专利名称：人参二醇组皂苷微生物转化水解产物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及人参二醇组皂苷微生物转化水解产物。 本发明还涉及其制备方法。
背景技术：
五加科(Araliaceae)植物属(Panax)植物具有很高的药用价值， 其主要有效成分为皂苷类成分。生晒参(/^"ox C.A.Meyer)中 人参皂苷有多种生理活性，根据文献调査结果，可以得到以下几点启 示(1)关于人参二醇组皂苷微生物合成技术使17位碳上支链降解， 未见应用；(2)有抗炎、抗肿瘤、抗心律失常及抗衰老和益智等药理 作用；(3)利用微生物合成技术可得到人参二醇组皂苷支链降解产物， 降解产物可能具有抗炎、抗肿瘤、抗心律失常及抗衰老和益智等药理 作用，(4)原人参二醇组皂苷的抗炎、抗肿瘤等活性的活性中心在原 人参二醇配基上，而不在Cn侧链上；是待进一步研究药理活性的新 化合物。
然而，人参二醇组皂苷微生物合成产物及其药理活性的研究还未 有相关报道。
发明内容
本发明提供了 ( I)人参二醇组皂苷微生物合成水解产物。 本发明还提供了这种皂苷微生物合成水解产物的制备方法。 本发明提供了具有下述通式(I )人参二醇组皂苷微生物合成水解产物4， 4， 8， 10， 14x, 2Qx-六甲基-20-羟基-5-甾-2， 12-二烯 -24-酸内酯。
C I )
本发明的通式(I)化合物可按如下方法制备
a. 生晒参(尸朋m ^V se/^C.A. Meyer)须根取须根粗粉，用5 7%醋酸调pH值为3 4，超声提取，超声时间每次30分钟)抽滤，合 并滤液，上D-101大孔吸附树脂柱，蒸馏水至无色且为中性，再用 1%氢氧化钠溶液洗柱至流出液成碱性，再蒸馏水洗至中性且澄清无 色，用75%乙醇洗脱至流出液无皂苷反应为止，将乙醇洗脱液减压回 收至干，残渣即为人参皂苷粗品。
b. 将人参总皂苷粗品溶于20倍量的95%乙醇中超声溶解，抽 滤，滤液减压回收至干，残渣即为精制人参皂苷。c. 取人参皂苷溶于乙醇，利用溶解度梯度，通过稀碱调节pH值
使二醇型皂苷沉淀析出。具体方法总皂苷溶于95%乙醇中过滤备用；
将0. 3%氢氧化钠_乙醇溶液滴加入总皂苷的95%乙醇溶液中有沉淀析 出，放置过夜；过滤得沉淀干燥即得人参二醇组皂苷即为为原料。
d. 将半知菌纲、丝孢菌目、丝孢菌科、拟青霉属(Paecilomyces) 的淡紫拟青霉(尸aecj7o耵ces Jj'7sci/3^)菌种。接种到装有P！〕培 养基(土豆200g;水1000mL;蔗糖20g，搅拌溶解，分装封好瓶口后 湿热灭菌即制成PD液体培养基)的三角瓶中，以摇床摇速60 80r/min在摇床上振荡培养菌丝球三天，直径大约为3 4mm。
e. 将以分离得到的人参二醇组皂苷用少量甲醇溶解，加入到培养 后的菌液中，使皂苷浓度分别保持为1. 0 mg/mL左右，以摇速80r/niin 培养一周。
f. 将转化后的菌丝球和发酵液过滤分离，用等体积的蒸馏水浸 泡菌丝球，将菌丝球超声提取3次，每次10分钟，合并提取的水溶 液，减压浓縮至发酵液的体积。菌丝球提取的浓縮液和发酵液分别用 氯仿萃取、正丁醇萃取。用10%硫酸水溶液，显色10分钟，无皂苷 反应，菌丝球提取的浓縮液和发酵液中已无皂苷，停止萃取。分别合 并氯仿、正丁醇萃取液，回收溶剂至干。
g. 合并氯仿和正丁醇萃取物，先用D-101大孔树脂75%乙醇洗 脱除去色素至无皂苷反应，回收乙醇得褐黄色固体粉末即微生物转化 后产物。h.取体积比为1 : 20 (98%浓硫酸50%乙醇)的硫酸-乙醇水解 液；在7(TC 80。C水浴中热回流温和水解72小时 120小时每一小 时薄层层析显色定性即各点无变化后，加水稀释，回收乙醉；水解液 分别用氯仿、正丁醇萃取，蒸馏水洗氯仿和正丁醇萃取液至中性，然 后滴加几滴5% 7%稀氨水；回收氯仿和正丁醇合并固体粉末，得人 参二醇组皂苷微生物转化水解产物。
I.所得微生物转化后人参二醇皂苷水解产物，用硅胶层析柱进行 粗分(流动相氯仿乙酸乙酯=3 : 1)得到(I )人参二醇组皂苷 微生物合成水解产物水解产物，由于其溶于甲醇，故采用ODS进行纯 化，得常温及-20'C均为黄色粘稠状液体。
本发明皂苷微生物转化水解产物药理作用
1、对神经系统的作用
可抑制给予一次可卡因产生的活动过度以及重复给予可卡因发 生的逆转耐受性和多巴胺受体过敏。这些作用可防止可卡因的不良反 应，也可抑制扭体反应的腹部收縮和甲醛所致咬舔后足反应。
2 、对心血管系统的作用
对小鼠急性脑缺血损伤有保护作用。对小鼠急性脑缺血损伤具有 保护作用，其作用机制与减轻组织酸中毒，抑制脂质过氧化损伤有关。
对抗自由基对心肌细胞的损伤，保护细胞膜的完整性。对正常兔 血小板聚集有抑制作用，可抑制失血性休克血小板肿胀，保持血小板 的形态完整，减轻血小板聚集。
3、对失血性休克保护机理的研究
3. 1 、对单胺类递质的影响可抑制交感-肾上腺髓质系统，和失血休克晚期血小板对5-HT 的释放。
3.2 、对血管紧张素的影响
采用放免法测定血清睾酮，紫外分光光度法测定睾丸血管紧张素 转换酶(ACE)的活性，观察对游泳训练大鼠血清睾酮和ACE的影响。表 明其可能抑制运动大鼠ACE活性，提高血清睾酮水平。
3.3 、对血清酶的影响
观察到失血性休克犬血清谷草转氨酶，古丙转氨酶、肌酸磷酸激 酶等显著低于失血休克对照组。超氧化歧化酶(S0D)浓度，显著高 于对照组，从而减少过氧化脂质，保护了组织细胞结构的完整。
3.4、对血糖的影响
提示可抑制失血性休克时的糖原过渡分解；对内毒性休克动物也 有明显的保护作用。
4、对脂代谢的作用
对实验性高脂血症大鼠血清总胆固醇(TC)、脂蛋白-胆固醇代谢 有影响并具有抗氧化作用。可能通过调节体内血脂代谢、提高 PGI2/TXA2比值及纠正自由基代谢紊乱发挥抗动脉硬化作用。
5 、对生殖功能的作用
精索静脉曲张是引起男性不育症的常见原因。大鼠精索静脉曲张 时睾丸脂质过氧化物(LP0)含量明显增高。降低精索静脉曲张时睾 丸LP0的含量，从而可减轻LPO对睾丸生殖细胞的损伤，因而改善生殖 功能。
6 、对蛋白质表达和核酸合成的作用 可促进雄性火鼠脑垂体LH- 0 -mRNA表达增强，表明垂体促性腺细胞内LH-e -mRNA含量增高，后者通过垂体性腺轴系统发挥作用而促进 血中睾酮水平增加。
7 、对免疫功能的影响
对进行长期游泳训练的动物模型大鼠有免疫调节效应。免疫检测 指标为淋巴细胞转化实验与胸腺细胞自发增殖反应。可以遏制长期游 泳训练大鼠胸腺细胞自发增殖反应指标下降的趋势，对运动后胸腺细 胞自发增殖反应的恢复有促进效应，利于运动后机体细胞免疫功能的 恢复。
8 、对肾功能的作用
用夹闭法致家兔肾缺血，并提取缺血血清和对照血清，分别与人 肾小管细胞共培养，四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞株吸光度(A) 值以判定其增殖活性，苔盼蓝染色计算活细胞率。对正常培养和经 急性缺血再灌注肾损伤家兔血清处理后的小管细胞增殖的影响，并探 讨其机制。可促进正常培养和急性缺血再灌注肾损伤性兔血清处理后 的人肾小管细胞增殖。
9 、对突变的作用
基因突变是--切疾病发生的根源，特别是癌症发生的根源-对 S-180艾氏腹水瘤、SMMC-7221肝癌细胞有明显的杀伤作用。
本发明产物溶于甲醇，在氯仿中有较大溶解度，常温下为液态， 且由于其分子结构特点其制备方法简便、高效、成本低；可用于新药 研发及保健品和功能性食品的开发。
具体实施例
制备实施例1
4， 4, 8， 10， 14x， 2ftx-六甲基-20-羟基-5-甾-2， 12-二烯-24-酸内酯，得化合物I 39mg黄色粘稠状液体，产率约1.2%。"C NMR: 132.8 (C")， 130.9 (C")， 130.6 (C勺,128.8 (Cj); IR: 1600 cm—1 (—C = C—)
1580 cm—乂一C-C—吸收峰)可知化合物I的分子结构中存在两个
~c=c_。 13c
NMR:167.1(C24)， IR:1727 cm—1 (羰基吸收峰)；ESI画MS: ESI-MS (100eV) /n/z(%):
391(M + Na+——C = 0—,81)， 371(M + Na+——C = O——H20 — 2HT,33),可以推断化合
物I的分子结构中存在羰基。由IR:1287 cm—1 (—C —O — C一吸收 峰)，1119 cm—1
(_C —0 — C—吸收峰)，1072 cm—1 (—C一0 —C—吸收峰)，1380 cm—、一 CH3吸收
峰)且不饱和度(t/)为8，可推断化合物I分子式为C27H4o02。
制备方法例
取生晒参须根粗粉6Kg，用5 7%醋酸调PH值为3 4，超声提 取，超声时间每次30分钟)抽滤，合并滤液，上D-101大孔吸附树 脂柱，蒸馏水至无色且为中性，再用1%氢氧化钠溶液洗柱至流出液 成碱性，再蒸馏水洗至中性且澄清无色，用75%乙醇洗脱至流出液无 皂苷反应为止，将乙醇洗脱液减压回收至干，残渣即为人参皂苷粗品 为580g,收率为9.67%，将人参总皂苷粗品溶于20倍量的95%乙 醇中超声溶解，抽滤，滤液减压回收至干，残渣即为精制人参皂苷取人参皂苷溶于乙醇，利用溶解度梯度，通过稀碱调节pH值使二醇 型皂苷沉淀析出。具体方法:总皂苷溶于95%乙醇中过滤备用；将0. 3%
氢氧化钠-乙醇溶液滴加入总皂苷的95%乙醇溶液中有沉淀析出，放 置过夜；过滤得沉淀干燥即得人参二醇组皂苷即为为原料；将半知菌 纲、丝孢菌目、丝孢菌科、拟青霉属(Paecilomyces)的淡紫拟青霉 (尸ae"7o历yces 7j7a"7 ws)菌种。接种到装有PD培养基(土豆200g; 水1000mL;蔗糖20g，搅拌溶解，分装封好瓶口后湿热灭菌即制成PD 液体培养基)的三角瓶中，以摇床摇速60 80r/min在摇床上振荡培 养菌丝球三天，直径大约为3 4mm;将以分离得到的人参二醇组皂 苷用少量甲醇溶解，加入到培养后的菌液中，使皂苷浓度分别保持为 1.0mg/mL左右，以摇速80r/min培养一周；将转化后的菌丝球和发 酵液过滤分离，用等体积的蒸馏水浸泡菌丝球，将菌丝球超声提取3 次，每次10分钟，合并提取的水溶液，减压浓縮至发酵液的体积。 菌丝球提取的浓縮液和发酵液分别用氯仿萃取、正丁醇萃取。用10% 硫酸水溶液，显色10分钟，无皂苷反应，菌丝球提取的浓縮液和发 酵液中已无皂苷，停止萃取。分别合并氯仿、正丁醇萃取液，回收溶 剂至干；
合并氯仿和正丁醇萃取物，先用D-101大孔树脂75%乙醇洗脱 除去色素至无皂苷反应，回收乙醇得褐黄色固体粉末即微生物转化后 产物；取体积比为1 : 20 (98%浓硫酸50%乙醇)的硫酸-乙醇水解 液；在70'C 8(TC水浴中热回流温和水解72小时 120小时每一小 时薄层层析显色定性即各点无变化后，加水稀释，回收乙醇；水解液分别用氯仿、正丁醇萃取，蒸馏水洗氯仿和正丁醇萃取液至中性，然
后滴加几滴5% 7%稀氨水；回收氯仿和正丁醇合并固体粉末，得人 参二醇组皂苷微生物转化水解产物；所得微生物转化后人参二醇皂苷 水解产物，用硅胶层析柱进行粗分(流动相氯仿乙酸乙酯=3 : 1) 得到(I )人参二醇组皂苷微生物合成水解产物水解产物，由于其溶 于甲醇，故采用ODS进行纯化，得常温及-2(TC均为黄色粘稠状液体。
权利要求
1. 下述通式(I)人参二醇组皂苷微生物合成水解产物4，4，8，10，14α，20α-六甲基-20-羟基-5-甾-2，12-二烯-24-酸内酯；id="icf0001" file="S2008100507595C00011.gif" wi="55" he="69" top= "85" left = "78" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>
2 、权利要求1的人参二醇组皂苷微生物合成水解产物的制备方 法，包括以下步骤a. 生晒参须根取须根粗粉，用稀酸调pH值为3 4，超声提取， 超声时间每次30分钟抽滤，合并滤液，上D-101大孔吸附树脂柱， 蒸馏水至无色且为中性，再用稀碱洗柱至流出液成碱性，再蒸馏水洗 至中性且澄清无色，用75%乙醇洗脱至流出液无皂苷反应为止，将乙 醇洗脱液减压回收至干，残渣即为人参皂苷粗品；b. 将人参总皂苷粗品溶于20倍量的95%乙醇中超声溶解，抽 滤，滤液减压回收至干，残渣即为精制人参皂苷。c. 取人参皂苷溶于乙醇，利用溶解度梯度，通过稀碱调节pH值 使二醇型皂苷沉淀析出；d. 将半知菌纲、丝孢菌目、丝孢菌科、拟青霉属(myces)的淡 紫拟青霉菌种接种到装有PD培养基的三角瓶中，以摇床摇速60 80r/min在摇床上振荡培养菌丝球三天，直径为3 4mrn;e. 将以分离得到的人参二醇组皂苷用少量甲醇溶解，加入到培养 后的菌液中，使皂苷浓度分别保持为1. 0 mg/mL左右，以摇速80r/min 培养一周；f. 将转化后的菌丝球和发酵液过滤分离，用等体积的蒸馏水浸 泡菌丝球，将菌丝球超声提取3次，每次10分钟，合并提取的水溶 液，减压浓縮至发酵液的体积，菌丝球提取的浓縮液和发酵液分别用 氯仿萃取、正丁醇萃取。用10%硫酸水溶液，显色10分钟，无皂苷 反应，菌丝球提取的浓縮液和发酵液中已无皂苷，停止萃取，分别合 并氯仿、正丁醇萃取液，回收溶剂至干；g.合并氯仿和正丁醇萃取物，先用D-101大孔树脂75%乙醇洗 脱除去色素至无皂苷反应，回收乙醇得褐黄色固体粉末即微生物转化 后产物；h.取体积比为1 : 20的硫酸-乙醇水解液，其中98%浓硫酸50% 乙醇，在7(TC 80'C水浴中热回流温和水解72小时 120小时，每 一小时薄层层析显色定性即各点无变化后，加水稀释，回收乙醇，水 解液分别用氯仿、正丁醇萃取，蒸馏水洗氯仿和正丁醇萃取液至中性，然后滴加几滴5% 7%稀氨水，回收氯仿和正丁醇合并固体粉末，得 人参二醇组皂苷微生物转化水解产物；I .所得微生物转化后人参二醇皂苷水解产物，用硅胶层析柱进 行粗分得到(I )人参二醇组皂苷微生物合成水解产物水解产物，其 中流动相氯仿乙酸乙酯=3 : 1，由于其溶于甲醇，故采用0DS进行 纯化，得常温及-2(TC均为黄色粘稠状液体。
3. 按权利要求2的方法，其中a步骤中稀酸为5 79&醋酸，稀碱 为1%氢氧化钠溶液。
4. 按照权利要求2的方法，其中步骤d中所述PD培养基配方为 土豆20重量份；水100重量份；蔗糖2重量份，搅拌溶解，分装封好 瓶口后湿热灭菌即制成PD液体培养基。
5. 按照权利要求2的方法，其中步骤c中所述方法总皂苷溶 于95%乙醇中过滤备用；将0. 3%氢氧化钠-乙醇溶液滴加入总皂苷的 95%乙醇溶液中有沉淀析出，放置过夜；过滤得沉淀干燥即得人参二 醇组皂苷即为为原料。
全文摘要
人参二醇组皂苷微生物转化水解产物及其制备方法，涉及人参二醇组皂苷微生物转化水解产物，以及制备方法。本发明提供了具有下述通式的人参二醇组皂苷微生物转化水解产物。采用醇提及培养基培养等工艺制取。本发明产物溶于甲醇，在氯仿中有较大溶解度，常温下为液态，且由于其分子结构特点其制备方法简便、高效、成本低；可用于新药研发及保健品和功能性食品的开发。
文档编号A61P25/00GK101284859SQ200810050759
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者张连学, 袁金田 申请人:吉林农业大学