专利名称：：人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医学
技术领域：
，具体涉及人干扰素a衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备和用途。
背景技术：
：人干扰素(interferon,简称IFN)是一类体内存在的具有广谱抗病毒、抗增殖和免疫调节机能的活性蛋白质，是最早用于临床治疗的细胞因子之一，人干扰素可分为三型，即人干扰素-a,人干扰素-p,人干扰素-Y,还可根据各型IFN的氨基酸序列不同再分为若干亚型。经大量临床研究证明，人干扰素-ot是一种重要的抗肿瘤和抗病毒治疗药物。目前我国在临床使用最广泛的主要是重组人干扰素a-la、cc-2a和oc-lb。目前已发现人干扰素cc的I型家族有20多个基因成员，其中大部分编码功能蛋白，^波此在核苷酸水平上有大约90y。的同源性。人干4尤素oc由165个氨基酸组成，分子量在19000道尔顿左右。现有的人干扰素a制剂的临床治疗效果尚不理想，其抗病毒比活性仅为lx108IU/mg，存在着大剂量时副作用较大的缺点。但是，无论是人干扰素a-2a、人干扰素a-lb和人干扰素a-1a，作为蛋白质性药物，由于稳定性差，血浆清除率高，体内半衰期短，易产生抗原抗体反应等，在临床治疗上受到很大限制。基因工程技术使大规模合成人重组蛋白成为可能，很大程度上解决了异源蛋白引起的免疫原性问题，却仍然无法克服血浆清除快和生物利用度低等缺点。这些缺点造成的结果是需频繁注射人干扰素才能达到有效的血浆治疗浓度；而且，每次注射后均会导致血药浓度的较大波动，形成药物浓度的"峰一谷，，效应。这样就可能增加了治疗费用以及给药不便和不良反应的风险。聚乙二醇修饰蛋白质的技术是近十年来发展起来的一种用于改进蛋白质类药物体内药动学性质的新技术。它是将活化的聚乙二醇分子(PEG)键合到蛋白质分子表面上，从而影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变，如化学稳定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，体内半衰期延长，血浆清除率降低等等。PEG组分是由氧乙烯单体聚合而成的惰性长链的两性分子。现在已有多种不同的PEG分子可供利用。被活化的PEG其活性功能基因可以被联结到治疗分子的某特殊部位(比如氨基、巯基或其他亲核物质)。N末端修饰则可获得高特异性修饰产物，可以有效控制修饰产物的纯度，使工艺更简单并且产品质量也更易评价。
发明内容本发明的目的之一是提供一种新的人干扰素a衍生物，是通过对人干扰素a进行修饰获得，该人干扰素a衍生物具有比活性高，抗病毒比活性达5-10xl()8lU/mg，比人干扰素a强510倍，以及聚乙二醇化修饰率高的优势。本发明的目的之二是提供一种人干扰素oc衍生物的聚乙二醇修饰物，是对本发明提供的人干扰素a衍生物进行定点修饰，获得高特异性的人干扰素a衍生物的聚乙二醇修饰物，这种聚乙二醇修饰物具有生物活性高和不含非N端修饰异构体的特点，以及体内半衰期延长，血浆清除率降低等优点。本发明的目的之三是提供上述人干扰素oc衍生物的聚乙二醇修饰物的制备方法。修饰物的制药用途。本发明的技术方案如下人干扰素oc衍生物，在人干扰素cc的N末端接上3个氨基酸，其结构式如下R3-R2-R1-interferon式中，interferon为人干扰素cx，人干扰素a的N末端连接的第一位氨基酸R1为含硫氨基酸或甘氨酸；第二位氨基酸R2为芳香族氨基酸或甘氨酸；第三位氨基酸R3为酸性氨基酸或甘氨酸。其中，所述的人干扰素a,包括人干扰素a-2a(IFNcc-2a)、人干扰素a-la(IFNa-la)、人干扰素a-lb(IFNcc-lb)。此外，还包括IFNa-2a、IFNoc-lb、IFNa-la三种蛋白的书亍生物、类4以物、生物活性或药用活性片段。其中，人干扰素a的N末端接上的第一位氨基酸Rl为含硫氨基酸或甘氨酸，含硫氨基酸包含曱硫氨酸、半胱氨酸，Rl优选曱硫氨酸或甘氨酸；N末端接上的第二位氨基酸R2为芳香族氨基酸或甘氨酸，芳香族氨基酸包含苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸，R2优选苯丙氨酸或甘氨酸；N末端接上的第三位氨基酸R3为酸性氨基酸或甘氨酸，酸性氨基酸包含天冬氨酸、谷氨酸，R3优选谷氨酸或甘氨酸。其中，人干扰素a衍生物包括Glu-Phe-Met-IFNoc-2a、Glu-Phe-Met-IFNa-lb、Glu-Phe-Met-IFNa-la、Gly-Gly-Gly-IFNa-2a、Gly-Gly-Gly-IFNa-lb、Gly-Gly-Gly-IFNoc-la、Glu-Tyr-Met-IFNa-2a、Glu-Tyr-Met-IFNa-lb、Glu-Tyr-Met-IFNoc-la、Glu-Gly-Met-IFNoc-2a、Glu-Gly-Met-IFNa-lb或Glu-Gly-Met-IFNa-la。本发明还提供了编码上述人干扰素a衍生物的核苷酸序列，该核苷酸序列式在人干扰素a的N末端具有核苷酸修饰序列，该修饰序列能够依次编码上述R3、R2和Rl所述的氨基酸。上述核苷酸序列的制备可以通过基因重组技术或人工全基因合成获得。如实施例1中用于构建含有Glu-Phe-Met-IFNcc-2a(IFN-D)的酵母表达载体的cDM序列(SEQIDNO:2)是经全基因合成获得。本发明还提供了含有编码上述人干扰素oc衍生物的核苷酸序列的表达载体。优选的表达载体是酵母表达载体，也可以选择其它常规的表达载体。该表达载体的构建可通过常规分子克隆技术将目的片段插入载体中构建表达载体。该表达载体可以在表达工程菌中有效表达，经分离纯化能够得到上述的人干扰素a衍生物。本发明还提供了上述人干扰素a衍生物的聚乙二醇化修饰物，是在所述人干扰素a衍生物的N末端的氨基上通过酰胺键连接活化的聚乙二醇分子(PEG),其结构式如下0IImPEG-0-C-NH-R3-R2-R1-interferon其中，聚乙二醇具有直链或分支结构，平均分子量为10000-40000道尔顿。制备上述人干扰素cc衍生物的聚乙二醇化修饰物的方法，包括以下步骤(a)利用含有表达载体的工程菌制备人干扰素a衍生物溶液；(b)聚乙二醇与人干扰素a衍生物偶联反应；(c)聚乙二醇人干扰素oc衍生物的纯化。本发明还提供了上述人干扰素a衍生物及其聚乙二醇修饰物在制备治疗或预防病毒性感染或肿瘤疾病的药物中的用途，上述人干扰素a衍生物及其聚乙二醇修饰物可以与医学上可接受的载体配制成液体制剂联合应用于恶性肿瘤的放疗和/或化疗，也可以用于治疗或预防病毒性感染。本领域技术人员可根据实际情况按给药剂量0.5~3yg/kg通过注射给予聚乙二醇化人干扰素a衍生物。本发明是在人干扰素OC原有氨基酸序列不变的情况下，在多肽分子的N末端接上3个氨基酸，形成人干扰素oc衍生物。经重组后的人干扰素oc衍生物具有比活性高，抗病毒比活性达510xio8iu/mg,比人干扰素a强510倍，以及聚乙二醇化修饰率高的优势。发明人经序列分析发现人干扰素oc族的a-la、cc-2a及a-lb的第1位N末端为半胱氨酸残基，其-SH与29位Cys的-SH之间形成二硫键，从而使人干扰素a的多肽分子变成巻曲的空间构型，若用PEG对这样的多肽N端残基进行修饰，其修饰率非常低，仅达2~5%。经基因重组技术在人干扰素oc的N端接上一个曱硫氨酸或甘氨酸，并成线性依次在其延伸的第2位连接上芳香族氨基酸或甘氨酸，第3位连接上酸性氨基酸或甘氨酸。因芳香族氨基酸具有较大的空间位阻，阻止了末端3个氨基酸向分子内巻曲，从而充分暴露了N端的游离-NH2，有利于PEG对重组衍生后的人干扰素ot的N端的游离-冊2进行修饰，完成PEG对N末端进行定点修饰，获得高特异性的人干扰素cc衍生物的聚乙二醇衍生物。这种衍生除具有譬如稳定、水溶性好、抗原性低等PEG化蛋白的一般性优点之外，尤其具有生物活性高和不含非N端修饰异构体的特点，以及体内半衰期延长，血浆清除率降低等优点，并为以后的临床应用打好基础。本发明提供了新的人干扰素a衍生物及其聚乙二醇人干扰素a衍生物，为科学研究和临床治疗提供了新的药物分子，可以治疗或预防病毒性感染或肿瘤疾病。图1为实施例1中IFN-D毕节酵母表达载体构建示意图。图2为实施例2中IFN-D的SDS-PAGE4全测结果。图中1、Marker:SDS-PAGE低分子量标准蛋白质；2、过CM柱目标物；3、过DEAE柱目标物；4、发酵液浓缩物。图3为实施例3中IFN-D经ALD-PEG201OH奮饰后SDS-PAGE;f全测结果。图中1、Marker:SDS-PAGE低分子量标准蛋白质；2、mPEG(20KD)-IFN-D目标物；3、IFN-D经ALD-PEG201OH奮饰后的样品；4、IFN-D样品。具体实施例方式以下通过实施例详细说明本发明。在下面的实施例中所涉及的实验3曰付。实施例1Glu-Phe-Met-IFNot-2a在曱醇酵母中的分泌表达1、目的基因获得及设计Glu-Phe-Met-IFNoc-2a(以下称为IFN-D)的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，序列长度为168个氨基酸。通过Genebank获知IFNcc-2a的CDNA后将相应密码子改成酵母偏爱性。并在N末端加入Glu-Phe-Met相应核苷酸序列。该CDNA序列用于毕节酵母的PIC9K表达质粒构建。构建的表达质粒转化GS115宿主菌后实现分泌表达。因此在设计中加入KEX2的酶识别位点CTCGAGAAAAGA，其中CTCGAG为Xhol酶切位点。同时3'端引入双终止密码子TGATAA和Notl酶切序列GCGGCCGC。SEQIDNO:2是用于构建IFN-D的酵母表达载体的cDNA序列。所述的IFN-DcDNA序列是委托上海生物工程有限/>司全人工基因合成。该序列经测序后平端插入pUC57质粒中，命名为pUC-IFN-D。2、表达质粒pPIC9-IFN-D、pPIC9K-IFN-D的两种不同载体的构建。把pUC57-IFN-D中的目的基因用Xhol和Notl核酸内切酶双酶切胶回收目的片段，以备连接。将表达载体pPIC9质4立用核酸内切酶Xho1和NotI双酶切回收大片賴二作为载体，与上述IFN-D片段用T4连接酶连接，16°C,30min,再用CaCl2法转化到E.coliDH5oc中，用酶切法筛选阳性克隆，命名为pPIC9-IFN-D。把表达载体pPIC9K质粒用SalI和SacI双酶切后回收大片l殳作为载体，再4巴pPIC9-IFN-D质粒用SalI和SacI双酶切后回收小片l殳作为目的基因，与上述pPIC9K人片段用T4连接酶连接，用CaCl2法转化到EcoliDH5cc中，用酶切法筛选阳性克隆，命名为pPIC9K-IFN-D。3、表达工程菌的获得pPIC9K-IFN-D质粒用SacI线形化后曱醇酵母GS115中及阳性重组子的选择过程是(1)制备感受态GS115;(2)加入线形化的质粒pPIC9K-IFN-D;(3)混匀后加入到转化杯中；(4)电击转化条件0.5kv,2.5Uf,1500hm;(5)用1.Oml,1,OM山梨醇洗出；(6)涂布于MD/His平板上，3(TC,24小时后长出单菌落；(7)挑取单菌落分别涂布于葡萄糖选择培养基(MD)或曱醇选择培养基(MM)上，在腿平板上生长迅速的是mut+,其他的是mutsc甲醇緩慢利用型；(8)重新接种到含有氨基糖戒类抗生素G418不同浓度的平板上，筛选拷贝数量高的单菌落，保存备用。4、pPIC9K-IFN-D工程菌的表达在MD平板上挑取单克隆工程菌于25mlBMGY在500ml摇瓶中培养，30°C,300rpm培养过夜。OD6。。=4.0-6.0时，用无菌离心管3000rpm，4。C离心去上清，用25mlB醒培养基悬浮菌体，转入含有250mlB薩培养液中诱导表达，每24小时补加100%甲醇，终浓度为0.5%，30°C,300rpm培养96小时。发酵液离心保留上清和沉淀。经电泳和HPLC分析表达结果为重组Glu-Phe-Met-IFNa-2a在上清液中表达量达到50mg/L。实施例2IFN-D的纯化1、阳离子凝胶柱(如CMSepharoseF.F.凝胶)层析采用pH3.8~4.6醋酸盐緩沖液进行上柱、洗脱，电泳监测收集目标物。然后使用pH7.5~8.5Tris-HCl緩冲溶液对目标物进行透析。2、阴离子凝胶柱(如DEAES印haroseF.F.凝胶)层析采用pH7.5~8.5Tris-HCl緩沖溶液进行上柱、洗脱，收集目标物。再用pH7.5~8.5磷酸盐緩冲溶液对目标物进行透析。3、SDS-PAGE片企测取上述CM柱与DEAE柱的穿过液与目标峰进4亍检测，试验结果表明，发酵液通过以上柱层析纯化，获得了纯度达95%以上的IFN-D。结果见附图2所示。实施例3PEG偶联修饰样品的制备与纯化工艺1、将IFN-D样品用磷酸盐緩沖液进行透析，然后加入等摩尔的ALD-PEG2OKD在2~15°C进行修饰，反应时间为24~36小时。将得到的修饰样品进行SDS-PAGE纟全测，试一验结果表明，经PEG偶联修饰后，分子量提高，由原来的19000道尔顿提高到近40000道尔顿，修饰率达40%以上，得到目标物mPEG(20KD)-IFN-D。结果如附图3所示。2、mPEG(20KD)-IFN-D阳离子凝胶柱(如SPSepharoseF.F.凝胶)的纯化将修饰样品使用调节电导率为4.0~5.Q以终止反应，上SP柱进行纯化。使用醋酸盐緩沖液进行洗脱，收集目标物。用磷酸盐緩冲溶液对目标物进行透析，即可。实施例4通过WISH-VSV系统测定人干扰素ot衍生物IFN-D及聚乙二醇化人干扰素ct衍生物mPEG(20KD)-IFN-D的体外抗病毒活性采用细胞病变抑制法通过WISH-VSV系统测定人干扰素的体外抗病毒活性，是本
技术领域：
公知的方法，具体参照2005版《中华人民共和国药典》三部附录XC"人干扰素的生物活性测定"。本实施例测定了人干扰素a衍生物IFN-D及聚乙二醇人干扰素cx衍生物mPEG(20KD)-IFN-D的体外抗病毒活性，其体外抗病毒活性测定结果见表l(以上为三次测定结果的平均值)。表lIFNoc-2a、IFN-D和mPEG(20KD)-IFN-D的体外抗病毒活性＝名称比活性(IU/mg)活性保留(％)IFNoc-2a1±0.28x108—IFN-D5.86±0.16x108100mPEG(20KD)-IFN-D1.17±0.35x10s20.1实验结论经重组后的人干扰素a衍生物具有比活性高，抗病毒比活性达5x108IU/mg,比人干扰素a强5倍。经聚乙二醇化修饰后活性下降，活性保留20°/。。实施例5、用ELISA法测小鼠体内聚乙二醇人干扰素a衍生物mPEG(20KD)-IFN-D才羊品的血药浓度1、实—险目的测小鼠体内mPEG(20KD)-IFN-D、IFN-D样品不同天数代谢后的血药浓度。2、实一發没计和实验方法取昆明种小鼠98只，雌雄性各半，体重在22-25g左右，随机分为高、低两个剂量组，每组42只，空白组14只。高剂量组给药剂量为mPEG(20KD)-IFN-D50微克/kg和低剂量组给药剂量为IFN-D10微克/kg,低剂量组在实验的第一天腹腔注射浓度为10微克/kg的样品，并每日按此剂量给药，给药7天。高剂量组在实验的仅第一天腹腔注射浓度为50微克/kg的mPEG(20KD)-IFN-D样品。两个给药实验组在实验的第1、2、3、4、5、6、7天各从小鼠目艮部采血六只，同时采空白组血样做空白。2000转/分钟离心5分钟，取上清液，照ELISA试剂盒上的说明书测血浆中样品的含量。根据标准管的吸光度值求出对数方程式(y=1.3229Ln(x)-0.0449,R2=0.9637)，再根据样品的吸光度代入方程求出浓度值。3、实验结果见表2。表210)ig/kg低剂量给药组和50Pg/kg高剂量给药组血药浓度比较<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4、实验结论经检测小鼠体内mPEG(20KD)-IFN-D、IFN-D样品不同天数代谢后的血药浓度数值比较说明了人干扰素ot衍生物聚乙二醇化修饰物可以延长体内半衰期。以上对本发明所提供的人干扰素a衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备方法和用途做了详细介绍。需要指出的是，具体实施方式所描述的内容是为更好的实施本发明而优选的实施方式，本发明的保护范围不限于上述实施方式所述的技术方案，而应以权利要求书所述的实质内容为准，本领域技术人员所作的任何可能的改变只要不脱离本发明权利要求的实质内容均属于本发明所保护的范围。序列表<110>1、海南四环心脑血管药物研究院有限^^司；2、北京四环制药有限^^司；3、海南四环医药有限乂^司<120>人干扰素ot衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备和用途<130>MP081195<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>168<212>PRT<213>Homosapiens<權>1GluPheMetCysAspIxuProGinThrHisSerLeuGlySerArgArg151015ThrLeuMetLeuLeuAlaGinMetArgLyslieSerIxuPheSerCys202530LeuLysAspArgHisAspPheGlyPheProGinGluGluPheGlyAsn354045GinPheGinLysAlaGluThrlieProValLeuHisGluMetlieGin505560GinliePheAsnLeuPheSerThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAsp65707580GluThrLeuLeuAspLysPheCysThrGluLeuTyrGinGinUuAsn859095AspLeuGluAlaCysVallieGinGlyValGlyValThrGluThrPro100105110LeuMetLysGluAspSerlieLeuAlaValArgLysTyrPheGinArg115120125lieThrLeuTyrLeuLysGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGlu130135140ValValArgAlaGlulieMetArgSerPheSerLeuSerThrAsnUu145150155160GinGluSerLeuArgSerLysGlu165<210>2<211>504<212>DM<213>Homosapiens<400>2gaattcatgtgtgatttgcctcaaactcattctttgggttctagaagaactttgatgttg60Uggctcaaatgagaagaatttctttgttttcttgtttgaaggatagacatgattttggt120tttcctcaagaagaatttggtaaccaatttcaaaaggctgaaactattcctgttttgcat180gaaatgattcaacaaatttttaacttgttttctactaaggattcttctgctgcttgggat240gaaactttgttggataagttttacactgaattgtaccaacaattgaacgatttggaagct300tgtgttattcaaggtgttggtgttactgaaactcctttgatgaaggaagattcUttttg360gctgttagaaagtactttcaaagaattactttgtacttgaaggaaaagaagtactctcct420tgtgcttgggaagttgtUgagctgaaattatgagatctttttctttgtctactaacttg480caagaatctttgagatctaaggaa50权利要求1、人干扰素α衍生物，其特征在于，在人干扰素α的N末端接上3个氨基酸，其结构式如下R3-R2-R1-interferon式中，interferon为人干扰素α，人干扰素α的N末端连接的第一位氨基酸R1为含硫氨基酸或甘氨酸；第二位氨基酸R2为芳香族氨基酸或甘氨酸；第三位氨基酸R3为酸性氨基酸或甘氨酸。2、根据权利要求1所述的人干扰素a衍生物，其特征在于，人干扰素a包括人干扰素a-2a、人干扰素oc-la、人干扰素a-lb或所述三种蛋白的衍生物、类似物、生物活性或药用活性片段。3、根据权利要求1所述的人干扰素a衍生物，其特征在于，所述含硫氨基酸包含甲硫氨酸、半胱氨酸。4、根据权利要求l所述的人干扰素a衍生物，其特征在于，所述芳香族氨基酸包含苯丙氨酸、酪氨酸。5、根据权利要求1所述的人干扰素a衍生物，其特征在于，所述酸性氨基酸包含天冬氨酸、谷氨酸。6、根据权利要求1所述的人干扰素oc衍生物，其特征在于，Rl为甲石克氨酸或甘氨酸。7、根据权利要求l所述的人干扰素a衍生物，其特征在于，R2为苯丙氨酸或甘氨酸。8、根据权利要求1所述的人干扰素a衍生物，其特征在于，R3为谷氨酸或甘氨酸。9、根据权利要求1所述的人干扰素cc衍生物，其特征在于，人干扰素oc彩f生物包4舌Glu-Phe-Met-IFNa-2a、Glu-Phe-Met-IFNoc-lb、Glu-Phe-Met-IFNa-la、Gly-Gly-Gly-IFNa-2a、Gly-Gly-Gly-IFNoc-lb、Gly-Gly-Gly-IFNa-la、Glu-Tyr-Met-IFNa-2a、Glu-Tyr-Met-IFNa—lb、Glu-Tyr—Met—IFNa-la、Glu-Gly—Met—IFNoc-2a、Glu-Gly-Met-IFNa-lb或Glu-Gly-Met-IFNa-la。10、编码权利要求1-9任一项所述人干扰素cc衍生物的核香酸序列。11、含有权利要求10所述核苷酸序列的表达载体。12、根据权利要求11所述的表达载体，所述表达载体是酵母表达载体。13、权利要求1-9任一项所述的人干扰素oc衍生物的聚乙二醇化修饰物，其特征在于，在所述人干扰素cc衍生物的N末端的氨基上通过酰胺键连接活化的聚乙二醇分子(PEG),其结构式如下mPEG-0-C-NH-R3-R2-Rl-interferon14、根据权利要求13所述的聚乙二醇化修饰物，其中聚乙二醇分子具有直链或分支结构，平均分子量为10000-40000道尔顿。15、制备权利要求13所述的聚乙二醇化修饰物的方法，其特征在于包括以下步骤(a)利用含有表达载体的工程菌制备人干扰素ct衍生物溶液；(b)聚乙二醇与人干扰素oc衍生物偶联反应；(c)聚乙二醇人干扰素a衍生物的纯化。16、权利要求1所述的人干扰素a衍生物及其聚乙二醇修饰物在制备治疗或预防病毒性感染或肿瘤疾病的药物中的用途。全文摘要本发明涉及人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备和用途。其中，人干扰素α衍生物是在人干扰素α的N末端接上3个氨基酸，其结构式为R3-R2-R1-interferon。式中，interferon为人干扰素α，人干扰素α的N末端连接的第一位氨基酸R1为含硫氨基酸或甘氨酸；第二位氨基酸R2为芳香族氨基酸或甘氨酸；第三位氨基酸R3为酸性氨基酸或甘氨酸。本发明还提供了上述人干扰素α衍生物的聚乙二醇衍生物及其制备方法，以及其在制备治疗或预防病毒性感染或肿瘤疾病的药物中的用途。本发明人干扰素α衍生物具有比活性高，聚乙二醇化修饰率高的优势，其聚乙二醇修饰物具有生物活性高和不含非N端修饰异构体的特点，具有体内半衰期延长，血浆清除率降低等优点。文档编号A61P31/12GK101671390SQ200810149510公开日2010年3月17日申请日期2008年9月10日优先权日2008年9月10日发明者丁成刚,夏中宁,张丽杰,军舒申请人:海南四环心脑血管药物研究院有限公司;北京四环制药有限公司;海南四环医药有限公司