对抗水产养殖中无脊椎动物的病原体感染的合成Replikin肽的制作方法

专利名称：对抗水产养殖中无脊椎动物的病原体感染的合成Replikin肽的制作方法
对抗水产养殖中无脊椎动物的病原体感染的合成
Rep I i k i η 肽本申请要求2008年1月18日提交的序列号为12/010，027的美国申请、2007年 11月30日提交的序列号为60/991，676的美国临时申请、2007年10月24日提交的序列号 为11/923，559的美国申请、2007年10月24日提交的序列号为60/982，336的美国临时申 请、2007年10月24日提交的序列号为60/982，333的美国临时申请、2007年10月24日提 交的序列号为60/982，338的美国临时申请、2007年8月31日提交的序列号为60/935，816 的美国临时申请、2007年8月16日提交的序列号为60/935，499的美国临时申请、2007年 8月8日提交的序列号为60/954，743的美国临时申请和2007年5月30日提交的序列号 为11/755,597的美国申请的优先权，其中每一个申请的整体通过引用被并入本文。另外， 本申请通过引用将如下每一个申请的整体并入本文2007年1月30日提交的序列号为 60/898, 097的美国临时申请、2007年1月18日提交的序列号为60/880，966的美国临时申 请、2006年10月24日提交的序列号为60/853，744的美国临时申请、2006年2月16日提 交的序列号为11/355，120的美国申请、2005年4月28日提交的序列号为11/116，203的美 国申请、2004年6月4日提交的序列号为10/860,050的美国申请、2002年7月8日提交的 序列号为10/189，437的美国申请、2002年3月26日提交的序列号为10/105，232的美国申 请、现在的序列号为7，189，800的美国专利、2001年10月26日提交的序列号为09/984，057 的美国申请和2001年10月26日提交的序列号为09/984，056的美国申请、现在的序列号 为7，176，275的美国专利。水产养殖一般指对食用水生动物的繁殖和养殖。水产养殖是21世纪快速发展 的全球性行业。造成该行业经济损失的最重要原因是疾病。Meyer，F. P.，J Anim Sci 1991.69 :4201-4208。水产养殖，特别是无脊椎动物水产养殖，常常包括在销售或诱发蜕 皮之前在围栏或储罐中短期保存高密度数量的动物。同前。这些浓度对于无脊椎动物例 如虾、蛤蛘、牡蛎、龙虾、扇贝、鲍鱼等是有压力的。有压力的条件对于病原体的传播是理 想的，其中所述病原体包括细菌例如弧菌(Vibrio)、衣原体(Chlamydia)样和立克次氏体 (Richettsia)样的物种，病毒例如桃拉综合征病毒和白斑综合征病毒，以及其他微生物病 原体。在水产养殖中一个特别严重的病毒性疾病是桃拉综合征，其显著地影响全世界的 虾养殖业。桃拉综合征由桃拉综合征病毒(TSV)所致，桃拉综合征病毒(TSV)是蟋蟀麻痹 病毒(Cripavirus)属中二顺反子病毒(Discistroviridae)家族的成员并且具有约10，000 个核苷酸的单个正链基因组。所述基因组含有两个开放的读码框(ORF)。据报道，ORFl含 有解旋酶、蛋白酶和依赖于RNA的RNA聚合酶的编码。据报道，0RF2含有三种衣壳蛋白的 编码。桃拉综合征现在被认为是美洲地方性的，而且也观察到在亚洲的爆发。受感染的 虾通常具有红色尾巴，厌食且行为反复无常，尾部肌肉可变得不透明，并且角质层可变软。 在该疾病的急性阶段观察到5%和95%之间的死亡率。从TSV爆发中幸存的虾看上去在保 持传染性的同时对再感染具有抵抗力。
快速复制是某些细菌、病毒和恶性肿瘤的毒力特征，其中所述细菌、病毒和恶性 肿瘤包括TSV和水产养殖中的其他病毒和细菌疾病，例如衣原体样疾病和白斑综合征 (一种病毒性疾病)。本发明人已经发现一类与快速复制有关的保守肽序列，其被命名为 R印likin。本发明人已经把流感和其它病毒种株中R印Iikin肽的浓度增加同增加的病毒 毒力联系起来。本领域中需要通过操控R印Iikin序列的复制功能而预防和治疗病原体感 染的方法，而且需要鉴定与R印Iikin序列的复制功能相关的分子靶标以治疗毒性感染，其 包括疫苗和其他疗法。此外，本领域中需要减少针对新出现的病原体的疫苗和其他疗法的 开发所需时间，其中所述新出现的病原体在种群中快速扩张或高度可变或二者。目前用于 疫苗开发的三至十二个月的时间范围常常将疫苗提供在流行病早已经结束之后，或在流行 病依然活跃但病原体变异已经使疫苗不太有效或无效之后。本领域这些问题对于人类和动 物健康专业人员和政府是很大的烦恼。发明概述本发明提供合成的肽序列以及分离的、合成的或被合成的R印Iikin肽序列以预 防和治疗病原体在水产养殖中的无脊椎动物中的爆发，以及向水产养殖中的无脊椎动物施 用一种或多种物质以预防和/或治疗病原体在无脊椎动物中的爆发的方法，其中所述物质 包括一个或多个所述分离的、合成的或被合成的R印Iikin肽序列或由一个或多个所述分 离的、合成的或被合成的R印Iikin肽序列组成。本发明第一个非限制性的方面提供一种用于水产养殖的物质，其包括至少一种含 有约七至约五十个氨基酸的合成肽，其中所述至少一种合成肽当被施用于至少一种能够在 水中养殖的无脊椎动物时增加该无脊椎动物对至少一种病原体的抵抗力。在一个非限制性 的实施方案中，所述至少一种无脊椎动物是甲壳纲动物。在一个进一步的非限制性的实施 方案中，所述至少一种甲壳纲动物是虾。本发明第一个方面的一个进一步的非限制性的实施方案提供一种提高水产养殖 的无脊椎动物抵抗力的物质，其包括至少一种分离的或合成的肽，所述肽是来自所述无脊 椎动物的病原体的至少一种肽的至少一种分离的或合成的形式，其中所述至少一种分离的 或合成的肽是至少一种由7至约50个氨基酸组成的分离的或合成的R印Iikin肽，其包括 R印Iikin模体,所述r印Iikin模体包括(1)位于所述模体的第一个末端的至少一个赖氨酸残基和位于所述模体的第二个 末端的至少一个赖氨酸残基或至少一个组氨酸残基；(2)位于距离第二个赖氨酸残基六至十个残基处的至少一个赖氨酸残基；(3)至少一个组氨酸残基；和(4)至少百分之六的赖氨酸残基。在一个进一步的非限制性的实施方案中，所述的至少一种分离的或合成的 R印Iikin肽由R印Iikin模体组成。在一个进一步的非限制性的实施方案中，所述R印Iikin 模体由约7至约10个、约10至约15个氨基酸、约15至约20个氨基酸、约20至约25个氨 基酸、约25至约30个氨基酸、约30至约35个氨基酸、约35至约40个氨基酸、约40至约 45个氨基酸或约45至约50个氨基酸组成。在本发明的一个进一步的非限制性的实施方案中，所述的至少一种分离的或合成 的 R印Iikin 肽包括 SEQ ID NO. 1_11、86、87、103-112 和 114-198 中的任一种。在一个进
7一步的非限制性的实施方案中，所述物质包括SEQ ID NO. 1-11、86、87、103-112和114-198 的分离的或合成的R印Iikin肽中的一种或多种的混合物。在一个进一步的非限制性的实 施方案中，所述的至少一种分离的或合成的R印Iikin肽包括KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1), HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2), KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK(SEQ ID NO. 5),KVPCEQKIffLH(SEQ ID NO. 6),KIffLHQNPGK(SEQ ID NO. 7)、 HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、KGNTRVHVK (SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK (SEQ ID NO. 10)或 HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。在一个进一步的非限制性的实施方案中，本发明第一个方面 的物质包括任意两种或多种合成的R印Iikin肽的混合物。在一个进一步的非限制性的实 施方案中，所述物质包括合成的R印Iikin肽的等重混合物。本发明的第二个非限制性的方面提供一种包括用于水产养殖的物质的疫苗，其中 所述物质包括至少一种含有约7至约50个氨基酸的分离的或合成的肽，其中所述至少一种 分离的或合成的肽当被施用于至少一种能够在水中养殖的无脊椎动物时增加该无脊椎动 物对至少一种病原体的抵抗力。在本发明的第二个方面的一个非限制性的实施方案中，所述疫苗的物质的至少一 种分离的或合成的肽是至少一种R印Iikin肽，其中所述R印Iikin肽由7至约50个氨基酸 组成并包括R印Iikin模体，所述Mplikin模体包括(1)位于所述模体的第一个末端的至少一个赖氨酸残基和位于所述模体的第二个 末端的至少一个赖氨酸残基或至少一个组氨酸残基；(2)位于距离第二个赖氨酸残基六至十个残基处的至少一个赖氨酸残基；(3)至少一个组氨酸残基；和(4)至少百分之六的赖氨酸残基。在一个进一步的实施方案中，所述疫苗还包括一种药学上可接受的载体。在本发明第二个方面的一个进一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗提供针对 无脊椎动物中至少一种病原体的保护，所述无脊椎动物例如是甲壳纲动物或软体动物。在 一个进一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗提供针对虾中至少一种病原体的保护。在 一个进一步的非限制性的实施方案中，为了施用于虾，将所述疫苗与虾饲料混合。在一个进 一步的非限制性的实施方案中，将所述疫苗与每日定量的虾饲料混合。在一个进一步的非 限制性的实施方案中，所述病原体是病毒。在一个进一步的非限制性的实施方案中，所述病 原体是桃拉综合征病毒。在本发明第二个方面的一个进一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗的至少一 种分离的或合成的肽是SEQ ID NO. 1-11、86、87、103-112和114-198中的任一种。在一个进 一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗包括SEQ ID NO. 1-11、86、87、103-112和114-198 的分离的或合成的R印Iikin肽中一种或多种的混合物。在本发明第二个方面的一个进一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗 的至少一种合成肽是 KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2)、 KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK (SEQ ID NO. 5)、 KVPCEQKIffLH (SEQ ID NO. 6), KIffLHQNPGK (SEQ ID NO. 7)、HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、 KGNTRVHVK(SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK(SEQ ID NO. 10)或HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。在 一个进一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗包括任意两种或多种合成肽的混合物。在一个进一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗包括每一种合成肽的混合物。在一个进一 步的非限制性的实施方案中，所述疫苗包括每一种合成肽的等重混合物。在本发明第二个方面的一个进一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗以每天每 只受治疗的虾的每克体重约0. OOlmg至约IOmg疫苗的量被施用于至少一只虾。在一个进 一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗以每天每只受治疗的虾的每克体重约0. 005mg至 约5mg疫苗的量被施用于至少一只虾。在一个进一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗 以每天每只受治疗的虾的每克体重约0. Olmg至约2mg疫苗的量被施用于至少一只虾。在一 个进一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗以每天每只受治疗的虾的每克体重约0. 02mg 至约1.5mg疫苗的量被施用于至少一只虾。在一个进一步的非限制性的实施方案中，所述 疫苗以每天每只受治疗的虾的每克体重约0. OSmg至约1. Omg疫苗的量被施用于至少一只 虾。在一个进一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗以每天每只受治疗的虾的每克体重 约0. Img至约0. 9mg疫苗的量被施用于至少一只虾。在一个进一步的非限制性的实施方案 中，所述疫苗以每天每只受治疗的虾的每克体重约0. 2mg至约0. Smg疫苗的量被施用于至 少一只虾。在一个进一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗以每天每只受治疗的虾的每 克体重约0. 5mg疫苗的量被施用于至少一只虾。在本发明第二个方面的一个进一步的非限制性的实施方案中，本发明的疫苗的至 少一种分离的、被合成的或合成的R印Iikin肽是存在于桃拉综合征病毒新出现的种株中 的至少一种R印Iikin肽的至少一种分离的、被合成的或合成的形式。在本发明第二个方面的一个进一步的非限制性的实施方案中，本发明所述疫苗作 为预防性疗法在桃拉综合征病毒的症状发作前被施用于虾。在一个进一步的非限制性的实 施方案中，本发明疫苗作为预防性疗法在桃拉综合征病毒的症状发作后被施用于虾。在一 个进一步的非限制性的实施方案中，所述疫苗以亚治疗浓度被施用。在一个进一步的非限 制性的实施方案中，所述疫苗在至少一只虾的基本上全部的生命周期中被施用。本发明第三个非限制性的方面提供一种为水产养殖中的无脊椎动物提供抵抗力 的方法，其包括施用一种包括至少一种合成肽的物质，其中所述至少一种合成肽当被施用 于至少一种能够在水中养殖的无脊椎动物时能够增加对至少一种病原体的抵抗力。在一个 非限制性的实施方案中，所述物质通过口服、通过将无脊椎动物浸没在含有此物质的水介 质中或通过注射被施用。在一个进一步的非限制性的实施方案中，所述物质被口服施用。在 一个非限制性的实施方案中，所述无脊椎动物是甲壳纲动物。在一个进一步的非限制性的 实施方案中，所述甲壳纲动物是虾。本发明第四个非限制性的方面提供一种由7至约50个氨基酸组成的分离的、合成 的或被合成的桃拉综合征病毒R印Iikin肽，其中所述R印Iikin肽包括R印Iikin模体，所 述r印Iikin模体包括(1)位于所述模体的第一个末端的至少一个赖氨酸残基和位于所述模体的第二个 末端的至少一个赖氨酸残基或至少一个组氨酸残基；(2)位于距离第二个赖氨酸残基六至十个残基处的至少一个赖氨酸残基；(3)至少一个组氨酸残基；和(4)至少百分之六的赖氨酸残基。在本发明一个进一步的非限制性的实施方案中，分离的、合成的或被合成的桃拉综合征病毒R印Iikin肽由R印Iikin模体组成。一个进一步的非限制性的实施方案提供编 码桃拉综合征病毒R印Iikin肽的核酸序列。本发明第五个非限制性的方面提供一种由约16至约34个氨基酸组成的分离的、 合成的或被合成的桃拉综合征病毒R印Iikin支架肽，其中所述R印Iikin支架肽包括(1) 一个末端赖氨酸和任选地紧邻所述末端赖氨酸的一个赖氨酸；(2) 一个末端组氨酸和任选地紧邻所述末端组氨酸的一个组氨酸；(3)距离另一个赖氨酸约6至约10个氨基酸以内的一个赖氨酸；和(4)至少6 %的赖氨酸。在一个进一步的非限制性的实施方案中，分离的、合成的或被合成的桃拉综合征 病毒R印Iikin支架肽由约28至约33个氨基酸组成。在一个进一步的非限制性的实施方 案中，所述肽包括 KKVQANKTRVFAASNQGLALALRRYYLSFLDH(SEQ ID NO. 197)或 KKACRNAGYKEA CLHELDCKSFLLAQQGRAGAH(SEQ ID NO. 198)。本发明第六个非限制性的方面提供一种增加无脊椎动物对病原体的抵抗力的方 法，其包括(1)使用所述病原体攻击与所述无脊椎动物同种的多个无脊椎动物，所述病原体 的水平足以使所述多个无脊椎动物的至少一个个体致病；(2)将患病的或死亡的所述多个无脊椎动物的至少一个个体丢弃；(3)重复步骤1和2至少一次；并且(4)至少一次地在步骤(1)、(2)和/或(3)中对所述多个无脊椎动物施用权利要 求1的物质，其增加所述无脊椎动物对病原体的抵抗力。在本发明第六个方面的一个非限制性的实施方案中，所述至少一种分离的或合 成的肽是至少一种R印Iikin肽，其中所述R印Iikin肽由7至约50个氨基酸组成并包括 Replikin模体,所述r印Iikin模体包括(1)位于所述模体的第一个末端的至少一个赖氨酸残基和位于所述模体的第二个 末端的至少一个赖氨酸残基或至少一个组氨酸残基；(2)位于距离第二个赖氨酸残基六至十个残基处的至少一个赖氨酸残基；(3)至少一个组氨酸残基；和(4)至少百分之六的赖氨酸残基。在一个进一步的非限制性的实施方案中，所述无脊椎动物是虾。在一个进一步的 非限制性的实施方案中，所述病原体是桃拉综合征病毒。本发明第七个非限制性的方面提供一种生产疫苗的方法，其包括(1)从一种能 够在水介质中养殖的无脊椎动物的病原体中鉴定至少一种R印Iikin序列，和(2)化学合 成至少一种被鉴定的R印Iikin序列作为所述疫苗的活性剂。在一个非限制性的实施方案 中，所述疫苗从在病原体内至少一种R印1 ikin序列被鉴定时起的七天或更少的时间内被生产。本发明第八个非限制性的方面提供一种包括用于水产养殖的物质的动物饲料， 其包括至少一种含约七至约五十个氨基酸的合成肽，其中所述至少一种合成肽当被施用 于至少一种能够在水介质中养殖的无脊椎动物时增加该无脊椎动物对至少一种病原体的 抵抗力。在一个非限制性的实施方案中，所述动物饲料是甲壳纲动物的饲料。在一个进
10一步的非限制性的实施方案中，所述动物饲料是虾饲料。在一个进一步的实施方案中， 所述动物饲料中的物质中的合成肽是合成的R印Iikin肽。在一个进一步的实施方案 中，所述动物饲料包括虾生产Rangen 35麦芽浆、1 %的海藻酸钠、1 %的六偏磷酸钠和至 少一种合成的R印Iikin肽，其中所述合成的R印Iikin肽是KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、 HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2)、KAENEFffDGVKQ SH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK(SEQ ID NO. 5),KVPCEQKIffLH(SEQ ID NO. 6),KIffLHQNPGK(SEQ ID NO. 7)、 HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、KGNTRVHVK (SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK (SEQ ID NO. 10)或 HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。本发明第九个非限制性的方面提供一种虾，其中所述虾被包括至少一种Iteplikin 肽的疫苗处理，其中所述至少一种R印Iikin肽由7至约50个氨基酸组成并包括R印Iikin 模体，所述Mplikin模体包括(1)位于所述模体的第一个末端的至少一个赖氨酸残基和位于所述模体的第二个 末端的至少一个赖氨酸残基或至少一个组氨酸残基；(2)位于距离第二个赖氨酸残基六至十个残基处的至少一个赖氨酸残基；(3)至少一个组氨酸残基；和(4)至少百分之六的赖氨酸残基。在一个进一步的实施方案中，所述R印Iikin肽是桃拉综合征病毒R印Iikin肽。在 本发明第九个方面的一个进一步的实施方案中，所述虾(1)与多个其他虾一起被桃拉综合 征病毒攻击，所述桃拉综合征病毒的水平足以使所述多个虾中的至少一个致病；(2)将所 述多个虾中患病的虾或死亡的虾或二者丢弃；(3)重复步骤1和2至少一次；并且(4)至少 一次地在步骤(1)、⑵和/或⑶中对所述多个虾施用一种疫苗，其中所述疫苗包括至少 一种分离的或合成的桃拉综合征病毒R印Iikin肽。附图简述

图1举例说明在用桃拉综合征病毒攻击的虾(南美白对虾(Penaeusvarmamei)) 15 天试验期内的存活率。图IA举例说明用Tl疫苗接种的虾，其中所述Tl疫苗含有来自桃拉 综合征病毒(TSV)的R印Iikin序列。图IB举例说明未被接种的虾(对照)。图1中的数 据反映下面实施例2中阐述的试验。图IA举例说明5个试验，其中每个试验与对照一起进 行了相同的15天时间。图IB举例说明在相同的15天期间的三个对照试验。在从总共六 个试验(如下面实施例2中所述)中去掉一个异常值后，被接种的虾具有59%的累计存活 率(图1A)。未被接种的虾具有25%的累计存活率(图1B)。被接种的虾的累计存活率比 未被接种的虾的累计存活率高。这些数据表明，使用R印Iikin序列接种提供了免受TSV感 染的保护。接种后对抗TSV的相对存活率是45%。图2举例说明被桃拉综合征病毒(TSV)预先攻击的(慢性感染的)并且接着在 用Tl疫苗、T2抑制的或“阻断的”疫苗或不用疫苗(对照)处理后被TSV再一次攻击的虾 (南美白对虾)的15天累计存活率。使用未被TSV预先攻击(未慢性感染的)的虾举例 说明了另一个对照研究。这另一个对照未被疫苗处理。对于Tl接种的虾，一直到第13天 未出现死亡。在暴露于TSV之后第15天，这组具有91%的存活率。对于喂有抑制的疫苗 T2的虾，在第2天观察到第一例死亡。此组具有60%的存活率。对于经受了之前TSV攻击 的未被接种的对照组，在第10天发生第一例死亡，并且该组具有75%的存活率。对于之前未被桃拉综合征病毒攻击的另一个对照组(SPF虾)，累计存活率是25%。这些结果显示， TSV慢性感染的虾当被TSV再次攻击时具有更高的存活率(60-91% )。特别地，Tl接种的 南美白对虾具有最高的存活率和最低的病毒载量。用TSV攻击的SPF南美白对虾的存活率 是25%。图2中举例说明的试验被描述在下面的实施例3中。图3举例说明分别从伯利兹、泰国、夏威夷和委内瑞拉采集的桃拉综合征病毒 (TSV)的分离物中的R印Iikin浓度与被相应TSV分离物在第1、2和3天攻击的凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei)达到50%死亡率所用的平均天数之间的直接顺序相关性(direct sequentialcorrelation)。每种分离物的R印Iikin浓度之间的统计学差异是显著的，在ρ < 0. 001的水平上。图3中所举例说明的数据在下面的实施例1中被描述。图4举例说明分别从伯利兹、泰国、夏威夷和委内瑞拉采集的桃拉综合征病毒 (TSV)的分离物中的R印Iikin浓度与被相应的TSV分离物攻击后15天的凡纳滨对虾的平 均累计存活率之间的直接相关性。每种分离物的R印Iikin浓度之间的统计学差异是显著 的，在P < 0. 001的水平上。图4中所举例说明的数据被描述在下面的实施例1中。图5举例说明被四种不同的桃拉综合征病毒分离物攻击的凡纳滨对虾的15天累 计存活率(除非在15天之前发生100%的死亡)与每种分离物的开放读码框I(ORFl)的 R印Iikin浓度之间的相关性。针对R印Iikin浓度分析了来自伯利兹、泰国、夏威夷和委 内瑞拉的TSV的个体分离物的基因组的ORFl的被翻译的氨基酸序列。对于伯利兹分离物 R印Iikin浓度被确定为3. 5，对于泰国分离物其为3. 4，对于夏威夷分离物其为3. 3，而对于 委内瑞拉分离物其为3. 0。图A举例说明用TSV的伯利兹分离物攻击的虾在三个试验中观 察到的存活率。在一个试验中，在第6天观察到全部死亡。在其他试验中，在第11天观察 到全部死亡。图B、C和D举例说明用泰国分离物、夏威夷分离物和委内瑞拉分离物分别攻 击的虾在为期15天的三个试验中观察到的存活率。在泰国分离物中，在第15天观察到平 均80%的死亡率。在夏威夷分离物中，在第15天观察到平均78. 3%的死亡率。在委内瑞 拉分离物中，在第15天观察到平均58. 3%的死亡率。图5中所举例说明的数据在下面的实 施例1中被描述。图6举例说明桃拉综合征病毒基因组中增加的R印Iikin浓度与在2000年和2007 年中此病毒在虾中的爆发之间的相关性。本发明人分析了可得自www.pubmed.com的桃拉 综合征病毒肽序列的公开可得的序列的平均R印Iikin浓度。图6是比较2000年和2005年 之间肽序列可公开获得的每年平均R印Iikin浓度(带有标准偏差)和桃拉综合征病毒严 重爆发日期的图。此图中所反映的R印Iikin浓度数据可在下面的表13中找到。在2000年 和2007年记录了此病的严重爆发。可以从此图观察到的是，此病毒的爆发发生在R印Iikin 浓度增加之后。在2000年，TSV具有2. 7的R印Iikin浓度。在2001和2004年之间，TSV 具有低至0. 6的较低平均R印Iikin浓度，而且被鉴定的R印Iikin支架消失了。在2005年 Replikin支架再现，赖氨酸和组氨酸增加，并且R印Iikin浓度相应增加到1. 8，接着是在 2006-2007年期间TSV爆发的增加。参见实施例5中的2000和2005年TSV的Replikin支
^K O图7举例说明西尼罗河病毒R印Iikin的周期产生和每年的人类发病率，通过证 明每年西尼罗河病毒的包膜蛋白的每100个氨基酸的R印Iikin浓度Oteplikin计数) (Replikin计数平均值被带有所绘标准偏差的黑色柱所举例说明)与疾病控制中心(CDC)报道的基于全国范围的美国每年的人类病例数之间的相关性。浏览此数据发现，包膜蛋白 的R印Iikin计数平均值的标准偏差在2000和2001年之间显著增加(ρ < 0. 001的统计学 显著性)。观察病毒种群的R印Iikin计数平均值的标准偏差的此种变化传达了所有常见流 感病毒种株的快速复制和R印Iikin计数范围的扩大(流感病毒被归类在显著不同于西尼 罗河病毒的病毒家族中)的信号。在流感中，在病毒爆发前观察到R印Iikin计数上的显著 统计变化。从2000至2003年在西尼罗河病毒中观察到的平均R印Iikin计数的增加发生 在被CDC独立记录并公布的人类西尼罗河病毒(WNV)病例的数量增加之前。同样详细的 R印Iikin计数与发病率关系已被显示在流感种株中，例如H5W与人的死亡率(参见图8)， 和H3N8马脑炎与马的发病率(参见图12)，和锥虫属恶性疟原虫(Plasmodium falciparum) (疟疾)与人的死亡率(参见图9)，和桃拉综合征病毒与虾的死亡率(参见图3-5)。因为所 述关系已经在若干物种即甲壳纲动物、马和人中被证明，而且因为R印Iikin序列已经与植 物、无脊椎动物、脊椎动物、原生动物(例如恶性疟原虫)、细菌(例如炭疽)和病毒(参见例 如编号为7，176，275和7，189，800的美国专利)的快速复制联系在一起，所以使R印Iikin 计数与发病率关联看上去是广泛分布的一般原则。图7中的数据另外举例说明，在2004年和又一次在2005年出现R印Iikin计数和 WNV人类病例数量二者的降低。在2006年，在R印Iikin计数增加之后在2007年人类病例 数量(发病率)增加。因此，图7举例说明R印Iikin浓度Oteplikin计数)的两个周期和 变化的WNV人类发病率的两个周期。在图7中观察到2000-2003年和2004-2008年之间的 两个周期(病毒R印Iikin周期)互相关联。在之前Hmi和H3N2流感病毒数据中已经观 察到R印Iikin计数的周期(参见例如图11)。所述关系在WNV数据中比它在流感数据中更 清楚地被证明，因为由Hmi或H3N2流感病毒所致的实际病例数在历史上对特定种株的记 录不像现在对西尼罗河病毒所记录的这样准确。相反地，Hmi和H3N2被记作爆发、流行或 大流行。在重复的周期中R印Iikin浓度Oteplikin计数)的逐步增加可用作预测病毒扩 张的方法。对R印Iikin计数的逐步增加的监测为技术人员提供了预测病毒种群扩张和造 成的包括病毒性疾病的爆发、流行或大流行的发病率的数据。这些事件实际的发病率未被 记录。应该注意的是，2007和2008年的R印Iikin计数的数据被排除在图7外，因为到本申 请撰写时为止，WNV序列的⑶C报告被推迟了。图7中的数据也是重要的，因为图7描述了一种在1999年第一次到达纽约市并在 之后蔓延到全美国的病毒的进展，而不是在许多先前的流行之后重返一个国家的病毒，例 如Hmi或H3N2的情况。从所述病毒的新发现的R印Iikin结构和⑶C提供的很好的流行 病学数据方面来看，存在着检查此种蔓延步骤的机会。图8举例说明在人H5m中R印Iikin峰基因pBl基因区域的R印Iikin计数与H5m 感染的人类病例中2003和2007年之间的人类死亡率百分数的关系。观察到H5W的pBl 基因区域中R印Iikin计数的增加与宿主的更高死亡率在数量上是相关的。在图中，(1)浅 灰色表示在指定年份全部病毒分离物的平均R印Iikin计数，(2)深灰色表示在指定年份人 H5N1分离物的公开可得的序列的pBl区域中的平均R印Iikin计数，(3)白色柱表示在指定 年份R印Iikin计数平均值的标准偏差，以及(4)黑色柱表示在指定年份被鉴定的H5W感 染的人病例的10%的死亡率百分数，其最终达到86%的死亡率(在图8中显示为8. 6)。
图9举例说明来自恶性疟原虫的每1000个临床人类病例的死亡率与恶性疟原虫 的ATP酶中的R印Iikin计数相关联。疟疾的高发病率和死亡率发生在20世纪90年代 晚期，而且这些率被认为是由于微生物的适应和抗疟疾药效果的降低所致。ATP酶是青蒿 素(arteminisin)治疗疟疾的首要靶。随着青蒿素使用的增加和公共健康措施的改善，从 1999年至2006年发病率和死亡率下降了。从1997年至1998年，恶性疟原虫的ATP酶的 Replikin计数和每个疟疾病例死亡率的增加一起增加了。从1998年至2006年，恶性疟原 虫的ATP酶的R印Iikin计数和死亡率一起减少了(目前可得的只贯穿于2005年的一致死 亡率)。1997至2005年的每1000个人类疟疾病例的死亡率如下1997年的死亡率是17 ； 1998年的死亡率是17 ；1999年的死亡率是19 ；2000年的死亡率是16 ；2001年的死亡率是 13 ；2002年的死亡率是10 ；2003年的死亡率是10 ；2004年的死亡率是9 ；而且2005年的死 亡率是9。死亡率如世界卫生组织所宣布的那样被记录。Slwww.who.int。图10举例说明在分离于1995和2007年之间的白斑综合征病毒(WSSV)的公开 可得的氨基酸序列中观察到的R印Iikin序列的平均R印Iikin计数和标准偏差与WSSV于 2001年在虾中的严重爆发之间的相关性。在2000年的R印Iikin浓度97. 6预言2001年的 爆发。此外，在来自2000年的WSSV分离物的核糖核苷酸还原酶蛋白序列中观察到R印1 ikin 浓度为103. 8，其中R印Iikin峰基因被鉴定具有甚至更高的R印Iikin浓度110. 7。图11举例说明在上世纪三次流感大流行中的总的血凝素R印Iikin计数。种株特 异性的高R印Iikin计数伴随着三次大流行中的每一次1918、1957和1968。在所有情况 下，此峰之后是减退(很可能是由于宿主的免疫力所致)，然后是恢复的以及“反弹的”流 行。这些相关是由于偶然性的概率非常低所致，因为它们对每个种株是特定的，对该世纪三 个大流行年份中的每一个是特定的，对每次大流行后的减退是特定的，并且对每次反弹流 行是特定的。图12显示1977-2007年间在马流感的ρΒ1、ρΒ2和pA基因组区域内被鉴定的 Replikin峰基因的R印Iikin计数与H3N8马流感所致的马脑炎流行病之间的关系。系列1 反映在所述基因组的PBl区域的R印Iikin峰基因中被鉴定的平均R印Iikin计数。系列2 反映PBl基因区域中的平均R印Iikin计数的标准偏差。系列3反映在所述基因组的pA基 因区域的R印Iikin峰基因中被鉴定的R印Iikin计数，其中所述pA基因区域与pBl基因区 域相邻。系列4反映在所述基因组的pB2基因区域的R印Iikin峰基因中被鉴定的R印Iikin 计数，其中所述PB2基因区域也与pBl基因区域相邻。据观察，pBl基因区域中的R印Iikin 计数的增加在流行病爆发前一至三年发生，而没有观察到PB2和pA基因区域中R印Iikin 计数的增加。发明详述定义如本文所用，“合成肽”指的是通过一种过程产生的肽，其中所述过程的至少一个 步骤是在活细胞外进行的，而且此过程是被人直接地或间接地启动或指挥的。如本文所用，“水产养殖”指的是天然水产物的养殖，例如有壳的水生动物的养殖。如本文所用，“施用(administer) ”、“施用(administration) ”或相关术语指的是 为了治疗目的而将一种化合物引入动物或其他受治疗者，其中所述引入可以由通过口的应 用、在皮肤上的应用、穿过皮肤的应用、穿过鳃的应用、经皮注射的应用或使用本领域技术人员现在和以后知道的任何其他方法的应用而完成，由此所述化合物被直接或间接地引入 动物或其他受治疗者体内。如本文所用，一种肽或其他化合物是“免疫原性的”，如果它能够独立地或与其他 化合物一起刺激活动物中的免疫应答或抵抗力应答。如本文所用，刺激“抵抗力，，或刺激发展“有抵抗力的，，无脊椎动物或其他动物的 化合物、治疗或疗法是能够独立地或与其他化合物、治疗或疗法一起刺激活动物包括例如 无脊椎动物中的免疫应答或抵抗力应答的化合物、处理或治疗。如本文所用，“治疗浓度”指的是病原体疾病在所述疾病至少一个生命周期中在统 计学可测量的水平上被抑制的治疗剂浓度。如本文所用，“亚治疗浓度”指的是病原体疾病在所述疾病至少一个生命周期中在 统计学可测量的水平上没有被抑制的治疗剂浓度。如本文所用，“疫苗”指的是一种能够刺激针对病原体的抵抗力或免疫应答的化合 物对动物或人体的施用。施用可以是通过口、鳃、经皮注射、浸没在一种浓度的疫苗中或本 领域技术人员现在和以后知道的任何其他施用方法。无脊椎动物例如虾、蛤蛘、扇贝等的免 疫系统的详情未被完全理解。例如，虾表面上可能不产生抗体。然而，本文的数据证实了对 于感染的抵抗现象。这种抵抗可以是基于“原始的免疫系统”。虽然不被理论所限制，但是 虾和一些其他无脊椎动物的“原始的免疫系统”被推理为与其他动物中的“Toll受体”和相 关系统类似。如本文所用，“动物”包括虾和任何其他动物。如本文所用，“无脊椎动物”指的是缺少脊柱的任何动物。容易水产养殖的无脊椎 动物包括但不限于软体动物、甲壳纲动物和棘皮动物。软体动物包括但不限于蛤、贻贝、牡 蛎、螺、扇贝和头足类动物如乌贼、章鱼、墨鱼和陆栖蜗牛。甲壳纲动物包括但不限于虾、蟹、 龙虾、对虾和螯虾。棘皮动物包括但不限于海参和海胆。如本文所用，“甲壳纲动物”根据本领域技术人员的理解是一组通常为水生的节肢 动物，并且包括但不限于虾、蟹、龙虾、对虾和螯虾。如本文所用，术语“肽”或“蛋白”指的是含有两个或多个氨基酸的化合物，其中一 个氨基酸的羧基通过肽键被连到另一个氨基酸的氨基。如本文所用，一种“分离的”或“纯 化的”肽或其生物活性部分指的是纯化后基本上不含来自衍生所述肽的细胞或组织来源的 细胞物质或其他污染蛋白或肽的一种肽。一种“合成的”或“被合成的”肽或其生物活性部 分指的是合成后基本时不含使用任何方法化学合成时的化学前体或其他化学药品，或基本 不含使用重组基因技术合成时的污染肽的一种肽。“被编码的”蛋白、蛋白序列、蛋白片段序列或肽序列是由编码所述蛋白或肽序列 的氨基酸的核酸序列所编码的肽序列，其中所述核酸使用本领域技术人员现在或以后知道 的任何密码子编码氨基酸。应该注意，本领域众所周知的是，由于遗传密码的冗余性，密码 子中单个核苷酸可容易地变换并仍然产生相同的氨基酸序列。将被本领域技术人员所理解 的是，鉴定R印Iikin氨基酸序列的方法还包括鉴定编码R印Iikin氨基酸序列的核酸序列 的方法，其中所述R印Iikin氨基酸序列由被鉴定的核酸序列所编码。如本文所用，Replikin序列是含有7至约50个氨基酸的氨基酸序列，其包括(1)位于距离第二个赖氨酸残基六至十个氨基酸残基处的至少一个赖氨酸残基；
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(2)至少一个组氨酸残基；和(3)至少6 %的赖氨酸残基。R印Iikin序列可包括一个末端赖氨酸并还可包括一个末端赖氨酸或末端组氨酸。 R印Iikin肽或R印Iikin蛋白是由R印Iikin序列组成的肽或蛋白。R印Iikin序列还可被 描述为7至约50个氨基酸的R印Iikin序列，其包括R印Iikin模体或由R印Iikin模体组 成，其中所述replikin模体包括(1)位于所述分离的肽的第一个末端的至少一个赖氨酸残 基和位于所述分离的肽的第二个末端的至少一个赖氨酸残基或至少一个组氨酸残基；(2) 位于距离第二个赖氨酸残基六至十个残基处的第一个赖氨酸残基；(3)至少一个组氨酸残 基；和(4)至少6%的赖氨酸残基。为了确定R印Iikin浓度，R印Iikin序列必须在一个末 端处具有赖氨酸残基和在另一个末端出具有赖氨酸残基或组氨酸残基。术语“R印Iikin序列”也可以指编码具有7至约50个氨基酸的氨基酸序列的核酸 序列，其中所述氨基酸序列包括(1)位于距离第二个赖氨酸残基六至十个氨基酸残基处的至少一个赖氨酸残基；(2)至少一个组氨酸残基；和(3)至少6%的赖氨酸残基，其中所述氨基酸序列可包括一个末端赖氨酸并还可包括一个末端赖氨酸或末端 组氨酸。如本文所用，R印Iikin峰基因(RPG)或R印Iikin峰基因区域(RPGA)可互换地 被用来指基因组区段、蛋白、蛋白区段或蛋白片段，其中被表达的基因或基因区段当与所述 基因组的其他区段或命名的基因相比时具有最高浓度的R印Iikin(每100个氨基酸中的 R印Iikin序列个数)，所述基因组具有连续的、不间断的和重叠的R印Iikin序列。一般地， 与全蛋白相关的基因或基因区段或表达蛋白的基因被称为R印Iikin峰基因，而与蛋白片 段相关的基因或基因区段被称为R印Iikin峰基因区域。在基因、基因区段、蛋白或蛋白片 段中可以鉴定不止一个RPG或RPGA。RPG或RPGA可具有一个末端赖氨酸或一个末端组氨 酸、两个末端赖氨酸、或一个末端赖氨酸和一个末端组氨酸。RPG或RPGA可同样地既不具有 末端赖氨酸也不具有末端组氨酸，只要它含有由R印Iikin序列的定义所定义的R印Iikin 序列，即，具有7至约50个氨基酸的氨基酸序列，其包括(1)位于距离第二个赖氨酸残基六至十个氨基酸残基处的至少一个赖氨酸残基；(2)至少一个组氨酸残基；和(3)至少6 %的赖氨酸残基。如本文所用，“新出现的种株”指的是被鉴定为相对于这种有机体的其他种株 中R印Iikin的浓度具有被提高的或正在提高的浓度的它的一个或多个蛋白序列中的 Replikin序列的病毒或其他病原体的种株。病毒的新出现的种株指示毒性或复制的提高。如本文所用，“爆发”是在与相同病毒性疾病中较早出现的感染的流行病学模式相 比之下病毒性疾病的毒力、发病率或死亡率的增加。如本文所用，“R印Iikin计数”或“Replikin浓度”指的是在蛋白、蛋白片段、病毒 或生物体中每100个氨基酸中R印Iikin的数量。已经发现，在病毒或生物体的第一个种株 中的较高R印Iikin浓度与第一种病毒或生物体的更快速的复制相关，相比之下所述病毒 或生物体的第二个较早或较晚出现的种株具有较低的R印Iikin浓度。
如本文所用，“R印Iikin支架”指的是一系列保守的R印Iikin肽，其中每个所述 Replikin肽序列包括约16至约34个氨基酸以及优选地约28至约33个氨基酸，并且还包 括(1) 一个末端赖氨酸和任选地紧邻所述末端赖氨酸的一个赖氨酸；(2) —个末端组氨酸 和任选地紧邻所述末端组氨酸的一个组氨酸；(3)距离另一个赖氨酸6至10个氨基酸残基 以内的一个赖氨酸；和(4)约6%的赖氨酸。“R印Iikin支架”还指一系列R印Iikin支架 的单个成员或多个成员。在桃拉综合征病毒中，R印Iikin支架可指包括约16至约34个氨基酸残基、优选地 约27至约33个氨基酸残基和更优选地约30至33个氨基酸残基的R印Iikin肽序列。在 流感病毒中，R印Iikin支架可指包括约16至约34个氨基酸残基和更优选地约28至30个 氨基酸残基的R印Iikin肽序列。在白斑综合征病毒中，R印Iikin支架可指包括约16至约 34个氨基酸残基和更优选地约27至29个氨基酸残基的R印Iikin肽序列。如本文所用，虾的“生命周期”基本上从虾能用口进食之时延伸直到虾被收获。如本文所用，“时间段”或“时间点”是可以彼此区分开的任两个时间段或点。例 如，2004年分离的病毒分离物在与2005年分离的相同病毒分离物的不同时间段被分离。同 样地，2004年5月分离的病毒分离物在与2004年六月分离的相同病毒分离物的不同时间段 被分离。作为包括虾在内的无脊椎动物中的治疗化合物的R印Iikin序列本发明人已经将水产养殖的无脊椎动物的病原体基因组中的R印Iikin序列(其 包括在桃拉综合征病毒(TSV)基因组中的R印Iikin序列)鉴定为针对例如虾、扇贝、牡蛎、 龙虾等无脊椎动物中病毒、细菌和原生动物疾病的治疗化合物。被鉴定的治疗化合物激发 被病原体攻击的无脊椎动物的抵抗力，其中所述病原体例如是衣原体样、立克次氏体样、弧 菌、桃拉综合征病毒、白斑综合征病毒和其他病原体。被鉴定的序列是分离的或被合成的 由7至约50个氨基酸组成的R印Iikin肽，其包括R印Iikin模体，所述R印Iikin模体包括 (1)位于所述模体的第一个末端的至少一个赖氨酸残基和位于所述模体的第二个末端的至 少一个赖氨酸残基或至少一个组氨酸残基、(2)位于距离第二个赖氨酸残基六至十个残基 处的第一个赖氨酸残基、(3)至少一个组氨酸残基和(4)至少6%的赖氨酸残基，其中所述 分离的或被合成的肽是通过选择被鉴定的模体以及分离或合成包括所述模体的所述肽而 被分离或合成的。在一个进一步的实施方案中，R印Iikin肽由所述R印Iikin模体组成。技 术人员将理解如何使用上述方法分离和合成R印Iikin肽。可以使用生产已知结构的肽的 任何方法。R印Iikin肽已经与植物、动物、细菌、病毒、恶性疟原虫和其他生物中的快速复制 相关联。参见序列号为7, 176，275和7，189，800的美国专利。R印Iikin还已经与例如流 感、西尼罗河病毒、疟疾、白斑综合征病毒和桃拉综合征病毒的病原体的毒力、发病率和死 亡率相关联。参见图6-12。此外，迄今进行的包括鸡、兔、虾和人的所有测试或研究都显 示，R印Iikin序列是免疫原性的和/或激发抵抗力的，或二者。参见2006年2月16日提 交的序列号为11/355，120的美国申请(实施例6和7)、序列号为6，638，505的美国专利。 此外，病原体基因组中R印Iikin序列(或病原体基因组中特别感兴趣的区域，其被称为 R印Iikin峰基因)的浓度已经与病原性爆发、发病率和死亡率相关联。参见图3-12。特 别地，Replikin浓度已经与桃拉综合征病毒中无脊椎动物(虾)的死亡率以及桃拉综合征 病毒和白斑综合征病毒二者中无脊椎动物(虾)的病原性爆发相关联。参见图3-6和10。R印Iikin序列已经广泛地与毒力、发病率和死亡率相关，并且一致地与马、兔、鸡、人和虾的 免疫原性和抵抗力相关。这些大范围的数据为含有R印Iikin序列的疫苗提供支持，其包括 对含有来自水产养殖中的病原体的Replikin序列的疫苗的支持。在水产养殖的无脊椎动物的病原体中鉴定的分离的或被合成的R印Iikin肽然后 被喂、被注射或以其他方式被施用于例如虾、扇贝、牡蛎、龙虾等无脊椎动物，作为在病原体 疾病包括TSV或其他病原体疾病的预测爆发之前或在所述疾病的爆发之中对抗所述疾病 可能的爆发的预防药。所述肽可被单独地或与普通饲料或为了携带所述肽而配制的补充饲 料一起被施用于无脊椎动物。技术人员将理解，可以使用配制饲料的任何方法，其中所述方 法经口服为无脊椎动物提供R印Iikin序列。可以将稳定剂或防腐剂或两者加入R印Iikin 序列的混合物或R印Iikin序列和无脊椎动物饲料的混合物中以在一段时间内维持治疗有 效的定量喂食和治疗所养殖的包括虾、扇贝、牡蛎、蛤、蟹、鲍鱼、龙虾等的无脊椎动物。技术 人员将理解对于使饲料和治疗混合物中短肽稳定的方法的广泛选择。可以在感染发生之前或之后施用治疗或亚治疗水平的肽。还可对慢性感染的群体 进行施用。在病原体基因组中被鉴定的或被鉴定为由病原体所表达的任何R印Iikin可作为 治疗化合物被施用以激发虾的抵抗力应答。下面的示范性序列可作为对抗桃拉综合征病 毒的疫苗单独地或以任何组合被喂给虾KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK(SEQ ID NO. 2)、KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQID NO. 4)、HRKVPCEQK (SEQ ID NO. 5), KVPCEQKIffLH (SEQ IDNO. 6)、KIWLHQNPGK (SEQ ID NO. 7)、HQNPGKTQQDMK (SEQID NO. 8)、KGNTRVHVK(SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK(SEQ IDNO. 10)或 HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。与所有桃拉综合征病毒Iteplikin序列一样，包括如下所讨论的R印Iikin序列和 R印Iikin支架序列的示范性序列可以被喂，或以浸入施用方法被使用，或被注射。所述序列 可被单独地或以任何组合被施用，其中所述组合包括肽的等重组合。含有约7至约50个氨 基酸的任何R印Iikin序列或免疫原性序列可被用作施用于无脊椎动物的化合物，包括用 作疫苗。例如，SEQ ID N0. 1-11、86、87、103-112和114-198中的每一个可被单独地或以组 合被用作施用于无脊椎动物以对抗TSV感染的化合物。病毒载量的减少和剂量响应曲线免疫原性的或激发抵抗力的合成肽可以以每天每只受治疗的无脊椎动物的每克 体重约0. OOlmg至约IOmg合成肽的量、以每天每只受治疗的无脊椎动物的每克体重约 0. 005mg至约5mg合成肽的量、以每天每只受治疗的无脊椎动物的每克体重约0. Olmg至约 2mg合成肽的量、以每天每只受治疗的无脊椎动物的每克体重约0. 02mg至约1. 5mg合成肽 的量、以每天每只受治疗的无脊椎动物的每克体重约0. OSmg至约1. Omg合成肽的量、以每 天每只受治疗的无脊椎动物的每克体重约0. Img至约0. 9mg合成肽的量、以每天每只受治 疗的无脊椎动物的每克体重约0. 2mg至约0. Smg合成肽的量、以每天每只受治疗的无脊椎 动物的每克体重约0. 5mg合成肽的量施用于无脊椎动物。本领域技术人员将理解如何确定 适合于治疗或亚治疗施用的合成肽剂量。现在已经在虾中测试了含有等重肽的混合物的TSV疫苗剂量并显示其提供保护 作用。已经测试了下面的肽KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2)、 KAENEFffDGVKQSH(SEQID NO. 3)、KGHRKVPCEQK(SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK(SEQ IDNO. 5)、KVPCEQKIffLH (SEQ ID NO. 6), KIffLHQNPGK (SEQ IDNO. 7)、HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8), KGNTRVHVK (SEQ IDNO. 9)、KEHVEKIVDK (SEQ ID NO. 10)和 HVEKIVDKAK (SEQ IDNO. 11)。在不 同实验中，所述疫苗以每天被测试虾的每克体重大约0. 02,0. 08和0. 50mg Replikin疫苗 的量被施用。所述剂量是近似的，由于个体虾消耗的个体差异。被重Ig至4g的虾口服摄 取后，所有三种剂量水平都被很好地耐受，而且与未被接种的对照相比，所有都在虾中产生 统计学上显著的较低的病毒载量。0. OSmg和0. 5mg剂量提供了统计学上显著的保护。最低 的剂量0. 02mg在两个实验之一中提供了未达到统计学显著性的保护，然而如上面所证明， 观察到统计学上显著的较低的病毒载量。每“克虾”0. 50mg的剂量(迄今被测的最高剂量) 提供了统计学上最显著的保护91%。因此，从迄今的结果来看，每“克虾”0. 50mg的剂量和 可能地更高一些，是本发明一个方面的优选的实施方案。在约七天或更少时间以内的疫苗生产本发明另一个非限制性的方面提供一种生产疫苗的方法，其中至少一种R印Iikin 序列在病原体内被鉴定而且所述至少一种R印Iikin序列作为疫苗的活性剂被化学合成。 本发明人已经在从病原体被鉴定之时开始七天或更少的时间内成功地生产了这样一种有 效的疫苗。一旦病原体被鉴定，其基因组就被确定。技术人员然后使用例如 ReplikinsForecast (Replikins LLC，波士顿，马萨诸塞州)来调查基因组的R印Iikin序 列。一旦R印Iikin序列被鉴定，任何一个或多个R印Iikin序列被选作化学合成。优选 的R印Iikin序列可以是在R印Iikin峰基因中鉴定的R印Iikin序列。被鉴定的至少一种 R印Iikin序列的化学合成是按本领域技术人员所理解的那样而进行。所述合成肽然后被施用于病原体的宿主。疫苗的施用可以是口服，与食物源混合 用于口服食用，通过鳃，在浓缩的浸液中使疫苗通过鳃、皮肤、口等被吸收入体内，通过注射 或使用本领域技术人员现在和以后知道的任何其他方法。所述疫苗可与药学上可接受的载 体、赋形剂、结合剂或本领域技术人员已知的其他有帮助的化合物、辅助剂、溶液或混合物 组合。所述方法可在七天或更少的时间内完成，这是基于在病原体基因组中鉴定 R印Iikin序列的容易性和化学合成大量肽的容易性。在七天或更少的时间内为疫苗提供有 效的活性成分的这个新方法解决了本领域一个关键问题，因为目前的疫苗生产方法通常需 要三至十二个月。疫苗生产的这种耽搁可能在流行病早已经结束之后，或在流行病仍活跃 但病原体的变异已经使疫苗不太有效或无效之后，才能供应疫苗。疫苗开发的长过程对于 卫生专业人员和政府是很大的烦恼。本发明人现在已经提供一种方法以大大地减少疫苗开 发的耽搁。养殖的无脊椎动物的抵抗系的开发本发明另一个非限制性的方面提供一种增加无脊椎动物对病原体的抵抗力的方 法，其包括(1)使用所述病原体攻击与所述无脊椎动物同种的多个无脊椎动物，所述病原体 的水平足以使所述多个无脊椎动物的至少一个个体致病；(2)将患病的或死亡的所述多个无脊椎动物的至少一个个体丢弃；(3)重复步骤(1)和⑵至少一次；并且
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(4)至少一次地在步骤(1)、(2)和/或(3)中对所述多个无脊椎动物施用权利要 求1的物质，其增加所述无脊椎动物对病原体的抵抗力。所述过程可被重复若干次，直至在养殖的无脊椎动物中观察到期望水平的存活 率，包括100%存活率。养殖的有抵抗力的无脊椎动物然后可被用作繁殖种以生产水产养殖 的无脊椎动物的抵抗系。包括免疫原性肽的化合物可在每次重复步骤1和2时被施用，可 在第二次重复步骤1和2时被施用，或可在之后某次重复步骤1和2时被施用。如下面的 实施例3和图2所证明，在对每克虾体重施用约0. 5mg的包括i^一种等重的桃拉综合征病 毒免疫原性肽的化合物之前被桃拉综合征病毒慢性感染的虾提供了 91 %的被TSV攻击的 虾的存活率。相比之下，只有25%的之前未被TSV攻击且未被施用疫苗的虾在攻击中存活 了下来。进一步地，75%的被TSV慢性感染且未被施用疫苗的虾另外在攻击中存活了下来。实施例3和图2中报告的试验证明，与疫苗处理结合的耐受抵抗力迄今已经提供 了所观察到的针对TSV攻击的最高度保护。像这样，本发明的一个方面提供了一种提高抵 抗力的方法，其使用所选病原体对无脊椎动物的周期攻击并与疫苗的施用相结合。在一 个优选的实施方案中，疫苗的至少一种分离的或合成的肽是R印Iikin肽。R印Iikin肽已 被证明激发脊椎动物和无脊椎动物中的免疫原性和/或抵抗力应答。例如，针对SARS的 Replikin序列和H5W流感病毒R印Iikin支架的疫苗产品已经被证明，参见例如2006年2 月16日提交的序列号为11/355，120的美国申请(实施例6和7)，所有在兔或鸡上测试的 Replikin序列诱导了免疫应答，而且神经胶质瘤R印Iikin序列已经在癌细胞中被鉴定且 被分离或合成为肽，其中所述肽在兔中诱导免疫应答并与人的天然抗体应答发生反应。参 见美国专利号6，638，505。Replikin结构的保守性与毒力和致死性相关任何结构的保守性对于此结构是否提供用来攻击和破坏或刺激的稳定不变的靶 来说是重要的。已经显示，R印Iikin序列通常是保守的。当一个结构被以某种方式与该生 物体的基本生存机制相关联时，所述结构往往是保守的。变化的结构提供不恒定的靶，这是 避免袭击者的好策略，其中所述袭击者例如针对先前结构专门生成的并因此对修改形式无 效的抗体。此策略被流感病毒所用，例如，以致先前疫苗在应对当前有毒性的病毒时可能是 非常无效的。然而，与存活功能太紧密联系的特定结构显然不能经常改变。R印Iikin结构的一 个必需成分是组氨酸(h)，已知其经常与氧化还原酶中的金属基团结合并且是复制所需的 能量的可能来源。因为组氨酸结构保持不变，Replikin序列结构更保持为用于破坏或刺激 的靶具有吸引力。此外，如下面表1和2中所证明，R印Iikin结构在有毒性的病原体中通 常是保守的，其中所述病原体包括无脊椎动物的病原体。鉴于R印Iikin结构在无脊椎动物病原体中的保守性，本发明的一个方面提供针 对至少一种分离的或被合成的R印Iikin序列的抗体或抗体片段或抗R印Iikin的小分子， 其中所述分离的或被合成的R印Iikin序列是在水产养殖病原体的蛋白或蛋白片段中或 在R印Iikin峰基因中或在包括水产养殖病原体的R印Iikin峰基因的蛋白或基因区域中。 Replikin的抗体和抗R印Iikin的小分子作为针对病原体爆发的疗法是有用的。在鉴定病 原体中的R印Iikin序列后，本领域技术人员知道很多为了治疗和诊断的目的而开发抗体 或抗体片段的途径。本领域技术人员同样知道如何生产用来结合被鉴定的R印Iikin序列的小分子。作为治疗靶和预示器的R印Iikin支架本发明人已经在流感、白斑综合征病毒和桃拉综合征病毒的种株中证实， Replikin支架的存在预示了流行病。像这样，除了病毒中R印Iikin的总数外，跨越时间 的每个R印Iikin的结构是富含信息的，而且R印Iikin支架提供用来鉴定和控制快速复制 的特别有用的靶，其中所述快速复制包括病原体疾病在水产养殖的无脊椎动物包括虾中的 爆发。下面的表1显示1917年在被流感感染的鹅中第一次观察到的R印Iikin支架(鹅 Replikin)。几十年来，恒定的长度、恒定的氨基末端的赖氨酸和羧基末端的组氨酸残基在 不同种株中在固定的支架中是保守的。鹅R印Iikin的同系物从1917年直至2006年在包 括对1918年、1957年和1968年三次大流行负责的每个种株HlNl、H2N2和H3N2的种株中 出现。含有其他取代的同系物也在H1N2、H7N7、H5N2和H5m中被观察到。ΜΛ 在与快速复制相关的流感病毒R印Iikin肽的89年的保守性中显示有序取 代的R印Iikin支架，从1917年鹅流感的R印Iikin和1918年人类大流行的R印Iikin到 2006年H5N1 “禽流感”的同系物。(SEQ ID NO. 12-74，分别地，按出现顺序)
年份
2 9个氨基酸
kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kkg圓sypklsksyjnnkgkevlvlwgvhh
kk^sypklsk、sy^nnkgkevlvlwgvhh kkg^sypkl^s y^nnkgkevlvlwgvhh kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kkg_sypklsksytnnkgkevlv||wgvhh kkg^sypklsksytnnkgkevlvilwgvhh kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kk^sypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kkgtsypklsksytnnkgkevlvlwgvhh kkg^sypklsksytnnkgkevlv_wgvhh
1917
1918
1930 1933
1976
1977
1979
1980
1980
1981 1981 1985 1991
种林
H1N_ 流感鹅 Replikin HlNl人流感大流行
HlNl HONl HlNl HlNl HlNl HlNl HlNl HlNl HlNl HlNl HlNl
2权利要求
一种用于在水产养殖中提高无脊椎动物的抵抗力的物质，其包括至少一种分离的或合成的肽，所述至少一种分离的或合成的肽是来自所述无脊椎动物的病原体的至少一种肽的至少一种分离的或合成的形式，其中所述至少一种分离的或合成的肽是由7至约50个氨基酸组成的至少一种分离的或合成的Replikin肽，其包括一个Replikin模体，其中所述Replikin模体包括(1)位于所述模体的第一个末端的至少一个赖氨酸残基和位于所述模体的第二个末端的至少一个赖氨酸残基或至少一个组氨酸残基；(2)位于距离第二个赖氨酸残基六至十个残基处的至少一个赖氨酸残基；(3)至少一个组氨酸残基；和(4)至少百分之六的赖氨酸残基。
2.如权利要求1所述的物质，其中所述无脊椎动物是甲壳纲动物。
3.如权利要求2所述的物质，其中所述甲壳纲动物是虾。
4.如权利要求1所述的物质，其中所述至少一种分离的或合成的肽是合成的。
5.如权利要求1所述的物质，其中所述至少一种分离的或合成的R印Iikin肽由所述 R印Iikin模体组成。
6.如权利要求5所述的物质，其中所述R印Iikin模体由7至约10个、约10至约15个 氨基酸、约15至约20个氨基酸、约20至约25个氨基酸、约25至约30个氨基酸、约30至 约35个氨基酸、约35至约40个氨基酸、约40至约45个氨基酸或约45至约50个氨基酸 组成。
7.如权利要求4所述的物质，其中所述至少一种分离的或合成的R印Iikin肽 包括下述中的至少一种:KVGSRRYKSH (SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2)、 KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK (SEQ ID NO. 5)、 KVPCEQKIffLH (SEQ ID NO. 6), KIffLHQNPGK (SEQ ID NO. 7)、HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、 KGNTRVHVK(SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK(SEQ ID NO. 10)和 HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。
8.如权利要求4所述的物质，其中所述物质包括分离的或合成的R印likir^t KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK(SEQID NO. 2),KAENEFffDGVKQSH(SEQ ID NO. 3)、 KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK (SEQ ID NO. 5), KVPCEQKIffLH (SEQ ID NO. 6)、 KIffLHQNPGK (SEQ ID NO. 7)、HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、KGNTRVHVK (SEQ ID NO. 9)、 KEHVEKIVDK (SEQ ID NO. 10)和 HVEKIVDKAK (SEQ ID NO. 11)中两种或多种的混合物。
9.一种疫苗，其包括权利要求1所述的物质。
10.一种疫苗，其包括权利要求6所述的物质。
11.如权利要求9所述的疫苗，其还包括药学上可接受的载体。
12.如权利要求11所述的疫苗，其中所述疫苗提供针对甲壳纲动物中至少一种病原体 的保护。
13.如权利要求11所述的疫苗，其中所述疫苗提供针对虾中至少一种病原体的保护。
14.如权利要求13所述的疫苗，其中所述病原体是病毒。
15.如权利要求14所述的疫苗，其中所述病原体是桃拉综合征病毒。
16.如权利要求13所述的疫苗，其中所述疫苗与虾饲料混合。
17.如权利要求16所述的疫苗，其中所述疫苗与每日定量的虾饲料混合。
18.如权利要求15所述的疫苗，其中所述至少一种分离的或合成的肽是 KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK (SEQ IDNO. 2), KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK(SEQID NO. 4)、HRKVPCEQK(SEQ ID NO. 5),KVPCEQKIffLH(SEQ IDNO. 6)、 KIffLHQNPGK (SEQ ID NO. 7)、HQNPGKTQQDMK (SEQID NO. 8)、KGNTRVHVK (SEQ ID NO. 9)、 KEHVEKIVDK(SEQ IDNO. 10)和 / 或 HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。
19.如权利要求18所述的疫苗，其包括分离的或合成的肽KVGSRRYKSH(SEQID NO. 1)、 HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2), KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK(SEQ ID NO. 5),KVPCEQKIffLH(SEQ ID NO. 6),KIffLHQNPGK(SEQ ID NO. 7)、 HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、KGNTRVHVK (SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK (SEQ ID NO. 10)禾口 HVEKIVDKAK (SEQ ID NO. 11)中两种或多种的混合物。
20.如权利要求19所述的疫苗，其包括分离的或合成的肽KVGSRRYKSH(SEQID NO. 1)、 HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2), KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQ ID NO. 4)、HRKVPCEQK (SEQ ID NO. 5)、KVPCEQKIWIH(SEQ ID NO. 6) ,KIffLHQNPGK (SEQ ID NO. 7)、 HQNPGKTQQDMK (SEQ ID NO. 8)、KGNTRVHVK (SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK (SEQ ID NO. 10)禾口 HVEKIVDKAK (SEQ ID NO. 11)的混合物。
21.如权利要求20所述的疫苗，其包括所述分离的或合成的肽中每种的等重混合物。
22.如权利要求20所述的疫苗，其中将所述物质以每天每只虾的每克体重约0.Olmg至 约2mg疫苗的剂量施用于虾。
23.如权利要求22所述的疫苗，其中所述剂量是每天每只虾的每克体重约0.2mg至 1. Omg疫苗。
24.如权利要求23所述的疫苗，其中所述剂量是每天每只虾的每克体重约0.5mg疫苗。
25.如权利要求15所述的疫苗，其中所述至少一种分离的或合成的R印Iikin肽是存在 于新出现的桃拉综合征病毒种株中的至少一种R印Iikin肽的至少一种分离的或合成的形式。
26.如权利要求15所述的疫苗，其中将所述疫苗作为预防性疗法在桃拉综合征病毒的 症状发作前施用于虾。
27.如权利要求15所述的疫苗，其中将所述疫苗作为疗法在桃拉综合征病毒的症状发 作后施用于虾。
28.如权利要求15所述的疫苗，其中将所述疫苗作为预防性疗法以亚治疗浓度施用于虾。
29.如权利要求28所述的疫苗，其中在至少一只虾的基本上全部的生命周期中施用所 述疫苗。
30.一种在无脊椎动物中提供对病原体的抵抗力的方法，其包括对所述无脊椎动物施 用权利要求1的物质。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述物质被通过口服、通过将所述无脊椎动物浸 没在含有所述物质的水介质中或通过注射施用。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述物质被口服施用。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述无脊椎动物是甲壳纲动物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述甲壳纲动物是虾。
35.一种由7至约50个氨基酸组成的分离的或合成的桃拉综合征病毒R印Iikin肽，其 中所述R印Iikin肽包括R印Iikin模体，所述Mplikin模体包括(1)位于所述模体的第一个末端的至少一个赖氨酸残基和位于所述模体的第二个末端 的至少一个赖氨酸残基或至少一个组氨酸残基；(2)位于距离第二个赖氨酸残基六至十个残基处的至少一个赖氨酸残基；(3)至少一个组氨酸残基；和(4)至少百分之六的赖氨酸残基。
36.如权利要求35所述的分离的或合成的桃拉综合征病毒R印Iikin肽，其中所述 Replikin肽由所述R印Iikin模体组成。
37.一种分离的或合成的核苷酸序列，其编码权利要求35的桃拉综合征病毒R印Iikin肽。
38.一种由约16至约34个氨基酸组成的分离的或合成的桃拉综合征病毒R印Iikin支 架肽，其包括(1) 一个末端赖氨酸和任选地紧邻所述末端赖氨酸的一个赖氨酸；(2) —个 末端组氨酸和任选地紧邻所述末端组氨酸的一个组氨酸；(3)距离另一个赖氨酸约6至约 10个氨基酸以内的一个赖氨酸；和(4)至少6%的赖氨酸。
39.如权利要求38所述的分离的或合成的桃拉综合征病毒R印Iikin支架肽，其中所述 肽由28至33个氨基酸组成。
40.如权利要求39所述的肽，其包括KKVQANKTRVFAASNQGLALALRRYYLSFLDH(SEQ ID NO. 197)或KKACRNAGYKEACLHELDCKSFLL AQQGRAGAH(SEQ ID NO. 198)。
41.一种增加无脊椎动物对病原体的抵抗力的方法，其包括(1)使用所述病原体攻击与所述无脊椎动物同种的多个无脊椎动物，所述病原体的水 平足以使所述多个无脊椎动物的至少一个个体致病；(2)将患病的或死亡的所述多个无脊椎动物的至少一个个体丢弃；(3)重复步骤1和2至少一次；并且(4)至少一次地在步骤⑴、(2)和/或(3)中对所述多个无脊椎动物施用权利要求1 的物质，其增加所述无脊椎动物对所述病原体的抵抗力。
42.如权利要求41所述的方法，其中步骤(4)通过至少一次地在步骤(1)、(2)和/或 (3)中对所述多个无脊椎动物施用权利要求7的物质而进行。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述无脊椎动物是虾。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述病原体是桃拉综合征病毒。
45.一种生产疫苗的方法，其包括(1)从能够在水介质中养殖的无脊椎动物的病原体 中鉴定至少一种R印Iikin序列，和(2)化学合成至少一种被鉴定的R印Iikin序列作为所 述疫苗的活性剂。
46.如权利要求45所述的方法，其中从在所述病原体内所述至少一种R印Iikin序列被 鉴定时起的七天或更少的时间内生产所述疫苗。
47.动物饲料，其包括权利要求1的物质。
48.动物饲料，其包括虾生产Rangen35麦芽浆、1 %的海藻酸钠、1 %的六偏磷酸钠 和至少一种合成的R印Iikin肽，所述合成的R印Iikin肽是KVGSRRYKSH(SEQ ID NO. 1)、HFATKCFGEVPKK (SEQ ID NO. 2), KAENEFffDGVKQSH (SEQ ID NO. 3)、KGHRKVPCEQK (SEQID NO. 4)、HRKVPCEQK(SEQ ID NO. 5),KVPCEQKIffLH(SEQ IDNO. 6)、KIWLHQNPGK(SEQ ID NO. 7)、 HQNPGKTQQDMK(SEQID NO. 8)、KGNTRVHVK(SEQ ID NO. 9)、KEHVEKIVDK(SEQ IDNO. 10)或 HVEKIVDKAK(SEQ ID NO. 11)。
49.用权利要求13的疫苗处理的虾。
50.如权利要求1所述的物质，其中所述无脊椎动物是蛤、贻贝、扇贝、牡蛎、其他软体 动物、螯虾或龙虾。
51.如权利要求11所述的疫苗，其中所述疫苗提供针对于蛤、贻贝、扇贝、牡蛎、其他软 体动物、螯虾或龙虾的至少一种病原体的保护。
52.如权利要求30所述的方法，其中所述无脊椎动物是蛤、贻贝、扇贝、牡蛎、其他软体 动物、螯虾或龙虾。
53.如权利要求42所述的方法，其中所述无脊椎动物是蛤、贻贝、扇贝、牡蛎、其他软体 动物、螯虾或龙虾。
54.一种用于水产养殖的物质，其包括含有约7至约50个氨基酸的至少一种合成肽，其 中当在水产养殖中所述至少一种合成肽被施用于至少一种无脊椎动物时增加所述至少一 种无脊椎动物对至少一种病原体的抵抗力。
55.一种疫苗，其包括权利要求54所述的物质。
56.一种增加无脊椎动物对病原体的抵抗力的方法，其包括(1)使用所述病原体攻击与所述无脊椎动物同种的多个无脊椎动物，所述病原体的水 平足以使所述无脊椎动物的至少一个个体致病；(2)将患病的或死亡的所述多个无脊椎动物的至少一个个体丢弃；(3)重复步骤(1)和(2)至少一次；并且(4)至少一次地在步骤(1)、(2)和/或(3)中对所述多个无脊椎动物施用权利要求54 的物质，其增加所述无脊椎动物对病原体的抵抗力。
全文摘要
本发明提供在水产养殖的无脊椎动物的病原体基因组中鉴定的含有约7至约50个氨基酸的分离的或被合成的肽，其用来预防和治疗水产养殖中这些病原体的爆发，以及使用被鉴定的肽预防和治疗病原体爆发的方法。
文档编号A61K39/12GK101969993SQ200880018241
公开日2011年2月9日 申请日期2008年4月23日 优先权日2007年5月30日
发明者埃伦诺尔·S·博戈奇, 塞缪尔·博戈奇, 塞缪尔·温斯顿·博戈奇, 安妮·埃伦诺尔·博桑伊 申请人:塞缪尔·博戈奇;埃伦诺尔·S·博戈奇;塞缪尔·温斯顿·博戈奇;安妮·埃伦诺尔·博桑伊