专利名称：：家蝇蛹天然抗菌肽制品及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物分离纯化的
技术领域：
，具体涉及一种家蝇蛹天然抗菌肽制品及其制备工艺，以及此抗菌肽制品在食品、果蔬防腐保鲜、饲料添加剂和护肤品等领域的应用。
背景技术：
：自从青霉素等抗生素被发现以来，对病原菌感染性疾病的防治产生了革命性飞跃。与此同时，人们也意识到病原微生物将最终会对青霉素等抗生素产生抗性，但是令人惊讶的是抗性产生的速度之快和抗性的广泛性。随着抗菌药物的广泛应用和滥用，在不到60年的时间内，原来容易被杀死的细菌开始有了耐药菌株及多重耐药菌株。为了应对耐药菌感染，人们在不断研究和开发新型抗菌药物。近年来出现的抗菌肽被认为是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物和天然食品防腐剂。昆虫体内抗菌肽种类繁多，具有相对分子质量低、热稳定和广谱高效抗菌活性(对细菌、真菌、病毒、原虫等)，而且不同于现有的抗生素的抗菌机理，且不破坏真核生物体的细胞，无免疫原性。在所有的昆虫资源中，家蝇Muscadomesf/ca占有极其重要的地位。作为一种资源昆虫，具有来源丰富、饲养方便和繁殖力强等优点。然而长期以来仅被作为一种物美价廉的饲料蛋白来使用，对其其它价值未作深入的研究及开发。家蝇表现出极强的适应恶劣环境的能力，对其免疫防御体系的研究具有理论意义和应用价值，因而家蝇抗菌肽开始受到关注。研究表明家蝇抗菌肽具有广谱的抗菌、抗癌和抗原生虫等功效。应用基因工程方法虽然可生产出大量抗菌肽，但目前还存在一些瓶颈问题有待解决，如如何提高表达水平、活性蛋白回收纯化、提高基因表达产物的稳定性以及翻译后修饰对活性的影响等。此外由于表达抗菌肽的种类单一而致使抗菌效果不佳。我国家蝇资源十分丰富。家蝇世代周期短，通常几星期就能繁殖一代，繁殖率高，分布范围广，便于人工控制，是适于工厂化生产的昆虫资源。从来源丰富、价格低廉的家蝇材料制备抗菌肽具有极高的应用前景，可克服动物源抗菌肽来源的限制。目前，昆虫蛋白质的提取制备，主要是在家蝇(向洋，徐向丽.家蝇幼虫蛋白质提取及纯化工艺研究.长沙电力学院学报，1999，14(1):67-69)、蚕蛹(回瑞华，侯冬岩，李学成等.柞蚕蛹蛋白的提取与分析.鞍山师范学院学报，2006,8(2):31-33.)、黄粉虫(冀宪领，盖英萍.黄粉虫蛋白质的提取工艺研究.食品科技，2000,5:24-25.)上作了一些研究，而对其它昆虫蛋白提取则报导不多。国内以应用为目标的从生物体内提取抗菌肽制备工艺相对简单，如萃取、减压蒸馏、超滤(田晓乐.林蛙抗菌肽的制备与制剂研究.吉林大学，2004，硕士学位论文.)，或萃取、分子筛过滤(韩彤彤.东北林蛙皮肤抗菌肽抗病毒活性的初步研究.东北林业大学，2006，硕士学位论文.)，或热处理、离子交换，纯化倍数较低(低于2000倍)，得率不高。以家蝇为材料的制备工艺方面的研究报道较少，仅见于Hou等(HouLX，ShiYH，ZhaiP，etal.Antibacterialactivityandinvitroanti-tumoractivityoftheextractofthelarvaeofthehousefly(Muscadomestics).JournalofEthnopharmacology,2007，111(2):227-231.)禾口陆婕等(陆婕，钟雅，柳林等.家蝇蛆抗菌肽提取工艺研究.昆虫学报，2007,50(2):106-112.)的报道。且目前家蝇抗菌肽制备工艺多处于实验探索阶段，提取工艺抗菌肽得率较低(低于1%)，工艺周期较长，难于进行大规模生产及制备。
发明内容针对现有技术中存在的问题与不足，本发明的首要目的是填补现有技术的空白，提供一种家蝇蛹天然抗菌肽制品。本发明的另一个目的是提供所述家蝇蛹天然抗菌肽制品的制备方法。本发明还有一个目的是提供所述家蝇蛹天然抗菌肽制品的应用。本发明的目的通过以下技术方案予以实现本发明提供了一种家蝇蛹天然抗菌肽制品的制备方法
技术领域：
：本发明选用家蝇蛹为原材料，经酸过夜提取和热处理后，收集上清为家蝇蛹粗提液；家蝇蛹粗提液再经筛过滤和超滤处理，然后进行喷雾干燥后得到产DOBo该方法具体包括以下步骤(1)称取一定量家蝇蛹，蒸馏水清洗后干燥，按1ml:46g的体积重量比例加入相应体积的48。C预冷的0.10.3M酸溶液，匀浆处理，48t:提取过夜，然后置9010(TC水浴热处理2535分钟，而后于46"C、800010000xg离心2535分钟，收集上清，此上清即为家蝇蛹粗提液，(2)步骤(1)所得家蝇蛹粗提液用300500目筛过滤，收集滤过液；(3)步骤(2)所得滤过液在超滤装置中，于46。C、30005000xg离心2040分钟，分别收集截留部分和滤过部分样品；(4)将步骤(3)所得滤过部分样品按400600:1的比例加入一定重量的辅料，在11013(TC条件下进行喷干，收集喷干粉，此即得到产品。所述步骤(1)中，所述酸溶液是乙酸溶液。所述步骤(2)中，所述筛是国家标准检验筛。所述步骤(4)中，所述辅料是糊精。本发明提供的上述任一中制备方法制备的家蝇蛹天然抗菌肽制品，是由分子量小于20kDa的肽类组成的，主要是一些分子量小于14.4kDa的小分子肽类，外在形态表现为淡黄色粉末状。发明人对本发明抗菌肽制品进行了以下的检测或测定本发明采用常规的高效液相色谱(HPLC)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)对制备的抗菌肽进行蛋白/肽组成及纯度检测；利用最小抑菌浓度法(MIC)对制备的抗菌肽的抗菌谱测定；按Hultmark等(1980)的改进方法对抗菌肽的抗菌活力进行测定；在4°C、40°C75%RH、100°C(30分钟)以及pH2—12的条件下对抗菌肽的稳定性进行检测；选用小鼠红细胞对抗菌肽的溶血性进行检测分析；利用全自动微量凯氏定氮仪对饲用昆虫蛋白粉中粗蛋白含量进行检测。本制备工艺生产的家蝇蛹天然抗菌肽制品具有如下特征该抗菌肽是从家蝇蛹中制备得到的一种由多种肽类组成的混合物，分子量小于20kDa，主要是一些分子量小于14.4kDa的小分子肽类。产品为淡黄色粉末状，对金黄色葡萄球菌(SfajD/7y/ococc〃sa〃厂e〃s)，短小芽孢杆菌(6ac/〃L/sAT7egaf/7eA7'"Ar)，枯草芽孢杆菌(fi.siy/柳s)等革兰氏阳性菌，大肠杆菌(￡sc/eAyc/7/aco//),铜绿杆菌(Pset/c/omoAasae/x/gf/Vosa)，沙门氏菌(Sa/moAe//ac/o/e/*aesty/s)，嗜7_R气单孢菌(Aeramonas/ycyrap//7a)，温和气单孢菌(Asoib〃'a)等革兰氏阴性菌以及青霉菌(PeA/'c/7//L/mcr"stosL/m)，尖孢镰刀菌(Rysa〃'〃moxysporum),黑腐霉菌(/a/sama//)等真菌具有抑菌活性。对小鼠红细胞无溶血性(浓度为50卩g/mL时)。能耐受100°C30分钟的加热，在较广泛的pH(2-12)条件下仍具有抗菌活性，4'C存放60天，仍具有90%以上的抗菌活力，稳定性较好。以上结果均说明本发明的家蝇蛹抗菌肽制品可以应用于制备抗菌用的药物、农产品防腐保鲜剂、食品防腐保鲜剂、动物饲料添加剂或者护肤品。与现有技术相比，本发明具有以下几个优点1、本发明家蝇蛹抗菌肽制品具有广谱的抗菌(细菌和真菌)、抗癌和抗原生虫等功效。Nisin作为一种天然抗菌肽已广泛用作食品防腐添加剂，但其抗菌谱较窄，只对革兰氏阳性菌具有抑制作用，对革兰氏阴性菌和真菌没有活性。本发明制备的抗菌肽制品抗菌谱广，且能耐受100°C30分钟的加热，在较广泛的pH值(2-12)条件下仍具有抗菌活性。2、本发明抗菌肽制品与化学抗菌剂相比，具有无毒、无残留和不易使细菌产生耐药性等诸多优点，用于食品防腐和饲料添加剂，符合当今绿色安全食品生产的需求。家蝇作为一种重要的资源昆虫，在我国民间食用已有较长的历史，具有较高的食用安全性。.3、家蝇世代周期短，通常几星期就能繁殖一代，繁殖率高，分布范围广，便于人工控制，是适于工厂化生产的昆虫资源。用家蝇蛹作为制备天然抗菌肽的原材料，来源丰富，价格低廉。4、本发明制备抗菌肽制品的方法是利用家蝇蛹作原材料，除制备出家蝇蛹天然抗菌肽制品外，副产物一饲用昆虫蛋白粉可用作畜禽、水产等动物养殖的蛋白饲料添加剂，实现了对原材料的综合利用。5、本发明制备方法可大规模工厂化生产，生产周期短，生产成本较低，得率较高，且不受外在环境的影响。图1是家蝇蛹天然抗菌肽制品(下)以及家蝇蛹粗提液(上)蛋白组成HPLC分析。图2是家蝇蛹天然抗菌肽制品组成及纯度SDS—PAGE检测。其中3为制备的家蝇蛹抗菌肽制品，2为家蝇蛹粗提液(热处理后)，1为家蝇蛹粗提液(未热处理)，M为蛋白分子量标准。图3是家蝇蛹天然抗菌肽制品的稳定性检测(4'C和4CTC条件下)。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。实施例1:1、家蝇蛹天然抗菌肽制品的制备具体包括以下步骤(1)称取一定量家蝇蛹，蒸馏水清洗后干燥，按1ml:4g的体积重量比例加入相应体积的4'C预冷的0.1M乙酸酸溶液，匀浆处理，4'C提取过夜，然后置9(TC水浴热处理25分钟，而后于4°C、8000xg离心25分钟，收集上清，此上清即为家蝇蛹粗提液。沉淀烘干(100°C)后，粉碎成粉末，该粉末即是本工艺的其中一个副产物一饲用昆虫蛋白粉。(2)步骤(1)所得家蝇蛹粗提液用300目筛过滤，收集滤过液；(3)步骤(2)所得滤过液上样于Amicon超率装置(MW50,000，Millipore公司)，在35度固定转角的离心机内4。C，3,000xg离心20分钟，分别收集截留部分和滤过部分的样品；(4)将步骤(3)所得滤过部分样品按400:1的比例加入一定重量的糊精，在11CTC条件下，按1.5mL/min的进行喷干，收集喷干粉，此即得到产品。本抗菌肽制品具有制备工艺简便快速，且抗菌肽产率达到1.2%，高于现有的制备工艺，制备的抗菌肽主要是一些分子量小于14.4kDa的小分子肽类，具有较高的纯度，抗菌肽的抗菌活力回收率也高达80%。工艺的副产物可用作畜禽、水产等动物养殖的蛋白饲料添加剂，实现了对原材料的综合利用。本抗菌肽制品也可通过下述的实施例得以实现2、家蝇蛹天然抗菌肽组成分析选用SiniChromODS-AP300Acolumn(4.6x250mm)层析柱对制备的家蝇天然抗菌肽制品以及家蝇蛹粗提液蛋白组成利用HPLC进行检测。色谱条件流动相A为0.05%三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈，08分钟10%B;888分钟10%B90%B，流速0.4mL/min。结果如图1所示，上图为家蝇蛹粗提液蛋白组成，下图为制备家蝇天然抗菌肽制品蛋白组成。从图中可以看出，制备的家蝇蛹天然抗菌肽制品的蛋白组成与家蝇蛹粗提液蛋白组成相比比较简单，表明制备后的家蝇天然抗菌肽具有较高的纯度。3、家蝇蛹天然抗菌肽制品的组成及纯度检测利用普通的SDS—PAGE电泳对制备的家蝇蛹抗菌肽制品进行其组成及纯度检测。结果如图2所示，可以看出制备的家蝇抗菌肽其分子量小于20kDa(电泳图中第3电泳道)，主要是一些分子量小于14.4kDa的小分子肽类，与家蝇蛹粗提液(无论是热处理还是未热处理)相比纯度较高。4、家蝇蛹天然抗菌肽制品对微生物的抑制作用实验将制备的家蝇蛹抗菌肽制品用灭菌蒸馏水1/2倍梯度稀释。取对数生长期的细菌LB培养基菌液90ijL，再加入不同浓度10pL的抗菌肽制品，混匀，在96孔平板上3(TC过夜孵育24小时，用酶标仪在600nm处测定各管的吸光度。吸光度没有明显变化的抗菌肽制品的最低浓度为最小抑菌浓度(MinimalInhibitoryconcentration,MIC)。真菌用80pL的真菌孢子(104孢子/ml)在土豆琼脂培养基上进行，各孔中加入不同浓度20pL的抗菌肽，混匀，在96孔平板上25"C过夜孵育24小时，用酶标仪在595nm处测定各管的吸光度。吸光度没有明显变化的抗菌肽制品的最低浓度为MIC。结果见表1，结果表明，制备的家蝇抗菌肽制品对金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，大肠杆菌、铜绿杆菌、沙门氏菌，、嗜水气单孢菌、温和气单孢菌等革兰氏阴性菌以及青霉菌、镰刀菌、黑曲霉菌等真菌具有抑菌活性。表1家蝇蛹天然抗菌肽的抗菌谱<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5、抗菌活力测定按Hultmark等(1980)的改进方法测定。用0.1mol/LpH6.4的磷酸钾盐缓冲液从固体斜面上将金黄色葡萄球菌冲下，并配成一定浓度的悬浊液(OD570nm-0.3-0.5)，取3mL该悬浊液置于冰浴中，再加入50|jL待测样品，混匀，测其保温前在570nm波长处的光密度(A。)值，然后将其移入37'C温浴中置30分钟，取出后立刻再置于冰浴内10分钟，以终止反应。测其在570nm波长处的光密度(A)值。抗菌活力按U2=(Ao-A)/A式计算，U:活力单位。6、家蝇蛹天然抗菌肽溶血性测定用PBS将制备的家蝇蛹天然抗菌肽制品1/2倍梯度稀释，将配制的不同浓度的抗菌肽制品溶液加入小鼠红细胞混悬液中使红细胞的终浓度为5。/。(v/v)，且使抗菌肽制品的浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125、1.56凶/mL;同时设阴性和阳性对照(0%和100%溶血)，阴性对照为不加抗菌肽的红细胞混悬液，阳性对照为加入1%Triton-X100的红细胞混悬液；将上述溶液在37'C震荡孵育1小时后，离心取上清液，用酶标仪在414nm处测定各管的吸光度，记录光密度值；用下式计算溶血性溶血作用=(抗菌肽组光密度一阴性对照组光密度)/(1。/。triton-X100组光密度一阴性对照组光密度)x100%以抗菌肽制品浓度为横坐标，溶血作用为纵坐标做量效曲线，并进行比较。结果显示抗菌肽制品浓度达到50pg/mL都没有出现血细胞的溶解现象，表明家蝇抗菌肽制品对小鼠红细胞无溶血性。7、家蝇蛹天然抗菌肽制品的稳定性检测在4。C(10、20、30、60天)、40°C75%RH(10、20、30、60天)、100°C(30分钟)以及pH2—12的条件下对制备的抗菌肽制品的抗菌活力稳定性进行检测，以样品的抗菌活力作为检测指标，抗菌活力测定参照本实施例"5、抗菌活力测定"。对比实验结果表明，制备的抗菌肽在4'C储存60天，抗菌活力仍能达到原样品的90%以上(图3)，40°C75%RH条件下存放60天，仍具有60%的抗菌活力(图3)，10CTC处理30分钟仍具有抗菌活性，在较广泛的pH(2-12)条件下不会丧失抗菌活性。8、饲用昆虫蛋白粉粗蛋白含量检测准确称量0.1000g饲用昆虫蛋白粉与10ml浓硫酸混合，放置于消化电炉上于380'C消化45min，冷却后，加入10ml去离子水，然后利用全自动微量凯氏定氮仪(KJELTECAUTO1030Analyzer,German)进行滴定，记录消耗的盐酸量，所得到的盐酸量换算成氮的含量，计算出粗蛋白含量。以空白为对照修正盐酸实际消耗量。测量结果表明饲用昆虫蛋白粉中粗蛋白占饲用昆虫蛋白粉比例为72.45%,表明制备的饲用昆虫蛋白粉中具有较高的粗蛋白含量。实施例2:(1)称取一定量家蝇蛹，蒸馏水清洗后干燥，按1ml:6g的体积重量比例加入相应体积的8"C预冷的0.3M乙酸酸溶液，匀浆处理，8'C提取过夜，然后置100。C水浴热处理35分钟，而后于6。C、10000xg离心35分钟，收集上清，此上清即为家蝇蛹粗提液。沉淀烘干(11(TC)后，粉碎成粉末，该粉末即是本工艺的其中一个副产物一饲用昆虫蛋白粉。(2)步骤(1)所得家蝇蛹粗提液用500目筛过滤，收集滤过液；(3)步骤(2)所得滤过液上样于Amicon超率装置(MW30,000，Millipore公司)，在35度固定转角的离心机内6。C，5,000xgr离心40分钟，分别收集截留部分和滤过部分的样品；(4)将步骤(3)所得滤过部分样品按600:1的比例加入一定重量的糊精，在13CTC条件下，按1.5mL/min的进行喷干，收集喷干粉，此即为本抗菌肽制口Bo本实施例所得产品的性能与实施例1所得产品相近。实施例3:(1)称取一定量家蝇蛹，蒸馏水清洗后干燥，按1ml:5g的体积重量比例加入相应体积的6'C预冷的0.2M乙酸酸溶液，匀浆处理，6'C提取过夜，然后置95'C水浴热处理30分钟，而后于5。C、9000xg离心30分钟，收集上清，此上清即为家蝇蛹粗提液。沉淀烘干(105°C)后，粉碎成粉末，该粉末即是本工艺的其中一个副产物一词用昆虫蛋白粉。(2)步骤(1)所得家蝇蛹粗提液用400目筛过滤，收集滤过液；(3)步骤(2)所得滤过液上样于Amicon超率装置(MW30,000，Mi川pore公司)，在35度固定转角的离心机内5。C，4,000xg离心30分钟，分别收集截留部分和滤过部分的样品；(4)将步骤(3)所得滤过部分样品按500:1的比例加入一定重量的糊精，在12(TC条件下，按1.5mL/min的进行喷干，收集喷干粉，此即为本抗菌肽制卯o本实施例所得产品的性能与实施例1所得产品相近。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。权利要求1、一种家蝇蛹天然抗菌肽的制备方法，其特征在于选用家蝇蛹为原材料，经酸过夜提取和热处理后，收集上清为家蝇蛹粗提液；家蝇蛹粗提液再经筛过滤和超滤处理，然后进行喷雾干燥后得到产品。2、根据权利要求1所述家蝇蛹天然抗菌肽的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤(1)称取一定量家蝇蛹，蒸馏水清洗后干燥，按1ml:46g的体积重量比例加入相应体积的48。C预冷的0.10.3M酸溶液，匀浆处理，48。C提取过夜，然后置901(XTC水浴热处理2535分钟，而后于46。C、800010000xg离心2535分钟，收集上清，此上清即为家蝇蛹粗提液；沉淀烘干后，粉碎成粉末，该粉末为副产物一词用昆虫蛋白粉；(2)步骤(1)所得家蝇蛹粗提液用300500目筛过滤，收集滤过液；(3)步骤(2)所得滤过液在超滤装置中，于46°C、30005000xg离心2040分钟，分别收集截留部分和滤过部分样品；(4)将步骤(3)所得滤过部分样品按400600:1的比例加入一定重量的辅料，在11013(TC条件下进行喷干，收集喷干粉，此即得到产品。3、根据权利要求2所述家蝇蛹天然抗菌肽的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述酸溶液是乙酸溶液。4、根据权利要求2所述家蝇蛹天然抗菌肽的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述筛是国家标准检验筛。5、根据权利要求2所述家蝇蛹天然抗菌肽的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中，所述辅料是糊精。6、权力要求15任一项所述的制备方法制备的家蝇蛹天然抗菌肽制品。7、根据权利要求6所述家蝇蛹天然抗菌肽制品，其特征在于所述家蝇蛹天然抗菌肽制品由分子量小于20kDa的肽类组成；外在形态表现为淡黄色粉末状。8、权利要求6所述的家蝇蛹天然抗菌肽制品用于制备抗菌类药物、农产品防腐保鲜剂、食品防腐保鲜剂、动物饲料添加剂或护肤品。全文摘要本发明涉及一种家蝇蛹天然抗菌肽制品及其制备方法和应用，本发明的抗菌肽制品选用家蝇蛹为原材料，经酸过夜提取和热处理后，收集上清；上清再经筛过滤和超滤处理，然后进行喷雾干燥后得到该制品。本抗菌肽制品具有制备工艺简便快速，抗菌肽的产率达到1.2％，抗菌活力回收率也高达80％。制备的家蝇抗菌制品由分子量小于20kDa的肽类组成，主要是一些分子量小于14.4kDa的小分子肽类。该抗菌肽具有广谱的抑菌活性，且对小鼠血红细胞无溶血活性，并具有耐高温，耐酸碱和稳定性好的特点。该工艺的副产物还可用作饲用昆虫蛋白粉。制备的抗菌肽制品可广泛应用于食品、果蔬防腐保鲜以及饲料添加剂和护肤品等领域。文档编号A61K38/17GK101392020SQ20081021893公开日2009年3月25日申请日期2008年11月6日优先权日2008年11月6日发明者党向利,张文庆,汪延生,娟王,王丽芳,郑小霞申请人:中山大学