专利名称：巨噬细胞调节蛋白mirf在制备抗炎药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体地说是MIRF (Macrophage Inflammation Related Factor)蛋白在医药中的用途。
背景技术：
巨噬细胞是人体吞噬细胞的一种，分布于组织中，有免疫信息传 递、协同和吞噬处理抗原功效。单核细胞渗出血管，进入组织和器 官后，可进一步分化发育成巨噬细胞，成为机体内吞噬能力最强的细 胞。巨噬细胞可以是固定不动的，也可以用变形虫样运动的方式移动。 固定和游走的巨噬细胞是同一细胞的不同阶段，两者可以互变，其形 态也随功能状态和所在的位置而变化。巨噬细胞在不同组织中的名称 不同在肺里称"肺巨噬细胞"；在神经系统里称为"小神经胶质细胞"； 在骨里则称为"破骨细胞"。
单核细胞和巨噬细胞都能消灭侵入机体的细菌、吞噬异物颗粒、 消除体内衰老、损伤的细胞和变性的细胞间质、杀伤肿瘤细胞，并参 与免疫反应。
巨噬细胞活性的调控在免疫系统中对于维持前炎和抑炎平衡是 至关重要的。当巨噬细胞过度活化后会引发炎症，甚至产生巨噬细胞 活化综合症。研究表明，炎症反应与一些细胞因子TNF-a、IL-l、IL-6、 IL-8密切相关。这些炎性细胞因子主要由要由单核/巨噬细胞、中性 粒细胞、淋巴细胞、上皮细胞或内皮细胞分泌。因此，通过抑制细胞 因子TNF-a、 IL-1、 IL-6、 IL-8的表达有望缓解和抑制炎症的产生。
MIRF蛋白，NCBI注释名称为CHID 1 (Homo sapiens chitinase domain containing 1 )蛋白，是发明人所在实验室通过生物信息学手段， 利用PSORT和HMM模型筛选出的25种人类分泌蛋白中的一个(GenBankID， NM—023947)。该基因长1182bp，编码393个氨基酸， 定位于11号染色体(llp15.5),其功能未知。在PDB(protein data bank)
数据库中进行比对的结果显示MIRF蛋白是一个结构未知的蛋白。蛋 白序列比对发现该蛋白含有一个glycohydrolases 18 (Glyco一18)的保
守结构域，但与同家族蛋白的序列同源性不到20%，属于一个结构 和功能完全未知的蛋白。
本发明人对该蛋白进一步进行研究，发现该蛋白能够抑制炎性细 胞因子的表达水平，因此提出了本申请。
发明内容
本发明的目的在于提供MIRF蛋白在制备抗炎药物中的新用途。 本发明通过Se-SAD法(Brodersen, de La Fortelle et al. 2000)解析 了 MIRF的三维晶体结构，发现MIRF具有Glyco-18几丁质酶家族 蛋白的典型的TIM桶状结构，但由于MIRF蛋白缺乏几丁质酶活的 保守结构域(motif)，所以它不具有几丁质酶的活性。与Glyco-18几丁 质酶家族其它蛋白结构最明显的不同之处在于，MIRF蛋白的N端存 在一个柔性很大的区域，很可能是它与受体蛋白等结合的区域。此外， MIRF结构显示了一个可能的与糖结合的裂缝(cleft )，与其它蛋白相 比，该裂缝比较长并且扁平。由于其他的类似几丁质酶的蛋白能够特 异地结合不同的糖类，通过表面能量共振转移分析发现MIRF与葡萄 糖胺、乙酰葡萄糖胺和半乳糖等单糖衍生物有明显结合，与甘露糖和 核糖业具有一定的结合，更为重要的是，MIRF能够与脂多糖、肽聚 糖和几丁质等病原菌特异的寡糖结合，并表现出浓度依赖性。从在 MIRF蛋白表面所看到的长而宽的结合裂缝结构特点可以解释MIRF 能够结合多糖(LPS、 PGN)等分子量能够比较大的糖类。
进一步的实验结果表明，MIRF在PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate，佛波醇酯)诱导分化的THP-1巨噬细胞中表达水平上调， 但其分泌到细胞培养基中的蛋白却减少，为了研究其原因，本发明检测了 MIRF在单核细胞和分化的巨噬细胞中的亚细胞定位。免疫荧光分析结果表明，MIRF蛋白与PMA诱导分化的巨噬细胞表面结合， 流式细胞术(FACS)检测观察到同样的结果，但在单核细胞THP-1 中则未观察到该现象。并且，MIRF与巨噬细胞的结合随着PMA处 理的时间的延长而增强。因此推测MIRF与巨p藍细胞的结合会影响细 胞的活性。本发明首先使用不同浓度纯化的MIRF蛋白(0|ag/ml， 0.01|ig/ml, 0.1)ig/ml， 1lig/ml和10ng/ml)刺激类巨噬细胞，通过实时RT-PCR分 析TNFa和IL-6等细胞因子的表达，结果显示MIRF蛋白的确以浓度 梯度依赖的方式抑制了 TNFa和IL-6的表达，表明MIRF蛋白能够抑 制自身免疫性疾病，如狼疮或风湿病引起的细胞炎症反应。LPS是革兰氏阴性菌细胞外膜的主要成分，由革兰氏阴性菌感染 造成许多生物效应如内毒素休克、发热和败血等均是由LPS产生的， LPS可以非特异性地激活机体免疫的淋巴和巨噬细胞，通过一些信号 放大激活NFkB通路，诱导TNFa等炎症相关因子的产生。本发明使 用LPS刺激巨p篮细胞体来模拟革兰氏阴性菌的感染，同时加入MIRF 蛋白，实时RT-PCR检测炎症相关因子的表达，结果发现在PMA诱 导分化的巨噬细胞中，LPS刺激与正常发育的巨噬细胞反应相同，同 样诱导了 TNFa、 IL-6、 IL-1(3和IL-8等炎症相关因子表达；加入MIRF 蛋白后，LPS诱导的前炎因子(pro-inflammation factor) TNFa和IL-6 被明显抑制，IL-l(3和IL-8的表达也在某种程度上被抑制。上述结果 表明MIRF通过与巨嗡细胞表明的蛋白结合进而抑制LPS引起的细 胞炎症反应。革兰氏阳性菌细胞壁的主要成分肽聚糖PGN由乙酰葡萄糖胺和 乙酰胞壁酸经6-7个氨基酸的短肽连接形成的重复单位构成，引起了 大部分由革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌感染造成的临床症状，如发 热、发炎、败血休克、白细胞增多、昏睡、脓肿和关节炎等。这些临床症状主要是由PGN诱导的细胞因子和其它炎症调节蛋白的释放引 起的，而PGN作为细菌特异的病原相关分子模式，是模式识别受体 理想的配体，上述糖结合实验显示MIRF蛋白可与PGN具有强烈的 结合，本发明使用PGN刺激巨噬细胞体来模拟革兰氏阳性菌的感染， 同时加入MIRF蛋白，实时RT-PCR检测炎症相关因子的表达。结果 发现，与MIRF在LPS诱导炎症相关因子表达变化上的影响类似， MIRF蛋白抑制了 PGN诱导的致炎因子TNFa、 IL-6的表达。巨噬细胞活性的调控在免疫系统中对于维持前炎和抑炎平衡是 至关重要的。本发明首次发现MIRF是能够特异性地抑制巨噬细胞活 性的新型分泌蛋白它可以与巨噬细胞结合，并且能够特异地与LPS、 PGN等病原菌特异的寡糖结合。由于病原菌的侵染诱导的前炎症细 胞因子的表达将会引起炎症反应，MIRF对TNFa和IL-6表达的抑止 说明MIRF对巨噬细胞具有抑活(deactivation )作用，即表现为MIRF 具有抑制炎症反应的作用。比较哺乳动物中至今发现的含有Glyco-8结构域的其它蛋白，我 们发现该家族中成员与炎症疾病的发生密切相关。酸性几丁质酶和壳 三糖酶分别在哮喘和Guacher病人中高表达，而YKL-39和YKL-40 则在风湿性关节炎的发病机理中具有重要的作用，并且在动脉粥样硬 化病人中也有高表达，小鼠Yml/2在哮喘或其它的炎症疾病中发挥 调节作用。它们均在巨噬细胞中表达，受到Th2细胞因子的调控，参 与树突状细胞(DC细胞)和吞噬细胞的激活等。MIRF蛋白也表现 出明显的固有免疫调节活性，它能够作为哮喘、风湿性关节炎等免疫 疾病的有效抑制剂。本发明MIRF蛋白能够抑制LPS、 PGN等诱导的以及自身免疫 性疾病(如风湿病或狼疮等)引起的细胞炎症因子的表达，因此能够 作为某些炎症，如哮喘、风湿性关节炎等免疫疾病的有效抑制剂，具 有潜在的临床应用价值。另外，通过基因工程技术，可以获得大量的、稳定的、有活性的重组MIRF蛋白，成本很低，适于推广应用。
图1显示的是MIRF蛋白的整体结构。(a)MIRF的丝带图。每 一个二级结构元件都做了标记。所有的图均通过PyMOL程序制作。 箭头所指的区域是MIRF的N端的一个新的结构域。(b)MIRF (黑色， PDB accession no. 3BXW)与YM1 (灰色，PDB accession no. 1VF8)蛋 白结构的比对图。图2显示的是MIRF与配体的结合。(a)MIRF与HCgp39-N-乙 酰葡萄糖胺复合物(1LG1)结构的比对图，显示了结合糖的裂缝。N-乙酰葡萄糖胺(NAG6)以棒状表示。MIRF主链(backbone)以深灰 色表示。HCgp39复合物以浅灰色表示。在MIRF裂缝的表面，有几 个芳香族氨基酸(Tyr62， Trp66, Tyr239, Tyr241, Tyr280 and Trp358)在 HCgp39蛋白中也是保守的，这些残基可能参与MIRF与糖的结合。(b) MIRF蛋白与NAG6对接的分子表面示意图。表面共振能量转移分析 验证不同糖(c)以及脂多糖LPS (d)与MIRF之间的结合。(e)不溶性 PGN和Chitin与MIRF结合的pull down分析。MIRF蛋白与PGN或 Chitin悬浮液孵育后，离心去除上清，PBS洗五次后，上清和沉淀分 别取样进行SDS-PAGE,转膜，anti-MIRF分析；同时分别使用 GluNAc-argrose和Glu-argrose进行pull down,作为阳性和阴性对照。 P,沉淀；S,上清。图3说明MIRF与PMA-诱导分化的THP-1细胞表面结合，并 且抑制该细胞中炎症因子的表达。(a)免疫荧光检测MIRF与单核 THP-1细胞以及PMA-诱导分化的THP-1细胞的结合。(b) FACS分 析检测内源的和重组MIRF蛋白与单核THP-1细胞以及PMA-诱导 分化的THP-1细胞的结合。右上角显示的数字为结合细胞的数目。(c) MIRF以时间依赖形式与PMA-诱导分化的THP-1细胞结合。PMA诱 导不同的时间后收集细胞，与80[xg/ml MIRF蛋白孵育，anti-MIRF及FITC标记的二抗标记后流式细胞分析MIRF蛋白的结合强弱。每 张图片右上角分别显示了 PMA的诱导时间(上)及表面结合有MIRF 蛋白的细胞数百分比(下)。图4说明MIRF能够抑制细胞炎症因子的表达。(a)RT-PCR分析 MIRF对细胞因子TNFa和IL-6表达的影响(左)。图中显示的为1.5% 琼脂糖凝胶电泳图。该实验独立重复三次。real time RT-PCR分析不 同浓度MIRF对细胞因子TNFa表达的影响(右)。实验结果为4次 独立实验的平均值，标准差如图所示。(b)MIRF在PMA-诱导分化的 THP-1细胞中明显地抑制LPS诱导的TNFa和IL-6的表达。结果显 示的是4次独立实验的平均值，标准差为PO.OU表示与单独的LPS 处理相比，MIRF+LPS产生的TNFa和IL-6表达变化差异及其显著。 (c) PGN或者PGN + MIRF处理PMA分化的THP-1细胞，ctrl.作为未 处理的对照。提取总RNA进行逆转录反应，real time PCR分析炎症 相关细胞因子的表达。柱状图显示了 4次独立实验的平均值，标准差 如图所示。*表示与单独的PGN处理相比，MIRF + PGN产生的TNFa 表达变化差异显著(PO.05); **表示与单独的PGN处理相比，MIRF 十PGN产生的IL-6的表达变化差异极显著(PO.Ol)。图5说明与未分化细胞相比，在PMA-诱导分化的THP-1细胞 中MIRF的表达水平明显提高。(a)半定量RT-PCR (左)与实时定量 RT-PCR (右)的结果。(b) Western blot结果。条带1,未处理的单核 THP-1细胞；条带2, PMA-诱导分化的THP-1细胞。Actin作为上样 的标准。(c)在单核THP-1细胞以及PMA-诱导分化的THP-1细胞中 MIRF蛋白的分泌。THP-1细胞在有/无50ng/ml PMA的培养基中培 养48小时，分别收集细胞与培养基，利用MIRF的抗体通过Western bolts分析检测MIRF蛋白。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。实施例l MIRF蛋白的克隆、表达和纯化以5，- ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaATGACCAAGGCCCGGC TGTTCCGG和5，-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcTCAGTGTCGGAG GAGGTTTTCGGG作引物，从IMAGE文库(The I.M.A.G.E. Consortium)中PCR (预变性94°C, 5分钟;变性94°C, 50秒, 退火50°C， l分钟，延伸72°C， 90秒；从变性到延伸30个循环 后，72°C, 10分钟)获得编码MIRF蛋白的cDNA，通过Gateway 克隆技术将编码MIRF蛋白的cDNA插入原核表达载体 pET21DEST(Invitrogen公司)中，该载体在其N端带有一个组蛋白(His6)标签。或者将编码MIRF蛋白的cDNA插入原核表达载体 pGEX4T-l(GE公司)中，该载体在其N端带有一个谷氨酰转肽酶蛋白(GST)标签。将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌种中。将转化后的菌液 涂在含有氨苄青霉素的平板培养基(1%氯化钠，1%蛋白胨，0.5% 酵母提取物，1.5%琼脂粉)上，37。C培养12小时。挑单克隆菌落于20ml含氨苄青霉素的LB培养基(1%氯化钠，1 %蛋白胨，0.5%酵母提取物)中，37'C培养12小时后，扩大培养至 1L培养基中，在37。C继续培养4小时，到菌液密度达到00。.6.。.8时， 加入lmM的IPTG (异丙基-b-d-硫代半乳糖苷)，在18'C条件下诱导 蛋白表达，约16小时后5000g离心收细菌。离心后的细菌用Buffer A ( 20mM Tris, 500mM NaCl, pH7.5 )重 悬。超声裂解细胞(200W工作5s,间隔10s，工作30次)，超声破 菌后，收集过滤上清，将上清注入镍柱，用Buffer B ( 20mM Tris,500mM NaCl， 1 OOmM imidazole, pH7.5 )首先洗去弱结合的蛋白， 然后用Buffer C(20mMTris， 500mMNaCl， 5OOmM imidazole, pH7.5 )洗下目的蛋白。浓缩后，用GE Superdex75分子筛进行进一步纯化， 然后通过脱盐柱将蛋白置换到磷酸缓冲溶液中，浓缩至lOmg/ml,分 装保存于-8(TC冰箱中。用于处理细胞用的纯化的MIRF蛋白首先与 干净的多粘菌素B树脂蛋白温育以去除内毒素(Nadesalingam, Dodds et al. 2005 )。MIRF蛋白的纯化也可以通过GST亲和层析的方法纯化。具体 是挑单克隆菌落于20ml含氨苄青霉素的LB培养基(1%氯化钠， 1%蛋白胨，0.5%酵母提取物)中，37。C培养12小时后，扩大培养至 1L培养基中，在37。C继续培养4小时，到菌液密度达到ODo.6-o.8时， 加入lmM的IPTG，在18。C条件下诱导蛋白表达，约16小时后5000g 离心收细菌。将离心后的细菌用PBS Buffer ( 10mMNa2HPO4， 1.8mM KH2P04， 2.7mM KC1, 140mM NaCl， pH7.3 )重悬。超声裂解细胞 (200W工作5s,间隔10s，工作30次)，超声破菌后，收集过滤上 清，将上清注入GST Sepharose 4B柱(Amersham Pharmacia Biotech), 用PBS Buffer首先洗去杂蛋白，然后用GST Elution BuffeK 50mMTris, 500mMNaCl， 20mM还原型谷胱苷肽，pH8.0 )洗脱目的蛋白。后续 提纯步骤请参考上文。MIRF的多克隆抗体通过免疫兔子获得，并利用NBr-activated Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech)通过抗原亲和层析进行进 一步的纯化。实施例2蛋白结晶和结构测定将纯化的MIRF蛋白浓缩到10mg/ml ,然后使用气象扩散座滴 法(Protein Crystallography. T丄Blundell)进行晶体的筛选，结果在 lOOmM Bis-Tris pH 6.5， 2M NH4S04， 10mM MPD, lOOmM MgCl2条件下获得晶体。晶体衍射数据在美国斯坦福大学同步辐射实验室使用MAR 325 CCD探测器进行收集。以20%的甘油为防冻液，晶体在 100K温度下以1。的转角进行衍射。收集后的数据通过Mosflm和 CCP4程序进行处理。晶体学参数以及数据收集统计在表1中给出。表1. MIRF晶体学参数的采集和统计(A).a,p,Y (o) 分辨率(A) Emerge因子 // / 完整度(%) 冗余度结构精修分辨率(A) 衍射点数"work /及free原子数 蛋白配基/离子 水分子蛋白配基/离子 水分子 均方根差 键长(A) 键角(°)P3221100.11, 100.11，249.9790, 90, 12050-2.7(2.85-2.7)*0.127(0.751)15.1/2.57.4 (6.6)50-2.74073722.23/25.29588058551040 20 200.01 1.4*括号中的数值是高分辨率下的值 采用标准方程定义不同i -值，这里不再在附注中定义。通过硒-单波长反常散射法(Se-SAD法，Brodersen, de La Fortelle et al. 2000))对MIRF的结构进行了解析(PDB代码3BXW)。硒的相 位是利用30 A到3 A的数据通过Phenix程序(Adams， Grosse-Kunstleve et al. 2002)确定的。结构的初步修正是通过监控Rfree 因子和电子密度图，利用CNS程序完成的。约有50%的氨基酸被自采群参e,掛间脱6数，昍a,动搭建出来，其余的结构部分是利用Coot (Emsley and Cowtan 2004) 通过手工搭建和结构精修。最终的结构通过PROCHECK,PYMOL和 COOT程序进行结构分析。结构的Ramachandran图显示85.8%和 14.2%的残基分别在MIRF结构的核心以及允许区域，在非允许区域 没有残基。实施例3 MIRF与糖类以及脂多糖结合的检测利用BIAcore 3000 (Amersham Phramacia Biotech)来检测MIRF与包括葡萄糖胺、半乳糖胺、乙酰葡萄糖胺、乙酰半乳糖胺、甘露糖, 葡萄糖以及核糖等在内不同的单糖的结合特异性。在10mM醋酸钠 (pH 5.0)溶液中的纯化的MIRF (200吗/ml)以及对照分别被固定在已 经被原胺活化的传感器芯片(sensor chip CM5, Amersham Phramacia Biotech))的表面，过量的羟基琥珀酰亚胺基酯基团通过1M的氨基 乙醇氢氯化物进行封阻。将溶于HBS缓冲液(10mM HEPES with 150mM NaCl， 3mM EDTA， and 0.05% Tween-20)的不同的单糖和 LPS以30 ^d/min的速度分别注射到芯片的表面，并实时观测结合曲 线。HBS-ET缓冲液被用于终止反应。利用BIA评价软件4.1计算 动力学数据 (Pharmacia Biosensor AB)。MIRF与不溶性糖，如肽聚糖(PGN )以及几丁质的结合通过pulldown实验进行分析。不溶的PGN以及几丁质等分别重悬于PBS中，加入MIRF与之4'C结合3h， PBS洗3遍后，沉淀和上清分别取样进行SDS-PAGE电泳和Western Blot分析。其结果如图2所示，(a) MIRF与HCgp39-N-乙酰葡萄糖胺复合 物(1LG1)结构的比对图，显示了糖的结合裂缝。N-乙酰葡萄糖胺 (NAG6)以棒状表示。MIRF主干(backbone )以深灰色表示。HCgp39 复合物以浅灰色表示。在MIRF裂缝的表面，有几个芳香族氨基酸 (Tyr62， Trp66， Tyr239, Tyr241, Tyr280 and Trp358)在 蛋白中12也是保守的，这些残基可能参与MIRF与糖的结合。(b)MIRF蛋白 与NAG6对接的分子表面示意图。表面共振能量转移分析验证不同糖 (c)以及脂多糖LPS (d)与MIRF之间的结合。不溶性PGN和Chitin与 MIRF的结合通过pull down分析得到验证(e)。实施例4 MIRF在PMA-分化的THP-1细胞与未分化的THP-1细胞 表面表达的检测人的单核细胞THP-1在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基 中，在37 。C， 5% C02条件下培养。单核细胞THP-1经过50 ng/ml PMA 处理48小时后分化为巨噬细胞。THP-1细胞在含有或者不含有50 ng/ml PMA的培养基中培养48 小时，然后分别通过免疫荧光分析以及流式细胞分析 (fluorescence-activated cell sorting, FACS)进行检观11, 具体如下对于免疫荧光分析，细胞首先用冰冷的PBS缓冲液洗3次，之后 用3.7%多聚甲醛在25 °C下固定20分钟，在用3%的BSA封阻后， 细胞在4。C下与MIRF的多克隆抗体孵育过夜，之后与FITC标记的 山羊抗兔IgG抗体在37。C温育30分钟，细胞用DAPI复染，然后在 荧光显微镜(Olympus IX51 - A11 PH)下观察照相。为了进行FACS分析，PMA诱导分化的巨噬细胞首先在含有 50mM EDTA的PBS中孵育以使细胞从培养皿分离下来，用冰冷的 PBS缓冲液洗3次，之后与10 jag/ml的MIRF多克隆抗体或者兔IgG 抗体在4。C温育l小时，接着与FITC偶联的山羊抗兔IgG在同样的 温度下温育30分钟，立刻用FACScan flow cytometer进行分析。实时定量RT-PCR分析细胞在没有LPS处理，或者1吗/ml LPS处理，或者125|ig/ml PGN, 或者是1 pg/ml LPS (或者125吗/ml PGN)和10 ng - 10 pg/ml MIRF蛋 白共同处理24小时后，利用TRIZOL试剂(Invitrogen公司)提取 细胞的全RNA。 1 jug的全RNA被用于逆转录为cDNA，逆转录反应利用Promega公司的Reverse Transcription System试剂盒进行的，具体操作按照试剂盒的说明书进行。以逆转录反应获得cDNA作模板，根据MIRF， IL-ip, IL-6， IL-8, TNFa基因序列设计引物，进行定量的real time PCR分析。所用引物 序列如下MIRF Forward primer 5 ，-GGGGCTCAACTTCTATGGTATGGAReverse pri西5，- TCCCACTGCGGCTCTTCTTGT TNFa Forward primer 5'陽ATCACCTTTTTGGACCGCCReverse primer 5'-GCTTGTAGGTGCCCAGGAGA IL-6Forward primer 5，- AACCTGAACCTTCCAAAGATGGReverse primer 5' -TCTGGCTTGTTCCTCACTACT IL-1 p Forward primer 5'- CGATCACTGAACTGCACGCTCReverse primer 5'- CAACACGCAGGACAGGTACAGA IL-8Forward primer 5'- ATACTCCAAACCTTTCCACCCReverse primer 5'- AAAACTTCTCCACAACCCTCTG Actin Forward primer 5，陽AAGTGTGACGTGGACATCCGC Reverse primer 5，- CCGGACTCGTCATACTCCTGCT 利用SYBR Green qPCR试剂盒(Finnzymes)，通过实时定量 RT-PCR，在Bio-RadMJ荧光定量PCR仪上进行Real Time PCR,检 测mirf的mRNA表达水平和前炎性因子TNFa， IL-ip， IL-6, and IL-8 的表达。P-actin作为上样定量标准蛋白。200nM forward primer, 200nM reverse primer, 10^1 2 x SYBR Green PCR Mix, 0.5画2pl cDNA,加水 至20pl。PCR条件95 °C lOmin — 95匸15sec — 64 °C 20sec — 72°C 20sec第二步至第四步进行44个循环。按照下列方法对所获数据进行分析在PCR反应中，每一扩增循 环的产物作为下一个循环的底物从而使产物呈指数增长。但随着循环 数的增加，由于模板数的增加，引物量的降低以及Taq酶活性的下降 等原因，扩增效率下降出现平台效应，因此只有线性范围内的循环数才能真实反应模板量的多少。根据荧光信号反映出来的PCR扩增曲线，在线性增长范围内界定一个域值(threshold),此域值与扩增曲 线的交点所对应的循环数称为Ct值。我们采用2-AACt方法[Livakand Schmittgen, 2001]来分析数据，此方法是一种方便的分析基因相对表 达量的方法。ACt = Ct 目的基因_ —Ct 内参 AACt 二ACt样品—ACt对照结果如图4所示。 Western Blot利用MIRF抗体(实施例1制备获得)，通过Western Blot分析 检测MIRF蛋白的表达以及分泌情况。 蛋白质的Western Blot分析具体如下蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至硝纤维膜，常规配置转移缓冲液 (5.8gTris, 2.9gGly, 0.375gSDS， 200ml甲醇)，冰洛下100mA转 移2h(胶冲阴极，膜冲阳极)；将转移成功的硝纤膜置于TBS T缓 冲液(1.21gTris, 4gNaCl， 1/1000体积的吐温 20)中冲洗2-3次， 转入10ml封闭缓冲液(0.5g脱脂奶粉，lmll0xTBS， lO^il吐温 20)室温封闭lh或4'C过夜；加入抗体稀释液(0.5g BSA， lml 10 xTBS， 10MlTween-20)稀释至工作浓度的一抗溶液，室温孵育2h， TBST洗三次，10min/次；接着加入抗体稀释液稀释至工作浓度的二 抗溶液，室温孵育2h, TBST洗三次，10min/次；最后加入化学发光 液3min后，于暗室中压片，洗片，观察信号。结果如图3和4所示。图3表明，MIRF与PMA-诱导分化的THP-1 细胞表面结合。(a)免疫荧光检测MIRF与单核THP-1细胞以及PMA-诱导分化的THP-1细胞的结合。(b) FACS分析检测内源的和重组 MIRF蛋白与单核THP-1细胞以及PMA-诱导分化的THP-1细胞的结 合。右上角显示的数字为结合细胞的数目。(c)MIRF以时间依赖形式与PMA-诱导分化的THP-1细胞结合。PMA诱导不同的时间后收 集细胞，与80(ig/mlMIRF蛋白孵育，anti-MIRF及FITC标记的二抗标记后流式细胞分析MIRF蛋白的结合强弱。每张图片右上角分别显 示了 PMA的诱导时间(上)及表面结合有MIRF蛋白的细胞数百分 比(下)。图4表明，MIRF抑制细胞中炎症因子的表达。(a)RT-PCR分析 MIRF对细胞因子TNFa和IL-6表达的影响(左)。图中显示的为1.5% 琼脂糖凝胶电泳图。该实验独立重复三次。real time RT-PCR分析不 同浓度MIRF对细胞因子TNFa表达的影响(右)。实验结果为4次 独立实验的平均值，标准差如图所示。(b)MIRF在PMA-诱导分化的 THP-1细胞中明显地抑制LPS诱导的TNFa和IL-6的表达。结果显 示的是4次独立实验的平均值，标准差为PO.Ol,表示与单独的LPS 处理相比，MIRF+LPS产生的TNFa和IL-6表达变化差异极其显著。 (c) PGN或者PGN + MIRF处理PMA分化的THP-1细胞，ctrl.作为未 处理的对照。提取总RNA进行逆转录反应，real time PCR分析炎症 相关细胞因子的表达。柱状图显示了4次独立实验的平均值，标准差 如图所示。*表示与单独的PGN处理相比，MIRF + PGN产生的TNFa 表达变化差异显著(PO.05); **表示与单独的PGN处理相比，MIRF 十PGN产生的IL-6的表达变化差异极显著(PO.Ol)。图5表明，与未分化细胞相比，在PMA-诱导分化的THP-1细胞 中MIRF的表达水平明显提高。(a)半定量RT-PCR(左)与实时定量 RT-PCR(右)的结果。(b) Western blot结果。条带1，未处理的单核 THP-1细胞；条带2， PMA-诱导分化的THP-1细胞。Actin作为上样 的标准。(c)在单核THP-1细胞以及PMA-诱导分化的THP-1细胞中 MIRF蛋白的分泌。THP-1细胞在有/无50ng/ml PMA的培养基中培 养48小时，分别收集细胞与培养基，利用MIRF的抗体通过Western bolts分析检测MIRF蛋白。Adams， P. D., R. W. Grosse-Kunstleve, et al. (2002). "PHENIX: building newsoftware for automated crystallographic structure determination. '， ActaCrvstallogr D Biol Crystallogr 58(Pt 11): 1948-54. Brodersen, D. E., E. de La Fortelle， et al. (2000). "Applications of single-wavelengthanomalous dispersion at high and atomic resolution." Acta Crvstallogr D BiolCrvstallogr 56(Pt 4): 431-41. Emsley, P. and K. Cowtan (2004). "Coot: model-building tools for moleculargraphics." Acta Crvstallogr D Biol Crystallogr 60(Pt 12 Pt 1): 2126-32. Nadesalingam， J.， A. W. Dodds, et al. (2005). "Mannose-binding lectin recognizespeptidoglycan via the N-acetyl glucosamine moiety, and inhibitsligand-induced proinflammatory effect and promotes chemokine productionby macrophages." J Immunol 175(3): 1785-94. Blundell,T丄and Johnson, L.N. (1976). Protein Crystallography. Academic Press.序列表说明SEQ ID N0.1&2是从IMAGE文库中扩增MIRF蛋白cDNA的引物，SEQ ID N0.3 14是对MIRF，IL-ip, IL-6, IL-8, TNFa进行实时定量PCR分析所用的引物。序列表<110> 北京大学<120〉巨噬细胞调节蛋白MIRF在制备抗炎药物中的应用<130><160> 14<170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 55<212〉 DNA <213>人工序列〈400> 1ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aatgaccaag gcccggctgt tccgg 55<210〉 2<211> 54〈212〉 DNA <213〉人工序列<400> 2ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcagtctcgg aggaggtttt cggg 54<210> 3<211> 24<212> DNA<213〉 人工序列〈400〉 3ggggctcaac ttctatggta tgga 24<210> 4<211> 21<212> DNA <213>人工序列<400〉 4tcccactgcg gctcttcttg t 21<210> 5〈211〉 19<212〉 腦A 〈213〉人工序列<400> 5atcacctttt tggaccgcc 19〈210〉 6〈211> 20<212> DNA 〈213>人工序列<400> 6gcttgtaggt gcccagg卿 20<210〉 7〈211〉 22<212> DNA <213>人工序列〈400〉 7aacctgaacc ttccaaagat gg 22<210〉 8tctggcttgt tcctcactac t 21<210> 9〈211〉 21<212> 腿 <213〉人工序列<400〉 9cgatcactga actgcacgct c 21<210〉 10<211> 22〈212〉 DNA <213>人工序列<400> 10caacacgcag gacaggtaca ga 22<210> 11<211> 21<212> DNA <213〉人工序列<400〉 11atactccaaa cctttccacc c 21<210〉 12 <211〉 22 <212〉 DNA<213〉人工序列 <400〉 12aaaacttctc cacaaccctc tg 22<210〉 13<211> 21<212> DNA<213〉 人工序列<400〉 13aagtgtgacg tggacatccg c 21<210〉 14<211〉 22〈212〉 腿 <213>人工序列<400〉 14ccggactcgt catactcctg ct 2权利要求
1、巨噬细胞调节蛋白MIRF在制备抗炎药物中的应用。
2、 如权利要求l所述的应用，其特征在于所述的抗炎药物为抑 制LPS、 PGN诱导的以及自身免疫性疾病引起的炎症的药物。
3、 一种抗炎药物，其含有有效量的MIRF蛋白。
全文摘要
本发明公开了MIRF在制备抗炎药物中的医药用途。同时提供了一种抗炎药物，其含有有效量的MIRF。实验表明，MIRF能够抑制LPS、PGN等诱导的以及自身免疫性疾病引起的炎症因子的表达，因此可作为某些炎症，如哮喘、风湿性关节炎等免疫疾病的有效抑制剂，具有潜在的临床应用价值。另外，通过基因工程技术，可以获得大量的、稳定的、有活性的重组MIRF蛋白，成本很低，适于推广应用。
文档编号A61K38/17GK101612387SQ20081011570
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月26日 优先权日2008年6月26日
发明者赓 孟, 白效耘, 明 罗, 赵艳梅, 郑晓峰 申请人:北京大学