专利名称：：慢性肝损伤合并应激抑郁大鼠模型的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种动物实验模型的制备方法，尤其是涉及一种慢性肝损伤合并应激抑郁大鼠模型的制备方法。
背景技术：
：慢性肝损伤即慢性肝炎主要是指慢乙肝、慢丙肝，我国属高发国家之一。因其具有传染性、难治性、恶变性、家族遗传性、经常出现躯体不适等特点，使慢性肝炎患者长期或间断地处于心、身双重的折磨中。所以，慢性肝炎患者长期处于一种抑郁状态，他们对生活悲观失望，对生存失去信心。我们把这种由慢性肝炎引起的抑郁状态称为"慢性肝炎合并抑郁症"。临床除慢性肝病常见的症状体征外，还具有失眠、焦虑、抑郁、强迫、对疾病过渡关注等精神障碍症，这种状态存在于肝病发生发展的各个阶段，并存在于每一个肝病个体，慢性肝病和抑郁症二者互为因果，病情逐渐加重，治疗难度也随之加大，故对本病的研究越来越受到医学界的重视。目前关于本病发生的流行病学大样本、多种心的研究尚缺乏，但是随着本病越来越受到关注，已经有很多学者对慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌等慢性肝病患者的抑郁状态进行了调查研究。有研究提示，一般肝病病人中有35%60%具有不同程度的抑郁。周爱红对110例肝炎病人进行了调査，其中有67例(60.9%)存在不同程度的抑郁心理。肖琼研究发现，212份肝硬化患者中，92例存在抑郁症状，占43.8%。张武等对82例慢性乙型肝炎患者进行测评，结果其中有抑郁者29例，患病率为35%(29/82)，抑郁自评量表标准分均值为43.16±10.05，高于正常组41.88士10.57(t=2.41，P〈0.05)。调查显示慢性乙型肝炎症状严重、病毒复制明显及肝功能损害严重患者其抑郁、焦虑情绪更明显。慢性肝炎合并抑郁症，祖国医学并无此病名，但根据其临床表现，可归属于中医学"黄疸"、"胁痛"等合并"郁证"的范畴。许多古代医籍中都有对"郁"的相关论述。对郁的认识源于《内经》，提出外感致郁及情志致郁两种观点。宋代陈无择，其在《三因极一病证方论》说"七情人之常性，动之则先自脏腑郁发，外形于肢体，为内所因"。《景岳全书4卩证》"凡五气之郁则诸病皆有，此因病而郁也。至若情志之郁，则总由乎心，此因郁而病也"。其病机是初起七情所伤，肝失条达，气机不畅而成气郁，病属实为气病；气有余便是火可成火郁；由气及血可成血郁；气滞湿阻，聚而成痰可成痰郁；气滞水气不行，湿气停留可成湿郁；气滞痰湿不化则食积难消可成食郁；此六郁互为因果又相互兼夹。由此可见躯体疾病伴发抑郁症与疾病本身有一定的关系。韩毳认为抑郁症与中医肝脏有诸多联系，其从中医肝脏的生理病理特点，以及中医学和现代医学对抑郁症的认识等方面进行分析阐述，得出如下推论肝郁可能是抑郁症的重要发病环节；神经内分泌功能失调是抑郁症和肝失疏泄证共同的病理学基础。导致心情压抑长期不能缓解，引起脑腑气机紊乱，脑神失调而致本病。慢性乙型肝炎的发病机制复杂，除与病毒感染有关外，还与机体的免疫应答失调有关。研究表明心理反应可导致一系列的生理反应，影响机体的免疫功能，从而影响疾病的治疗进程。对于肝炎合并抑郁的发生国内外已有报道，但对其机理尚无较清晰的认识。从抑郁的发病机理看，多认为与生物-心理-社会因素有关。目前研究表明抑郁症是脑内单胺类递质，如去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)和多巴胺(DA)等功能不足所致而成的。多种神经肽，包括促皮质激素释放激素(CRH)、促甲状腺素释放激素(TRH)、生长激素(GH)、生长激素释放激素(GHRH)等参与抑郁症的发病过程。此外，慢性应激造成下丘脑一垂体一肾上腺轴亢进时产生的应激激素对海马神经元的选择性损伤是导致抑郁发生的关键原因。脑源性神经营养因子(BDNF)属于神经营养素家族，是一类很重要的保护因子。研究发现慢性不可预知的应激可致抑郁症大鼠海马神经元明显受损，BDNF阳性神经元数量显著减少。关于慢性肝炎合并抑郁症的发病越来越受到重视，目前无有效的药物治疗，而对本病的实验研究尚未见有报道，如果可以成功复制慢性肝损伤合并慢性不可预知温和应激抑郁模型大鼠模型，不但可以研究本病发生的机理，还可以为研制治疗本病有效药物提供动物实验依据，且本发明的造模方法为复合式造模方法，研究的是一种疾病长期存在的状态下，合并其他相关疾病的实验，为其他疾病有合并症提供实验思路。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种慢性肝损伤合并应激抑郁大鼠模型的制备方法，用于研究本病发生的机理，为研制治疗本病有效药物提供动物实验依据。为解决上述技术问题，本发明提供一种慢性肝损伤合并应激抑郁大鼠模型的制备方法，其特征在于包括下列步骤选用雄性Wistar大鼠，体重在180-220g之间，适应环境1周后，进行敞箱实验行为学筛选，选出积分相近的大鼠；第l-4周，5只/笼，正常饮食饮水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周；第5-12周，5只/笼，正常饮食饮水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周，生理盐水灌胃，l次/日；第13周，5只/笼，正常饮食饮水，生理盐水灌胃，l次/日；第14-16周，首先进行敞箱实验，1只/笼，正常饮食饮水，禁食禁水刺激时除外，生理盐水灌胃，1次/日，给予慢性应激刺激，每日随机选用l种；第112天，称体重、进行糖水消耗及敞箱实验，实验结束即得慢性肝损伤合并应激抑郁大鼠模型。本发明采用皮下注射40%CCL4、孤养、给予慢性不可预知温和刺激造模方法制备慢性肝损伤合并孤养慢性不可预知温和应激抑郁大鼠模型，确立慢性肝损伤合并孤养慢性不可预知温和应激抑郁模型评价指标，不但可为今后研究本病造模提供参考依据，为临床诊治肝病合并抑郁症提供有效的实验依据，还可为今后研发治疗本病的药物提供实验验证手段。下面通过实验例进一步说明本发明的效果选用雄性Wistar大鼠，体重在180-220g之间，适应环境1周后，进行敞箱实验(Open-field)行为学筛选，将积分相近的170只大鼠分为8组空白组、慢性肝损伤模型组(简称"肝炎模型组")、肝损伤合并慢性轻度不可预见性应激抑郁模型(简称"抑郁模型组")、养肝解郁颗粒低剂量组(简称"低剂量组")、养肝解郁颗粒中剂量组(简称"中剂量组")、养肝解郁颗粒高剂量组(简称"高剂量组")、乙肝益气解郁颗粒组(简称"对照1组")，盐酸氟西汀胶囊组(简称"对照2组")，盐酸氟西汀胶囊组30只，其余各组为20只，实验周期为16周；l-4周空白组5只/笼，正常饮食饮水；肝炎模型组、抑郁模型组、对照1组、对照2组、高中低剂量组5只/笼，正常饮食饮水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周；5-12周空白组5只/笼，正常饮食饮水，生理盐水灌胃，1次/日；肝炎模型组、抑郁模型组:5只/笼，正常饮食饮水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周，生理盐水灌胃，l次/日；对照l组5只/笼，正常饮食饮水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周，乙肝益气解郁冲剂水溶液灌胃，l次/日；对照2组5只/笼，正常饮食饮水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周，盐酸氟西汀胶囊水溶液灌胃，l次/日；高、中、低剂量组5只/笼，正常饮食饮水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周，相应浓度的养肝解郁颗粒水溶液灌胃，l次/日；13周空白组、肝炎模型组、抑郁模型组5只/笼，正常饮食饮水，生理盐水灌胃，l次/日；对照l组5只/笼，正常饮食饮水，乙肝益气解郁冲剂水溶液灌胃，l次/日；对照2组5只/笼，正常饮食饮水，盐酸氟西汀胶囊水溶液灌胃，1次/日；高、中、低剂量组5只/笼，正常饮食饮水，相应浓度的养肝解郁颗粒水溶液灌胃，l次/日；在实验的第84天进糖水消耗实验，称量各组大鼠的体重；14-16周首先各组大鼠进行敞箱实验；空白组、肝炎模型组5只/笼；正常饮食饮水，生理盐水灌胃，1次/日；抑郁模型组-1只/笼，正常饮食饮水，生理盐水灌胃，l次/日，给予慢性应激刺激，每天1种，具体详见表l;对照l组l只/笼，正常饮食饮水，乙肝益气解郁冲剂水溶液灌胃，l次/日，给予慢性应激刺激，每天1种，具体详见表l;对照2组l只/笼，正常饮食饮水，盐酸氟西汀胶囊水溶液灌胃，1次/日，给予慢性应激刺激，每天1种，具体详见表1;高、中、低剂量组1只/笼，正常饮食饮水，相应浓度的养肝解郁颗粒水溶液灌胃，l次/日，给予慢性应激刺激，每天1种，具体详见表l;实验第112天各组大鼠称体重、进行糖水消耗及敞箱实验，实验结束24小时后麻醉大鼠取实验标本。应激刺激实验日程表如下(表l):<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>每种刺激的操作方法如下:①禁食24h断料，即早8:00至次日早8:00不喂食。②禁水24h断水，即早8:00至次日早8:00不喂水。③昼夜颠倒于早7:OO将动物放入暗室中，不开灯使动物处于黑暗状态；至晚19:OO将日光灯打开，使动物处于光照状态，直至次曰早7:00。④冰水游泳游泳器具为一长方形硬塑料盒子，长50cm宽无限制，高度30cm以上，将动物放入盛有4。C冰水箱中，箱内冰水的深度为15cm(大鼠的后足尖刚刚能触及桶底)，5min后将动物取出放回笼中。⑤热烘烘箱温度调至45。C恒定，将动物放入烘箱中，5min后将动物取出。⑥夹尾将大鼠放入固定笼中，将鼠尾从笼盖缺口中反向拉出，即大鼠的身体在笼内，而尾巴通过笼盖暴露在外，使用文件夹夹在距离大鼠尾根lcm处，(用力不要过大，使大鼠发出哀叫即可)持续1min后，将大鼠取出放回笼中。⑦电击使用大鼠电击箱操作，利用变压线圈将电压控制在36v，每隔lmin—次，每次通电10s，共进行30次。实验过程中及实验结束所获得的结果1、结果表2各组大鼠体重的变化(；±s,g)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注与空白组比较，？<0.05,"P<0.01;与肝炎模型组比较，*P<0.05**P<0.01;与抑郁模型组比较，AP<0.05,A。P<0.01。P值意义以下相同。表2结果表明造模前各组大鼠体重无明显差异(P>0.05)，随着时间的推移各组大鼠逐渐消痩，体重明显减轻。实验84天与空白组比较，模型1组、模型2组体重减少有明显的差异(P<0.01)。在第112天与空白组比较模型1、2组体重明显减少(P<0.01)。表3各组大鼠糖水偏爱百分比比较(S±s,%)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3结果表明应激刺激前，即第84天，与空白组比较，各组大鼠糖水偏爱百分比无明显差异(P>0.05);实验结東后，与空白组比较模型2组及对照1组糖水偏爱百分比明显减少(P<0.01);与模型2组比较，模型1组大鼠对糖水偏爱百分比明显增高(P<0.01)。表4各组大鼠Open-Field法行为测定水平运动比较(；±s，运动次数，次/3min)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表5各组大鼠Open-Field法行为测定垂直运动比较(；±s,运动次数，次/3min)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表4分无差异(P〉0.05);实验结束后与空白组比较，模型2组大鼠水平运动评分明显下降(P<0.01)，与模型2组比较，模型1组大鼠水平运动评分明显升高(P<0.01)。表5垂直运动结果表明实验第1天及第92天，与空白组比较各组大鼠垂直运动评分无差异(P>0.05);实验结東后与空白组比较，模型2组大鼠垂直运动评分明显下降(P<0.01),与模型2组比较，模型l组大鼠垂直运动评分明显升高(P<0.01)。表6各组慢性肝损伤合并孤养慢性不可预知温和应激抑郁模型各组大鼠血清胆红素及蛋白含量的比较(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>TBIL:与空白组比较模1组、模型2组大鼠血清TBIL含量明显升高(P<0.01)。TP:与空白组比较模型1组、模型2组大鼠血清TP含量明显下降(P復01)。ALB:与空白组比较模型1组、模型2组大鼠血清ALB含量明显下降(P復01)。表7各组慢性肝损伤合并孤养慢性不可预知温和应激抑郁模型各组大鼠血清酶含量的比较(X±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>ALT:与空白比较模型1组、模型2组大鼠血清ALT含量明显升高(P〈0.01);AST:与空白比较模型l组、模型2组大鼠血清ALT含量明显升高(P<0.01)。表8各组大鼠下丘脑单胺类神经递质的变化G土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>5-HT:与空白组比较，模型2组大鼠大脑下丘脑内5-HT的含量均明显降低(P<0.01);DA:与空白组比较，模型2组大鼠大脑下丘脑内DA的含量均明显降低(P<0.01);;NE:与空白组比较，模型2组大鼠大脑下丘脑内NE的含量均明显降低(P<0.01)。2、结论(1)通过对上述表格中正常对照组、肝炎模型组、肝炎合并抑郁模型组的数据统计的分析，可得出如下的结论在行为学上肝炎合并抑郁模型组在实验结束时明显出现抑郁的表现；在体重上三者间均有着差异性，且肝炎合并抑郁模型组大鼠的体重下降最明显；在糖水消耗试验上，在实验到第13周末时，三组大鼠对糖水的偏爱没有显著性的差异，而在实验第16周末时，正常对照组、肝炎模型组大鼠对糖水的偏爱没有显著差异，而肝炎合并抑郁模型组大鼠对糖水的偏爱明显的降低，说明抑郁模型造模成功；在敞箱实验上，实验开始时三组大鼠均无明显差异，试验结束的时候，肝炎合并抑郁模型组的大鼠在水平运动和垂直运动与正常对照组和肝炎模型组有显著性差异，说明抑郁模型造模成功；在肝功改变上，正常对照组与肝炎模型组、肝炎合并抑郁模型组大鼠肝功能的变化上有显著性的差异，说明慢性肝损伤的模型复制成功；在神经递改变上，肝炎合并抑郁模型组均比正常对照组及肝炎模型组大鼠偏低，且有统计学意义，通过下丘脑神经递质的变化，说明慢性不可预见性应激抑郁模型照模成功。经分析说明采用皮下注射40%CCL4、孤养、给予慢性不可预知温和刺激造模方法可成功制备慢性肝损伤合并孤养慢性不可预知温和应激抑郁大鼠模型。养肝解郁颗粒方来源于丹栀逍遥散，丹栀逍遥散出自明代医家薛己《内科摘要》，为古代经典名方的中药复方制剂，疗效确切，今用于治疗慢性肝病合并抑郁症，是现代医学疾病与中医证候相结合(病证结合)，体现中药复方制剂的传统继承观与现代应用之发展观，组成丹皮、栀子、白术、茯苓、甘草、柴胡、当归、白芍、生姜、薄荷。实施例选用雄性Wistar大鼠，体重在200g，适应环境1周后，进行敞箱实验行为学筛选，选出积分相近的大鼠；第l-4周，5只/笼，正常饮食饮水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周；第5-12周，5只/笼，正常饮食饮水，40%CCUlml/kg，皮下注射2次/周，生理盐水灌胃，l次/日；第13周，5只/笼，正常饮食饮水，生理盐水灌胃，l次/日；第14-16周，首先进行敞箱实验，1只/笼，正常饮食饮水，禁食禁水刺激时除外，生理盐水灌胃，1次/日，给予慢性应激刺激，每日随机选用l种；第112天，称体重、进行糖水消耗及敞箱实验，实验结束24小时后麻醉大鼠即得慢性肝损伤合并应激抑郁大鼠模型。权利要求1.一种慢性肝损伤合并应激抑郁大鼠模型的制备方法，其特征在于包括下列步骤选用雄性Wistar大鼠，体重在180-220g之间，适应环境1周后，进行敞箱实验行为学筛选，选出积分相近的大鼠；第1-4周，5只/笼，正常饮食饮水，40％CCL41ml/kg，皮下注射2次/周；第5-12周，5只/笼，正常饮食饮水，40％CCL41ml/kg，皮下注射2次/周，生理盐水灌胃，1次/日；第13周，5只/笼，正常饮食饮水，生理盐水灌胃，1次/日；第14-16周，首先进行敞箱实验，1只/笼，正常饮食饮水，禁食禁水刺激时除外，生理盐水灌胃，1次/日，给予慢性应激刺激，每日随机选用1种；第112天，称体重、进行糖水消耗及敞箱实验，实验结束即得慢性肝损伤合并应激抑郁大鼠模型。全文摘要一种慢性肝损伤合并应激抑郁大鼠模型的制备方法，选用雄性Wistar大鼠，体重在180-220g之间，适应环境1周后，进行敞箱实验行为学筛选，选出积分相近的大鼠；第1-4周，正常饮食饮水，40％CCL<sub>4</sub>1ml/kg，皮下注射2次/周；5-12周，正常饮食饮水，40％CCL<sub>4</sub>1ml/kg，皮下注射2次/周，生理盐水灌胃，1次/日；第13周，正常饮食饮水，生理盐水灌胃，1次/日；第14-16周，首先进行敞箱实验，1只/笼，正常饮食饮水，生理盐水灌胃，1次/日，给予慢性应激刺激；第112天，称体重、进行糖水消耗及敞箱实验。本发明研究本病造模提供参考依据，为临床诊治肝病合并抑郁症提供有效的实验依据，还可为今后研发治疗本病的药物提供实验验证手段。文档编号A61K49/00GK101284138SQ20081005078公开日2008年10月15日申请日期2008年6月4日优先权日2008年6月4日发明者刘铁军申请人:刘铁军