减毒的活疫苗的制作方法

专利名称：减毒的活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及减毒黄病毒(flavivirus)活疫苗。
背景技术：
黄病毒科包括三个属，即黄病毒属(genus flaviviridae)，瘕病毒属(genuspestiviruses)以及肝炎病毒属(genus hepaciviruses)。
黄病毒属主要包括由蚊子或蜱传播的病毒，这些病毒中许多是人类，同时也是动物的重要病原体。尤其重要的是黄热(YF)病毒(yellow fevervirus),曰本脑炎(JE)病毒(Japanese encephalitis virus),登革(Den)病毒(dengueviruses)的四种血清型，蜱传脑炎(TBE)病毒(tick-borne encephalitis virus)以及
(West Nile virus)。
瘟病毒属包含极有经济意义的动物病原体，即典型猪发热(CPV)病毒(classical porcine fever),牛病毒性腹渴(BVD)病毒(bovine viral diarrhea virus)以及边界病病毒(border disease virus)(BDV)。
肝炎病毒属包含丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)(HCV)的不同亚型以及相关的病毒，如庚型肝炎病毒(hepatitis G virus)(HGV)。
这三个属都属于黄病毒科的成员，因为该家族的所有代表成员都有几乎相同的基因组结构，并且在许多结构和功能特性方面都显示一致性。所有的黄病毒都是相对小的，有包膜的病毒，包含单链RNA分子，具有以mRNA作为基因组的倾向。基因组有较长可读框，编码以多蛋白(polyprotein)形式存在的所有蛋白。单个成熟的病毒蛋白通过病毒和细胞的蛋白酶酶切形成。单个病毒蛋白在基因组中的排列对所有黄病毒来说是相同的，即5，端开始是衣壳蛋白，然后是表面蛋白和一系列非结构蛋白，最后是病毒的
4聚合酶。瘟病毒还有一特殊的特征，即在衣壳蛋白之前还含有自身蛋白酶
(autoprotease)。黄病毒的核衣壳仅由单一病毒蛋白即衣壳蛋白形成，核衣壳包绕病毒基因组。所述衣壳呈现二十面体对称。
人们还不知道任何一种黄病毒衣壳蛋白准确的三维结构。但已知的氨基酸序列有许多相关性，因此很可能这些衣壳蛋白存在多种结构相似性。在这种情况下，同一属的代表之间的相似性自然会比不同属的代表之间的相似性更大。在所有情况下，衣壳蛋白都是相当小的蛋白，长度大约100到190个氨基酸。其中有异乎寻常高比例的碱性氨基酸，即赖氨酸和精氨酸。推测这些碱性氨基酸对于与病毒RNA之间的相互作用是重要的'(Khromykh和Westaway， 1996)。另外，所有黄病毒衣壳蛋白还有特征性的疏水区(图1)。这类疏水区通常是由羧基末端约20个氨基酸形成。该区在基因组序列中充当随其后的表面结构蛋白的内部信号序列。该信号序列在蛋白合成过程中与内质网膜结合，使衣壳蛋白开始时锚定到所述膜上。然后，此锚通过蛋白裂解切除。此外，还存在内部疏水区。在黄病毒属的代表中，内部疏水区功能的重要性已由Markoff等描述。作者指出对一系列黄病毒而言该区的边界如下登革病毒l: 46-67，登革病毒2: 46-66，登革病毒3: 46-67,登革病毒4: 45 -65，日本脑炎病毒46-62，西尼罗病毒46-62,墨累山谷脑炎(Murray Valley encephalitis)病毒46-62，圣路易脑炎(Saint louis encephalitis)病毒45 — 61,黄热病毒43 — 58， Langat: 42-54,玻瓦散病毒(Powassan): 40-52， TBE: 42- 54。对于丙型肝炎病毒，已鉴定出一个在功能方面重要的内部疏水区(Hope and Mclauchlan, 2000)，该区是从氨基酸119延伸到氨基酸145，尤其是氨基酸125 - 144。瘟病毒具有短的主要具有疏水特性的内部区。
疫苗已成功地用于抗御一些黄病毒。已有活疫苗抗御YF病毒，JE病毒和CPF病毒，灭活疫苗用来抗御JE和TBE。鉴于黄病毒在人类医学和兽医学方面极其重要，所以极需开发新的改进的疫苗。
已知有一系列减毒的黄病毒，其减毒是基于对基因组的不同区域突变
进行的。减毒性突变可见于天然产生的菌抹中，也可通过实验室中病毒的一系列传代获得，或通过在中和抗体存在下筛选突变体而制备，或者借助于重组克隆技术通过靶向引入突变而获得。数种黄病毒的感染性cDNA克隆是已知存在的，且本领域技术人员知道如何制备这样的克隆。借助于这些感染性cDNA克隆，根据现有技术，即可将突变特异性地导入黄病毒基
因组中。
减毒黄病毒的已知突变在基因组的如下部分
包膜蛋白已发现大部分减毒突变与黄病毒属的包膜蛋白E有关(参见McMinn， 1997; new e.g. Mandl et al.， 2000)。同样，也有文献描述了存在于癍病毒属蛋白E(rns)中的减毒突变(Meyers et al., 1999)。
非结构蛋白在Kunjin病毒的NSl蛋白中的点突变导致延迟复制，并因此导致减毒(Hall et al., 1999)。在蛋白NS3(Butrapet et al., 2000)和NS5(Xieet al., 1999)中的减毒突变也已有描述。
非编码的基因组区通过3，末端非编码区缺失所致的TBE病毒的减毒已有描述(Mandl et al.， 1998)。对于登革病毒，已制备出在5，和3，非编码区都有缺失的实验性疫苗(Laietal., 1998)。据推测，这些病毒减毒的分子基础是通过所述突变对病毒复制产生不良作用。

发明内容
本发明的目的是提供减毒黄病毒的其它可能途径，从而产生主要适合预防黄病毒所致疾病的活疫苗。
根据本发明，所述目的可以通过包含黄病毒突变体的减毒黄病毒活疫苗达到，该疫苗的特征在于所述黄病毒突变体在衣壳蛋白中有至少4个以上连续的氨基酸的缺失，其中，羧基末端疏水区不受所述缺失的影响。尽管如上所述，现有技术中已描述了一系列基于突变而减毒的黄病毒，但至今没有人描述将衣壳蛋白中的突变，尤其是缺失作为黄病毒减毒的基础。而令人惊奇的是，在衣壳蛋白中包含本发明突变的黄病毒可导致对黄病毒的可靠的减毒，并可用作黄病毒活疫苗。尽管对所述衣壳蛋白进行了本发明的突变，但在以活疫苗形式给药依照本发明的病毒后，在接受接种的受试者体内所述减毒病毒仍可以增殖。这便产生了超越灭活疫苗的一 系列优点。
衣壳蛋白中的缺失构成了一种全新的黄病毒减毒的理论。至今，从没有人考虑过将衣壳蛋白在本领域中作为相关对象。因此，如下发现更令人惊奇，即本发明所描述的缺失突变体实际上可成功产生减毒的黄病毒活疫苗，而该疫苗对回复成为有毒力的表型有抗性，因此非常适于广泛应用于人类。
对于常规的灭活疫苗的制备而言，制备大量的有感染性且有毒力的病—毒是必需的。对于重组制备的灭活疫苗，须制备大量的抗原并进行纯化。对于活疫苗，需制备的量大大减少，因为疫苗本身可在被接种的受试者体'内增殖，由此，活疫苗制备的成本通常比制备灭活疫苗的成本低很多。而且，因其是无毒力的非致病的病毒，因此该制备不危及健康。常规的灭活黄病毒疫苗通过用甲醛处理灭活感染性的病毒颗粒来制备，可导致抗原结'构的一定变化。在被接种的受试者体内，主要诱导出针对抗原结构与其天然形式不完全吻合的结构蛋白的体液免疫应答，而未诱导对持久免疫力的
建立和细胞毒性T细胞的形成非常重要的非结构蛋白的免疫应答。
相反，用本发明的疫苗，可获得针对体内产生的且以其完全天然形式存在的表面蛋白和非结构蛋白的体液和细胞免疫应答，从而获得依照本领域目前的状况而言持续的时间比灭活疫苗长很多的保护性免疫应答。
本发明的减毒黄病毒活疫苗，尤其是优选实施方案中的那些，还有超过常规活疫苗和用基因工程制备的实验性活疫苗的其他优点。
目前所使用的黄病毒活疫苗已在实验室中传代许多次，这导致了多处突变的产生，这些突变对这些病毒的生物学意义人们还没有完全详细地了解，并且它们各自对这些病毒的减毒所起的作用，以及各个减毒突变之间的相互作用人们也没有完全了解(对于JE,参照Nitayaphan等，1990;对于YF,参照Post等，1992;对于CPF参照Bjorklund等，1988)。 一些突变也位于对免疫应答尤其重要的抗原中，如表面蛋白E中。因此， 一些抗原决定基与野生型病毒相比其存在形式发生了改变。这些病毒减毒的基因基础的复杂性使作为减毒基础的一些规律不能够直接应用于其它黄病毒。
相反，在本发明的疫苗中，仅仅是确定的和通常可应用的减毒突变被引入到衣壳蛋白中，因此不必要改变对免疫应答尤其重要的蛋白(包膜蛋白或一些非结构蛋白，如黄病毒属的NS1)。
依照本发明的活疫苗的优选实施方案因此不包含任何进一步的突变，尤其不包含包膜蛋白以及与免疫应答有关的其它蛋白中的突变。
如上所述，已报道了一系列基因工程改造的减毒的黄病毒，其中所述减毒是基于点突变。它们相对比较易于发生遗传回复。而且，已有人报导通过点突变减毒的病毒，通过第二个点突变回复成为有毒力的表型(Mandletal.,2000)。相反，依照本发明的活疫苗中，减毒是通过缺失获得的，因此向野生型的回复是不可能的。
在已报导的一些情况下，减毒是基于对免疫应答而言重要的包膜蛋白中的改变，或者是基于对复制和翻译而言重要的基因组部分中的改变。如果想产生尽可能天然和有效的免疫应答，那么在包膜蛋白的抗原结构中的变化和对复制或翻译的实质性的负作用都是不希望的。这些缺点都被本发明克服了，本发明仅改变了内部的结构成分，而没有改变任何包膜蛋白，非结构蛋白或调控性的非编码区。
也有人报导通过组合各种病毒(嵌合病毒)制备了黄病毒疫苗(Guirakhooetal.，2000)。因为在嵌合病毒这样的生物中，致病性病毒的基因彼此以非天然方式被重新组合在一起，因此，这些嵌合病毒通过免疫接种释放时将会带来形成无法预测其特性的新病毒的危险。相反，新的疫苗不是由各种病毒基因组的组合而构成，因此免疫接种释放时就不会引起非天然病毒种的产生。
将本发明的缺失通过例如重组技术导入到黄病毒的衣壳蛋白中，对本领域的任何技术人员而言，用已知方法本身，不需要不必要的试验即可卖现。编码各个衣壳蛋白的基因区对基因组序列目前已被阐明的所有黄病毒而言都是已知的，而对于新的黄病毒序列，该基因区可通过序列比较很容易地确定。当然，在这种情况下所述缺失一定不要引起可读框的任何移动，以使羧基末端疏水区不要受到缺失的影响。较严格保持羧基末端疏水区，-使其不受缺失的影响是非常必要的。而用所提及的技术，制备在其增殖ii程中除衣壳蛋白外所有的病毒蛋白都以其天然形式来形成的那种突变的感染性病毒是可能的。这些病毒的复制和翻译将不会受到限制，或基本不会受到限制。通过在细胞培养基中的增殖，可从这些病毒制备出用作疫苗的制品。与未进行改变的野生型病毒不同，依照本发明的病毒，接种到合适的宿主生物后，可呈现减毒的表型，即它们不引起疾病。但它们诱导特异性的免疫应答。用本发明的黄病毒活疫苗免疫的宿主生物将受到保护而免于有毒力的野生型病毒的随后感染，也就是说，与未被保护的生物不同，该宿主生物将不发生由野生型病毒导致的疾病。
如果在制备适合用作疫苗的突变体的过程中能注意到可使疫苗的特性得到改善的许多方面，那么本发明在衣壳蛋白区的缺失便尤其适合用于制备适合作为活疫苗的突变体。为制备适当的减毒的免疫原性病毒，依照本
发明提供的缺失在任何情况下都须大于4个氨基酸，因为缺失至多4个氨基酸时病毒仍然可呈现与野生型病毒类似的有毒力的表型。而且，只有达到上述水平的缺失才能够排除向有毒力的病毒类型的回复。
进一步地，依照本发明的缺失一定不要涉及衣壳蛋白羧基末端疏水区。已知该序列对基因组中随后的包膜蛋白的正确形成是必需的，且其可通过蛋白水解性切割从成熟衣壳蛋白除去。该信号序列的长度在不同黄病毒之间不同，但可通过绘制亲水图(参照图l)很容易地确定。因此，依照本发明的缺失一定不要涉及该羧基末端区。
羧基末端疏水区至少涉及该区中依照图1所示亲水性得分等于和小于-1的所有氨基酸。尤其优选，依照图1亲水性在0以下的C末端区保持不变。
依照本发明优选的缺失涉及内部疏水结构域的区域。从图l可以看到，所有黄病毒的衣壳序列，除了羧基末端的上述疏水信号序列外，还包含另
外明显亲水性氨基酸链中部的 一些具有显著疏水特性的区域。将这些内部
疫苗。因为至少所有那些区域都被认为是"内部的疏水结构域"，它们如图1所示亲水性得分为负值。
在图2中，尤其优选的疏水区域，即依照本发明可在疫苗中至少部分缺失的区域是许多黄病毒的特征。这些区域可通过计算各个氨基酸序列的疏水图来确定。在图2中下面划线的这些区域已用Kyte和Doolittle(1982)1算法，以窗口大小(window size)为5算出。或者，疏水区域也可以用5到13个氨基酸残基的窗口大小计算，或用其它算法，如Hopp和Woods(1981)算法，其中通常选择3到11的窗口大小。
图1的亲水性图是依照Kyte和Doolittle(1982)算法，以9个氨基酸残基的窗口大小计算的，或依照hopp和Woods(1981)算法，以7个氨基酸残基的窗口大小计算的。优选的疏水区域选自登革病毒l: 46-67,登革病毒2: 46-66，登革病毒3: 46-67，登革病毒4: 45 -65，日本脑炎病毒；46-62,西尼罗病毒46-62，墨累山谷脑炎病毒46-62，圣路易脑炎病毒45 — 61，黄热病毒43 — 58， Langat: 42 — 54，玻瓦散病毒40 — 52,TBE: 42- 54，以及HCV: 119—145，尤其是125 — 144。
9减毒疫苗的具体实施方案是衣壳缺失，即除去内部疏水结构域的大部 分以使所产生的突变体基因组不能产生能在细胞培养中传代的病毒。这些 基因组能复制且能有效翻译除天然形式的衣壳蛋白外的所有蛋白，而且它 们还可能形成非感染性的亚病毒颗粒。通过导入另外的能增加衣壳蛋白疏 水性的点突变或插入，可将这种缺失突变体制成能传代并适合作为活疫苗, 的病毒突变体。这些插入物是不同于原始所缺失序列的序列。适当的额外
的突变可例如如下制备和鉴定将不再能在细胞培养系统中复制的缺失突 变体导入比细胞培养基更敏感的扩增系统中(例如用于黄病毒属病毒的实验 小鼠中，瘟病毒的天然宿主中，如果是丙型肝炎病毒则导入猪，羊，牛或 黑猩猩中)，且适当的突变体通过在该系统中传代得到制备和选择。在这种 情况下，尤其优选的更敏感的系统是动物，尤其是小鼠，大鼠，家兔，野 兔，猪，绵羊，牛或灵长类动物，例如黑猩猩。所产生的病毒突变体构成 尤其安全的疫苗，因为额外突变的任何回复都会产生不能扩增的病毒或只 能非常有限扩增的病毒。而缺失的回复据推理是不可能的。
优选的减毒的黄病毒活疫苗包含黄病毒突变体，该突变体衣壳蛋白中 具有5到70个，优选6到25个，尤其是7到20个连续氨基酸的缺失。达 到这种优选等级的缺失均以其减毒传代行为中性质发生改变的特性为特 征。如果缺失大于20个连续的氨基酸，在宿主细胞中制备该活疫苗时传代 能力可能丢失。这种丢失传代能力的特性将依赖于宿主细胞的敏感性，对 各自的宿主细胞而言，通过一些额外的突变，其可以恢复。这种恢复可通 过使衣壳蛋白疏水性增加的一种或多种突变实现。这种进一步的突变优选 是选自使衣壳蛋白疏水性增加的点突变，或是将具有显著疏水特性的氨基 酸区段的插入到衣壳蛋白基因中。衣壳蛋白疏水区域的重复证明是尤其有 利的。特别优选的点突变包括将带电荷的，或亲水性氨基酸(如，例如天冬 氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，色氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺， 酪氨酸，丝氨酸等)分别替换成极性较小的氨基酸或非极性氨基酸(如，例如 异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，缬氨酸等)。这种额外突 变尤其优选通过导入到更敏感系统中自动产生。对这些额外突变的选择也 通过其恢复传代能力而自动实现。 '
通常， 一个仅带来氨基酸极性方面轻微改变的单个突变就足以恢复传 代能力(例如将脯氨酸更换为亮氨酸或将缬氨酸更换为苯丙氨酸)。
10优选，所述缺失可以达到至氨基末端的15个氨基酸和/或紧邻羧基末端 信号序列起始之前。尽管至今推测黄病毒衣壳蛋白的(或编码该氨基酸的基
因组区段的)开始的20个氨基酸对复制而言是绝对必需的(Khromykh和 Westaway, 1997)，但也可成功制备能够复制和扩增，并具有延伸到该区域的 缺失的病毒，这也包括在本发明的范围之内。
本发明对黄病毒所有的代表抹而言都是适用的。在本申请的范围内， 术语"黄病毒"涉及黄病毒科的所有代表，除了在表述时指出其仅指黄病 毒属的代表。能够实现本发明的黄病毒的尤其优选的代表选自黄热病毒，. 日本脑炎病毒，登革病毒的四种血清型，蜱传脑炎病毒，西尼罗病毒，墨: 累山谷脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，玻瓦散病毒，典型猪发热病毒，牛病 毒性腹泻病毒，边界病病毒，丙型肝炎病毒或庚型肝炎病毒。这些代表尤 其适合本发明，因为它们对人和动物的致病性是已知的，对这些代表而言， 尤其需要适当的减毒活疫苗。
本发明涉及一种包含黄病毒属病毒突变体的减毒的黄病毒属病毒活疫 苗，其特征在于所述黄病毒属病毒突变体在衣壳蛋白中有5到70个连续的 氨基酸的缺失，其中，羧基末端疏水区不受该缺失的影响。
本发明还涉及一种黄病毒属病毒疫苗，特征在于其包含编码缺失的衣 壳蛋白的核酸，所述衣壳蛋白有5到70个连续的氨基酸的缺失，其中，羧 基末端疏水区不受该缺失的影响。
对依照本发明的活疫苗而言，有效免疫仅需要少量的病毒，所以，每 次给药时，本发明的活疫苗中有101-107，优选102 - 106，尤其103-105 的黄病毒感染单位即足够。优选，活疫苗以该感染单位的量单剂给药。
优选，依照本发明的活疫苗包含另外的活性物质或辅助物质。尤其优 选的是添加抗生素，如新霉素或卡那霉素，防腐剂，如石克柳汞，以及稳定 剂，如人白蛋白，乳糖-山梨糖醇，山梨糖醇-明胶，polygeline或盐，如 MgCl2或MgS04。通常，优选氨基酸，多糖和(緩冲)盐用作添加剂。
在依照本发明的活疫苗的制备中，如果是施用于人，推荐用非转化的 宿主细胞，因为这样既可避免特性改变的危险(例如容易导入新的不希望的 突变)，又可避免污染这些细胞的成分的危险。
依照本发明的另一方面，黄病毒疫苗也可以以核酸疫苗的形式提供，' 所述核酸即编码依照本发明的缺失的衣壳蛋白。优选，这样的核酸黄病毒疫苗除所述核酸以外还包括氨基糖戒类抗生素，如新霉素或卡那霉素，正
如FDA为质粒疫苗推荐的。现有技术已描述了用"棵露"核酸进行接种的 整个一系列最具变化的策略(参照例如WO 90/11092， WO 94/29469， WO 97/47197， 已纳入本文做参考，liopsome-mediated nucleic acid transfer,' preferably nucleic acid transfer with (preferably biodegradable) microspheres, )。
另外，本发明还涉及制备依照本发明的活疫苗的方法，该方法的特征 在于以下步骤
*提供黄病毒或黄病毒核酸，其中黄病毒或黄病毒核酸包含本发明的
衣壳蛋白中的缺失， *在适当的宿主细胞中扩增黄病毒或黄病毒核酸， *回收通过宿主细胞扩增的病毒颗粒，和 *将病毒颗粒制备成活疫苗。
本发明涉及一种制备黄病毒属病毒活疫苗的方法，其特征在于以下步 骤 *提供黄病毒属病毒或黄病毒属病毒核酸，其中黄病毒属病毒或黄病
毒属病毒核酸在衣壳蛋白中具有5到70个连续氨基酸的缺失，其中,
羧基末端疏水区不受该缺失的影响， *在适当的宿主细胞中扩增黄病毒属病毒或黄病毒属病毒核酸， *回收由宿主细胞扩增的病毒颗粒，以及 *将病毒颗粒制备成活疫苗。
优选的宿主细胞选自鸡胚细胞，原代鸡胚细胞，人二倍体细胞系(例如 WI-38，MRC-5)，非洲绿猴肾细胞系细胞(vero cells),原代仓鼠肾细胞，原 代犬肾细胞或恒河猴(rhesus)二倍体胎儿肺细胞。
最后，本发明还涉及在衣壳蛋白中有本发明缺失的黄病毒核酸在制备 预防黄病毒感染的疫苗方面的用途。
本发明涉及黄病毒核酸在制备预防黄病毒感染的疫苗中的应用，所述 黄病毒核酸在衣壳蛋白中具有5到70个连续氨基酸的缺失，其中，羧基末 端疏水区不受该缺失的影响。
以下实施例和附图用来更详细地解释本发明，而非对本发明进行限制。


图1A-C显示黄病毒科3个属中，每个属3种代表病毒的衣壳蛋白的 亲水性图。负值表示有显著疏水特性的区域。羧基末端疏水区是基因组中 随后的包膜蛋白的信号序列。对每种蛋白都已计算出亲水性并通过实例加 以说明， 一次是依照Kyte和Doolittle(1982)的算法，采用的窗口大小为9 个氨基酸残基(上图)， 一次是按照Hopp和Woods(1981)算法，采用的窗口 大小是7个氨基酸残基(下图)。
图2显示黄病毒科3个属中，每个属3种代表病毒的衣壳蛋白的序列 对比。具有显著疏水特性的序列区段(依照Kyte和Doolittle算法采用窗口大 小为5确定的)用下划线表示。在这种情况下，各自最靠羧基末端排列的区 段代表随后的包膜蛋白的信号序列。在该区段，不应有任何缺失。其它的(内 部的)疏水区段代表用于减毒缺失的优选区域。
实施例
实施例1: TBE病毒衣壳缺失突变体作为活疫苗的应用 就TBE病毒而言，其致病性和免疫原性可在成年小鼠模型中得到检测。 在衣壳蛋白区域有16个氨基酸缺失的TBE病毒突变体(CD28-43)可用作活 疫苗。该突变体和以下实施例中讨论的其它突变体总结于表l中。突变体 CD28-43的基因表达与野生型病毒相当，且能在HBK-21细胞中如所希 望的那样频繁传代。该突变体可通过将相应突变导入到TBE病毒的感染性 cDNA克隆中来制备。可将来自该突变体cDNA克隆的RNA在体外进行转 录，然后将该RNA通过电穿孔导入到BHK-21细胞中。3天后，收获细胞 培养上清，然后将该病毒在幼鼠脑中传代二次以获得高滴度的病毒悬液。 将后者用于检测该突变体是否适合在成年小鼠模型中用作活疫苗。为此目 的，将10只5周龄的小鼠每只皮下接种10,000pfu的突变体或有毒力的野 生型病毒，4周期间观察存活率。从表2中可以明显发现，接种有毒力的野 生型病毒的10只小鼠中9只出现典型的脑炎临床症状而死亡。相反，接种 衣壳缺失突变体的小鼠没有一只死亡。将突变体的接种剂量增加100倍时， 10只小鼠中仍没有一只染病。这一结果表明衣壳缺失突变体是非致病的。 对接种突变体的所有小鼠的血清样品进行检测发现，所有小鼠都形成了针对TBE病毒的特异性免疫应答。为检测该免疫应答是否能保护小鼠抗御野: 生型病毒的感染，用较高剂量的野生型病毒进行接种。结果所有小鼠在受 到攻击后都活了下来，都没有出现任何疾病的体征。该结果表明这种衣壳 缺失突变体已经引发了保护性免疫，可以用作抗野生型病毒的疫苗。
实施例2:能进行传代的突变体的回复，这种突变体具有延伸至氨基末 端20个氨基酸区域的缺失。
在感染性cDNA克隆的辅助下，将缺失导入到TBE病毒衣壳蛋白中， 该缺失是自氨基酸16延伸至氨基酸25(突变体CD16-25;参照表1)。突变 体CD16-25在细胞培养基中如所期望的那样频繁传代。该结果表示，与本 领域以往的情形不同，延伸至20个氨基末端氨基酸的区域(包括氨基酸16 在内)，缺失不破坏黄病毒的复制。
实施例3:有毒力的衣壳缺失突变体
衣壳缺失突变体CD28和CD28-31分别携带长度为1和4个氨基酸的 缺失(表l)。在这些突变体中，缺失的氨基酸不是内部疏水结构域的一部分 (图1)。给成年小鼠接种这种突变体显示，它们具有相当于野生型病毒的毒 力表型，分别杀死80%和100%的小鼠(表2)。这一结果表示在衣壳蛋白非 疏水区缺失不超过4个氨基酸对制备减毒疫苗而言是不适合的。
实施例4:减毒的衣壳缺失突变体
衣壳缺失突变体CD28-35， CD28-39和在实施例1中描述的突变体 CD28-34携带长度为8， 12和16个氨基酸的缺失(表1)。这些缺失除去了内 部疏水结构域中的多个部分(图1)。用这些突变体接种成年小鼠显示它们具 有减毒表型，即没有杀死小鼠，或在CD28-35的情况中仅杀死10%的小鼠 (表2)。这一结果显示除去部分内部疏水结构域可导致减毒。减毒的程度还 取决于缺失范围的大小，扩大缺失范围可增强减毒作用。用上述减毒突变 体免疫的所有小鼠能够完全抗御有毒力的野生型病毒感染。这一结果证实 了实施例1所得的结果，即衣壳缺失突变体能用作活疫苗。
实施例5:额外突变的鉴定
衣壳缺失突变体CD28-48, CD28-54和CD28-89携带长度为21， 27和 62个氨基酸的缺失(表1)。这些缺失完全去除了内部疏水结构域，或者在最 大缺失的情况下，除去了衣壳蛋白的所有内部疏水区段(图1)。这些突变体 显示基因表达未受到干扰，但不能在BHK-21细胞中传代。用这些突变体转染BHK-21细胞，3天后收获培养上清液，并对10只幼鼠(1日龄)每只进 行颅内接种。这构成了已知TBE病毒扩增系统中最敏感的一个扩增系统。5 到IO天后，在CD28-48突变体情况下所有的幼鼠，以及CD28-54情况下的 10只幼鼠中的7只死亡并伴有明显的脑炎临床症状。用突变体CD28-89接 种的小鼠没有一只死亡。在所有死亡小鼠的大脑中都可以通过PCR检测到 TBE病毒，而在存活的小鼠体内没有发现该病毒。来自死亡小鼠大脑中的 病毒能够在BHK-21细胞培养基中如所期望的那样频繁传代。这一结果提 示在通过去除疏水结构域而在细胞培养基中丧失了其传代能力的突变体 中，可选择出又能在细胞培养基中传代的回复体。
为了确定这些变化的基因基础，对一系列这样的回复体中编码衣壳蛋 白的基因组区段进行测序。结果显示，在每种情况下，除了最初导入的缺 失外在蛋白C中还存在另外的突变。这些突变为点突变或序列的重复。这 些额外的突变在表3中概括。所有这些突变的一个共同的特点是它们增强 了衣壳蛋白的疏水性。结果显示，增强衣壳蛋白疏水性的突变能回复内部 疏水序列缺失所导致的结果，即能回复黄病毒在细胞培养中的传代能力。 实施例6:用作活疫苗的伴有额外突变的衣壳缺失突变体 在感染性克隆的辅助下，制备两种突变体，所述每种突变体包含内部 疏水结构域的长度为21个氨基酸的缺失，同时还伴有衣壳蛋白中的一种突 变(选自表3所列的突变)。与没有额外突变的相应缺失突变体(CD28-43)不 同，这两种突变体，CD28-43/L70和CD28-43/Du8，能按预期频繁传代(表: 1)。该结果证实了实施例5所得的结果。成年小鼠接种这些突变体显示，这 两种突变体都无致病性，且都能引发保护性的免疫应答(表2)。该结果表明 具有缺失和额外突变的突变体根据上述观点适合用作活疫苗。
表1
TBE病毒的衣壳缺失突变体
名称 CD28 CD28-31 CD28-35
缺失a
Q28 Q28-V31 Q28-N35
额外突变
基因表达 + + +
传代能力e
+ + +
15CD28-39Q28-L39++
CD28-43Q28-M43++
CD28-46Q28-L46++
CD28-48Q28-H48+—
CD28-54Q28-A54+—
CD28-89Q28-L89+—
CD16-25R16-K25++
CD28-48/L70Q28-H48Q70誦> L++
CD28-48/Du8Q28-H48I78-L85Dupld++
a表示第一个和最后一个缺失的氨基酸。数字是指氨基酸的位置，从衣 壳蛋白氨基末端计数。
b通过用TBE特异性抗血清对BHK-21细胞进行免疫荧光染色来检测。 + =与野生型病毒相比的免疫荧光染色强度；-=没有染色。
c通过向BHK-21细胞中多次转移细胞培养上清液进行的检测+表 示能被传代；-表示不能被传代。
d 78-85位的8个氨基酸的重复。
表2
对成年小鼠的免疫
接种物接种量a存活b得到保护性免疫
野生型104pfb1/10n.a.
CD28104pfu0/10n.a.
CD28-31104pfu2/10n.a.
CD28-35104pfti9/109/10
CD28-39104pfu10/1010/10
CD28-43104pfti10/1010/10
CD28-43104pfu10/1010/10
CD28-48/L70104pfu10/1010/10
CD28隱48/Du8104pfU10/1010/10a表示皮下应用的接种物的量，以每只小鼠接种的空斑形成单位(Pfb)表示。
b表示存活的小鼠数/总的小鼠数。
c被免疫的小鼠数/总的小鼠数。通过检测血清中TBE特异性抗体来确 定免疫作用。通过随后用有毒力的野生型病毒进行的感染证实，免疫接种 完全可以抗雄卩疾病，起到保护作用。n.a.表示不适用。
表3
在衣壳缺失突变体中的补偿性突变
RNAa蛋白b
A299- > UD56- > I
C302画〉UP57國> L
G328- > UV66- 〉 F
A341画〉UQ70画〉L
C347画〉UT72-> I
A368画〉UK79画> I
C374- 〉 UT81画〉M
A401-〉UQ90- > L
364-387Duplc178画L85Dupl
307-363DuplL59曙K77Dupl
a表示TBE病毒基因组中核苷酸的位置(GenBank编号U27495)。
b蛋白C中的氨基酸的位置。
e所示区段的重复。序列表
<110> 英特赛尔股份公司(Intercell AG )
<120> 减毒的活疫苗
<130> R39186
<140〉 PCT/AT02/00046 <141> 2002-02-11
<150〉 A 272/2001 AT <151〉 2001-02-21
<160> 9
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1 <211〉 115 <212> PRT
<213> 蜱传月亩炎病毒(Tick-borne encephalitis virus) <400> 1
Val Lys Lys Ala lie Leu Lys Gly Lys Gly Gly Gly Pro Pro Arg Arg 15 10 15
Val Ser Lys Glu Thr Ala Thr Lys Thr Arg Gin Pro Arg Val Gin Met 20 25 30
Pro Asn Gly Leu Val Leu Met Arg Met Met Gly lie Leu Trp His Ala 35 40 45
Val Ala Gly Thr Ala Arg Asn Pro Val Leu Lys Ala Phe Trp Asn Ser 50 55 60
Val Pro Leu Lys Gin Ala Thr Ala Ala Leu Arg Lys lie Lys Arg Thr 65 70 75 80
Val Ser Ala Leu Met Val Gly Leu Gin Lys Arg Gly Lys Arg Arg Ser 85 90 95
Ala Thr Asp Trp Met Ser Trp Leu Leu Val lie Thr Leu Leu Gly Met 100 105 110
Thr Leu Ala 115
<210> 2<211〉 124 <212〉 PRT
<213> 西尼罗病毒(West Nile virus) <400> 2
Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Asn Arg Ala Val Asn Met Leu 15 10 15
Lys Arg Gly Met Pro Arg Gly Leu Ser Leu lie Gly Leu Lys Arg Ala 20 25 30
Met Leu Ser Leu lie Asp Gly Lys Gly Pro lie Arg Phe Val Leu Ala 35 40 45
Leu Leu Ala Phe Phe Arg Phe Thr Ala lie Ala Pro Thr Arg Ala Val 50 55 60
Leu Asp Arg Trp Arg Gly Val Asn Lys Gin Thr Ala Met Lys His Leu 65 70 75 80
Leu Ser Phe Lys Lys Glu Leu Gly Thr Leu Thr Ser Ala lie Asn Arg 85 90 95
Arg Ser Thr Lys Gin Lys Lys Arg Gly Gly Thr Ala Gly Phe Thr lie 100 105 110
Leu Leu Gly Leu lie Ala Cys Ala Leu Leu Ser Lys 115 120
<210〉 <211> <212〉 <213>
3
113 PRT
登革病毒
<400> 3
Asn Asp Gin Arg Lys Lys Ala Arg Asn Thr Pro Phe Asn Met Leu I>ys 15 10 15
Arg Glu Arg Asn Arg Val Ser Thr Val Gin Gin Leu Thr Lys Arg Phe 20 25 30
Ser Leu Gly Met Leu Gin Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met Ala 35 40 45
Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu Thr lie Pro Pro Thr Ala Gly lie
1950
55
60
Leu Lys Arg Trp Gly Thr lie Lys Lys Ser Lys Ala lie Asn Val Leu
65
70
75 80
Arg Gly Phe Arg Lys Glu lie Gly Arg Met Leu Asn lie Leu Asn Arg 85 90 95
Arg Arg Arg Thr Ala Gly Met lie lie Met Leu lie Pro Thr Val Met 100 105 110
Ala
<210> 4
<211> 99
<212> PRT
<213> 典型猪发热病毒(klassisches Schweinef ieber-Virus )
<400> 4
Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly 1 5
Ser l>ys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met 10 15
Asn Lys Gly Lys Leu Lys lie Ala Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser
20
25 30
Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr He Val Val Glu Gly Val Lys Tyi
35
40 45
Gin lie Lys Lys Lys Gly Lys Val Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly
50 55
60
Ixu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu
65 70
75
80
Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val lie Thr lie Leu Leu Tyr Gin Pro
85 90
95
Val Ala Ala
<210> 5
<211> 102
<212> PRT
<213> 牛病毒性腹瑪病毒(Bovines virales Diarrhoe Virus)
20<400> 5
Ser Asp Thr 1
Lys Glu Glu Gly Ala Thr Lys Lys Lys Thr Gin Lys Pro 5 10 15
Asp Arg Leu Glu Arg Gly Lys Met Lys lie Val Pro Lys Glu Ser Glu 20 25 30
Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr lie Val Val Glu Gly
35
40 45
Val Lys Tyr Gin Val Arg Lys Lys Gly Lys Thr Lys Ser Lys Asn Thr
50
55 60
Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro Gin Glu Ser Arg Lys
65
70 75 80
Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala lie lie Ala lie Val Leu 85 90 95
Phe Gin Val Thr Met Gly 100
<210> <211> <212> <213〉
6
100 PRT
边界病病毒
<400> 6
Ser Asp Asp Asn Lys Asn Glu Lys Thr Asn Glu Lys Lys Pro Asp Arg
1
10 15
Val Lys Arg Gly Ala Met Lys lie Thr Pro Lys Glu Ser Glu Lys Asp 20 25 30
Ser Lys Ser Lys Pro Pro Asp Ala Thr lie Val Val Asp Gly Val Lys
35
40 45
Tyr Gin Val Lys Lys Lys Gly Lys Val Lys Ser Lys Asn Thr Gin Asp
50
55 60
Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu 65 70 75 80Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val Leu Ala Val Leu Met Trp Gin 85 90 95
Pro Val Lys Pro 100
<210> <211〉 <212〉 <213>
<400>
190 PRT
丙型肝炎病毒1
Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Lys Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg 15 10 15
Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin lie Val Gly Gly 20 25 30
Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr 35 40 45
Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro lie 50 55 60
Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gin Pro Gly Tyr 65 70 75 80
Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu 85 90 95
Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg 100 105 110
Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val lie Asp Thr Leu Thr Cys Gly 115 120 125
Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr lie Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly 130 135 140
Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly 145 150 155 160
Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser lie Phe 165 170 175Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala 180 185 190
<210> 8 <211> 190 <212> PRT
<213> 丙型肝炎病毒2 <400〉 8
Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg 15 10 15
Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin lie Val Gly Gly 20 25 30
Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr 35 40 45
Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro lie 50 55 60
Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly Tyr 65 70 75 80
Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu 85 90 95
Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Asn Asp Pro Arg 100 105 110
His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val lie Asp Thr Leu Thr Cys Gly 115 120 125
Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr lie Pro Val Val Gly Ala Pro Leu Gly 130135 140
Gly Val Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly 145 150 155 160
Val Asn Phe Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser lie Phe 165 170 175
Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys lie Thr Thr Pro Val Ser Ala 180 185 190
23<210〉 9 <211〉 189 <212〉 PRT<213〉 丙型肝炎病毒3 <400> 9Ser Thr Leu Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr lie Arg1 51015Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin Leu Val Gly Gly 20 25 30Val Tyr Val Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr 35 40 45Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro lie 50 55 60Pro Lys Ala Arg Arg Ser Glu Gly Arg Ser Trp Ala Gin Pro Gly Tyr657075 80Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu 85 90 95Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Asn Asp Pro Arg 100 105 110Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val lie Asp Thr Leu Thr Cys Gly 115 120 125Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr lie Pro Leu Val Gly Ala Pro Val Gly 130 135 140Gly Val Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Ala Leu Glu Asp Gly145150155 160lie Asn Phe Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser lie Phe 165 170 175Leu Leu Ala Leu Phe Ser Cys Leu lie His Pro Ala Ala 180 18权利要求
1.一种包含黄病毒突变体的减毒的黄病毒活疫苗，其特征在于所述黄病毒突变体在衣壳蛋白中有至少4个以上连续的氨基酸的缺失，其中，羧基末端疏水区不受该缺失的影响。
2. 依照权利要求l的活疫苗，其特征在于所述缺失涉及衣壳蛋白的内部 疏水结构域。
3. 依照权利要求1或2的活疫苗，其特征在于衣壳蛋白中缺失了5到70个， 优选6到25个，更优选7到20个连续的氨基酸。
4. 依照权利要求1至3任一项的活疫苗，其特征在于所述缺失大于20个连 续的氨基酸，且衣壳蛋白额外还包含一个或多个进一步的突变，通过所述突 变衣壳蛋白的疏水性得到增强，所述进一步的突变优选选自*可增强衣壳蛋白疏水性的点突变，或*具有显著疏水特征的氨基酸片段的插入，尤其是衣壳蛋白疏水区的 重复。
5. 依照权利要求1至4任一项的活疫苗，其特征在于所述黄病毒选自黄热 病毒(YFV),日本脑炎病毒(JEV),登革病毒(DV)的四种血清型，蜱传脑炎病 毒(TBE病毒)，西尼罗病毒(WNV)，墨累山谷脑炎病毒(MVEV),圣路易脑炎 病毒(SLEV)，玻瓦散病毒(PV)，典型猪发热病毒(CPFV),牛病毒性腹泻病毒 (BDV),边界病病毒(BDV),丙型肝炎病毒(HCV)或庚型肝炎病毒(HGV)。
6. 依照权利要求1至5任一项的活疫苗，特征在于其包含1(^-10"个，优 选102 - 106个，更优选103 - 105个黄病毒感染单位。
7. 依照权利要求1至6任一项的活疫苗，特征在于其进一步包含抗生素， 防腐剂，稳定剂，緩冲物质或它们的混合物。
8. 依照权利要求7的活疫苗，特征在于其包含新霉素，卡那霉素，硫柳 汞，人白蛋白，乳糖-山梨糖醇，山梨糖醇-明胶，polygeline, MgCl2， MgS04， 氨基酸，多糖，緩冲盐或它们的混合物。
9. 依照权利要求1至8任一项的活疫苗，特征在于其是由非转化的宿主细 胞制备。 ；
10. —种黄病毒疫苗，特征在于其包含编码权利要求1至5任一项定义的 缺失的衣壳蛋白的核酸。
11. 依照权利要求10的黄病毒疫苗，特征在于其包含氨基糖甙类抗生素，尤其是新霉素或卡那霉素，脂质体，微球体或它们的混合物。
12. —种制备权利要求1至9任一项的活疫苗的方法，其特征在于以下步骤*提供黄病毒或黄病毒核酸，其中黄病毒或黄病毒核酸在衣壳蛋白中具有权利要求1至5任一项定义的至少4个以上连续氨基酸的缺失， *在适当的宿主细胞中扩增黄病毒或黄病毒核酸， *回收由宿主细胞扩增的病毒颗粒，以及 *将病毒颗粒制备成活疫苗。
13. 依照权利要求12的方法，其特征在于所述宿主细胞选自鸡胚细胞， 原代鸡胚细胞，人二倍体细胞系，非洲绿猴肾细胞系细胞，原代仓鼠肾细胞， 原代犬肾细胞或恒河猴二倍体胎J L肺细胞。
14. 黄病毒核酸在制备预防黄病毒感染的疫苗中的应用，所述黄病毒核 酸在衣壳蛋白中具有权利要求1至5任一项定义的至少4个以上连续核酸的缺 失。
全文摘要
本发明公开了一种包含黄病毒突变体的减毒黄病毒活疫苗，其特征在于该黄病毒突变体包含缺失至少4个以上连续氨基酸的衣壳蛋白，而疏水的羧基末端区不受所述缺失的影响。
文档编号A61K39/12GK101670101SQ200810149940
公开日2010年3月17日 申请日期2002年2月11日 优先权日2001年2月21日
发明者克里斯琴·曼德尔, 弗朗兹·X·海因茨 申请人:英特塞尔股份公司