专利名称：：用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的免疫调节多肽及其应用的制作方法用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的免疫调节多肽及其应用发明领域本发明涉及一种免疫调节多肽及应用，多肽来源于应激蛋白尤其是细菌热休克蛋白，用于在免疫介导的疾病中调节异常的炎症反应。该多肽作为制备治疗和/或预防自身免疫性疾病尤其是类风湿性关节炎的药剂的应用，以及含有该多肽的药物组合物、疫苗、编码该多肽的多核苷酸。
背景技术：
：类风湿关节炎(RheumatoidArthritis,RA)是一类危害人类健康的重症疾病，属器官特异性自身免疫病，以对称性、侵蚀性滑膜炎为主要临床表现，可反复迁延导致进行性关节破坏、畸形和功能丧失。我国患病率为0.34%，全国有近500万患者，致残率高达93%，成为沉重的社会和家庭负担。类风湿性关节炎是在一定遗传背景的基础上，抗原驱动、T细胞介导的自身免疫性疾病，人类白细胞抗原HLAII类基因与RA的易感性相关，其中HLA-DR1/DR4与RA的关系最为密切。RA发病与患者体内存在的针对自身抗原的特异性自身免疫反应有关，自身抗原被抗原提呈细胞(APC)识别，与APC表面HLA-DR1/DR4分子形成HLA-抗原肽复合物，进而与T细胞表面受体(TCR)分子特异性结合，激活自身反应性T细胞，引起一系列炎症细胞及炎性因子的产生，导致RA的免疫病理损伤，如滑膜炎、血管炎等。近年来研究发现，热休克蛋白(Heat-shockProtein，HSP)参与RA的免疫调节，在RA的发病中起重要的作用。HSP不属于免疫系统但在天然和适应性免疫应答中都发挥重要作用。由于其进化上高度的保守性，在抗感染反应中，哺乳动物和微生物HSP间的交叉反应是引起表位扩展的机制之一。在RA患者的滑膜组织或滑膜液中多种HSP水平(如hsp60，hsp70)比骨关节炎(OA)和正常健康人明显升高。RA患者滑膜组织出现多种应激原(如炎症因子)可以诱导HSPs表达和释放增加。机体对抗病原微生物HSP的免疫反应可引起针对自身表位的免疫应答，并在RA炎症持续反应中发挥重要作用。因此定位病原微生物HSP抗原表位，筛选与HLA-DR1/DR4分子高亲和力的肽段，通过诱导粘膜免疫耐受促进Th2型细胞因子分泌，调节Thl/Th2平衡，可以减轻关节炎的症状，能够对RA进行有效的特异性治疗。目前，尚无从根本上控制类风湿关节炎的药物。常规治疗药物(如非甾体抗炎药、慢作用抗风湿药、糖皮质激素)都存在一定的局限性，传统的一线药物只能暂时缓解炎症，不能控制疾病的进展；二线药物则治疗时间长，副作用大，易造成低免疫状态继发肿瘤、感染等疾病，难以广泛使用。研究开发具有免疫双向调节作用的治疗类风湿并节炎的新型粘膜疫苗，克服传统药物在类风湿关节炎治疗中存在特异性差，难以在保证安全性的情况下针对性的控制病变进展的缺点。通过表位特殊的方式耙向特异性T细胞起始环节进行免疫调节治疗，从根本上控制类风湿性关节炎的进展，具有高特异性，使用简便，安全，和持久治疗不引起免疫抑制的优点。该疫苗还可用于其他T细胞自身免疫病，如多发性硬化、糖尿病、银屑病等的预防和治疗。
发明内容本发明提供一种用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的免疫调节多肽。该多肽是包含QKRAAQDAAVDAACG(SEQIDNO:l)的多肽及其类似物或衍生物；包含QKRAAQAARVEAACG(SEQIDNO:2)的多肽及其类似物或衍生物。包含QKLFKTLQSLFADFN(SEQIDNO:3)的多肽及其类似物或衍生物。本发明还提供制备本发明用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的免疫调节多肽及其类似物或衍生物的方法。本发明还提供一种用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其含有有效量的本发明的多肽或其类似物或其衍生物和必要时药学上可接受的载体或赋形剂。本发明还提供包含有效量的本发明多肽或其类似物或其衍生物在制备用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物组合物的用途。本发明还提供一种编码含有本发明多肽的多核苷酸。本发明人基于中国人群类风湿性关节炎发病遗传背景基础上，通过计算机"SYFPEITHI"算法(http://www.syfj)e他i.de)分析结核分枝杆菌hsp65序列，选择与HLADR3个亚型DR1、DR4、DR7结合力高的多肽确定为HLA-DR限制性T细胞表位，设计并合成了本发明系列多肽，并对这些多肽进行了与RA患者血清的反应性的研究，体外剌激RA患者PBMC细胞因子分泌的研究，以及免疫小鼠体内免疫原性及血清中细胞因子研究。优选本发明多肽为SEQIDNO:l所述的合成肽QKRAAQDAAVDAACG(Pl)，或SEQIDNO:2所述的合成肽QKRAAQAARVEAACG(P2)，或SEQIDNO:3所述的合成肽QKLFKTLQSLFADFN(P7)，根据计算机多肽HLA(人白细胞抗原)结合力分析及本发明的实施例2所示的结果，Pl、P2和P7具有强的诱导自反应性T细胞增殖，诱导细胞因子分泌的能力。这说明其中包含完整的抗原表位，另外，从本发明的实验数据也可以看出，Pl、P2和P7结构简单，生物活性好，是很好的活性肽分子，并具有优良的诱导内源粗FN-Y、TNF-a因子及TH2类细胞因子产生的功能。本发明多肽类似物被定义为，与发明多肽相比较，具有一个或几个氨基酸取代，删除，转换或增加的分子。本发明多肽中氨基酸残基可为生物活性近似残基替换。如疏水性残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸之间互相替换；或者极性残基间的相互替换，如精氨酸替代赖氨酸，谷氨酸替代门冬氨酸等。氨基酸残基间保守置换还包括精氨酸-赖氨酸，天冬氨酸-谷氨酸，半胱氨酸-丝氨酸，甘氨酸-脯氨酸，异亮氨酸-亮氨酸或缬氨酸，亮氨酸-缬氨酸或异亮氨酸，赖氨酸-精氨酸或谷氨酸，蛋氨酸-亮氨酸或异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸或亮氨酸或蛋氨酸，丝氨酸-苏氨酸，色氨酸-酪氨酸，缬氨酸-异亮氨酸或亮氨酸等。发明多肽衍生物被定义为如下一种分子，具有本发明多肽或多肽类似物氨基酸序列，但是另外还具有化学修饰的一个或几个氨基酸侧链集团，a-碳原子，末端氨基，或者术端羧酸基。用于化学修饰的侧链集团不影响发明多肽的活性及抗原性，无毒性。本发明的多肽可通过常规固相合成方法合成。多肽的固相化学合成法是本领域熟知的，可以在一般教科书的范围内找到，例如J.M.StewartandJ.D.Young,SolidPhasePeptideSynthesis,2nded.，PierceChemicalCo.,Rockford，111.(1984)、Dugas禾卩Penney1981;Merrifield1962;Stewart和Young1969。使用a氨基被酸或碱敏感性集团保护的氨基酸。这种保护基应该在肽键形成条件下稳定，又容易除去而不破坏成长的肽链，不会引起其中的任何手性中心外消旋。适当的保护基有9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基、苄氧羰基、2-氰基叔丁氧羰基等。多肽合成后用HPLC纯化，纯度达到95%以上，为白色粉末。制备本发明的多肽也可以使用基因表达的方式获得。重组基因表达载体优选质粒或粘粒包括编码本发明多肽的多聚核苷酸，也可以为病毒或逆转录病毒载体。用于本发明的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、RNA病毒如逆转录病毒等。逆转录病毒有莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuS-V)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)等。本发明的多肽或类似物或衍生物可以单独使用，也可以以药物可接受的盐形式使用。药物可接受的盐指适于与人或动物的组织接触，而无过多的毒性、刺激、变态反应等的盐。药物可接受的盐是本领域熟知的。可以是盐酸盐、磷酸盐、乙酸盐等，这种盐可以在本发明多肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将多肽与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。本发明的实施例2和3中，本发明多肽体外能够明显刺激RA患者PBMC增殖，诱导RA患者PBMC培养上清IFN-y、TNF-a细胞因子的产生，说明本发明的多肽体外能够诱导强的免疫反应，具有一定的免疫原性。发明多肽在免疫大鼠血清中能够降低IFN-Y细胞因子水平，诱导IL-4、IL-10细胞因子分泌，根据本发明的实验结果，本发明多肽具有一定的免疫原性，免疫动物体内Th2型细胞因子分泌升高，诱导免疫耐受，对实验动物模型具有保护作用。因此，本发明同时提供了一种具有预防和/或治疗类风湿性关节炎作用的多肽。为了进一步提高本发明多肽的免疫原性，本发明多肽可以进一步与其它蛋白形成融合肽。例如，可以与牛血清白蛋白形成融合肽，以通过结合大的免疫原性强的分子，来提高目的多肽的免疫原性。本发明还提供本发明的多肽作为制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药剂的应用。本发明提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的本发明多肽和必要时药学上可接受的载体和赋形剂。药学上可接受的载体和赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料。可以根据预防和/或治疗目的，给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，例如溶液剂、脂质体包裹剂、微胶囊剂及其他缓释制剂。常用的载体或赋形剂包括碳酸镁，二氧化肽，乳糖，甘露醇，乳蛋白，明胶，淀粉，维生素，纤维素，动物和植物油，聚乙二醇，和溶剂有灭菌水，生理盐水，缓冲盐水，乙醇，甘油和多元醇等。本发明中，包含本发明多肽的药理组分作为免疫调节剂可通过各种途径给药，如局部、口服、鼻内、静脉、肌注或皮下注射等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽药物组合物制成合适的剂型，其中包含至少一种有效剂量的本发明多肽和至少一种药学上可接受的药用载体。适当剂型的实例为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆，用于皮肤表面的油膏和药贴，气雾胶，鼻喷剂，以及可用于注射的无菌溶液等。剂型中还可含有其它常规组分，如防腐剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲液、调节渗透压的盐、乳化剂、增甜剂、着色剂、调味剂等。优选的给药途径是口服、鼻内或静脉给药，考导免疫耐受，致TH1—TH2偏移。本发明的药物组合物中多肽的用量可以在一个较大范围内变动，给药的最佳剂量取决于一些已知的因素，包括疾病类型、年龄、体重以及病情的严重程度，剂型及所选用的给药途径等。此外，本发明还涉及一种编码含有如SEQIDNO:l或SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所述合成肽的多肽的多核苷酸。本领域普通技术人员已知，可以根据不同氨基酸对应的密码子，确定编码含有如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示合成肽的多肽的多核苷酸，由于密码子的简并性，所示的多核苷酸可以有不同的形式，优选根据不同生物密码子的使用频率，选择相应的密码子。本发明的多肽的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA，DNA可以是双链或是单链形式，单链DNA可以是编码链或是非编码链(反义链)。图1示不同的应激蛋白相关肽对RA患者外周血淋巴细胞刺激指数图中Y轴为刺激指数，X轴显示不同的抗原肽，P0为阳性对照肽，P1—P8为合成的应激蛋白相关肽。图2示不同合成肽滴鼻免疫对大鼠关节炎指数评分的影响图中Y轴为致炎大鼠关节炎指数，X轴为致炎后观察期。具体实癱方式实施例l合成肽制备本发明人基于中国人群类风湿性关节炎发病遗传背景基础上，利用SYFPEITHI软件，根据蛋白质结构和抗原性预测原理，其局部亲水性及主链柔韧性预测，结合HLA分子呈递的抗原肽的一些特点设计结核分枝杆菌hsp65表位肽，分析设计肽序列与HLADR的三种亚型DR1、DR4、DR7的结合力。用413A型自动合成仪合成。合成肽的序列如表l:合成肽产品经高压液相色谱(HPLC)分析进行纯度鉴定，纯度均大于95%，符合设计要求。附圉说明表1本发明系列多肽序列PlP2P3P4P5P6P7P8QKRAAQDAAVDAACGQKRAAQAARVEAACGEDPYILLVSSKVSTVKVVVTKDETTIVEGAQERAAYDQYGHAAFEQVDLASVLTPEIMAPQKLFKTLQSLFADFNAQRFPWLGSPHYKCH8实施例2本发明合成肽体外刺激RA患者PBMC增殖及细胞因子分泌的研究1研究对象选取活动期RA患者30例。符合下列5项中4项者:①休息时有中等疼痛；②晨僵〉lh;③有3个以上关节肿胀;@关节压痛数>8个关节;血沉>281^1.11-1。RA患者在受试前l个月未用过激素、免疫抑制剂及其它可能影响免疫功能的药物，所有患者诊断均符合1987年美国风湿病学会(ACR)修订的RA分类诊断标准。实验所用RA患者血清取自西安市风湿病专科医院第五医院。2方法2.1标本PBMC的提取取新鲜静脉肝素抗凝血5ml，加等量Hank's液稀释，混匀，轻铺到与血体积等量的淋巴细胞分离液液面上，1500-2000rpm/min，离心30分钟，吸出云雾状的淋巴细胞层，用Hank，s液洗两次，可获得大量的淋巴细胞。2.2细胞培养将获得的淋巴细胞在显微镜下计数，按每份的细胞数大约为2xl05/20(Hil将细胞平均分配，加到96孔细胞培养板上，加入一定量的多肽(浓度l(Hig/mL)，阳性对照为植物血凝素(10pg/ml)，阴性对照为1640培养液，每组做3复孔，振荡混匀，置入37'C、5WC02条件下培养5d后于实验各孔分别加CCK-8试剂l(HiL，37'C继续孵育4h，酶联免疫检测仪测定各孔的吸光度值(测定波长450nm，参比波长650nm)。CCK-8法检测T细胞增殖情况。以刺激指数(SI)评价增殖反应。刺激指数(SI"实验孔OD值/阴性对照孔OD值。S&2.0者判定为增殖试验阳性。2.3细胞因子检测1)培养上清的收集培养72小时后，用多头细胞收集器仔细将细胞收获于试管中，1000rpm/min，离心10分钟沉淀细胞，收集培养上清，ELISA法检测细胞因子IFN个TNF-a、IL-4的分泌。2)加样分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37'C反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。3)弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100ul(取lul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37'C，60分钟。4)温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡l-2分钟，350ul/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。5)每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液)lOOul，37°C，60分钟。6)温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡l-2分钟，350ul/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。7)依序每孔加底物溶液90ul，37。C避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。8)依序每孔加终止溶液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。9)用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。3.结果3.1不同合成肽对RA患者PBMC增殖的影响CCK-8法检测不同合成肽对于RA患者PBMC增殖的情况，见表2。表2不同合成肽对RA患者PBMC增殖结果(OD值)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>计算不同合成肽对细胞刺激指数(SI)评价增殖反应。见图1，图中Y轴为刺激指数，X轴显示不同的抗原肽，PO为阳性对照肽，图中可看出，Pl、P2、P7肽可诱导多肽特异性的淋巴细胞增殖反应。故对上述多肽的细胞因子分泌水平进行了研究。3.2体外细胞因子分泌水平研究培养72小时上清中细胞因子检测结果见表3表3不同肽作用组培养上清中各细胞因子浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>结果表明Pl、P2、P7肽均能诱导RA患者外周血IFN-y、TNF-a细胞因子分泌明显升高，与对照组相比，差异有显著意义(p<0.05)。实施例3本发明的多肽在胶原致大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用1实验动物Lewis近交系大鼠，雌性，45周龄，体重(100士20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。2方法1)大鼠CIA模型的建立及评价用0.1mol/L乙酸溶解II型胶原蛋白(2mg/ml，4'C搅拌过夜)，再与等体积的IFA混合，冰浴中充分乳化，于尾根部和背部皮内多点注射,每只大鼠注射胶原蛋白0.3mg。第7天同样方法加强注射1次。致炎即CII诱导CIA后，每天观察大鼠的生长情况，重点观察四肢足关节肿胀情况，并按04级进行评分，四肢评分之和为关节炎指数。2)纳米微囊疫苗的制备将DSPE、DPPG溶解在水中，在4(TC条件充分混匀约40—60分钟。显微镜镜检没有大的颗粒后，加入8PPm的棕榈酸表面活性剂，室温下混匀15分钟；后加入PEG4000作为稳定剂，混匀30分钟；分装三支中加入冻干瓶中低温下冷冻干燥。重新加入溶剂(蒸馏水)约10倍体积，振荡形成含有微囊的悬液。候选表位肽与制备的脂质微囊在漩涡震动下，以1:3体积比两种溶液高速混合20slmin;12000r/min离心20min，用0.9y。Nacl溶液重悬，自动形成乳白色悬液，即为表面肽微球疫苗。3)表位肽微囊疫苗鼻饲给药实验组大鼠在诱导关节炎前-14、-10、-7和-3天，鼻腔滴入微囊疫苗溶液(IOmg/ml)治疗，每只大鼠20nl;阳性对照组以及阴性对照组大鼠鼻腔滴入同等剂量的PBS溶液。4)细胞因子IFN-Y、IL-4、IL-10分泌水平的检测大鼠血清细胞因子检测，采用ELISA法。加样分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品iooui，酶标板加上盖或覆膜，3rc反应uo分钟。弃去液体，甩千，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100ul(取lul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37'C，60分钟。洗板3次。每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液)100ul，37°C,60分钟。洗板5次。依序每孔加底物溶液90ul，37。C避光显色。依序每孔加终止溶液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)。用酵联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。3结果3.1不同合成肽滴鼻免疫对大鼠关节炎指数评分的影响发明肽与阳性对照组比较，P1肽、P2、P3肽段免疫组大鼠的足关节肿胀程度明显降低，全身症状也得到较好的改善。关节评分从第14天开始与阳性对照组比较有统计学差异(P<0.05),而P1肽、P2、P3肽段免疫组之间无统计学差异(P〉0.05)，见图2。3.2大鼠血清细胞因子水平阳性对照组分泌IFN-Y水平明显高于P1肽段、P2肽段和P3肽段免疫组(P〈0.05);Pl肽段、P2肽段和P3肽段免疫组分泌IL-4IL-10水平高于阳性对照组(P〈0.05)，结果如表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上述实验结果表明P1肽段、P2肽段和P3肽段免疫大鼠后可以减轻关节炎的症状，分泌IL-4、IL-10等炎性抑制性细胞因子，调节Thl/Th2平衡，纠正外周血T淋巴细胞亚群失衡从而发挥免疫调节作用。本发明免疫调节多肽P1肽、P2肽和P3肽对实验性关节炎具有保护作用。权利要求1.一种免疫调节多肽，该多肽包含10-30个氨基酸残基，部分或全部氨基酸序列包含SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3的序列或其类似物或其衍生物。2.权利要求1所述的多肽来源于细菌热休克蛋白M^列，能与人HLADR1，DR4,DR7相结合，。3.权利要求l所述的多肽，其特征在于其具有或包含SEQIDNO:1，SEQIDNO:2,SEQIDNO:3所述的多肽或其类似物或其衍生物。4.制备权利要求1-3多肽的方法。5.根据权利要求4的方法，其特征在于权利要求1-3的多肽是通过固相合成的方法制备的。6.根据权利要求4的方法，其特征在于权利要求1-3的多肽是通过重组体表达的方法制备的。7.—种编码权利要求1-3任一项多肽的多核苷酸。8.权利要求l-3所述的多肽，可共价连接一个佐剂，佐剂是牛血清白蛋白，Ai^清白蛋白，或同源的IgG，或聚乙二醇。9.权利要求1-3任一项所述的多肽在诱导细胞因子IFN-y、TNF-ct、IL-4、IL-10和抗体产生中的应用。10.—种预防和/或治疗类风湿性关节炎和自身免疫病的药物组合物，其含有治疗有效量权利要求l-3任一项的多肽或其药物可接受的盐；和必要时药学上可接受的栽体或赋形剂。11.权利要求10所述的组合物，进一步包含一个生物反应调节剂，可以选自IL-l(aorp)，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5,IL-6,IL-7，IL-8，IL-9,IL-IO，IL-ll，IL-12,GM-CSF,M-CSF，G-CSF，LIF,LT,TGF-P,y-LFN,TNF-1，BCGF，CD2和ICAM。12.根据权利要求10所述药物组合物的用途，其特征在于该药物组合物通过多种给药方式预防和/或治疗类风湿性关节炎和/或自身免疫病，包括皮下或肌肉注射，口服给药如药丸、胶嚢，鼻喷剂等。全文摘要本发明涉及一种用于预防和/或治疗类风湿性关节炎或自身免疫病的免疫调节多肽，部分或全部氨基酸序列包含SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3的多肽。本发明还涉及上述多肽作为制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药剂的应用，以及含有上述多肽的治疗类风湿性关节炎或自身免疫病的药物组合物、疫苗、编码该多肽的多核苷酸。文档编号A61K9/20GK101602793SQ20081015003公开日2009年12月16日申请日期2008年6月12日优先权日2008年6月12日发明者梅王申请人:陕西麦科奥特科技有限公司