专利名称：：特异性钠通道调制剂BmKIT2的新应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及特异性钠离子调制剂BmKIT2的新应用。发明背景-癫痫是世界上最为普遍的中枢神经系统性疾病之一，目前世界每年约有1%到2%的人群深受癫痫疾病的困扰。由于兴奋性神经元过度活动以及抑制性神经元活动的减弱导致了原先神经网络的稳态失衡，最终产生超兴奋性从而诱发惊厥的发作。惊厥发作时的脑损伤可诱发一系列氨基酸递质释放的异常，导致诸如癫痫持续状态下的苔藓状纤维的出芽，海马突触体重排以及海马、杏仁核、梨状皮层等区域祌经元的大量死亡。电压门控钠离子通道(VGSC)对于神经元及大多数兴奋性细胞动作电位的产生及传递起着不可或缺的作用。蝎毒被认为是富集各种膜通道特异配体或调制剂的潜在资源宝库，许多肽类蝎毒素单一成分己被鉴定是选择性地作用在不同物种VGSC或同一物种不同VGSC亚型的调制剂。按照与电压门控钠通道受体位点结合不同，可以将长链肽链蝎毒分为a-类和P-类蝎毒，BmKIT2是从东亚钳蝎粗毒(5w"i/s/7S7^e"w'KarschVenom)中分离纯化而得的一类特异性作用于钠通道受体位点4的长链e-类蝎毒，共含有61个氨基酸，BmKIT2对于外周神经系统具有强烈的镇痛效应，电生理证据表明其可以使通道的激活相电压朝超极化方向移动，易化钠电流的激活过程，减小峰钠电流但对通道的失活化电压没有影响，从而改变通道的门控特性。电压门控钠离子通道特性改变被认为是诱发诸如癫痫等神经系统疾病的重要因素之一。同时电压门控钠通道也已经被证实是许多抗癫药物的天然靶点。但目前，大量报道集中于a类毒素作为一种特异性钠通道调制剂在相关癫痫发作及其机理的探讨，相反地，对于长链e类蝎神经毒素在惊厥保护和癫痫治疗中的应用报道依旧处于空白阶段，同时对于与抗癫痫作用相关的中枢神经系统钠离子通道亚型的选择及脑内相关靶器的作用机制研究依旧是个迷团。
发明内容本发明目的之一在于提供特异性钠通道调制剂BmKIT2在抑制即刻基因c-fos的早期表达中的应用。本发明的目的之二在于提供特异性钠通道调制剂BmKIT2在降低海马神经元的峰钠电流中的应用。本发明的目的之三在于提供特异性钠通道调制剂BmKIT2在制备抗癫药物中的应用。发明第一次将长链0类蝎神经毒素BmKIT2注入大鼠海马区域，观察BmKIT2对于大鼠惊厥潜伏期、脑电发放频率变化情况，从免疫组化水平观察fos基因表达情况。同时观察BmKIT2对于海马全细胞钠电流的作用影响。结果证明，BmKIT2可以显著压抑各类致癫剂所诱发的惊厥样行为及放电，并且减少c-fos基因的表达，同时BmKIT2可以降低海马神经元的峰钠电流，从而起到调制钠离子通道的作用。因此本发明为长链e类蝎毒在惊厥治疗中的应用提供强有力的实验证据，同时也借此阐明脑内癫痫相关靶器作用的分子机制。图1为在PTZ模型中，BmKIT2对高频高幅放电次数(a)和持续时间(b)的抑制作用图2为在pilocarpine模型中，BmKIT2可以显著降低大鼠惊厥持续状态潜伏期(a)以及惊厥发作级数(b)图3为免疫组化实验观察BmKIT2对于早期即刻基因c-fos表达的影响，从图a、b、c、d中可以看出随着BniKIT2剂量的增高，给药侧海马区域c-fos表达明显减少，从图e、f、g、h中可以看出BmKIT2对于对侧海马c-fos表达的影响。图4为定量分析海马各分区c-fos基因的数目，结果发现BmKIT2剂量依赖性抑制给药侧(a)和对侧海马(b)各区域c-fos基因的表达。图5为海马神经元全细胞记录神经元在TTX(特异性钠通道阻断剂)(a)与在BmKIT2(b)中的电流变化显示BmKIT2抑制海马神经元峰钠电流。具体实施例方式BmKIT2的分离纯化方法简述将粗毒4'C下离心去沉淀后经过HPLC分离，直至出现单峰为止，详细方法及实验条件请参见(吉永华，服部宏之，徐科，1993，中国科学B辑)实施例一PTZ惊厥模型的建立及行为学观察经6%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠固定于立体定位仪上，剃去头顶毛发并消毒头皮，剪丌皮肤并用10%双氧水烧灼皮下组织，暴露颅骨Bregma点，在颅骨上确定给药基座植入点(AP-4.3mm、L2.2mm)。位置确定后，用牙科钻钻一小孔，将给药基座套管植入至颅骨下2.5ram的海马CAl区。基座通过牙科水泥固定于大鼠颅骨表面。对于记录脑电的大鼠，除在相同位置植入给药基座外，另外将记录电极植入额叶区(AP-3.5mm，R2.0mm、H1.5mm)，参考电极植入小脑(AP-10.0mm，HL5腿)。72h后将不同剂量的BmKIT2或生理盐水通过给药基座注射入海马CA1区，注射体积为1^1。30min后腹腔注射PTZ(85mg/kg)以诱发大鼠惊厥发作，然后将其放回原处持续观察2h。大鼠惊厥发作根据PTZ注射后2h内发作的潜伏期、不同惊厥发作严重程度下的持续时间和发作次数进行测定。大鼠的惊厥发作严重程度根据以下标准评级.0级，无反应；l级节律性嘴部和面部抽动；2级躯体波动样游走性痉挛；3级全身肌阵挛、臀部上翘；4级躯体向一侧翻转；5级仰翻位，全身强直痉挛发作。一次完整的惊厥发作定义为从惊厥丌始发作至惊厥后恢复正常，区分两次独立的惊厥发作的最短间隔时间限定为5秒。潜伏期定义为注射PTZ后至首次2级惊厥发作开始的时间。在PTZ模型中，BmkIT2对行为学潜伏期，发作持续时间，发作级数的影响参见图1和表1。表l在PTZ模型中，BmkIT2对行为学潜伏期，发作持续时间影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>结果发现BraKIT2对于PTZ惊厥模型行为学表征有明显抑制作用。对于LiCl-Pilocarpine诱发的癫痫持续状态实验，所有大鼠均预先接受氯化锂(3mM/kg)腹腔注射。24h后，海马内注射2pl生理盐水和不同剂量的BmKIT2，30niin后通过腹腔注射Pilocarpine(25mg/kg)诱发癫痫持续状态。大鼠置于观察盒内并连续观察2h。癫痫持续状态的特征表现为持续时间超过30min的反复性躯体和四肢阵挛。癫痫持续状态的潜伏期定义为Pilocarpine注射后至癫痫持续状态开始的时间。惊厥发作严重程度根据之前描述的标准进行评级。参见图2，说明BmKIT2可以显著降低大鼠惊厥发作级数(a)以及惊厥持续状态潜伏期(b)实施例二脑电的采集分析在实施例--中的大鼠癫痫行为发作的同时，通过生物信号处理系统在自由活动的大鼠上进行脑电的分析和釆集，大鼠癲痫样电活动发作程度根据高频高幅放电(Highamplitudeandfrequencydischarge,HAFD)的次数和持续时间来测定。对于一次IIAFD的定义是持续吋间超过5s，频率至少为5Hz，并且其波幅至少是基线的两倍的放电。实施例三c-fos表达的检测在LiCI-Pilocarpine诱发的癫痫持续状态行为实验结束后，动物通过腹腔注射戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉后，经生理盐水灌流、4%多聚甲醛固、用20%和30%的蔗糖脱水沉底后对大鼠海马区域进行切片，贴于经明胶-硫酸铬钾处理的载玻片上，之后将玻片用PBS漂洗3次共15min，滴加5%马血清封闭lh后加入经血清稀释液处理的一抗兔抗c-Fos抗体(l:2000)。置于湿盒中4'C下孵育48h，PBS漂洗3次供15min，除去未反应的非特异性吸附的抗体，减少背景染色。然后加入二抗0.01MPBS稀释的生物素标记羊抗兔IgG(l:200)，室温孵育2h，弃二抗，PBS漂洗3次共15min，加入ABC复合物(1:100)，室温孵育lh后，PBS漂洗3次共15min，DAB-硫酸镍胺-葡萄糖氧化酶法显色，待观察得明显阳性fos神经元后，酒精梯度脱水，二甲苯透明，并用中性树脂封片后镜检观察，结果参见图3和图4。实施例四BmKIT2对于大鼠海马神经元峰钠电流的影响乙醚麻醉怀孕18天的SD大鼠，取出胚胎置于预先冷却好的HBSS缓冲液中，在解剖显微镜下分离出海马，放入含0.25%胰蛋白酶的HBSS缓冲液丁在培养箱内消化12-15min，以预先孵育好的含血清培养液(80%DMEM，10%F-12，10%胎牛血清)终止酶反应，并重复3-4次洗净组织；将海马转移到灭菌好的15ml玻璃离心管内，加10ml左右含血清培养液，用移液管或lml移液枪轻轻吹打至悬液中无组织块；静置3-5miri;去除部分上清液，将细胞悬液转移到原来装培养液的瓶子内稀释并混匀；台盼蓝染色后计数活细胞数，以每平方厘米5x104个活细胞的密度种入预先已用Poly-D-Lysine(0.lmg/ml)包被的玻片上，并于培养箱(37°C，5%C02/95%02)培养。2仆后半换无血清培养液(1%Glutamate，2%B27，97%NeurobasalMedium);3天后再半换；待胶质已铺满玻片后(约6天后)，用含5pM阿糖胞苷的无血清培养液给细胞半换液；48h后用去除阿糖胞苷的无血清培养液全换；此后每隔3天1/3换液。在培养的14-21天的海马神经元上进行全细胞记录。玻璃微电极尖端阻抗为2-4MQ。利用200B膜片钳放大器和C]anipexv8.1软件(Axon，USA)采样和处理。电极内液由120raMCsCl,20mMTEA-Cl，2mMMgCU10mMEGTA，2mMNa-ATP,10mMHEPES组成。内液pH用Tris-base调至7.2。细胞外液由150mMNaCl，5mMKC1,lmMMgCU2mMCaCl2，lOraMHEPES,lOraMGlucose,2.5mMTEA_Cl,5mM4-AP组成，夕卜液pH用Tris-hyd皿ymethylami,ethane(Tris-base)调至7.2-7.4。电信号通过3kHz带宽滤波，采样频率为50kHz。漏电流用P/4模式在记录中去除，串联电阻部分补偿(70-80%)。Ag-AgCl盐桥作为参考电极。加药系统为自制重力加药系统。加药管直径约IOO,，距离细胞约100，，给药速度为200-30(Vl/min。结果参见图5。权利要求1.特异性钠通道调制剂BmKIT2在抑制即刻基因c-fos的早期表达中的应用。2.特异性钠通道调制剂BmKIT2在降低海马神经元的峰钠电流中的应用。3.特异性钠通道调制剂BmKIT2在制备抗癫药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种特异性钠通道调制剂BmKIT2的新应用。本发明将特异性钠通道调制剂BmKIT2注入大鼠海马内，研究其对于不同致癫剂诱发的大鼠惊厥反应中的保护作用，从行为学、免疫组织化学、电生理学等方面发现BmKIT2具有明显的惊厥保护作用。该项发明为新型多肽类抗癫药物的筛选提供了依据及候选。文档编号A61P25/08GK101352568SQ20081004260公开日2009年1月28日申请日期2008年9月8日优先权日2008年9月8日发明者吉永华,隽杨,程慧雯,翁春春,荣赵申请人:上海大学