测仪(caliber)上读数用于细胞周期分析。该研究的结果示于图2中，结果清楚地显示蒌叶叶子提取物在依马替尼耐药性细胞系中诱导的细胞凋亡是显著的。实施例8:在慢性髓样白血病(CML)患者细胞中蒌叶叶子提取物的有效小生所有样品都是在知情同意和伦理委员会的批准下获得的。本研究中对CML疾病的诊断是基于标准的形态学、免疫表型和细胞遗传学标准完成的。血细胞经过Ficoll-hypaque密度梯度离心，然后收集棕黄层(buffy画coat)。CML样品来自海得^立巴的Nizam'sInstituteofMedicalSciences。样品在低温运输系统中运输到NPRC。一旦收到样品，立即处理样品，使用Ficoll/Hapaque法通过密度梯度离心进行PBL(外周血淋巴细胞)分离。在RPMI-1640培养基中洗涤通过ficol得到的棕黄层两次。将细胞重新悬浮于含10%FBS和浓度为0.02-0.08ng/mL的GM-CSF的培养基中。将获得的细胞接种于组织培养瓶中，在37。C、5。/。C02的培养箱中培养1-2小时进行条件化。培养2小时后，用血细胞计数器对细胞进行计数，并接种在96孔板上，接种密度为每孔1-5x104个细胞，在0.180mL培养基中。化合物(提取物/依马替尼)稀释为10X储备液，向每个孔中添加0,02mL这种储备液，一式三份。这些板在37。C、5%C02的培养箱中继续培养。每隔24小时对用于台盼蓝细胞计数的板进行分析，直到96小时。用于311胸苷摄取的板进行胸苷摄入。该研究的结果示于下述表7中。表7:蒌叶叶子提取物对依马替尼耐药的CML患者样品的效果序号样品ic501蒌叶叶子提取物2依马替尼8nM实施例9:在依马替尼耐药的和依马替尼敏感的肿瘤模型中，蒌叶叶子提取物的体内有效性测试22在本研究中使用表达全长野生型Bcr-Abl或突变Bcr-AblT315I的细胞系Ba/F3转染体。这些重组细胞系来自美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学癌症研究院的霍华德'休斯医学院的BrianDruker博士的实验室。提取物的储存所有的样品(提取物/依马替尼)均在4-8。C下储存在琥珀色瓶中。样品(提取物/依马替尼)溶液也储存在4-8。C的冰箱中。每日新鲜配制用于动物注射的样品，并按照化学品处理SOP收集并处理剩余的液体。剂量的准备称量样品(提取物/依马替尼)，并与0.5%(w/v)的羧曱基纤维素(CMC)相混合，与Tween-20(人工地)一起碾》卒，期间逐渐添加水，制成最终浓度。在SCID小鼠中有效性的研究使用一组85只重症联合免疫缺陷型(SCID抹-CBySmn.CB17-Prkdcscid/J，TheJacksonLaboratory,Stock#001803)雄性小鼠，小鼠年龄为6-8周，体重为大约20g。在含5%C02的37°C培养箱中,BAF3Bcr-Abl/p210WT细胞和BAF3Bcr-Abl/T315I细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中生长。在1000rpm转速下离心10分钟沉淀细胞。将细胞重新悬浮于盐水中得到每毫升80-100X106个细胞的计数，给SCID小鼠皮下(s.c.)注射0.2mL该细胞悬浮液。每隔一天观察小鼠可触摸的肿瘤块。一旦肺瘤大小长到直径为5-7mm时，将动物随才几分到相应的治疗组中。每天给予一定剂量。以每2-5天的时间间隔记录一次胂瘤大小。根据长椭球的公式({长(mm)x[宽(mm)2]x0.5})估算肿瘤的重量(mg)，其中假定比重为1,;r为3。在使用化合物治疗的动物中，23根据T/C(治疗/对照)x100%计算肺瘤的生长，根据[100-T/C。/。]计算生长抑制百分比(GI%)。相应的治疗组如表8所示。表8:治疗组(第I套和第II套)(第I套)名称Ba/F3Bcr-Abl/P210WT<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>数注射体积10mL/kg身体重量下述表9中的数据证明，当以与表达野生型Bcr-Abl的异种移植物(即BAF3Bcr-Abl/p210WT)相同的剂量进行检测时，蒌叶叶子提取物在抑制大多数突变形式的Bcr-Abl(即T315I)方面显示出比依马替尼显著更高的体内有效性。这些结果如图3a(第一套)和3b(第二套)中的曲线所示。表9:生长抑制(第一套和第二套)(第一套)名称Ba/F3Bcr-Abl/p210WT组II组III组IV天数蒌叶叶子提取物蒌叶叶子提取物伊马替尼500mg/kg500mg/kgbid150mg/kg6617-l83339391044545614506361(第二套)名称Ba/F3Bcr-Abl/T315I天数组II蒌叶叶子提取物500mg/kg组III蒌叶叶子提取物500mg/kgbid组IV蒌叶叶子提取物1000mg/kgbid组V伊马替尼150mg/kg2634962385546458228556156311262625532药物有活性GI%250%药物为高活性GI%>75%药物无活性GI%<50%(突出显示的数值显示显著的肿瘤抑制)根据本发明，本发明人认为显示生长抑制(GI)%>50%的化合物为活性化合物；显示生长抑制(GI)%>75%的化合物为高活性化合物，显示生长抑制(GI)%<50%的化合物为无活性化合物。2权利要求1.一种草药组合物，其单独包含作为活性成分的治疗有效量的蒌叶叶子提取物，或者还包含至少一种药学上可接受的赋形剂，所述组合物适于治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病。2.根据权利要求1所述的草药组合物，其中，所述组合物包含大约5%至大约50%(w/w)的蒌叶叶子提取物，所述组合物适于治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病。3.根据权利要求1或2所述的草药组合物，其中，伊马替尼耐药性是由Bcr-Abl突变引起的。4.根据权利要求1或2所述的草药组合物，其中，所述组合物配制用于口服、肠胃外、皮下、静脉内或关节内给药。5.根据权利要求4所述的草药组合物，其中，所述组合物配制成片剂、胶嚢剂、颗粒剂、糖浆剂或悬浮剂用于口服给药。6.根据权利要求5所述的草药组合物，其中，所述组合物配制用于肠胃外给药。7.根据权利要求1或2所述的草药组合物，进一步包含至少一种化疗剂。8.根据权利要求1或2所述的草药组合物，其中所述组合物适于以每天大约1g至大约20g的剂量治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病。9.权利要求1或2所述的草药组合物在制备治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病的药物中的用途。10.—种治疗伊马替尼耐药的慢性髓样白血病的方法，包括给需要的患者施用治疗有效量的权利要求1或2所述的草药组合物。11.根据权利要求10所述的方法，其中，伊马替尼耐药性是由Bcr-Abl突变引起的。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述草药组合物是经口服、肠胃外、皮下、静脉内或关节内给药的。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述草药组合物是经口服给药的。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述草药组合物配制为片剂、胶嚢剂、颗粒剂、糖浆剂或悬浮剂的形式。15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述草药组合物是经肠胃外给药的。16.根据权利要求IO所述的方法，其中，所述草药组合物以每天大约1g至大约20g的剂量给药。17.—种制备权利要求1所述的草药组合物的方法，包含以下步骤(a)制备蒌叶叶子提取物；(b)将步骤(a)中的提取物与至少一种药学上可接受的赋形剂混合以获得所述组合物。18.根据权利要求17所述的方法，其中在步骤(b)中，将大约5%至大约50%(w/w)的蒌叶叶子提取物与所述药学上可接受的赋形剂相混合以获得所述草药组合物。全文摘要本发明公开了一种单独包含作为活性成分的治疗有效量的蒌叶(Piperbetle)叶子提取物，或者还包含药学上可接受的赋形剂的草药组合物。本发明还提供了制备所述草药组合物的方法。所述草药组合物适于治疗对伊马替尼(gleevec或glivec)的治疗显示出耐药性的慢性髓样白血病(CML；慢性髓性白血病)。文档编号A61K36/00GK101631556SQ200780051634公开日2010年1月20日申请日期2007年2月20日优先权日2006年12月21日发明者K·S·乔希,S·沙玛,V·韦格申请人:皮拉玛生命科学有限公司