证明cd44表面表达的细胞的细胞毒性介导的制作方法

专利名称：证明cd44表面表达的细胞的细胞毒性介导的制作方法
技术领域：
本发明涉及分离和产生减轻癌性疾病的抗体(CDMAB )和这些 CDMAB单独地或与一或多种CDMAB/化疗试剂组合用于治疗和诊断过 程中的用途。本发明进一步地涉及利用本发明的CDMAB的结合测定法。
背景技术：
癌症中的CD44:针对人白血细胞的单克隆抗体的制备导致了CD44抗 原的发现； 一种表达在广泛的正常组织和所有类型的造血细胞上单链透明 质酸(HA )结合糖蛋白。其起初与淋巴细胞的激活和归巢(homing)相 关。当前，其推定的生理学作用还包括炎症基因的激活、细胞周期的调节、 细胞增殖的诱导、分化和发育的诱导、细胞骨架重组和细胞迁移以及细胞 存活/抵抗凋亡的诱导。
在人体中，单基因拷贝的cD44位于染色体11的短臂，11P13上。该 基因包含19个外显子；前5个是恒定的，随后的9个是可变的，紧接的 3个是恒定的，且最后的2个是可变的。差异剪接可以造成超过1000种 不同的同种型。然而，目前仅己识别了数十种天然存在的变体。
CD44标准糖蛋白由N-末端胞外(包括20个氨基酸的前导序列和近 膜区(85个氨基酸))结构域(270个氨基酸)、跨膜区(21个氨基酸) 和胞质尾(72个氨基酸)组成。胞外区还在N-末端包含连接部分。该区 域有92个氨基酸的长度且显示出与其它HA结合连接蛋白的同源性。在 小鼠型和人型CD44之间存在高同源性。蛋白的变体形式被插入外显子5 的羧基末端且在表达时位于胞外。
CD44的血清可溶形式也天然地存在且能够由终止密码子(在可变区 内)或蛋白水解活性产生。通过各种刺激包括TNF-a对细胞的激活造成 cD44受体的释放(shedding)。在肿瘤细胞中也观察到受体的释放且该释
5放可导致CD44在人血清中的浓度增加多达10倍。CD44的高血清浓度 暗示着恶性肿瘤(卵巢癌除外)。
CD44的标准形式以大约37kD的分子量存在。翻译后修饰将分子量 增加至80-90kD 。这些修饰包括氨基末端胞外结构域在天冬酰胺残基上的 N-连接糖基化、在胞外结构域的羧基末端的丝氨酸/苏氨酸残基上的O-连接糖基化以及糖胺聚糖添加。剪接变体的大小可以在80-250kD范围内。
HA， 一种哺乳动物中位于胞外基质(ECM )上的多糖，被认为是主 要的CD44配体。然而，也己经发现CD44与诸如胶原、纤连蛋白、层粘 连蛋白等蛋白结合。在HA结合和糖基化之间似乎存在关联。无活性的 CD44 (不结合HA )具有最高的糖基化水平，有活性的CD44 (结合 HA )糖基化水平最低而可诱导的CD44 (除非被细胞因子、单克隆抗体、 生长因子等激活，否则不与HA结合或很微弱地与HA结合)的糖基化水 平在活性和无活性形式之间。
CD44通过信号转导通路能够介导其的一些功能，这些通路依赖于细 胞、刺激以及环境的相互作用。这样的一些通路包括NFKB信号传导级联 (涉及炎症反应)、Ras-MAPK信号转导通路(涉及细胞周期和增殖的激 活)、Rho蛋白家族(涉及细胞骨架重组和细胞迁移)以及PI3-K相关信 号传导通路(涉及细胞存活)。上述所有的功能与肿瘤疾病的发生和发展 密切相关。CD44也被暗示通过各种另外的机理在癌症中发生作用。这些 机理包括CD44细胞表面存在的细胞表面蛋白聚糖将生长因子、趋化因子 和细胞因子呈递给参与恶性肿瘤中的受体。同样的，在CD44-HA复合物 内化后通过溶酶体透明质酸酶进行的HA的胞内降解可以潜在地增加了 肿瘤入侵和通过ECM诱导血管发生的可能性。此外，己经显示存活或凋 亡信号的传递通过标准的或可变的CD44受体发生。CD44也被暗示参与 细胞分化和迁移。这些机理中的很多，如果不是全部，是环境和细胞依赖 性的且若干机理引起了不同的发现。因此，在得出任何结论之前需要更多 的研究。
为了证实CD44在癌症中潜在的功能作用，进行了CD44的表达研究 以确定受体的差异性表达是否与疾病的进程相关。然而，在大部分肿瘤类 型中观察到不一致的现象，且这可能是由于研究人员之间在试剂、技术、
6病理学评分和细胞类型上的差异的混和造成的。肾细胞癌和非霍奇金氏
(non-Hodgkin's )淋巴瘤似乎是例外，因为具有CD44高表达肿瘤的患 者一致地比其低或无CD44表达的副本患者存活时间短。
由于其与癌症的关联，CD44己经成为发展抗癌治疗的靶点。关于肿 瘤进程需要CD44的标准还是变体形式仍然存在争论。两种观点都有体内 动物数据支持，且同样的，这可能取决于肿瘤类型甚至细胞类型。不同的 治疗手段己包括可溶CD44蛋白、乙酰透明质酸合酶cDNA、透明质酸酶 的注射，反义CD44和CD44特异性抗体的使用。各种手段己经实现了一 定程度的成功由此为抗CD44癌症治疗提供了支持。
实验中己经产生了变体和标准CD44的特异性单克隆抗体，但绝大部 分这些抗体除了与它们识别的CD44类型特异性地结合外，没有固有的生 物学活性。然而，存在某些抗体具有体外活性或体内活性，但通常没有兼 具这两种活性。己经显示一些抗CD44抗体介导细胞事件。例如，针对人 红血球吕泰罗(Lutheran)抗原CD44标准型的鼠科抗体A3D8显示出增 强CD2(9-1抗体)禾QCD3(OKT3抗体)介导的T细胞激活；另一种抗 CD44抗体具有相似的效应。A3D8也诱导IL-1从单核细胞的释放和IL-2 从T淋巴细胞的释放。有趣的是，A3D8与药物如柔红霉素、米托蒽醌和 依托泊苷联合使用通过消除第二信使神经酰胺的产生而抑制了 HL60和 NB4AML细胞中的凋亡诱导。没有固有活性且针对CD44的相似表位的 J173抗体不抑制药物诱导的凋亡。针对CD44的85-1 IOKD和200 KD形 式的NIH44-1抗体通过一种通路增强了 T细胞的增殖，作者推断该通路 为CD44的交联或聚集。综上所述，没有证据说明诸如这些的抗体适合作 为癌症治疗使用，因为它们不针对癌症(例如激活淋巴细胞)，诱导细胞 增殖，或者在与细胞毒性试剂一同使用时抑制癌细胞的药物诱导死亡。
已描述了一些抗CD44抗体，这些抗体证实了体内的抗肿瘤效应。抗 体1.1AsML， 一种针对CD44的v6变体的小鼠IgGl抗体，己经显示减 少了大鼠胰腺癌BSp73ASML的淋巴结和肺转移。治疗后的动物的存活随 之提高。该抗体仅当在淋巴结定植(colonization )之前给药有效，且据 推断其干扰淋巴结中的细胞增殖。在体外，该抗体对肿瘤细胞没有直接的 细胞毒性，且该抗体没有提高补体介导细胞毒性、或免疫效应细胞功能。没有描述该抗体针对人细胞的应用。
Breyer等记述了一种可商购的抗CD44s抗体在破坏原位植入的大鼠 成胶质细胞瘤的进程中的应用。将大鼠成胶质细胞瘤细胞系C6植入额叶， 一周后通过脑内注射用抗体对大鼠进行3次治疗。治疗后的大鼠与缓冲液 或同种型对照治疗后的大鼠相比，证实了降低的肿瘤生长以及更高的体 重。在体外，该抗体能够抑制细胞对由胞外基质成分包被的盖玻片的粘附， 但对细胞没有直接的细胞毒性效应。没有针对人细胞测试该抗体。
进行了比较抗CD44抗体(IM陽7.8,1)和抗CD44vlO抗体(K926)功 效的研究。将表达两种CD44同种型的高度转移的鼠科黑素瘤系B16F10 静脉内植入小鼠。两天后，在研究期间每三天给予抗体。两种抗体在肺转 移的数量上均造成了大于50 %的显著降低；在两种抗体的功效之间没有 显著的差别。该抗体在体外不影响增殖，且作者Zawadzki等推测肿瘤生 长的抑制是因为抗体阻断了CD44和其配体的相互作用。在使用IM-7.8.1 的另一研究中，Zahalka等证实了该抗体及其F(ab')2片段能够阻断小鼠T 细胞淋巴瘤LB对淋巴结的浸润。这赋予了小鼠显著的存活益处。 Wallach-Dayan等显示用CD44v4-v10转染不会自发形成肿瘤的LB-TRs鼠 科淋巴瘤导致其具有形成肿瘤的能力。IM-7.8.1的施用和同种型对照抗体 相比降低了植入的转染细胞的肿瘤尺寸。这些研究没有一个证实了人体对 该抗体的利用。
GKW. A3，小鼠的IgG2a，对人CD44具有特异性且在SCID小鼠中 防止人黑素瘤异种移植物的形成和转移。将该抗体与转移性人细胞系 SMMU-2混和并随后皮下注射。治疗在随后的3周内持续。4周后，相 比于未治疗动物的100%, 10只小鼠中仅l只在注射部位形成了肿瘤。该 抗体的F(ab')2片段证实了对肿瘤形成相同的抑制，提示该作用机理不依赖 于补体或抗体依赖性细胞毒性。如果在第一次抗体注射前一周注射肿瘤细 胞，则80 %的动物在原始位点形成肿瘤。然而，注意到存活时间仍然显 著增长了。尽管延迟的抗体施用对原发性肿瘤的形成没有效应，但是其完 全阻止在未治疗动物中出现的向肺、肾、肾上腺、肝和腹膜的转移。在体 外，该抗体对细胞系没有任何直接的细胞毒性也不干扰SMMU-2细胞的 增殖，且似乎通过影响转移或生长对肿瘤的形成具有其主要的效应。该抗体的一个显著的特征是其识别CD44的所有同种型，这提示其在治疗应用
中有限的可能性。
Strobd等记述了抗CD44抗体(克隆515 )在小鼠异种移植模型中抑制人卵巢癌细胞腹膜移植的应用。在抗CD44抗体或对照抗体的存在下，将人卵巢细胞系36M2腹腔内植入小鼠，且在随后的20天中进行治疗。5周后，在抗体治疗组的腹膜腔中有显著更少的节结(nodules )。来自抗CD44和对照治疗组的节结具有相同的尺寸，这提示一旦细胞被植入，抗体对肿瘤的生长没有效应。当细胞皮下植入时，对肿瘤生长也没有效应，意味着该抗体本身没有抗增殖或细胞毒性效应。此外，抗体在体外对细胞生长没有效应。
VFF-18，也称作BIWA 1，是对CD44的v6变体具有高度亲和性的抗体，其对该多肽的360 — 370区域具有特异性。在对12名患者进行的1期临床试验中，该抗体己被用作"m锝标记的缀合物。在患有头部和颈部鳞状细胞癌的患者中对该抗体的安全性及其靶向潜能进行了测试。在注射后40小时，注射剂量的14 %被肿瘤吸收，且在其它器官包括肾、脾和骨髓中具有最少的积聚。高度选择性的肿瘤结合提示该抗体在放射免疫疗法中的作用，尽管该抗体异常高的亲和力阻止其渗透到肿瘤更深层中。进一步限制BIWA1应用的是鼠科抗体的免疫原性(12名患者中的ll名产生了人抗小鼠抗体(HAMA))、遍及肿瘤的不均匀积聚以及抗体-可溶性CD44复合物的形成。WO 02/094879公开了 VFF-18的人源化形式，将其设计用于克服HAMA反应，命名为BIWA4。据发现，BIWA4和亲本VFF18抗体相比，具有显著更低的抗原结合亲和力。意外的是，较低亲和力的BIWA4抗体比较高亲和力的BIWA 8人源化的VFF-18抗体具有更高的肿瘤吸收特征。在33名患者的l期临床试验中对"m锝标记的和186铼标记的BIWA4抗体进行评价，以确定^Re-标记的BIWA4情形中的安全性、耐受能力、肿瘤积聚和最大耐受剂量。""Tc标记的BIWA4中似乎存在肿瘤相关的吸收。针对^Re-标记的BIWA4的所有剂量没有观察到肿瘤的应答，尽管一些具有稳定的病情；剂量限制毒性发生在60mCi/m2。存在50-65%的不良事件发生率，33名患者中的12位被认为发生了严重的不良事件(血小板减少、白血球减少以及发热)，且其中6名均接受186Re-标记BIWA4治疗的患者在治疗期间死亡或因为疾病恶化随后死亡。2名患者产生了人抗人抗体(HAHA)。在20名患者中进行了 ^Re-标记BIWA4的1期剂量递增试验。观察到口腔粘膜炎和剂量限制的血小板减少和白血球减少； 一名患者产生了 HAHA反应。在以60mCi/n^的最高剂量治疗的5名患者中观察到稳定的病情。尽管在获得功效的安全性和耐受能力上被认为可以接受，这些研究相比于临床研究中其它非放射性同位素缀合的生物学治疗具有更高的不良事件发生率。美国专利申请US 2003/0103985公开了在肿瘤治疗中使用的与美登木素生物碱(maytansinoid)缀合的VFF-18人源化形式，命名为BIWIl。人源化VFF18抗体BIWA4，在与一毒素缀合时，即BIWIl，被发现在人外阴表皮状癌、咽喉鳞状细胞癌或乳腺癌的小鼠模型中具有显著的抗肿瘤效应。未缀合的形式BIWA4没有抗肿瘤效应，且缀合形式BIWI 1没有在人体中安全性或功效的证据。
Mab U36通过UM-SCC-22B人下咽骨癌细胞免疫和癌及组织特异性选择产生的鼠科单克隆IgGl抗体。通过cDNA克隆和序列分析进行的抗原表征将角质形成细胞特异性CD44剪接变体表元(epican )的v6结构域确定为Mab U36的靶标。免疫组织化学研究显示该表位局限于细胞膜上。此外，Mab U36对94 %的头部和颈部鳞状细胞癌(HNSCC)发生了强标记，且在这些肿瘤中细胞染色不均匀。10名患者的99mTc标记的Mab U36研究显示该抗体针对HNSCC癌症的选择性积聚(2天内20.4+/-12.4%注射的剂量/1^);没有报告副作用，但2名患者产生了HAMA。在放射性碘标记的鼠科MabU36的研究中，在18名患者中有3例HAMA以及HNSCC的选择性均匀吸收。为了降低MabU36的抗原性以及降低HAMA的发生率，构建了嵌合抗体。嵌合或原始的鼠科MabU36均没有ADCC活性。没有关于Mab U36天然功能活性的证据。^Re标记的嵌合Mab U36用于确定Mab U36作为治疗试剂的应用。在该1期剂量递增试验中，13名患者接受了"mTc标记的嵌合Mab U36的尝试剂量和随后的^Re标记嵌合Mab U36。没有急性不良事件的报道但在治疗后观察到3名患者中的2名有剂量限制髓毒性(1.5GBq/m2)，且l名接受最大耐受剂量(1.0GBq/m2)治疗的患者血小板减少。尽管对肿瘤尺寸有一些效应，但是这些效应没有满足关于针对治疗的客观响应的标准。186Re标记嵌合
10Mab U36的进一步的研究采用使用粒细胞集落形成刺激因子刺激的全血回输的策略将最大耐受活性加倍至2.8 Gy。在对患有头部和颈部各种肿瘤的9名患者的该研究中，3名因为药物相关贫血需要输血。其它毒性包括3级髓毒性和2级粘膜炎。尽管在5名患者中获得了3-5个月的稳定病情，但是没有报告客观的肿瘤响应。因此，可以看出尽管Mab U36是高度特异性抗体，但是其要求放射免疫缀合物以实现抗癌效应的缺点因为其与获得临床效应相关的治疗相关联的毒性而限制了其有效性。
总之，己经显示，CD44v6 ( I,IASML)和CD44vl0 (K926)单克隆抗体分别在用转移型胰腺腺癌注射的大鼠或在用恶性黑素瘤注射的小鼠中降低了转移活性。另一种抗CD44v6抗体((VFF-18及其衍生物)，仅在与美登木素生物碱或放射性同位素缀合时，显示出具有抗肿瘤作用。抗标准CD44单克隆抗体也己经显示抑制大鼠成胶质细胞瘤的脑内进程(抗CD44)、小鼠T细胞淋巴瘤的淋巴结侵入(IM-7.8.1)以及抑制人卵巢癌细胞在裸鼠中的移植(克隆515 )、小鼠黑素瘤细胞系的肺转移(IM-7.8.1)以及人黑素瘤细胞系在SCID小鼠中的转移(GKW.A3)。放射性同位素缀合的MabU36抗CD44v6抗体及其衍生物在伴随着显著毒性的临床试验中具有抗肿瘤活性。尽管这些结果是鼓舞人心的且支持将抗CD44单克隆抗体发展成为潜在的癌症治疗法，它们说明了对人体癌症有限的效应、安全性或适用性。
因此，如果分离出一种抗体组合物，该组合物介导癌细胞的细胞毒性，作为其与所述细胞上的CD44细胞表面表达相互吸引的功能，将会实现有价值的诊断和治疗方式。 -
作为癌症治疗的单克隆抗体患有癌症的每个个体都是独特的，并且患有与其它癌症不同的癌症，正如个人的身份一样。除此之外，目前的治疗法以相同的方法治疗患有同种类型的癌症、处于相同的阶段的所有患者。这些患者中至少有30%将在一线治疗中失败，由此导致以后几轮的治疗和治疗失败、转移、以及最终死亡的增加的可能性。较好的治疗方法应该是对于特定的个体量身定制的治疗法。目前本身适于量身定制的唯一的治疗法是手术。化疗和放射治疗不能对患者进行量身定做，并且手术本身
ii在大部分情形中不足以产生治愈。
随着单克隆抗体的出现，由于每种抗体可以针对单个表位，则开发量身定制的治疗法的方法的可能性变得更加现实。此外，产生针对独特限定特定个体的肿瘤的表位群的抗体组合也是可能的。
己经认识到在癌症细胞和正常细胞之间的显著不同是在于癌症细胞包含对转化的细胞特异的抗原，科学团体长期认为单克隆抗体可以设计成通过特异性与这些癌症抗原结合而特异性靶向转化的细胞；因此产生这样
的信心单克隆抗体可以作为"魔力子弹(Magic Bullets)"来消除癌细胞。然而，现在广泛认识到，没有任何一种单个的单克隆抗体可以在所有癌症情形中起作用，并且单克隆抗体可以被配置为一类作为靶向癌症治疗。己经表明按照本文公开的发明的教导分离的单克隆抗体以有益于患者的方式改善癌性疾病过程，例如通过减少肿瘤负荷的方式，并且在本文中应该不同地称为减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)或"抗癌"抗体。
目前，癌症患者通常具有很少的治疗选择。对癌症治疗法的管理方法已经在全球存活和发病率中产生了改善。然而，对于特定的个体，这些改善的统计学没有与他们个人情况的改善必然相关。
因此，如果采用能够使执业者独立于处于同一团体中的其他患者而治疗每种肿瘤的方法，这将允许产生仅使治疗适合该名个体的独特方法。这样的治疗疗程将理想地增加治愈率，并且产生更好的结果，由此满足长期渴望的需要。
历史上，多克隆抗体的应用已经进行了应用，在治疗人类癌症中具有有限的成功。己经使用人血浆治疗淋巴瘤和白血病，但是存在很少延长的好转或反应。此外，与化疗相比，缺少再现性，并且没有任何其它的益处。实体瘤诸如乳腺癌、黑素瘤和肾细胞癌也己经使用人血液、黑猩猩血清、人血浆和马血清进行治疗，具有相对不可预知的和无效的结果。
对于实体瘤，己经存在单克隆抗体的许多临床试验。在20世纪80年代，对于人乳腺癌存在至少4种临床试验，其使用针对特异抗原的或基于组织选择性的抗体，在至少47名患者中仅产生一名响应者。直到1998年才出现使用人源化的抗Her2/neu杭体(Herc印tin⑧)与顺铂组合的成功的临床试验。在该试验中，评估37名患者的响应，其中约四分之一具有部分响应率，另外四分之一具有较小或稳定的疾病发展。在所述响应者中对发
展的中值时间是8.4个月，中值响应持续5.3个月。
Herceptin⑧在1998年首次核准与Taxol⑧组合用于一线应用。临床研 究结果显示，与仅接受Taxol⑧的组(3.0个月)相比，对于接受抗体治疗 加Taxo,的那些的疾病发展的中值时间(6.9个月)增加。在中值存活中 也存在稍微的增加；对于Herceptin⑧加Taxol⑧治疗组相对于单独的Taxol 治疗组为22个月相对于18个月。另夕卜，与单独的Taxo倾相比较，在抗体 加Taxol⑧组合组中，在完全(8%相对于2%)和部分响应者(34%相对于 15。/。)的数量中存在增加。然而，与单独的Taxo,治疗相比较，用Herc印tin⑧ 和Taxol⑧治疗导致更高的心脏中毒的发生(分别为13%相对于1%)。此 外，Herceptin⑧治疗法只对过量表达(通过免疫组化(IHC)分析确定)人表 皮生长因子受体2 (Her2/neu)的患者有效，在患有转移乳腺癌的患者的大 约25%中有效；所述人表皮生长因子受体2是一种受体，其目前具有未知 的功能或生物学重要的配体。因此，对于患有乳腺癌的患者仍然存在大量 未满足的需求。即使可以受益于Herceptin⑧治疗的那些仍然需要化疗，并 且因此仍然必须处理，至少在某种程度上，这种治疗的副作用。
研究结肠直肠癌的临床试验包括针对糖蛋白和糖脂靶点的抗体。抗体 如17-1A,其对于腺癌具有某种特异性，已经在六十多名患者中进行了 2 期临床试验，仅有1名患者具有部分响应。在其它试验中，在使用额外的 环磷酰胺的方案中，使用17-1A在52名患者中仅产生1例完全响应和2 例较小的响应。迄今为止，17-1A的III期临床试验尚末表现出作为III期 结肠癌的辅助治疗的提高的功效。最初核准用于成像的人源化鼠单克隆抗 体的应用也没有产生肿瘤衰减。
仅在最近，使用单克隆抗体的直肠结肠癌临床研究产生了一些积极的 结果。在2004年，ERBITUX⑧核准用于患有表达EGFR的转移结肠直肠 癌的患者的二线治疗，所述患者对基于伊立替康的化疗不起反应 (refractory)。来自两组(two-arm) II期临床研究和单组研究的结果表明， ERBITUX⑧与伊立替康组合分别具有23%和15%的响应率，疾病发展的中 值时间分别为4.1个月和6.5个月。来自同一两组II期临床研究和另一单 组研究的结果表明，仅用ERBITUX⑧治疗分别导致11%和9%的响应率，
13疾病发展的中值时间分别为1.5个月和4.2个月。
因此，在瑞士和美国，ERBITUX⑧与伊立替康组合治疗，并且在美国， 单独的ERBITUX⑧治疗，已经被核准作为在一线伊立替康治疗中失败的结 肠癌患者的二线治疗。因此，如同Herceptin⑧，在瑞士只核准治疗作为单 克隆抗体和化疗的组合。另外，在瑞士和美国只核准治疗作为二级治疗用 于患者。此外，在2004年，AVASTIN⑧被核准与静脉内基于5-氟尿嘧啶 的化疗组合用作转移性结肠直肠癌的一线治疗。III期临床研究结果表现出 与仅用5-氟尿嘧啶治疗的患者相比，用AVASTIN⑧加5-氟尿嘧啶治疗的患 者的中值存活延长(分别为20个月相对于16个月)。然而，同样如同 Herceptin⑧和ERBITUX ,治疗仅被核准作为单克隆抗体和化疗的组合。
对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌还继续存在极差 的结果。对于非小细胞肺癌的最有希望的最近的结果来自II期临床试验， 其中治疗包括与杀细胞药多柔比星缀合的单克隆抗体(SGN-15; dox-BR96, 抗-唾液酸(sialyl)-LeX)，其与化疗药TAXOTERE⑧组合。TAXOTERE⑧是 唯一一种FDA核准的化疗药，用于肺癌的二线治疗。原始数据显示与单 独的TAXOTERE⑧相比提高的整体存活时间。在本研究征募的62名患者 中，三分之二接受SGN-15与TAXOTERE⑧组合，而其余三分之一接受单 独的TAXOTERE 。对于接受SGN-15与TAXOTERE⑧组合的患者，中值 整体存活时间是7.3个月，而与之比较的接受单独的TAXOTERE⑧的患者 是5.9个月。对于接受SNG-15加TAXOTERE⑧的患考的整体存活时间为 1年和18个月的分别为29%和18%，而与之比较的对于接受单独的 TAXOTERE⑧的患者分别为24%和8%。计划了进一步的临床试验。
临床前，对于黑素瘤使用单克隆抗体已经存在一些有限的成功。这些 抗体中很少已经达到临床试验阶段，并且迄今为止没有一种已经被核准或 在III期临床试验中表现出有利的结果。
治疗疾病的新药的发现受到在30,000种己知的基因产物中缺少相关 靶点的鉴定的阻碍，所述30,000种已知的基因可能有助于疾病的发病机 理。在肿瘤学研究中，潜在的药物靶点通常仅由它们在肿瘤细胞中过量表 达的事实来选择。然后筛选这样鉴定的靶点与多种化合物的相互作用。在 潜在的抗体治疗的情形中，这些候选化合物通常衍生于根据Kohler和Milstein所述的基本原理(1975，自然(Nature) , 256, 495-497, Kohler和 Milstein)的单克隆抗体产生的常规方法。从用抗原(例如，全细胞，细胞 级分，纯化的抗原)免疫的小鼠收集脾细胞，并且与无限增殖的杂交瘤配 偶体融合。筛选所得到的杂交瘤，并且针对最亲和性地与所述靶点结合的 抗体的分泌进行选择。针对癌细胞的许多治疗和诊断抗体，包括Herceptin⑧ 和RITUXIMAB，已经使用这些方法产生，并且基于它们的亲和性进行选 择。这种方法中的缺点是两方面的。首先，对治疗或诊断抗体结合选择适 当的耙点受到关于组织特异性致癌过程的极少的知识以及用于鉴定这些 靶点的所得到的过于单纯化的方法的限制，所述过于单纯化的方法如通过 过量表达进行选择。第二，与受体以最大的亲和力结合的药物分子通常具 有起始或抑制信号的最大可能性的假设可能不总是这种情形。
除了对于乳腺癌和结肠癌的治疗的一些进展之外，但是有效抗体治疗 的鉴定和开发，不管是作为单一药剂还是共同治疗，对于所有类型的癌症 尚是不充足的。
现有专利
美国专利号5,750,102公开这样一种方法，其中来自患者肿瘤的细胞 用MHC基因转染，所述MHC基因可能克隆至来自该患者的细胞或组织。 然后，使用这些转染的细胞对该患者进行预防接种。
美国专利号4,861,581公开这样一种方法，所述方法包括下列步骤 获得单克隆抗体，所述单克隆抗体对哺乳动物的肿瘤细胞和正常细胞的内 部细胞成分是特异性的，但是对外部成分不是特异性的；标记所述单克隆 抗体，使所标记的抗体与已经接受治疗的哺乳动物组织接触以杀死肿瘤细 胞；并且通过测量所标记的抗体与退化的肿瘤细胞的内部细胞成分的结合 而确定治疗的功效。在制备针对人细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认 为恶性细胞代表这样的抗原的便利的来源。
美国专利号5,171,665提供一种新型抗体以及其生产方法。具体地， 该专利教导形成这样的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有与人肿瘤相关的 蛋白质抗原例如结肠和肺的那些强结合而与正常细胞以弱得多的程度结 合的性质。
15美国专利号5,484,596提供一种癌症治疗方法，所述方法包括从人癌 症患者手术摘除肿瘤组织，处理所述肿瘤组织以获得肿瘤细胞，辐射所述 肿瘤细胞以成为存活的但非致瘤性的，并且使用这些细胞制备用于患者的 疫苗，所述疫苗能够抑制原发瘤的复发而且同时抑制转移。该专利教导开 发与肿瘤细胞的表面抗原反应的单克隆抗体。如第4栏，第45行及以后 所述的，专利权所有人在开发人肿瘤形成的表达单克隆抗体的活性特异性 免疫治疗中使用自生的肿瘤细胞。
美国专利号5,693,763教导一种糖蛋白抗原，其是人癌症特有的，并 且不依赖于起源的上皮组织。
美国专利号5,783,186涉及在表达Her2的细胞中诱导程序性细胞死亡 的抗-Her2抗体，产生所述抗体的杂交瘤细胞系，使用所述抗体治疗癌症 的方法和包括所述抗体的药物组合物。
美国专利号5,849,876描述了用于产生针对黏蛋白抗原的单克隆抗体 的杂交瘤细胞系，所述黏蛋白抗原由肿瘤和非肿瘤组织来源纯化。
美国专利号5,869,268涉及产生人淋巴细胞的方法，所述人淋巴细胞 产生对需要的抗原特异性的抗体，产生单克隆抗体的方法，以及由所述方 法产生的单克隆抗体。该专利特别涉及有效用于癌症诊断和治疗的抗-HD 人单克隆抗体的生产。
美国专利号5,869,045涉及与人癌症细胞反应的抗体、抗体片段、抗 体缀合物和单链免疫毒素。这些抗体作用的机制是双重的，原因在于分子 与在人癌症表面上存在的细胞膜抗原反应，并且此外，原因在于所述抗体 具有在癌症细胞内部内在化的能力，随后结合，使它们特别有效用于形成 抗体-药物和抗体-毒素缀合物。在它们的未修饰形式中，所述抗体还在特
定的浓度表现出细胞毒性特征。
美国专利号5,780,033公开自体抗体用于肿瘤治疗和预防的应用。然 而，这种抗体是来自年老的哺乳动物的抗核自体抗体。在这种情形中，认 为该自体抗体是在免疫系统中发现的一种自然抗体类型。因为该自体抗体 来自"年老的哺乳动物"，不存在所述自体抗体实际来自被治疗的患者的 要求。另外，该专利公开了来自年老的哺乳动物的天然和单克隆抗核自体 抗体，和产生单克隆抗核自体抗体的杂交瘤细胞系。美国专利号5,750,102公开这样一种方法，其中来自患者肿瘤的细胞 用MHC基因转染，所述MHC基因可能克隆至来自该患者的细胞或组织。 然后，使用这些转染的细胞对该患者进行预防接种。
美国专利号4,861,581公开这样一种方法，所述方法包括下列步骤 获得单克隆抗体，所述单克隆抗体对哺乳动物的肿瘤细胞和正常细胞的内 部细胞成分是特异性的，但是对外部成分不是特异性的；标记所述单克隆 抗体，使所标记的抗体与已经接受治疗的哺乳动物组织接触以杀死肿瘤细 胞；并且通过测量所标记的抗体与退化的肿瘤细胞的内部细胞成分的结合 而确定治疗的功效。在制备针对人细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认 为恶性细胞代表这样的抗原的便利的来源。
美国专利号5,171,665提供一种新型抗体以及其生产方法。具体地， 该专利教导形成这样的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有与人肿瘤相关的 蛋白质抗原例如结肠和肺的那些强结合而与正常细胞以弱得多的程度结 合的性质。
美国专利号5,484,596提供一种癌症治疗方法，所述方法包括从人癌 症患者手术摘除肿瘤组织，处理所述肿瘤组织以获得肿瘤细胞，辐射所述 肿瘤细胞以成为存活的但非致瘤性的，并且使用这些细胞制备用于患者的 疫苗，所述疫苗能够抑制原发瘤的复发而且同时抑制转移。该专利教导开 发与肿瘤细胞的表面抗原反应的单克隆抗体。如第4栏，第45行及以后 所述的，专利权所有人在开发人肿瘤形成的表达单克隆抗体的活性特异性 免疫治疗中使用自生的肿瘤细胞。
美国专利号5,693,763教导一种糖蛋白抗原，其是人癌症特有的，并 且不依赖于起源的上皮组织。
美国专利号5,783,186涉及在表达Her2的细胞中诱导程序性细胞死亡 的抗-Her2抗体，产生所述抗体的杂交瘤细胞系，使用所述抗体治疗癌症 的方法和包括所述抗体的药物组合物。
美国专利号5,849,876描述了用于产生针对黏蛋白抗原的单克隆抗体 的杂交瘤细胞系，所述黏蛋白抗原由肿瘤和非肿瘤组织来源纯化。
美国专利号5,869,268涉及产生人淋巴细胞的方法，所述人淋巴细胞 产生对需要的抗原特异性的抗体，产生单克隆抗体的方法，以及由所述方
17法产生的单克隆抗体。该专利特别涉及有效用于癌症诊断和治疗的抗-HD 人单克隆抗体的生产。
美国专利号5,869,045涉及与人癌症细胞反应的抗体、抗体片段、抗 体缀合物和单链免疫毒素。这些抗体作用的机制是双重的，原因在于分子 与在人癌症表面上存在的细胞膜抗原反应，并且此外，原因在于所述抗体 具有在癌症细胞内部内在化的能力，随后结合，使它们特别有效用于形成 抗体-药物和抗体-毒素缀合物。在它们的未修饰形式中，所述抗体还在特
定的浓度表现出细胞毒性特征。
美国专利号5,780,033公开自体抗体用于肿瘤治疗和预防的应用。然 而，这种抗体是来自年老的哺乳动物的抗核自体抗体。在这种情形中，认 为该自体抗体是在免疫系统中发现的一种自然抗体类型。因为该自体抗体 来自"年老的哺乳动物"，不存在所述自体抗体实际来自被治疗的患者的 要求。另外，该专利公开了来自年老的哺乳动物的天然和单克隆抗核自体 抗体，和产生单克隆抗核自体抗体的杂交瘤细胞系。
美国专利号5,916,561公开了针对CD44基因变体外显子v6的特异性 抗体VFF-18及其变体。该抗体相对于其它同类抗体有所改进，因为其识 别人CD44 v6变体而不识别大鼠的CD44v6变体。此外，该抗体公开了 对于CD44 v6表达的诊断测定。对于该抗体没有公开任何体外或体内的 功能。
美国专利号5,616,468公开了单克隆抗体Var3.1，该抗体针对包含由 人的CD44基因的外显子6A编码的序列的合成肽制备。特别地，该抗体 与人CD44的90kD形式不发生结合且可以与Hermes-3抗体相区别。提 供了检测CD44的v6变体的方法以及基于该抗原筛选和测定恶性转化的 方法。还提供了基于检测血清中的抗原筛选炎症疾病的方法。
美国专利号5,879,898公开了与人CD44变体6的129bp的外显子结 合的特异性抗体，所述129bp的外显子产生43个氨基酸的肽。该单克隆 抗体由许多杂交瘤细胞系制备MAK<CD44>M-U.12, MAK<CD44>M-2.42.3， MAK<CD44>M-4.3.16。该抗体从一种融合蛋白产 生，该融合蛋白包含新CD44 v6氨基酸序列的至少一个六肽。此外，公 开了用于检测外显子6变体的免疫测定，该测定可用作癌症的诊断。值得
18注意地，没有公开该抗体的体外或体内功能。
美国专利号5,942,417公开了编码CD44样多肽的多核苷酸以及使用 该多核酸及其变体制备重组蛋白的方法。该专利权利要求了这些多肽的抗 体但没有具体实施例也没有分泌这些抗体的保藏的克隆。Northern印迹法 证实该多核苷酸在若干类型的组织中出现，但没有该多核苷酸翻译和表达 的相应证据。因此，没有证据说明抗体是针对该多核苷酸的基因产物制备 的，这些抗体具有体外或体内功能，以及它们是否与人癌性疾病相关。
美国专利号5,885,575公开了与CD44的变体表位反应的抗体以及通 过使用该抗体识别该变体的方法。从大鼠细胞中分离出编码该变体的分离 的多核苷酸，且针对该变体的抗体mAbl.lASML识别分子量为120 kD, 150 kD, 180 kD,和200 kD的蛋白。单克隆抗体1.1ASML的施用延缓了大 鼠BSp73ASML在同基因大鼠中的生长和转移。值得注意地，正如其缺乏 针对LCLC97人大细胞肺癌的活性所证实的，.1ASML不识别人肿瘤。 从LCLC97中分离出人的同系物但没有制备出识别该同系物的等价抗体。 由此，尽管制备了对大鼠CD44的变体具有特异性的抗体且该抗体显示影 响大鼠肿瘤的生长和转移，但是没有证据说明该抗体对人肿瘤具有效应。 更具体地，该发明人指出该抗体不识别人癌症。
发明概述
本申请利用在U.S. 6,180,357专利中教导的生产患者特异性抗癌抗体 的方法分离杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系编码减轻癌性疾病的单克隆 抗体。这些抗体可以针对一种肿瘤特异性制备，并且因此使得癌症治疗的 量身定制成为可能。在本申请的情形中，具有杀伤细胞(细胞毒性)或抑 制细胞生长(抑制细胞)特性的抗癌抗体在下文中称为细胞毒性的。这些 抗体可以用于辅助癌症的分阶段和诊断，并且可以用于治疗肿瘤转移。这 些抗体还可以用于通过预防治疗的方式用于预防癌症。与根据传统药物发 现样本(paradigm)产生的抗体不同，以这种方式产生的抗体可以靶向这样 的分子和途径，所述分子和途径先前没有显示出对于恶性组织的生长和/ 或存活是必需的。此外，这些抗体的结合亲和力适合起始可能不易受更强 的亲和性相互作用影响的细胞毒性事件的需要。此外，将标准化疗形式如放射性核素与本发明的CDMAB缀合也在本发明的范围内，由此集中在所 述化疗药的应用。所述CDMAB也可以与毒素、细胞毒性部分、酶例如生 物素缀合的酶、细胞因子、干扰素、靶标或受体部分或造血细胞缀合，由 此形成抗体缀合物。所述CDMAB可以单独或与一种或多种CDMAB/化 疗试剂组合使用。个体化的抗癌治疗的前景将在患者的管理方式中引起改变。可能的临 床方案(scenario)是在出现时获得肿瘤样品，并且储存。从该样品，肿瘤 可以用一组预先存在的减轻癌性疾病的抗体而确定类型。将患者进行常规 分阶段，但是可用的抗体可以用于将患者进一步分阶段。患者可以立即用 现有的抗体进行治疗，并且使用本发明描述的方法或通过利用噬菌体展示 文库与本发明公开的筛选方法联合，可以产生一组对肿瘤特异性的抗体。 由于其它肿瘤可能携带一些与被治疗的肿瘤相同的表位，故将产生的所有 抗体加入到抗癌抗体文库中。按照该方法产生的抗体可以有效用于治疗许 多患有与这些抗体结合的癌症的患者中的癌性疾病。除了抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐的治疗作为多形式治 疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对非癌症细胞是相对无毒的事实 允许以高剂量抗体组合，单独的，或与常规治疗组合。高治疗指数还允许 在短时间范围内再次治疗，这应该降低耐受治疗的细胞出现的可能性。如果患者对初始的治疗疗程没有反应或发展了转移，则可以重复产生 针对肿瘤的特异性抗体的方法，进行再次治疗。此外，所述抗癌抗体可以 与从该患者获得的红血细胞缀合，并且重新输注用于治疗转移。对于转移 癌存在很少有效的治疗，并且转移通常预示着导致死亡的最坏结果。然而， 转移癌通常充分地血管化，通过红血细胞递送抗癌抗体可以具有将所述抗 体集中在肿瘤部位的作用。甚至在转移之前，大部分癌症细胞依赖于宿主 的血液供应它们的生存，并且与红血细胞缀合的抗癌抗体还可以有效针对 原位肿瘤。备选地，所述抗体可以与其它造血细胞缀合，如淋巴细胞、巨 噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞等。存在5类抗体，并且每类与由其重链赋予的功能相关。通常认为由裸 抗体杀伤癌症细胞通过抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细 胞毒性(CDC)进行介导。例如，鼠lgM和IgG2a抗体可以通过结合补体系统的C-1成分而激活人补体，由此激活可以导致肿瘤消退的补体激活经典途径。对于人抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgGl。 IgG2a 和IgG3同种型的鼠抗体有效征募具有Fc受体的细胞毒性细胞，其将导致 由单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞进行的细胞杀伤。IgGl 和IgG3同种型的人抗体介导ADCC。通过Fc区介导的细胞毒性需要效应子细胞、它们相应的受体、蛋白例 如NK细胞、T细胞和补体的存在。在缺乏这些效应子机制的条件下，抗 体的Fc部分是惰性的。抗体的Fc部分可以赋予影响抗体体内药物动力学 的性质，但在体外，这是无效的。我们测试抗体的细胞毒性测定不具有任何效应子机制的存在，且在体 外进行。这些测定不具有效应子细胞(NK、巨噬细胞、或T细胞)或补 体的存在。因为这些测定完全由加在一起的物质定义，所以可以表征每种 成分。本发明中使用的测定仅包含靶细胞、培养基和血清。靶细胞不具有 效应子功能，因为它们是癌细胞或成纤维细胞。在没有具有效应子功能性 质的外源细胞的存在下，没有具有这种功能的细胞元件。培养基不含有补 体或任何细胞。如销售者公开地，用于支持靶细胞生长的血清不具有补体 活性。此外，在我们自己的实验室中，我们验证了所用血清中不存在补体 活性。因此，我们的工作证明了这样的事实，即抗体的作用完全归因于通 过Fab介导的抗原结合的作用。有效地，靶细胞仅识别和仅与Fab相互作 用，因为它们不具有Fc的受体。尽管杂交瘤分泌用靶细胞测试的完整免 疫球蛋白，但是免疫球蛋白中与该细胞枏互作用的部分仅是Fab，其起抗 原结合片段的作用。至于目前要求的抗体和抗体结合片段，本申请，在提交时，根据图1 中的数据证明了细胞毒性。如上指出地，和如本文中通过客观证据证实地， 该作用完全归因于Fab对肿瘤细胞的结合。抗体介导的细胞毒性归因于抗体与靶抗原的直接结合，而与通过Fc 复原的效应子机制无关的技术领域中存在充足的证据。关于这一点的最佳 证据是体外实验，其不具有补充细胞，或补体(从而正式排除那些机制)。 这些类型的实验使用完整的免疫球蛋白进行，或使用抗原结合片段诸如 F(ab)，2片段进行。在这些类型的实验中，抗体或抗原结合片段可以直接诱21导靶细胞的凋亡，诸如在抗Her-2和抗EGFR抗体的情形中，这二者已被 US FDA批准市售用于癌症治疗法。
抗体介导的癌症杀伤的另一种可能的机制可以通过使用作用为催化 细胞膜中的不同化学键以及与之缔合的糖蛋白或糖脂的水解的抗体，即所 谓的催化抗体。
存在3种抗体-介导的癌症细胞杀伤的其它机制。第一种是使用抗体 作为疫苗来诱导机体产生针对存在于癌症细胞上的推定的抗原的免疫反 应。第二种是使用这样的抗体，所述抗体靶向生长受体，并且干扰它们的 功能，或下调所述受体，以致有效地丧失其功能。第三种是所述抗体对细 胞表面部分的直接连接的作用，所述细胞表面部分的直接连接可能导致直 接的细胞死亡，诸如死亡受体如TRAIL Rl或TRAIL R2的连接，或整联 蛋白分子如(xV(33的连接等。
癌症药物的临床应用基于所述药物在对患者的可接受的危险模式下 的益处。在癌症治疗中，通常是在益处之后最追求生存，然而，除了延长 生命之外，还存在许多其它公认的益处。这些其它的益处，其中治疗没有 不利地影响生存，包括症状减轻，针对不利事件的保护，复发时间的延长 或没有疾病的生存，并且延长发展的时间。这些标准通常被接受，并且管 理团体如美国食品及药品管理局(U.S. Food and Drug Administration) (F.D.A.)核准产生这些益处的药物(Hirschfeld等.肿瘤学/血液学的重要综 述(Critical Reviews in Oncology/Hematolgy) 42:137-143 2002)。除了这些 标准之外，公认还存在其它的可以预示这些类型的益处的终点(endpoint)。 部分地，由美国F.D.A.授予的加速的核准流程承认存在可能预测患者益处 的替代品。到2003年年末时，在这种流程下已经核准了 16种药物，并且 这些中有4种已经继续获得了完全的核准，即，随后的研究已经表明由替 代品终点预测的直接的患者益处。确定药物在实体瘤中的作用的一个重要 的终点是通过测量针对治疗的响应而评估肿瘤负荷(Themsse等.国家癌症 研究所杂志(Journal of the National Cancer Institute) 92(3):205-216 2000)。 关于所述评估的临床标准(RECIST标准)已由癌症国际专家组实体瘤工作 组的响应评估标准公布。与适当的对照组相比较，对肿瘤负荷具有证明的 作用的药物，如由RECIST标准所述的目标响应所示，最终倾向于产生直
22接的患者益处。在临床前设定中，肿瘤负荷通常更直接进行评估和记录。 因为临床前研究可以转换成临床设定，在临床前模型中产生延长的生存的 药物具有最大的预测临床用途。与产生针对临床治疗的积极响应类似，在 临床前设定中减少肿瘤负荷的药物还可能对疾病具有显著的直接影响。尽 管延长生存是在癌症药物治疗的临床结果后最追求的，但是存在其它的益 处，其具有临床应用，并且清楚地，可能与疾病发展的延迟、延长的生存 或二者相关的肿瘤负荷减少还可以导致直接的益处和具有临床影响
(Eckhardt等.发展的治疗学目标化合物的临床试验设计的成功与失败 (Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial
Designs of Targeted Compounds); ASCO教科书，第39次年会，2003,第209
-219页)。
基本使用US 6,180,357的方法，在用来自患者肺肿瘤活检组织和来自 肺癌细胞系NCI-H460 (ATCC, Virginia, MA)的细胞免疫小鼠之后，获得小 鼠单克隆抗体H460-16-2。H460-16-2抗原在来自不同组织的广泛范围的人 细胞系的细胞表面上表达。乳腺癌细胞系MDA-MB-231 (MB-231)和皮肤 癌细胞A2058在体外对H460-16-2细胞毒性效应敏感。
在细胞培养中H460-16-2对MB-231细胞的细胞毒性结果通过在其被 植入小鼠时对这些癌细胞的抗肿瘤活性得以进一步延伸(如S.N. 10/603,000中公开的)。临床前异种移植肿瘤模型被认为是治疗功效的有效 预测。
在人乳腺癌的预防性体内模型中，在治疗期间，H460-16-2治疗比同 种型对照抗体显著(pO.OOOl)更有效地抑制肿瘤生长。在治疗期结束时， 接受H460-16-2的小鼠的肿瘤生长只有对照组的1.3%。在治疗后的后续期 间，H460-16-2的治疗效应继续维持，且直到测量期结束，治疗组的平均 肿瘤体积一直显著地小于对照组。使用存活作为抗体功效的度量标准，据 估计在治疗后的70天，H460-16-2治疗组中的死亡风险是抗体缓冲液对 照组的大约71 % (p=0.028)。这些数据说明H460-16-2治疗与对照治疗组 相比赋予了存活益处。由于没有诱导任何毒性迹象，包括体重降低和临床 痛苦，H460-16-2治疗似乎是安全的。因此，H460-16-2治疗是有效的，因 为在充分成熟的人乳腺癌模型中，它与对照治疗组相比延缓了肿瘤的生长并提高了存活。
此外，H460-16-2在成熟体内肿瘤的模型中证明了对MB-231细胞的 抗肿瘤活性(如S.N. 10/603,000中公开的)。将使用H460-16-2的治疗和 标准化疗药物顺铂进行了比较，比较显示顺铂和H460-16-2治疗组和接受 抗体稀释缓冲液或同种型对照抗体治疗的组相比具有显著更小的平均肿 瘤体积(pO.OOl)。 H460-16-2治疗介导了大约为顺铂化疗的2/3的肿瘤抑 制但没有顺l白治疗中观察到的显著的(19.2%)体重降低(p< 0.003)和临 床痛苦，包括在顺铂治疗中观察到的2例治疗相关的死亡。H460-16-2的 抗肿瘤活性及其最小化的毒性使其成为一种具有吸引力的抗癌治疗试剂。
在治疗后阶段，H460-16-2显示了显著的存活益处(pO.02)，因为在治 疗后的〉70天，H460-16-2组的死亡风险大约是同种型对照抗体组的一 半。观察到的存活益处持续到治疗后的120天，其时相比67。/。的H460-16-2 治疗组，100%的同种型对照和顺铂治疗的小鼠死亡。和同种型对照抗体组 相比，通过以26 %延缓肿瘤生长，H460-16-2维持对肿瘤的抑制。在治 疗后的31天，H460-16-2通过以相对于同种型对照组以48%减慢肿瘤生长 从而限制肿瘤体积，这和在治疗结束时观察到的49%的降低相当。在乳腺 癌的成熟肿瘤模型中，这些结果意味着H460-16-2在治疗期以外维持肿瘤 抑制的潜力且证明了该抗体在哺乳动物体内降低肿瘤负荷和提高存活的 能力。
除了在乳腺癌的成熟体内肿瘤模型中的有益效果，H460-16-2治疗与 化疗药物(顺铂)的组合在前列腺癌的成熟体内模型中具有针对PC-3细 胞的抗肿瘤活性(如S.N. 10/810,165中公开的)。利用配对t-检验， H460-16-2加顺铂的治疗与缓冲液对照(pO.OOOl)，单独的顺铂治疗 (p-0.004)或单独的H460-16-2治疗(pO.0001)相比，在治疗期后不久显著更 有效抑制肿瘤生长。在治疗期结束时，施用H460-16-2加顺铂的小鼠具有 仅生长至缓冲液对照组的28.5%的肿瘤。对于PC-3 SCID异种移植模型， 体重可以用作疾病进展的代用指示。所有组的小鼠均经历严重的体重减 少。在该研究中，所有组中的小鼠在治疗期结束时显示出约23-35%的体 重减少。用H460-16-2治疗的组显示最小程度的体重减少(21.7%)。治疗后， 第48天，与缓冲液对照相比，不存在与H460-16-2和顺铂治疗相关的显著体重增加(p^.5042)。因此，H460-16-2加顺铂的治疗是有效的，因为其 在人前列腺癌的充分成熟模型中，与同种型对照治疗组相比，延缓肿瘤生 长。
为了证实H460-16-2表位是药物靶标，此前确定了 H460-16-2抗原在 正常人体组织中的表达(S.N. 10/603,000)。通过与抗CD44抗体；克隆 L178 (如S.N. 10/647,818中公开的)和克隆BU75 (如S.N. 10/810,165中 公开的)的比较，此项工作得到了扩展。通过H460-16-2的IHC染色，大 部分组织未能表达H460-16-2抗原，包括要害器官，如肝、肾(管状上皮 细胞的边缘染色除外)、心脏和肺的细胞。组织染色的结果意味着 H460-16-2呈现对各种细胞类型的受限结合但与浸润性巨噬细胞、淋巴细 胞和成纤维细胞结合。BU75抗体显示了相似的染色模式。然而，注意到 至少一种差别；和H460-16-2相比，BU75对淋巴细胞的染色更强。
H460-16-2抗原的定位及其在人群诸如乳腺癌患者中的普遍性的确定 对评价H460-16-2的治疗用途和设计有效临床试验是重要的。为了弄清 H460-16-2抗原在癌症患者乳腺肿瘤中的表达，之前筛选来自50名乳腺癌 患者的肿瘤组织样品，以确定H460-16-2抗原的表达(S.N. 10/603,000)，并 与L178 (S.N. 10/647,818), BU75 (S.N. 10/810,165)和抗Her2抗体c-erbB-2 (S.N. 10/810,165)进行比较。这些研究的结果相似并显示出62%的组织样品 是H460-16-2抗原染色阳性的而73。/。的乳腺肿瘤组织是BU75表位阳性的。 在患者样品中H460-16-2的表达似乎对癌细胞具有特异性，因为染色局限 于恶性细胞。H460-16-2染色了 IO份来自乳腺癌患者的正常组织样品中的 4份，而BU75染色了 8份。H460-16-2和BU75抗原的乳腺肿瘤表达似乎 主要定位在恶性细胞的细胞膜上，使CD44成为具有吸引力的治疗靶标。 基于激素雌激素和孕酮的受体在乳腺肿瘤中的表达对H460-16-2的表达进 行了进一步的评估，这两种激素受体在乳腺肿瘤的发展、治疗和预后中发 挥重要作用。在H460-16-2抗原表达和雌激素或孕酮受体表达之间没有明 显的关联性。当根据肿瘤的阶段或癌症发展的程度分析肿瘤时，再一次地， 在H460-16-2抗原表达和肿瘤阶段之间没有清晰的关联。使甩BU75获得 了相似的结果。与c-erbB-2相比，H460-16-2显示完全不同的染色特征， 其中对H460-16-2抗原显阳性的乳腺肿瘤 织样品的52%对Her2表达显阴性，这显示对乳腺癌患者至今未满足的靶治疗需要。在对H460-16-2和Her2均显阳性的乳腺肿瘤组织切片之间也存在染色强度的差别。c-erbB-2抗体也阳性染色正常乳腺组织切片之一。
为了进一步扩展H460-16-2的潜在治疗益处，此前确定了抗原在各种人癌症组织中的频率和定位(S.N. 10/603,000)并与克隆L178 (S.N.10/647，818)进行比较。这些肿瘤类型中的大部分对L178抗原也是阳性的。和人乳腺肿瘤组织一样，H460-16-2和L178的定位发生在肿瘤细胞的细胞膜上。然而，和H460-16-2相比，L178中存在基本更多的膜定位。同样的，在由H460-16-2和L178染色的肿瘤类型中，43 X的组织对L178抗体显示了更高强度的染色。
另外，此前确定了抗原在前列腺和肝正常组织和癌症组织中的频率和定位(S.N. 11/364,013)。由前列腺癌阵列，19/53 (36%)测试的肿瘤对H460-16-2显阳性。H460-16-2特异于肿瘤细胞和基质成纤维细胞。细胞定位主要在膜和细胞质膜，其具有或不具有腔定位。阳性细胞的百分比范围是<10% - >50%，这显示抗体与肿瘤细胞的异源结合。不能严格评估抗体结合与肿瘤阶段的关系，这归因于不同肿瘤阶段中肿瘤数量的差异，对于I, II, III和IV期分别是1/1 (100%), 4/12 (33%), 0/2 (0%)禾口 11/33 (33%)。存在对Gleason分数G3-G4 (36%)比对Gl-G2 (25%)更高的结合。Gleason分数是分级前列腺癌的系统。Gleason分级系统对组织样品中的两个最大面积的癌症指定级别。级别范围是l-5， l是最小入侵的，且5是最大入侵的。3级肿瘤，例如，很少转移，但是转移在4级或5级中普遍。然后将这两级加在一起产生Gleason分数。认为分数2-4是低级；5-7是中级；且8-10是高级。具有低Gleason分数的肿瘤典型地生长足够慢以致可能不造成对患者寿命的显著威胁。所有3份正常前列腺组织切片对抗体显阳性。然而，组织特异性针对肌上皮和基质成纤维细胞且忽略腺上皮。图12示范H460-16-2与测试的前列腺肿瘤结合的不均匀性10/53， 6/53， 3/53的阳性肿瘤分别在<10-10% 、 <50-50%和>50的分类中。作为其结合前列腺癌细胞的结果，H460-16-2的治疗益处可以潜在地扩展到治疗前列腺癌。
由肝癌阵列，H460-16-2抗体显示与21/49 (43%)测试肝癌结合，包括11/37 (30%)原发性的，7/8 (88%)转移性肝细胞癌，1/2 (50%)原发性和2/2
26(100%)转移性胆管癌。与早期i和n相比，抗体显示出对晚期肿瘤III和IV期显著更高的结合(p = 0.03) [I期，0/2 (0%); II期，2/17 (12%); III期，8/16(500/。)和IV期，6/8 (75%)]。 H460-16-2特异于肿瘤细胞并浸润炎性细胞。细胞定位主要在膜。 一些肿瘤也展示扩散细胞质染色模式。抗体与9/9的非-赘生性肝组织结合。然而，结合局限于血窦细胞并浸润淋巴细胞。H460-16-2抗原似乎特异性表达在晚期肝肿瘤组织上。H460-16-2因此在治疗肝癌中具有作为治疗药物的潜力。
根据与文献中的IHC数据的比较，似乎没有CD44的形式与本文中出现的IHC数据精确匹配。CD44的标准形式通常在人脑中表达；H460-16-2抗原不在人脑中表达。针对全CD44同种型的抗体不对肝(包括Kuppfer细胞)发生染色且对生殖周期的所有阶段中的子宫内膜腺阳性染色。H460-16-2抗原清晰地存在于Kuppfer细胞上且仅存在于生殖周期的分泌性子宫内膜腺上。H460-16-2抗原清楚地存在于组织巨噬细胞上且仅有变体形式V4/5和V8/9显示出偶尔的巨噬细胞染色。与抗CD44L178和现在的BU75相比，观察到的H460-16-2相似但不同的结合模式，说明H460-16-2抗原是CD44的独特表位。
如以前公开地(S.N. 10/647,818)，额外的生化数据也说明H460-16-2识别的抗原是CD44的一种形式。这得到了研究的支持，研究显示与CD44反应的单克隆抗体(L178)通过免疫沉淀识别与H460-16-2结合的蛋白。Western印迹法研究也提示由H460-16-2识别的CD44的表位不存于v6或v10上。H460-16-2表位也可由于其是碳水化合物和构象依赖性的而被区分，而很多抗CD44抗体是针对CD44的肽部分的。这些IHC和生化结果证明H460-16-2与CD44抗原的变体结合。由此，多数证据显示H460-16-2通过与CD44变体上存在的独特的碳水化合物依赖性构象表位的连接介导抗癌效应。为了本发明的目的，所述表位定义为"CD44抗原部分"，其特征在于与由杂交瘤细胞系H460-16-2编码的单克隆抗体、其抗原结合片段或其抗体缀合物结合的能力。
为了进一步说明H460-16-2的抗癌效应背后的机制，进行了透明质酸(HA)结合测定(如S.N. 10/810,165中所公开的)。确定了需要平均浓度为1.87 (+/- 1.01)微克/mL的H460-16-2抑制MDA-MB-231细胞与HA的50%的粘附。这些结果说明H460-16-2与，至少部分地与CD44上的区域相互作用，所述区域促进与HA的结合并因此通过下调血管发生或肿瘤通过ECM的入侵可以介导其抗癌效应。
除HA结合测定外，进行了细胞周期实验，以确定H460-16-2的体外和体内抗癌效应是否归因于对细胞周期的调节(如S.N. 10/810,165中所公开的)。24小时和使用20微克/mLH460-16-2后，与同种型对照相比，存在MDA-MB-231凋亡细胞数量的增加。该效应还似乎是剂量依赖性的。因此，H460-16-2的功效可能也全部或部分地归因于其凋亡诱导能力。
为了进一步说明H460-16-2的作用机制，研究H460-16-2对在乳腺癌异种移植模型中体内生长的MDA-MB-231肿瘤中的凋亡的作用(如S.N.11/364,013中公开的)。凋亡细胞利用形态学标准诸如单细胞的消除、细胞收縮和染色质压缩为致密质(dense mass)计算。缓冲液对照处理组产生平均总分为17个细胞(士 5.29)，而H460-16-2处理组产生平均总分为22.5个细胞(±4.20)。因此，如利用细胞形态学所确定地，使用H460-16-2治疗
倾向于增加凋亡。
生成两种嵌合形式的H460-16-2，如在S.N. 11/364，013中所公幵地。一种形式是同种型IgGl，即K((ch)ARH460-16-2-IgGl)，且另一种是同种型IgG2，即K((ch)ARH460-16-2-IgG2)。来自嵌合的IgGl和嵌合的IgG2-分泌克隆的上清液能够利用类似于对鼠科H460-16-2获得的信号，在Western印迹法中检测CD44 (如S.N. 11/364,013中所公开的)。
这两种嵌合抗体均在乳腺癌的成熟模型中与鼠科形式的H460-16-2相比较(如S.N. 11/364,013中所公开的)。鼠科H460-16-2和(ch)ARH460-16-2-IgGl均在人乳腺癌的成熟MDA-MB-231体内模型中减少肿瘤的生长。在第62天，即施用最后剂量后5天，使用H460-16-2的治疗导致39%的肿瘤生长抑制(平均T/C = 57%)。这种肿瘤生长的减少与对照显著不同^=0.0037)。嵌合抗体(ch)ARH460-16-2-IgGl导致64%的增强的肿瘤生长抑制(TGI)(平均170 = 26.9%; <0.0001)。相反，嵌合抗体的lgG2形式，即(ch)ARH460-16-2-IgG2在与缓冲液对照相比较时，没有显示出肿瘤生长的抑制(TGI = 0%;平均T/C = 122%; p=0.7264)。
进行膜联蛋白-V染色确定H460-16-2的嵌合形式是否能够以与鼠科副本相同的方式在MDA-MB-231人乳腺癌细胞系上诱导凋亡(如S.N.11/364,013中所公开的)。发现用同种型对照处理的细胞的自发凋亡效应类似于仅用赋形剂处理的细胞。在每次实验中，发现鼠科和人嵌合IgGl和IgG2H460-16-2抗体都在乳腺癌细胞系中以剂量依赖性方式诱导凋亡，对(ch)ARH460-16-2 IgGl和IgG2抗体观察到更高的凋亡效应。结果说明在体外(ch)ARH460-16-2-IgG2抗体在与嵌合IgGl抗体相比时，具有最大的凋亡效应。全部3种抗体显示出超过其预期的同种型对照的％坏死和坏死/凋亡数量的增加。对(ch)ARH460-16-2-IgG2观察到最大的％坏死和坏死/凋亡数量的增加，其次是(ch)ARH460-16-2-IgGl，再其次是H460-16-2。
总之，这些数据说明鼠科和嵌合H460-16-2抗原是癌症相关抗原且在人体中表达，并且是病理相关癌症靶标。此外，这些数据还说明H460-16-2抗体与人癌症组织结合，且可被合适地用于诊断、治疗预测或预后的测定。此外，由于该抗原在绝大多数非恶性细胞中没有表达，该抗原的细胞膜定位是细胞癌症状态的指示，且该发现允许该抗原、其基因或衍生物、其蛋白或其衍生物被用于诊断、治疗预测或预后的测定。
其它涉及抗CD44抗体使用的研究具有H460-16-2所没有呈现的治疗潜力的局限。H460-16-2证实了体外和体内的抗肿瘤活性。此前所述的抗体 如 MAK<CD44>M-1.U2， MAK<CD44>M-2.42.3 和MAK<CD44>M-4.3.16没有属于它们的体外和体内细胞毒性且VFF-18与MabU36显示没有固有的肿瘤细胞毒性。此外，呈现了体内肿瘤效应的其它抗CD44抗体也具有在H460-16-2上不明显的某些局限。例如，ASMLl.l、 K926、抗CD44禾B IM-78.1分别显示了对大鼠、鼠科、异种移植模型中生长的大鼠和鼠科肿瘤的体内抗肿瘤活性。H460-16-2在人体癌症模型中证实了抗肿瘤活性。H460-16-2也针对人CD44而抗体如ASMLl.l仅识别大鼠CD44。克隆515抗CD44抗体的确抑制人卵巢细胞系的腹膜肿瘤移植但不阻止或抑制肿瘤的生长。H460-16-2在SCID小鼠异种移植模型中能够抑制人乳腺肿瘤的生长。GKW.A3是抗人CD44单克隆抗体，其能够在预防性但非成熟模型中抑制在小鼠中生长的人转移性黑素瘤的肿瘤生长。H460-16-2己在人乳腺癌的预防性和成熟的鼠科异种移植模型中证实了显著的抗肿瘤活性。因此，很明显，H460-16-2和此前所
29述的抗CD44抗体相比具有更好的抗肿瘤性质。其在SCID小鼠的人乳腺 肿瘤上的体外和体内抗肿瘤活性己被证实并且靶向人CD44。该抗体还在 人乳腺癌的预防性和成熟(更临床相关的)模型中呈现了活性，且该抗体 在人前列腺癌成熟模型中与顺铂一起呈现出活性。
本发明描述了 H460-16-2的发展和使用，所述H460-16-2是通过专利 US 6,180,357中所述方法开发的，和通过其在细胞毒性测定中、在动物模 型中肿瘤生长中和在患有癌症的那些患者中延长存活时间中的效应确定 的。
本发明描述了癌症治疗领域中的一个进步，因为其描述了与靶分子， CD44上存在的一个或多个表位特异性结合，并在人肝癌体内模型中直接 介导对肿瘤生长和转移的抑制的试剂。本文中的大多数证据证明嵌合 H460-16-2通过与在肝癌上表达的CD44上存在的表位的连接，介导抗癌 效应，这应该被广泛理解为包括任何由肝细胞产生的原发性或转移性肿瘤 位点。该申请证明利用转移性对比原发性人肝癌细胞系观察CD44的表达。 本发明还公开嵌合H460-16-2较小肿瘤负荷和人肝癌体内转移的可能性。
这与任何其他以前所述的抗-CD44抗体相比是一个进步，因为没有抗 体显示出具有相似性质。它还提供本领域中的进步，因为其清楚地证明 CD44直接参与与某些类型的肿瘤的生长和发育相关的事件。它还代表癌 症治疗中的进步，因为其具有在人患者中展示类似抗癌性质的潜力。另一 种进步是抗癌抗体文库中包含这些抗体应该通过确定不同抗癌抗体的组 合，提高靶向表达不同抗原标记的肿瘤的可能性，从而发现在靶向和抑制 肿瘤生长和发育中最有效的。
总之，本发明教导了 H460-16-2抗原作为治疗试剂靶标的应用，该试 剂在施用时能够降低哺乳动物体内表达该抗原的癌症的肿瘤负荷(由此延 缓疾病进展)和哺乳动物体内表达该抗原的癌症转移的可能性，并还能够 导致治疗的哺乳动物延长的存活。本发明还教导了 CDMAB(H460-16-2) 及其衍生物、配体及其可以结合片段在靶向其抗原以降低哺乳动物内表达 该抗原的癌症的肿瘤负荷和延长患有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的寿 命中的应用。此外，本发明还教导了在癌细胞中检测H460-16-2的用途， 其可被用于对患有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的诊断、治疗预测和预
30后。
因此，本发明的一个目的是利用产生针对来源于特定个体的癌性细胞
或一种或多种特定的癌症细胞系的减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)的方法， 以分离杂交瘤细胞系，和所述杂交瘤细胞系编码的相对应的分离的单克隆 抗体及其抗原结合片段，所述CDMAB对于癌症细胞是细胞毒性的，但是 同时对于非癌性细胞相对是无毒的。
本发明的另一个目的是教导减轻癌性疾病的抗体，其配体和抗原结合 片段。
本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，其细胞毒性通过抗 体依赖性细胞毒作用介导。
本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，其细胞毒性通过补 体依赖性细胞毒作用介导。
本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，其细胞毒性是它们 催化细胞的化学键水解的能力的功能。
本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，所述抗体有效用于 癌症诊断、预后和监测的结合测定。
本发明的其它目的和优点将通过下述描述变得清楚，其中通过举例说 明和实施例的方式描述本发明的某些实施方案。


本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在提出要求并支付了必要 费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的复印 件。
图1结合在人肝肿瘤和正常组织微阵列上的H460-16-2的总结。 图2是来自人组织微阵列的代表性显微图，其显示利用H460-16-2 (A) 或同种型对照抗体(B)获得的在肝肿瘤组织上和利用H460-16-2 (C)或同种 型对照抗体(D)获得的在非-赘生性肝组织上的结合模式。H460-16-2对肿 瘤细胞展示强阳性染色，并仅限于对血窦细胞的染色(黑色箭头)并浸润 非-赘生性肝组织上的淋巴细胞(绿色箭头)。放大倍数是200倍。
图3显示CD44过表达和多种HCC细胞系转移潜力之间的相关性。图4显示(ch)ARH460-16-2-IgGl在成熟同位HCC肿瘤模型中对HCC 肿瘤生长和转移的影响。数据点表示平均值+ASEM。
图5显示(ch)ARH460-16-2-IgGl在成熟同位HCC肿瘤模型中对肿瘤 生长的定量影响。柱状图总结来自四组动物的肿瘤的的平均基础信号，以 光子/s/cm"steridian为单位。每个柱表示肿瘤接种后第45天时的平均基础 水平信号。
图6在视觉上显示(ch)ARH460-16-2-IgGl在成熟同位HCC肿瘤模型 中对原发性肿瘤生长的影响。
图7是在有或无抗体处理的条件下发展的不同转移数量的表格。
发明详述
一般地，以下词语或短语在概述、说明、实施例、和权利要求中使用 时具有指定的定义。
术语"抗体"以最宽泛的意义使用，并且特别涵盖，例如，单一的单 克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、和中和抗体、去免疫的(de-immunized)、 鼠、嵌合的或人源化的抗体)，具有多表位特异性的抗体组合物，单链抗 体，双抗体，三链抗体，免疫缀合物和抗体片段(见下文)。
当用于本发明时，术语"单克隆抗体"是指从一群基本上均一的抗体 获得的抗体，即，除了可能以较少量存在的可能天然存在的突变之外，包 括所述群体的个体抗体是相同的。单克隆it体是高度特异性的，针对单一 的抗原位点。此外，多克隆抗体制剂包括针对不同决定簇(表位)的不同 抗体，与所述多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决 定簇。除了它们的特异性，因为单克隆抗体可以不被其它抗体污染地合成， 所以单克隆抗体是有利的。修饰词"单克隆"表示该抗体的特征是从基本 上均一的抗体群体获得，并且不被解释为抗体的生产需要通过任何特定的 方法。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等^然 (7VamreJ, 25(5:邦5 (1975)首先描述的杂交瘤(鼠或人)方法制备，或可 以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制备。"单克隆 抗体"还可以使用例如Clackson等，^然(7V自e入352:624-628 (1991) 和Marks等，分子主激,染,志a Mo/.历o/.入222:581-597 (1991)中所述的技术，从噬菌体抗体文库分离。
"抗体片段"包括完整抗体的一部分，优选地包括其抗原-结合或可
变区。抗体片段的实例包括小于全长的抗体，Fab，Fab，， F(ab，)2,和Fv片 段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；单链抗体，单结构域抗体分子，融 合蛋白，重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。
"完整的"抗体是一种这样的抗体，其包括抗原-结合可变区以及轻 链恒定结构域(CO和重链恒定结构域CH1、 CH2和CH3。恒定结构域可以 是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列 变体。优选地，完整的抗体具有一种或多种效应子功能。
根据它们重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将完整抗体分成不同的 "种类"。存在五种主要类别的完整抗体IgA, IgD, IgE， IgG,和IgM，且 这些中的一些可以进一步分成"亚类"(同种型)，例如，IgGl,IgG2,IgG3， IgG4， IgA，和IgA2。对应于不同类型抗体的重链恒定结构域分别称为ot， 5， 和P。不同类型免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的。 抗体"效应子功能"指属于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列 可变Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括Clq结合； 补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性 (ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调
等坐
"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性"和"ADCC"是指细胞介导的反应， 其中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK) 细胞，嗜中性粒细胞，和巨噬细胞)识别在靶细胞上的结合的抗体，并且 随后引起该耙细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，即NK细胞，仅表达 FcyRIII，而单核细胞表达FcyRI， FcyRII和FcyRIIL FcR在造血细胞上的 表达总结在Ravetch和Kinet，免疫学年度综述"画.T ev. /腦國/J 9:457-92 (1991)的第464页表3中。为了评估目的分子的ADCC活性，可 以进行体外ADCC测定，诸如在美国专利号5,500,362或5,821,337中所述 的测定。对于所述测定有用的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和 天然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外地，目的分子的ADCC活性可以在 体内进行评估，例如，在动物模型中，诸如在Clynes等.户7VAS (USA)
3395:652-656 (1998)中公开的动物模型中。
"效应子细胞"是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。 优选地，该细胞表达至少FcYRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC 的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、 单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞是优 选的。效应子细胞可以从其天然来源分离，例如从如本文中所述的血液或 PBMC中分离。
术语"Fc受体"或"FcR "用于描述结合抗体Fc区的受体。优选的 FcR是天然序列人FcR。而且，优选的FcR是结合IgG抗体的受体(y受 体)并包括FcyRI, FcyRII，和Fey RIII亚类的受体，包括这些受体的等位基 因变体和备选剪接形式。FcYRI1受体包括Fc，nA("激活受体")和FcryRIIB
("抑制受体")，它们具有主要在它们的细胞质结构域不同的相似的氨基 酸序列。激活受体Fc丫RIIA在其细胞质结构域包含免疫受体基于酪氨酸的 激活基序(ITAM)。抑制受体FcyRIIB在其细胞质结构域包含免疫受体基于 酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见在M. Dagron，免疫学年度综述 i ev./附wm"o/.) 15:203-234(1997)中的综述)。FcRs在Ravetch和Kinet,免 疫学年度综述(Annu. Rev. Immunol) 9:457-92 (1991); Capd等，竟疫学^T^
(7mm,om"/2o^;> 4:25-34 (1994);和de Haas等,^^l^皇游^",学^^志" 丄W. Me^U 126:330-41 (1995)中综述。其它FcRs，包括将在将来鉴定 的那些，包含在本发明的术语"FcR"中。该术语还包括新生受体，FcRn， 其负责将母亲的IgGs转运到胎儿(Guyer等，^疫学J^志O！ /mmimo/J 117:587 (1976)和Kim等，欲///,疫学染志fEur. J /mm柳o/J 24:2429 (1994))。
"补体依赖性细胞毒性"或"CDC"是指分子在存在补体的条件下裂解 靶点的能力。补体激活途径通过补体系统的第一补体(Clq)同与同源抗原复 合的分子(例如，抗体)的结合而起始。为了评估补体激活，可以进行 CDC测定，例如，如在Gazzano-Santoro等，免瘦学^"法^^若a/mm柳o/. MeAod^ 202: 163 (1996)中所述。
术语"可变"是指这样的事实，即，在抗体之间，某些可变结构域的 部分在序列上大量不同，并且其用于每种特定的抗体对于其特定的抗原的结合和特异性。然而，在抗体的整个可变结构域中可变性不是均匀分布的。 它集中在在轻链和重链可变区内称为高变区的三个片段中。可变结构域的
更高度保守的部分称为构架区(FRs)。天然重链和轻链的可变结构域分别包 括4个FRs，其主要采取(3-折叠构型，通过三个高变区连接，其形成环连 接，并且在某些情形中形成P-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过 FRs紧密相邻保持在一起，并且与另一条链的高变区一起有助于形成抗体 的抗原-结合位点(见Kabat等,^^学^邀游歪^游 "e^em^ 尸rafe/ra1 0/7附附""0/6^'(^//"&^5^ ,第5版.公共卫生月艮务(Public Health Service),全国卫生研究所(National Institutes of Health) , Bethesda, Md. (1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出多种效应 子功能，诸如在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)中的抗体参与。
当用于本发明时，术语"高变区"是指抗体负责抗原结合的氨基酸残 基。高变区通常包括来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如，在 轻链可变结构域中的残基24-34 (LI), 50-56 (L2)和89-97 (L3)和在重链可 变结构域中的31-35 (HI), 50-65 (H2)和95-102 (H3); Kabat等，^瘦学,邀
共卫生服务(Public Health Service),全国卫生研究所(National Institutes of Health) ,Bethesda，Md.(1991))和/或来自"高变环"的那些残基(例如，在 轻链可变结构域中的残基2632 (Ll)， 50-52 (L2)和91-96 (L3)和在重链可 变结构域中的26-32 (HI), 53-55 (H2)和96-101 (H3); Chothia和Lesk，分子 生物学杂志(J Mo/. 5/o/./l96:901-917(1987))。"构架区"或"FR"残基是除 了如本文所定义的所述高变区残基之外的那些可变结构域残基。木瓜蛋白 酶消化抗体产生两种相同的抗原-结合片段，其称为"Fab"片段，每个具有 单个抗原-结合位点，并且产生残留的"Fc"片段，它的名称反应了它容易结 晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原-结合位点， 并且仍然能够交联抗原。
"Fv"是包含完整的抗原-识别和抗原-结合位点的最小抗体片段。该区 域由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。 正是在这种构型中每个可变结构域的三个高变区相互作用，以限定在 Vh-Vl二聚体表面上的抗原-結合位点。笼统地，6个高变区赋予抗体的抗
35原-结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包括对抗原特异的3 个高变区的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管是以比完整的
结合位点低的亲和力结合。Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第 一恒定结构域(CHI)。 Fab，片段不同于Fab片段，其通过在重链CH1结构 域的羧基端添加几个残基而不同，所述添加的残基包括来自抗体铰链区的 一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本发明中是Fab'的名称，其中恒定结构 域的半胱氨酸残基携带至少一个游离的巯基(thiol)基团。F(ab，)2抗体片 段最初作为一对Fab，片段产生，其在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片 段的其它化学偶联也是已知的。
基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎物种的抗体的 "轻链"可以被指定为两种明显不同的类型中的一种，所述两种明显不同 的类型称为kappa (k)和lambda (X)。
"单链Fv"或"scFV，抗体片段包括抗体的Vh和Vt结构域，其中这些 结构域存在于单一的多肽链中。优选地，Fv多肽还包括在Vh和V^结构 域之间的多肽连接体，其使得scFv能够形成用于抗原结合的理想结构。 对于scFv的综述，参见Pliickthun，在卓克燈贫沐游药湮学(7726 尸/zarwaco/og7 o/Mowoc/o"a/ Jw/z'Z c^z.es )中，巻113, Rosenburg禾口 Moore编, Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994)。
术语"双抗体"是指具有两个抗原-结合位点的小抗体片段，所述片
段包括与在同一多肽链(vh-vo中的可变轻链结构域(vo连接的可变重链 结构域(vh)。通过使用太短而不允许在同一条链中的两个结构域之间成对 的连接体，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域成对，并且产生两个
抗原-结合位点。例如，在EP404,097;WO 93/11161;禾口 Hollinger等，夷房 ^^弃学腐学叛Ato/.OS^j , 90:6444-6448 (1993)中更充
分地描述了双抗体。
术语"三链抗体"或"三价三聚体"指三个单链抗体的组合。三链抗
体使用v!^或vh结构域的氨基酸末端构建，即无任何连接体序列。三链抗
体具有三个Fv头部，其中多肽以环形、头到尾的方式排列。三链抗体的 可能构象是平面的，其具有位于平面上彼此成120度角的三个结合位点。 三链抗体可以是单特异性、双特异性或三特异性的。"分离的"抗体是一种已经被鉴定并且与其天然环境的成分分离和/ 或从中回收的抗体。它的天然环境的污染成分是将干扰抗体的诊断或治疗 应用的物质，并且可以包括酶、激素、和其它蛋白样或非蛋白样溶质。因 为将不存在抗体天然环境的至少一种成分，分离的抗体包括在重组细胞内 原位的抗体。然而， 一般地，分离的抗体应该通过至少一个纯化步骤制备。 与目的抗原如CD44抗原性部分"结合"的抗体是一种能够以充足的 亲和力结合所述抗原的抗体，以便所述抗体通过靶向表达所述抗原的细胞
而有效用作治疗或诊断剂。在所述抗体是一种结合CD44抗原性部分的抗 体的情形中，与其它受体相反，它通常优先结合CD44抗原性部分，并且 不包括偶然发生的结合，如非特异性Fc接触，或不包括其它抗原所常见 的与翻译后修饰结合，并且可以是一种不与其它蛋白显著交叉反应的抗
体。用于检测与目的抗原结合的抗体的方法在本领域中是公知的，并且可 以包括，但不限于，如FACS、细胞ELISA和Western印迹的测定。
当用于本发明时，表述"细胞"、"细胞系"和"细胞培养物"可以互 换地使用，并且所有这样的名称包括后代。还应该理解，由于故意的或偶 然的突变，所有的后代在DNA内容物上可能不是精确相同的。包括在初 始转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的突变的后代。这将通 过使用不同名称的上下文变得清楚。
"治疗或处理"是指治疗性治疗和预防或预防性措施，其中目的是预 防或减缓(减轻)目的病理症状或病症。需要治疗的那些包括已经患有病 症的那些.，以及倾向于患有病症的那些，或要预防病症的那些。因此，在 本发明中待治疗的哺乳动物可以已经诊断患有病症或可以是倾向于或易 受病症影响的。
术语"癌症"和"癌性的"是指或描述哺乳动物中的生理状况，所述 生理状况的典型特征在于失控的细胞生长或死亡。癌症的实例包括，但不 限于，癌，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤，和白血病或淋巴恶性病。所述癌症 的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)，肺癌，包括 小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃 的或胃癌(gastric or stomach cancer)，包括胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞
瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠
37癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾脏或肾癌，前列腺 癌，阴道癌，甲状腺癌，肝的癌症，肛门癌，阴茎癌，以及头颈癌。
"化疗药"是有效用于治疗癌症的化学化合物。化疗药的实例包括烷
基化试剂，如塞替哌和环磷酰胺(CYTOXANTM);烷基磺酸酯如白消安， 英丙舒凡，哌泊舒凡；吖丙啶类如苯佐替派(benzodopa),卡波醌，美妥 替哌(meturedopa),禾卩乌瑞替哌(uredopa);氮丙啶禾口 methylamelamines， 包括六甲蜜胺，曲他胺，三亚乙基磷酰胺，塞替哌 (triethylenethiophosphoramide)禾卩三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮 芥 (nitrogen mustards ) 如苯丁酸氮芥,萘氮芥 (chlornaphazine), cholophosphamide,雌莫司汀，异环磷酰胺，氮芥(mechlorethamine),盐 酸氧氮芥，美法仑，新氮芥，苯芥胆甾醇，泼尼莫司汀，曲磷胺，乌拉莫司 汀；亚硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀， 尼莫司汀，雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素(aclacinomysins),放线菌素， authramycin,偶氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C, calicheamicin, carabicin, carnomycin，
嗜癌霉素，色霉素，放线菌素D,柔红霉素，地托比星，6-重氮 -5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星，伊达比星，马塞罗 霉素，丝裂霉素，麦考酚酸，诺拉霉素，橄榄霉素，培洛霉素，potfiromydn， 嘌罗霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑霉素，链佐星，杀结核菌素，乌苯 美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢物如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶 酸类似物如den叩terin,甲氨喋呤，喋罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达 拉滨，6-巯嘌呤，thiamiprine,硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨，阿扎胞苷， 6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿 苷，5-FU;雄激素诸如卡普睾酮，屈他雄酮丙酸盐，环硫雄醇，美雄垸，睾 内酉旨；抗肾上腺药(anti-adrenals)如氨鲁米特，米托坦，曲洛司i旦；叶酸补 偿物如frolinic acid;醋葡醛内酯；羟醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside) ; 5-氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil;比生群；依达曲沙 (edatraxate) ; defofamine;秋水仙胺；地吖酉昆；elformithine;依利醋铵；依 托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫 哌达醇；尼曲吖啶;喷司他丁；异丙嗪(phe匪et);吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide);丙卡巴肼；PSK⑧；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2，,2"-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan);长春地 辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷； gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");环磷酰胺；塞替哌；紫杉垸类，例如，紫 杉醇(TAXOL⑧，Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,新泽西)和多西 他赛(TAXOTERE⑧，Aventis, Rhone-Poulenc Rorer， Antony,法国)；苯丁酸 氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物如顺铂和卡钼； 长春碱；钼；依托泊苷(YP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C;米托蒽醌；长春 新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵(novantrone);替尼泊苷；道诺霉素；氨 喋呤；适罗达；伊班膦酸盐；CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟甲 基鸟氨酸(DMFO);视黄酸；esperamicins;卡培他滨；以及任何上述物质的 药用盐、酸或衍生物。下列物质也包含在本定义中，它们是作用调控或 抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药剂，诸如抗雌激素药，包括例如他莫昔 芬，雷洛昔芬，抑制芳香酶的4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬， keoxifene， LY117018,奥那司酮，和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素药诸 如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及任何上述物 质的药用盐、酸或者衍生物。
用于治疗目的的"哺乳动物"是指分类为哺乳动物的任何动物，包括 人，小鼠，SCID，或裸鼠或小鼠品系，家畜和农场动物，以及动物园、运 动或宠物动物，诸如绵羊、狗、马、猫、牛、等等。优选地，所述哺乳动 物是人。
"寡核苷酸"是长度短的、单链或双链的多脱氧核苷酸，其通过已知 方法化学合成(如磷酸三酯、亚磷酸酯、或亚磷酰胺化学，使用固相技术， 如在1988年5月4日公布的EP 266,032中所述的，或通过脱氧核苷H-磷 酸酯中间物，如Froehler等，樣虔薪秀f7Vz/c/. Jc/A i 仏入14:5399-5407, 1986所述)。然后在聚丙烯酰胺凝胶上纯化它们。
按照本发明，非人(例如鼠)免疫球蛋白的"人源化的"和域"嵌合 的"形式是指这样的抗体，所述抗体包含特异的嵌合免疫球蛋白、免疫球 蛋白链或其片段(如Fv， Fab， Fab，, F(ab，)2或抗体的其它抗原-结合亚序列)， 与原始抗体相比较，其导致人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA) 或人抗-人抗体(HAHA)反应的减少，并且所述抗体包含来源于所述非人免疫球蛋白的、对再现所需要的作用是必需的必需部分(例如， 一个或多个 CDR(S)、抗原结合区、可变结构域等)，同时保留与所述非人免疫球蛋白 相当的结合特征。对于大部分，人源化的抗体是这样的人免疫球蛋白(受
体抗体)，其中来自该受体抗体互补决定区(CDRs)的残基被来自非人物种
(供体抗体)CDRs的、具有需要的特异性、亲和性和能力的残基取代， 所述非人物种如小鼠、大鼠或兔。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv构 架区(FR)残基被相对应的非人FR残基取代。此外，所述人源化的抗体可 以包括在受体抗体和在所引入的CDR或FR序列中都找不到的残基。进行 这些修饰以进一步限定和最优化抗体性能。通常，所述人源化的抗体应该 包括基本上不少于至少一个、和典型地两个可变结构域，其中所有或基本 上所有的CDR区与非人免疫球蛋白的那些相对应，并且所有或基本上所 有的FR残基是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗体任选地还 应该包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒 定区。
"去免疫的(De-immunized)"抗体是对于给定的物种是无免疫原性的 或较少免疫原性的免疫球蛋白。去免疫可以通过抗体的结构改变实现。可 以使用本领域技术人员已知的任何去免疫技术。例如，用于使抗体去免疫 性的一种适宜的技术记述在于2000年6月15日公布的WO 00/34317中。
诱导"凋亡"的抗体是一种通过任何方式诱导程序性细胞死亡的抗体， 所述方式示例而不限于，膜联蛋白V的结合，胱天蛋白酶活性，DNA的 片段化，细胞收縮，内质网膨胀，细胞片段化和/或膜囊泡的形成(称为凋 亡小体)。
用于本文中时，"抗体诱导的细胞毒作用"应该理解为意指源自下列各 项的细胞毒性作用由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的 杂交瘤上清液或抗体，由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生 的分离的单克隆抗体的人源化抗体，由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC 的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体，其抗原结合片段，或抗体 配体，该作用不必须与结合程度有关。
在整个说明书中，备选地，杂交瘤细胞系，以及由其产生的分离的单 克隆抗体，还通过它们的内部名称H460-16-2(鼠科)，(h)ARH460-16-2-IgGl，
40(ch)ARH460-16-2-IgGl,或保藏命名ATCC PTA-4621指示。
用于本文中时，"抗体-配体"包括这样的部分，所述部分表现出针对 靶抗原的至少一个表位的结合特异性，并且其可以是完整的抗体分子、抗 体片段、以及至少具有它的抗原-结合区或部分(即，抗体分子的可变部分) 的任何分子，例如，Fv分子,Fab分子,Fab'分子,F(ab')2分子，双特异性抗 体，融合蛋白，或特异性识别和结合所述抗原的至少一个表位的任何遗传 工程分子，所抗原是通过由名称为ATCC PTA-4621的杂交瘤细胞系产生 的分离的单克隆抗体(ATCC PTA-4621抗原)、由以保藏号PTA-4621保藏 在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体、由以保藏号 PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体、 和其抗原结合片段结合的。
用于本文中时，"减轻癌性疾病的抗体"(CDMAB)指以有益于患者的 方式，例如，通过减小肿瘤负荷或延长携带肿瘤的个体的存活而改善癌性 疾病过程的单克隆抗体，及其抗体-配体。
"CDMAB相关结合试剂"，最广义理解为包括，但不仅限于，任何形 式的人或非人抗体，抗体片段，抗体配体，等，其竞争性结合至少一个 CDMAB耙表位。
"竞争性结合剂"理解为包括具有针对至少一个CDMAB靶表位的结 合亲和力的任何形式的人或非人抗体、抗体片段、抗体配体等。
待治疗肿瘤包括原发性肿瘤和转移性肿瘤，以及不应性(refractory) 肿瘤。不应性肿瘤包括未能响应或对使用单独的化疗试剂、单独的抗体、 单独的辐射或其组合的治疗有抗性的肿瘤。不应性肿瘤还包括似乎受到所 述试剂治疗的抑制但在停止治疗后多至5年，有时多至10年或更长复发 的肿瘤。
可以治疗的肿瘤包括不血管化的，或基本尚未血管化的，以及血管化 的肿瘤。可以由此治疗的实体瘤的实例包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、 胰腺癌、神经胶质瘤和淋巴瘤。所述肿瘤的一些实例包括表皮状肿瘤，鳞 片状肿瘤，诸如头和颈部肿瘤，结肠直肠肿瘤，前列腺肿瘤，乳腺肿瘤， 肺肿瘤，包括小细胞和非小细胞肺肿瘤，胰腺肿瘤，甲状腺肿瘤，卵巢肿 瘤，和肝肿瘤。其他实例包括卡波西肉瘤，CNS瘤，成神经细胞瘤，毛细血管成血管细胞瘤，脑膜瘤和脑转移瘤，黑素瘤，胃肠和肾癌和肉瘤，横 纹肌肉瘤，成胶质细胞瘤，优选成胶质细胞瘤多形性，和平滑肌肉瘤。 用于本文中时，"抗原结合区"意指分子识别靶抗原的部分。
用于本文中时，"竞争性抑制"意指使用常规的交互(reciprocal)抗体竞 龟 |A台fe^^口ai实n么i^^^古辛的:/iiA吝祭/er占 曰n 岀a々a at广厂dta_k，i
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的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(ATCC PTA-4621抗体)、由以保藏号 PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体、 由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的 嵌合抗体、和其抗原结合片段、抗体配体针对所述决定簇位点。(Bdanger L., Sylvestre C.禾口 Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures (通过竞争性禾口夹心式禾呈 序进行关于a胎蛋白的酶联免疫测定).ClinicaChimicaActa48, 15) 用于本文中时，"靶抗原"是ATCC PTA-4621抗原或其一部分。 当用于本文时，"免疫缀合物"意指与细胞毒素、放射性试剂、细胞 因子、干扰素、靶标或报告蛋白部分、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗药剂化 学或生物学连接的任何分子或CDMAB，如抗体。所述抗体或CDMAB可 以在分子的任何位置处与所述细胞毒素、放射性试剂、细胞因子、干扰素、 靶标或报告蛋白部分、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗药剂连接，只要它能够 结合其耙点。免疫缀合物的实例包括抗体毒素化学缀合物和抗体-毒素融合 蛋白。
适合于作为抗肿瘤试剂使用的放射性试剂是本领域中那些技术人员已 知的。例如，使用131I或211At。利用常规技术使这些同位素与抗体附着 (例如，Pedley等，Br. J. Cancer (英国癌症杂志)68,69-73 (1993))。备选 地，与抗体附着的抗肿瘤试剂是激活前药的酶。可以施用前药，所述前药 将保持其无活性形式直到到达肿瘤位点，当施用抗体复合物时，其在该处 转化为其细胞毒素形式。实践中，将抗体-酶缀合物施用于患者，并容许定 位在待治疗的组织的区域内。然后，将前药施用于患者，以致于在待治疗 的组织区域内发生向细胞毒性药物的转化。备选地，与抗体缀合的抗肿瘤 试剂是细胞因子，诸如白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)或肿瘤坏死因子 (x(TNF-a)。抗体使细胞因子靶向肿瘤，以致于细胞因子在不影响其他组织
42的条件下介导对肿瘤的损伤或破坏。利用常规重组DNA技术使细胞因子
与抗体在DNA水平融合。还可以使用干扰素。
用于本文中时，"融合蛋白"意指任何嵌合蛋白，其中抗原结合区与生 物学活性分子，例如毒素、酶、荧光蛋白、发光标记、多肽标记物、细胞 因子、干扰素、靶标或报告蛋白部分或蛋白药物相连接。
本发明还预期本发明的CDMAB，其与靶标或报告蛋白部分相连接。 靶标部分是结合对的第一成员。抗肿瘤试剂，例如，与所述对的第二成员 缀合，并由此针对抗原结合蛋白结合的位点。所述结合对的常见实例是抗 生物素蛋白和生物素。在优选的实施方案中，生物素与本发明CDMAB的 靶抗原缀合，并由此提供关于抗肿瘤试剂的靶标或与抗生物素蛋白或链霉 抗生物素蛋白缀合的其他部分。备选地，生物素或另一种所述部分与本发 明的CDMAB的靶抗原连接，并且，例如，在其中产生可检测信号的试剂 与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的诊断系统中，作为报告蛋白使 用。
产生可检测信号的试剂有效用于体内或体外诊断目的。信号产生试剂 产生可测量的信号，该信号可以通过外部方式，通常电磁辐射测量检测。 通常，信号产生试剂是酶或发色团，或通过荧光、磷光或化学发光而发光。 发色团包括吸收紫外或可见区的光的染料，且可以是酶催化反应的底物或 降解产物。
而且，本发明的范围包括本发明的CDMAB在体内和体外用于研究或 诊断方法的用途，这是本领域中公认的。为了执行如本文中预期的诊断方 法，本发明还可以包括包含本发魂CDMAB的试剂盒。所述试剂盒应该有 效用于通过检测所述CDMAB靶抗原在所述个体细胞上的过表达，而确定 个体处于某种类型的癌症风险中。
诊断测定试剂盒
预期使用采用用于确定肿瘤存在的诊断测定试剂盒形式的按照本发明 的任何合适的CDMAB。在患者中检测出肿瘤通常基于在获自该患者的生 物样品，诸如血液、血清、尿液和/或肿瘤活组织切片中存在一种或多种肿 瘤特异性抗原，例如蛋白和/或编码该蛋白多核苷酸。所述蛋白起指示具体的肿瘤，例如结肠、乳腺、肺或前列腺肿瘤的存 在或不存在的标记的作用。还预期所述抗原应该具有检测其他癌性肿瘤的
效用。诊断测定试剂盒中包含包括本发明的CDMAB的结合试剂、或 CDMAB相关结合试剂，容许检测生物样品中与该试剂结合的抗原的水平。 多核苷酸引物和探针可以用于检测编码肿瘤蛋白的mRNA水平，这也指 示癌症的存在或不存在。为了使该结合测定具有诊断性，应该产生这样的 数据，即该数据使统计学显著水平的抗原关于正常组织中存在的抗原相关 联，从而使得结合识别成为癌性肿瘤存在的确定诊断。预期许多形式应该 有效用于本发明的诊断测定，如本领域中那些普通技术人员所已知的，从 而使用结合试剂检测样品中的多肽标记。例如，如Harlow和Lane， Antibodies: A Laboratory Manual (抗体实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港实验室)，第9-14章，1988中举例说明的。还预期了 上述诊断测定形式的任意和全部组合、改变或改进。
患者中存在或不存在癌症典型应该通过以下步骤确定(a)使获自患 者的生物样品与结合试剂相接触；(b)检测样品中与该结合试剂相结合的 多肽的水平；和(c)比较多肽水平和预先确定的截取值。
在举例说明的实施方案中，预期所述测定应该试剂包括使用固定在固 体支持物上的基于CDMAB的结合试剂结合和去除样品剩余物中的多肽。 结合的多肽可以再利用含有报告基团并特异性结合该结合试剂/多肽复合 物的检测试剂进行检测。例证性检测试剂可以包括特异性结合所述多肽的 基于CDMAB的结合试剂或特异性结合所述结合试剂的抗体或其他试剂， 诸如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或凝集素。在备选的实施方案中，预 期可以使用竞争性测定，其中多肽用报告基团标记，并容许其在温育结合 试剂和样品后与固定的结合试剂结合。用固定的结合试剂指示样品的反应 性是该样品的成分抑制标记的多肽与结合试剂结合的程度。适合用于所述 测定中的多肽包括结合试剂对其具有结合亲和力的全长肿瘤特异性蛋白 和/或其部分。
应该对诊断试剂盒提供固体支持物，其可以采用本领域中那些普通技 术人员已知的蛋白质可以与之附着的任何材料形式。合适的实例可以包括 微量滴定板中的测试孔或硝基纤维素或其他合适的膜。备选地，所述支持物可以是珠或盘，诸如玻璃、玻璃纤维、乳胶或塑料材料诸如聚苯乙烯或 聚氯乙烯。所述支持物还可以是磁性粒子或光纤传感器，诸如美国专利号
5,359,681中公开的那些。
预期所述结合试剂应该利用多种本领域中那些技术人员已知的技术固 定在所述固体支持物上，所述技术详细地记述在专利和科学文献中。术语 "固定"指非共价结合，诸如吸附，和共价附着，其在本发明的情形中， 可以是试剂和支持物上的官能团之间的直接键合，或可以是通过交联试剂 的键合。在优选但非限制性实施方案中，通过吸附与微量滴定板的孔或与 膜固定是优选的。吸附可以通过使结合试剂在适当缓冲液中与固体支持物 接触一段合适的时间实现。接触时间可以随温度变化，且通常应该在约1 小时到约1天的范围内。
结合试剂与固体支持物的共价附着一般通过首先使该支持物与双官能 试剂反应，所述双官能试剂与该支持物和所述结合试剂上的官能团，诸如 羟基或氨基基团反应。例如，结合试剂可以利用苯醌或通过使支持物上的 乙醛基团与结合配偶体上的胺和活性氢的縮合而共价附着于具有适当聚 合物涂层的支持物。
还预期诊断测定试剂盒应该采用两-抗体夹心式测定形式。该测定可以 通过首先使抗体，例如本文中公开的已经固定在固体支持物， 一般为微量 滴定板的孔上的CDMAB，与样品相接触，从而容许样品中的多肽与固定 的抗体结合。然后，从固定的多肽-抗体复合物中除去禾结合的样品，并添 加含有报告基团的检测试剂(优选地，能够结合该多肽上不同位点的二级 抗体)。然后利用对特异性报告基团合适的方法确定保持与固体支持物结 合的检测试剂的量。
在特殊的实施方案中，预期抗体一旦如上所述固定在支持物上，则通 过使用本领域中那些普通技术人员已知的任何合适的封端剂，诸如牛血清 清蛋白或吐温20 (Sigma Chemical Co.(西格玛化学公司)，St Louis, Mo.) 封闭支持物上剩余的蛋白结合位点。固定的抗体然后与样品一起温育，并 容许多肽与抗体结合。在温育前，可以使用合适的稀释剂，诸如磷酸盐缓 冲液(PBS)稀释样品。通常，应该将合适的接触时间(即温育时间)选 择为符合足以检测在获自具有特异性选择的肿瘤的个体的样品中存在多肽的一段时间。优选地，接触时间足以获得在结合和未结合多肽之间平衡 时获得的结合水平的至少约95%的结合水平。本领域中的那些普通技术人 员应该公认获得平衡所需要的时间可以容易地通过测定一段时间内发生 的结合水平确定。
还预期未结合的样品应该再通过用合适的缓冲液洗涤固体支持物而去 除。应该再将二级抗体，其含有报告基团，添加到固体支持物中。然后， 应该以足以检测结合多肽的时间量，进行对检测试剂和固定的抗体-多肽复 合物的温育。随后，再除去未结合的检测试剂，并利用报告基团检测结合 的检测试剂。用于检测报告基团的方法必须对所选的报告基团类型具有特 异性，例如对放射性基团具有特异性，闪烁计数或放射自显影术通常是合 适的。可以使用分光光度法检测染料、发光基团和荧光基团。可以利用与 不同报告基团(一般地，放射性或荧光基团或酶)偶联的抗生物素蛋白检 测生物素。酶报告基团通常可以利用添加底物(通常，持续一段特定的时 间)，和随后进行该反应产物的分光光度或其它分析来检测。
为了使用本发明的诊断测定试剂盒来确定癌症，诸如前列腺癌的存在 或不存在，由与固体支持物保持结合的报告基团检测的信号通常与对应于 预先确定的截取值的信号进行比较。例如，用于检测癌症的示例性截取值 可以是当固定的抗体与来自无癌症的患者的样品一起温育时获得的平均
信号。 一般地，认为产生高于预先确定的截取值约3标准偏差的信号的样 品对癌症应该是阳性的。在另一个实施方案中，按照Sackett,临床流行病 学■ (Clinical Epidemiology) . Basic Science forClinical Medicine (临床医学 的基本科学知识)，Little Brown and Co.(小布朗公司),1985,第106-7页 的方法，截取值可以通过利用接收操作曲线(Receiver Operator Curve)确 定。在该实施方案中，截取值可以由对于诊断测试结果的每个可能的截取 值的真阳性率(即灵敏性)和假阳性率(100%-特异性)对的图表确定。 该图表中最接近左上角的截取值(即包含最大面积的数值)是最准确的截 取值，且产生高于通过该方法确定的截取值的信号的样品可以认为是阳性 的。备选地，截取值可以沿该图表左移，从而最小化假阳性率，或右移， 从而最小化假阴性率。 一般地，认为产生高于通过该方法确定的截取值的 信号的样品对癌症是阳性的。预期能够通过该试剂盒实现的诊断测定应该以流经(flow-through)或
条带测试形式进行，其中结合试剂固定在膜，诸如硝基纤维素上。在流经 测试中，样品中的多肽在样品流经该膜时与固定的结合试剂结合。第二种 标记的结合试剂在包含该第二种结合试剂的溶液流经该膜时，再与结合试 剂-多肽复合物结合。然后如上所述检测结合的第二种结合试剂。在条带测 试形式中，将膜的与结合试剂结合的一个末端浸没在含有样品的溶液中。 样品沿该膜移动经过含有第二种结合试剂的区域并到达固定的结合试剂 的区域。第二种结合试剂在固定的抗体区域内的浓度表示癌症的存在。在 结合位点产生一种可以通过视觉阅读的模式，诸如线，将指示阳性测试。 缺乏这种模式表示阴性结果。
一般地，选择固定在膜上的结合试剂的量， 从而在生物样品含有足以在采用上述形式的两-抗体夹心式测定中产生阳 性信号的多肽水平时，产生视觉可辨的模式。在该诊断测试中优选使用的 结合试剂是本发明公开的抗体、其抗原结合片段、和如本文中所述的任何
CDMAB相关结合试剂。固定在膜上的抗体的量应该是有效产生诊断测定 的任意量，且可以在约25纳克-约l微克的范围内。典型地，所述测试可 以对非常小量的生物样品进行。
另外，本发明的CDMAB可以用于实验室研究，这归因于其识别其靶
抗原的能力。
为了使本文中所述的发明可以得到更完整的理解，提供下述说明。 本发明提供特异性识别和结合ATCC PTA-4621抗原的CDMAB (即， ATCC PTA-4621 CDMAB，由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤 产生的分离的单克隆抗体的人源化抗体，由以保藏号PTA-4621保藏在 ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的嵌合抗体，其抗原结合片段， 或抗体配体)。
由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗 体的CDMAB可以采用任意形式，条件是其具有这样的抗原结合区，所述 抗原结合区竞争抑制由杂交瘤ATCC PTA-4621产生的分离的单克隆抗体 与其靶抗原的免疫特异性结合。因此，与ATCC PTA-4621抗体具有相同 结合特异性的任何重组蛋白(例如，融合蛋白，其中抗体与第二蛋白诸如 淋巴因子或肿瘤抑制生长因子组合)落入本发明的范围内。在本发明的一个实施方案中，CDMAB是ATCCPTA-4621抗体。
在其他实施方案中，CDMAB是抗原结合片段，其可以是Fv分子(诸 如单链Fv分子)，Fab分子，Fab'分子，F(ab')2分子，具有ATCC PTA-4621 抗体的抗原结合区的融合蛋白、双特异性抗体、杂种抗体或任意重组分子。 本发明的CDMAB针对ATCC PTA-4621单克隆抗体所针对的表位。
本发明的CDMAB可以被修饰，即通过分子中的氨基酸修饰，从而产 生衍生物分子。化学修饰也是可能的。通过直接的突变的修饰、亲和力成 熟法、噬菌体展示或链改组也可以是可能。
亲和力和特异性可以通过突变CDR和/或苯丙氨酸色氨酸(FW)残基 和筛选具有理想特征的抗原结合位点得到改进或提高(例如，Yang等，J. Mol.Biol.(分子生物学杂志)，(1995)254:392-403)。 一种方法是随机化各 个残基或残基的组合，从而在一群另外相同的抗原结合位点中，发现2-20 个氨基酸的子集处于特定的位置。备选地，可以通过倾向差错PCR法诱 导一定范围的残基突变(例如，Hawkins等，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)， (1992)226:889-96)。在另一个实例中，包含重链和轻链可变区基因的噬菌 体展示载体可以在大肠杆菌(E 的突变菌株中增殖(例如，Low等，J.
Mol. Biol.(分子生物学杂志)，(1996) 250:359-68)。这些诱变方法是本领 域中技术人员已知的许多方法的举例。
增加本发明抗体亲和力的另一种方式是进行链改组，其中重链或轻链 与其他重链或轻链随机配对，从而制备具有更高亲和力的抗体。抗体的不 同CDR也可以与其他抗体中的相应CDR进行改组。
衍生的分子应该保留所述多肽的功能性质，即，具有所述取代的分子 仍应该允许该多肽与IDAC 051206-01抗原或其部分的结合。
这些氨基酸取代包括，但不必然限于，本领域中己知的，如"保守的" 氨基酸取代。
例如，蛋白质化学的成熟理论是，称为"保守的氨基酸置换"的某些 氨基酸取代，可以常常可以在蛋白中，在不改变该蛋白构象或功能的条件 下制备。
所述改变包括将异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、和亮氨酸(L)中的任一种 取代为任何其他这些疏水性氨基酸；天冬氨酸(D)取代为谷氨酸(E)且反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代为天冬酰胺(N)且反之亦然；和丝氨酸(S)取 代为苏氨酸(T)且反之亦然。其他取代也可以认为是保守的，这取决于具 体氨基酸的环境或其在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙 氨酸(A)通常可以互换，丙氨酸和缬氨酸(V)也同样可以互换。相对疏水 性的甲硫氨酸(M)，通常可以与亮氨酸和异亮氨酸互换，且有时与缬氨酸 互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)通常在这样的位置中互换，在所述位置中 氨基酸残基的显著特性是其所带的电荷，且改变这两种氨基酸残基的pK 并不重要。还有其他改变可以在特定的环境中被认为是"保守的"。
实施例1
人肝肿瘤组织染色
进行IHC研究进一步评估H460-16-2与人肝肿瘤组织的结合。以前进 行IHC最优化研究，从而确定进一步实验的条件。H460-16-2单克隆抗体 如以前在S.N. 10/603,000中公开那样进行生产和纯化。
抗体与49份人肝肿瘤和9份正常肝组织的结合利用人的、肝正常和肿 瘤组织微阵列进行(Imgenex，圣地亚哥，CA)。提供关于每名患者的下列信 息年龄、性别、器官和诊断。组织切片通过在58°C烤箱中干燥1小时 去石蜡，并通过浸没在科普林缸(Coplinjars)中的二甲苯中5次、持续4 分钟脱蜡。在经过一系列分级乙醇洗涤(100%-75%)处理后，在水中对 切片进行再水合。将载玻片浸没在IO mM柠檬酸缓冲液pH6(Dako，多伦 多，安大略省)中，然后在高、中、和低能量设置下各微波加热5分钟，并 最后浸没在冷PBS中。然后，将载玻片浸没在3%过氧化氢溶液中6分钟， 用PBS洗涤3次，每次5分钟，干燥，与通用封闭溶液(Dako，多伦多，安 大略省) 一起在室温下温育5分钟。将H460-16-2，即抗-AFP (al胎蛋白； 克隆AFP-ll， Abeam, Cambridge, MA)或同种型对照抗体(针对黑曲霉 (/^^rg/〃w 葡萄糖氧化酶，即一种在哺乳动物组织中既不存在也
不可诱导的酶；Dako,多伦多，安大略省)稀释在抗体稀释缓冲液(Dako, 多伦多，安大略省)中，达到其工作浓度(除对抗-PSMA稀释到10微克/mL 外，使每种抗体均为5微克/mL)，并在室温下温育1小时。用PBS洗涤 载玻片3次，每次5分钟。 一抗的免疫反应性利用与提供的HRP缀合的二抗(Dako Envision System (Dako预见系统)，多伦多；安大略省)在室温 下检测/显现30分钟。在这个步骤后，用PBS洗涤载玻片3次，每次5分 钟，并通过添加DAB(3,3，-二氨基联苯胺四盐酸盐(3,3，-diaminobenzidine tetmhydrachloride)， Dako,多伦多，安大略省)生色团底物溶液形成颜色 反应，从而在室温下进行免疫过氧化物酶染色10分钟。在自来水中洗涤 载玻片终止生色反应。在用Meyer's苏木精(Meyer's Hematoxylin) (Sigma Diagnostics (西格玛诊断学)，Oakville， ON)复染色后，载玻片用分级乙醇
(75-100%)脱水并用二甲苯清洗。利用封片剂(Dako Fammount,多伦多， 安大略省)对该载玻片进行盖玻片封片。利用Axiovert 200 (Ziess Canada, 多伦多，ON)对载玻片进行显微镜检查，并利用北方日食成像软件
(Northern Eclipse Imaging Software) (Mississauga， ON)获得和保存数字图 像。通过组织病理学说对结果进行阅读、打分和解释。
如图1中所公开地，H460-16-2抗体显示出与21/49 (43%)的所测试的 肝癌，包括11/37 (30%)原发性，7/8(88%)转移性肝细胞癌，1/2 (50%)原发 性和2/2(100%)转移性胆管癌的结合。与早期I和II期相比，该抗体显示 出与晚期肿瘤III和IV期显著更高的结合(p = 0.03) [I期，0/2 (0%); II期， 2/17 (12%); III期，8/16 (50%)和IV期，6/8 (75%)]。 H460-16-2特异于肿瘤 细胞并渗透炎性细胞。细胞定位主要在膜。 一些肿瘤还表现出扩散的细胞 质染色模式。抗体与9/9的非-赘生性肝组织结合(图2)。然而，该结合 仅限于血窦细胞并渗透淋巴细胞H460-16-2抗原似乎特异性表达在晚期 肝肿瘤组织上。H460-16-2因此具有作为治疗肝癌的治疗药物的潜力。
因此，H460-16-2抗原似乎表达在肝肿瘤组织上，其具有对转移性和 晚期肝肿瘤组的结合优选性。H460-16-2因此具有作为关于肝细胞癌的诊 断试剂，和作为治疗肝癌的治疗药物的效用。
实施例2
CD44与多种HCC细胞系的转移潜力的相关性
为了进一步在体外评估该相关性，通过利用(ch)ARH460-16-2-IgGl抗 体的流式细胞计数法，评估6种具有不同转移潜力的肝细胞癌(HCC)细 胞系(Hep3B (American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心)，Manassas, VA), Huh-7 (由H. Nakabayashi十専士馈贝曾，Hokkaido University School of Medicine (北海道大学医学院),札幌，日本)，PLC (Japanese Cancer Research Bank (日本癌症研究文库)，东京，日本)，MHCC-97L, MHCC-97H禾tl HCCLM3 (Liver Cancer Institute (肝癌研究所)，Fudan University (复旦大学)，上海，中国))的CD44表达。为了检测CD44在多 种HCC细胞系中的表达，用(ch)ARH460-16-2-IgGl或同种型对照抗体(10 微克/mL)对细胞染色1小时，并用合适的二抗对细胞染色30分钟，并通 过FACS分析。
通过流式细胞计数法，发现当与原发性非转移细胞系(Hep3B, Huh-7 和PLC)相比日寸，CD44的表达水平在转移性HCC细胞系(MHCC-97L, HCCLM3和MHCC-97H)中更高(图3)。
实施例3
HCCLM3细胞的同位HCC肿瘤模型 细胞的荧光素酶标记
为了进一步在体内评估该相关性，在同位HCC肿瘤模型中测试 (ch)ARH460-16-2-IgGl。为了萤光素酶标记HCCLM3 (—种转移性HCC细 胞系，Yang等，Cancer Genet. Cytogenet.(癌症遗传性和细胞遗传学) 158(2):180-183 2005)细胞，利用以前所述的方法(Cheung等，Cancer Res.(癌 症研究)66(8):4357-4367 2006)，构建携带萤光素酶基因的慢病毒载体， 并将其转染到细胞中。稳定转染子由多于20个阳性克隆(其是利用浓度 为2微克/mL的杀稻瘟菌素选择的)的集合中产生。
动物CCD实验
将一百万个HCCLM3萤光素酶标记的细胞皮下注射到裸鼠的右胁， 然后每日观察其肿瘤发展的征兆。 一旦肿瘤达到直径l-1.5cm，则摘除肿 瘤，并切成约l-2mm的立方体，随后将其植入到5周龄雄性裸鼠的左肝 叶中。10天后，将裸鼠随机分成4组，并用同种型对照或2、 10或20 mg/kg (ch)ARH460-16-2-IgGl处理。用稀释剂稀释储备浓縮液后，将体积为200 微升的(ch)ARH460-16-2-IgGl测试抗体腹膜内施用于各组，所述稀释剂含有2.7 mM KC1, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04。然后， 以相同的方式每周施用抗体2次，总共12剂量，直到植入后第45天。
小鼠在肿瘤接种后第7天和第45天进行成像。依照香港大学教学和研 究使用活体动物委员会，用比例为4:1的氯胺酮-赛拉嗪混合物麻醉小鼠。 利用Xenogen IVIS 100冷却的CCD照相机(Xenogen,新泽西，美国)进行成 像。在成像前15分钟，用200微升15mg/mL的D-萤光素腹膜内注射小鼠， 其后，将它们置于不透光的室中。获得灰度色标参考图像，其后捕获生物 发光图像。捕获时间范围是3秒-l分钟。显示的图像是发射光假图像，以 光子/s/cm2/立体弧度为单位，其重叠在动物的灰度色标照片上。
(ch)ARH460-16-2-IgGl在人HCC的成熟模型中显著减小肿瘤负荷(图 4)。肿瘤植入后第45天时，(ch)ARH460-16-2-IgGl以剂量2、 10和20 mg/kg 分别将原发性肝肿瘤信号由37.6E+7士0.17减至9E+7±0.72， 2.3 E+7± 0.52 禾口0.1E+7土0.5 (图5)。还对来自不同组的代表性原发肿瘤照相(图6)。 在研究过程中，这两组之间不存在显著的平均体重差异。
(ch)ARH460-16-2-IgGl在人HCC的成熟同位模型中显著抑制肝内和 肺转移。治疗组和对照组中具有肺和肝内转移的小鼠数量显示在图7中。 (ch)ARH460-16-2-IgGl以剂量2 mg/kg显著抑制肝内转移，从(5/5) 100% 降至(2/5) 40%。 (ch)ARH460-16-2-IgGl也以剂量2 mg/kg显著抑制肺转 移，从(5/5)100%降至(0/5)0% (图7)。除肝和肺转移外，对照组还表现出 肠(4/5)和泌尿器官(3/5)的转移。
总之，(ch)ARH460-16-2-IgGl在该成熟的人同位HCC肿瘤模型中， 是充分耐受的，减小肿瘤负荷和肝内和肺转移。
大量的证据显示鼠科和嵌合H460-16-2通过与在肝癌上表达的CD44 上存在的表位连接而介导抗癌效应。已经显示出在转移性对比原发性人肝 癌细胞系中观察到更高的CD44表达。还显示出嵌合H460-16-2在体内减 小肿瘤负荷和人肝癌转移的可能性。因此，嵌合H460-16-2具有诊断和治 疗肝癌的治疗潜力，所述肝癌广义理解为包括由肝细胞产生的任何原发性 或转移性肿瘤位点。
本说明书中提到的所有专利和出版物均表示本发明所属领域中那些技术人员的水平。以与将各篇出版物通过参考具体和分别引入本文中相同的 程度将所有专利和出版物通过参考弓!入本文。
应该理解尽管举例说明了本发明的某些形式，但是其不仅限于本文中 所述和所示部分的具体形式或安排。对于本领域中的那些技术人员清楚的 是，在不偏离本发明范围的条件下可以进行多种变化，且不认为本发明仅 限于说明书中所示和所述的内容。本领域中的技术人员应该容易理解，本 发明充分适合于执行目的并获得提到的结果和优势，以及其中固有的那 些。本文中所述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物学相关化合物、方法、 程序和技术是当前优选实施方案的代表，其意欲示范而非意欲限制范围。 其中的变化和其他用途是本领域中那些技术人员可以想到的，其包含在本 发明的精神内，且由所附权利要求的范围限定。尽管联系具体的优选实施 方案描述了本发明，但是应该理解，所要求的发明不应该不适当地仅限于 这些具体的实施方案。实际上，所述执行本发明模式的多种改进对本领域
中的那些技术人员是显而易见的，其意欲属于以下权利要求的范围。ATCC_
10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209.电话703-365-2700.传真:703-365-2745
国际微生物保藏组织以专利程序为目的的布达佩斯条约
鄉表搭
按照细则Rule 7.3发布原始保藏情形中的收据和 按照细则Rule 10发布的存活证明(译文)
致(保藏人或律师的名称和地址) ，里乌斯研究公司
律师:Jena de Sousa-Hitzler 55 York Street 16th Floor
多伦多，安大略省 加拿大，M5J 1R7
保藏代表阿里乌斯研究公司
保藏人给予的鉴定参考 专利保藏命名
小鼠杂交瘤H460-16-2 PTA-4621 小鼠杂交瘤H460-22-I PTA-4622 小鼠杂交瘤7BD1-60 PTA-4623
该保藏物伴随_科学描述 一以上指出的提议的分类描述。该保藏物于2002年9月4日由本国 际保藏机构接收，并己被接受。
按照您的要求1我们将在30年中通知您关于该品系的请求。
如果签署布达佩斯条约的专利局确认其接收的权利，或如果引用该品系的美国专利得到授权，该 品系将成为可以获得的，且ATCC在美国专利和商标局或保藏人的指示下释放该品系。
如果该培养物在保藏有效期内死亡或被破坏，您将负责用相同的活培养物替换它们。
该品系将从保藏日期开始被维持至少30年，或最近一次要求样品后5年，二者选较长的时期。美 国和许多其他国家签署布达佩斯条约。
以t引用的培养物的存活于2002年9月6日检测。在该日期时，该培养物是存活的。 国际保藏机构美国典型培养物保藏中心，Manassas, VA20U0-2209美国。 有权代表ATCC的人的签字
_ 日期2002年10月9曰
Marie Harris,专利专家，ATCC专利保藏
cc: Ferris Lander先生 (参考目录或案件号2056.009和美国系列号09/727361)
权利要求
1.治疗原发性人肿瘤部位和转移性部位的方法，其中所述原发性人肿瘤或转移瘤表达抗原的至少一个表位，所述抗原特异性结合由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC中的克隆产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB，其特征在于，竞争抑制所述分离的单克隆抗体或其CDMAB与其靶抗原结合的能力，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效导致所述哺乳动物肿瘤负荷减小的量的所述分离的单克隆抗体或其所述的CDMAB。
2. 权利要求1的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB与细胞毒性部分缀合。
3. 权利要求1的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
4. 权利要求1的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
5. 权利要求1的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞毒性。
6. 权利要求1的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB的人源化抗体。
7. 权利要求1的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB的嵌合抗体。
8. 在哺乳动物中治疗易受抗体诱导的细胞毒性影响的原发性人肿瘤部位和转移性部位的方法，其中所述原发性人肿瘤或转移瘤表达抗原的至少一个表位，所述抗原特异性结合由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC中的克隆产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB，其特征在于，竞争抑制所述分离的单克隆抗体或其CDMAB与其靶抗原结合的能力，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效导致所述哺乳动物肿瘤负荷减小的量的所述分离的单克隆抗体或其所述的CDMAB。
9. 权利要求8的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB与细胞毒性部分缀合。
10. 权利要求8的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
11. 权利要求8的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
12. 权利要求8的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖性细胞毒性。
13. 权利要求8的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB的人源化抗体。
14. 权利要求8的方法，其中所述分离的单克隆抗体是由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB的嵌合抗体。
15. 用于治疗表达人CD44抗原的一个或多个表位的人癌性肿瘤的方法，所述人CD44抗原与由具有ATCC保藏号PTA-4621的杂交瘤细胞系H460-16-2产生的分离的单克隆抗体特异性结合，所述方法包括向患有所述人癌症的个体施用至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB，所述分离的单克隆抗体或其CDMAB识别与由具有ATCC保藏号PTA-4621的杂交瘤细胞系H460-16-2产生的分离的单克隆抗体所识别的相同的一个或多个表位；其中所述一个或多个表位的结合导致肿瘤负荷的减小。
16. 用于治疗表达人CD44抗原的一个或多个表位的人癌性肿瘤的方法，所述人CD44抗原与由具有ATCC保藏号PTA-4621的杂交瘤细胞系H460-16-2产生的分离的单克隆抗体特异性结合，所述方法包括向患有所述人癌症的个体施用至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB，所述分离的单克隆抗体或其CDMAB识别与由具有ATCC保藏号PTA-4621的杂交瘤细胞系H460-16-2产生的分离的单克隆抗体所识别的那些相同的一个或多个表位；其中所述施用导致肿瘤负荷的减小。
17. 用于确定选自人癌性肿瘤的组织样品中存在癌细胞的结合测定法，所述癌细胞表达人CD44抗原的一个或多个表位，所述人CD44抗原与由具有ATCC保藏号PTA-4621的杂交瘤细胞系H460-16-2产生的分离的单克隆抗体特异性结合，所述方法包括提供至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB，所述分离的单克隆抗体或其CDMAB识别与由具有ATCC保藏号PTA-4621的杂交瘤细胞系H460-16-2产生的分离的单克隆抗体所识别的那些相同的一个或多个表位；使所述至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB与所述人组织样品相接触；和确定所述至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB与所述组织样品的幺士A^口 1=1 ;由此指示所述组织样品中存在所述癌细胞。
18. 权利要求1的方法，其中所述原发性人肿瘤部位和/或转移性部位由肝细胞产生。
19. 权利要求8的方法，其中所述原发性人肿瘤部位和/或转移性部位由肝细胞产生。
20. 权利要求15的方法，其中所述人癌性肿瘤由肝细胞产生。
21. 权利要求16的方法，其中所述人癌性肿瘤由肝细胞产生。
22. 权利要求17的方法，其中所述人癌性肿瘤由肝细胞产生。
23. 用于检测人癌性肿瘤存在的测定试剂盒，其中所述人癌性肿瘤表达抗原的至少一个表位，所述抗原特异性结合由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC中的克隆产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB，所述CDMAB的特征在于，竞争抑制所述单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述试剂盒包括由以保藏号PTA-4621保藏在ATCC中的克隆产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB，和用于检测所述单克隆抗体或其CDMAB是否结合多肽的工具，所述多肽以特定截取值水平的存在对所述人癌性肿瘤的存在具有诊断性。
全文摘要
本发明涉及癌性疾病的诊断和治疗，具体涉及原发性和转移性人肿瘤细胞的细胞毒性的调控；且更具体涉及分离的单克隆抗体或其减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)，任选以与一种或多种化疗剂组合的方式，作为用于在所述人肿瘤，例如任何由肝细胞产生的原发性或转移性肿瘤部位中起始细胞毒性应答的方式的应用。本发明还涉及利用本发明CDMAB的结合测定法。
文档编号A61K39/395GK101663049SQ200880007668
公开日2010年3月3日 申请日期2008年3月10日 优先权日2007年3月9日
发明者戴维·S·F·扬, 特伦斯·健华·李, 范尚达, 达阿德·萨伊格, 龙尼·东平·潘 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司