专利名称：一种新的纯化无颌类脊椎动物血清天然蛋白-intelectin的方法
技术领域：
本发明涉及ftOtein G亲和层析法在无颂类脊椎动物血清蛋白intelectin纯化中的应用。属蛋白质纯化领域。
背景技术：
凝集素(lectin)是一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白。它因能使红细胞或其他细胞凝集故名凝集素。其最大的特点是能够识别糖蛋白和糖肽，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性的结合能力。因此凝集素可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显示其结合部位。凝集素也因其能够识别仅在病原中发现或是无法进入宿主细胞的糖类而在免疫系统中扮演重要的角色。Intelectin(ITLN)是lectin家族中发现的较新的一类基因。它能够结合多种细菌表面的糖结构。当有机体受到这些细菌感染时，intelectin能够辅助吞噬细胞清除细菌。研究表明，在许多物种中，intelectin具有潜在的抵抗外界抗原的功能，并因此参与免疫反应。htelectin的这些功能使其在制药及科学研究中都具有深远的意义。然而天然活性蛋白的分离纯化仍是一个比较复杂的工艺。因此，仍需要经济有效的方法分离纯化大然 intelectin。Protein G是一种来自G类str印tococci细菌的细胞壁蛋白，它属于第三类的Fc 受体蛋白，能够同IgG上的Fc区域特异性的结合。使用ftOtein G Agarose纯化抗体的原理正是基于这种高度的亲和能力。Protein G能够广泛的结合来自真核生物的各种抗体，是在实验室水平纯化抗体的很好的选择。但至今没有用ftOtein G Agarose纯化其他蛋白的实例。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种经济有效的日本七鳃鳗intelectin天然蛋白的纯化方法，即通过日本七鳃鳗血清与ftOtein G Agarose孵育结合并沉淀获得。该过程可通过以下步骤达到(a)日本七鳃鳗血清的制备泄殖腔下方断尾采集新鲜日本七鳃鳗血液，2-8°C孵育lh，8000rpm离心8-15min。 取上清，获得日本七鳃鳗血清。将血清用缓冲液A(0.02mol/L PB，pH7. 4士0. 1)稀释10-15 倍，经孔径不大于0. 45 μ m的滤膜过滤准备上样。(b) Intelectin 蛋白用 Protein G Agarose 层析介质进行纯化Protein G Agarose层析介质(购自GE公司)用缓冲液A平衡不少于10倍柱体积，流速为2-aiil/min，紫外检测至基线；
将日本七鳃鳗血清样品以不高于lml/min的速度通过层析介质；然后用缓冲液A以2-3ml/min的速度清洗上样后的层析柱，用量不少于10倍体积，紫外检测至基线；再用缓冲液B(0. lmol/L Gly-HCl, pH 2. 7士0· 1)以 3-4ml/min 的速度洗脱层析介质并收集洗脱峰。洗脱时应边洗脱边用缓冲液C(lmol/L Tris-HCl, pH 9.0士0.1)中和至pH 7-8，洗脱液洗脱每1或2滴中和一次。洗脱后的蛋白立即透析于pH 7.2-7.4的 0. 01mol/L PBS缓冲液中，2_8°C透析8-16小时。本发明将纯化所得到的蛋白经SDS-PAGE电泳检测，在66kD和40kD处得到两个特
异性条带。本发明将洗脱的蛋白进行双向电泳。经由等电聚焦，垂直SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝R250染色，结果分别在66kD和40kD处得到特异性的点。选取这两个点进行质谱分析。结果显示两种分子量的蛋白分别为intelectin的两个亚型。本发明从NCBI数据库中获得无颂类脊椎动物intelectin序列和高等动物免疫球蛋白Fc段序列，用生物软件GeneDoc进行序列比对，发现二者具有同源性。这为本发明的顺利实施奠定了理论基础。
图1是日本七鳃鳗血清与ftOtein G Agarose孵育结合，沉淀所得的蛋白经 SDS-PAGE电泳检测结果。其中，1 沉淀前的七鳃鳗血清；2 裂解的ftx)tein G Agarose ；3 用ftOtein G Agarose沉淀下来的条带；4 沉淀时的七鳃鳗血清洗涤液。图2是对沉淀下来的血清蛋白进行质谱分析的结果。图3是无颂类脊椎动物intelectin与高等动物免疫球蛋白Fc段序列比对结果。图4是本发明的实验流程。
具体实施例方式本发明已经成功用ftOtein G Agarose凝胶对七鳃鳗血清进行了沉淀反应。并通过双向电泳和质谱技术分析，得到沉淀的蛋白为intelectin。将无颂类脊椎动物与高等动物免疫球蛋白Fc段进行序列比对，分析结果表明二者具有同源性。这为本发明的成功实施提供了理论依据。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明权利要求范围之内。实施例1 日本七鳃鳗htelectin蛋白用ftx)tein G Agarose层析介质进行纯化日本七鳃鳗泄殖腔下方断尾采集新鲜血液，4°C孵育lh，8000rpm离心lOmin，取上清，即为血清。将血清稀释10倍，0.45μπι滤器过滤，作为待纯化的样品。纯化过程如下(1)灌胶将保存于20%乙醇中的ftOtein G Agarose层析介质(购自GE公司) 上层乙醇去除，用三蒸水重悬介质，缓慢灌入层析柱，避免气泡产生，开至最大流速，使介质压实；(2)平衡用缓冲液A以2-3ml/min的速度流经层析介质，平衡不少于10倍柱体积，紫外检测至基线；(3)上样待纯化血清样品以不高于lml/min速度上样；(4)洗涤用缓冲液A清洗上样后的凝胶介质，流速为2-3ml/min，清洗不少于10 倍柱体积，紫外检测至基线；(5)洗脱用缓冲液B以3-^il/min的速度洗脱，边洗脱边用缓冲液C及时中和至 PH7-8，紫外检测洗脱峰并收集，洗脱液在0. 01mol/L PBS中2_8°C透析8_16小时。结果沉淀反应后得到两条特异性条带，分子量分别为66kD和40kD(图1)。实施例2 沉淀产物的鉴定1.双向凝胶电泳第一向等电聚焦电泳，沉淀蛋白样品以水化液(8mol/L尿素+质量分数4% CHAPS+0. 065mol/L DTT+体积分数0. 2% Bio-Lyte+质量分数0. 001 %溴酚蓝)充分溶解后，沿聚焦盘中槽边缘自左向右线性加入样品，避免气泡产生。待样品加入聚焦盘中后，用镊子轻轻去除IPG胶条上的保护层，胶面朝下置于聚焦盘样品溶液上，使胶条正极对应于聚焦盘正极。在胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止液体蒸发。设置聚焦程序，开始聚焦。聚焦结束的胶条立即在平衡缓冲液I (6mol/L尿素+质量分数2% SDS+0. 375mol/L Tirs-HCl， PH8. 8+质量分数2% DTT+体积分数20%甘油+痕量溴酚蓝)中平衡15min，然后再在平衡缓冲液 II(6mol/L 尿素 + 质量分数 2% SDS+0. 375mol/L Tirs-HCl，pH8. 8+质量分数 2. 5% 碘乙酰胺+体积分数20%甘油+痕量溴酚蓝)中平衡15min。第二向垂直板SDS-PAGE电泳，将平衡后的IPG胶条移至15% SDS-PAGE连续胶上端，并在其酸性端的外侧加上SDS-PAGE蛋白低分子量标准蛋白质，以琼脂糖封固。于 20°C循环水恒温，先以5mA/gel进样，再以30mA/gel恒流电泳直至溴酚蓝到达距胶底边 0. 5-lcm处停止电泳，取出凝胶，考马斯亮蓝R250染色。结果分别在66kD和40kD处得到特异性的点。2.质谱技术分别选取66kD和40kD处的点作为质谱1号和2号样品，切胶置于1. 5mlEppendorf 管(已硅化)中，处理成Imm左右的胶片。由布鲁克质谱测序仪进行质谱测序。结果质谱测序的结果显示，沉淀得到的两种蛋白均为intelectin (图2)，为两个不同亚型。实施例3 蛋白序列比对从NCBI数据库中获得无颂类脊椎动物intelectin两个亚型序列以及高等动物免疫球蛋白Fc段序列。利用GeneDoc生物软件进行同源性序列比对。结果无颂类脊椎动物intelectin与高等动物抗体Fc段具有同源性(图3)。
权利要求
1.一种无颂类脊椎动物血清蛋白intelectin的提取纯化方法，其特征在于，该方法按照以下步骤进行(1)泄殖腔下方断尾采集日本七鳃鳗新鲜血液，2-8°C孵育lh，8000rpm离心8-15min， 取上清即为血清；将血清用缓冲液A稀释10-15倍，经孔径不大于0. 45 μ m的滤膜过滤，准备上样；(2)Protein G Agarose层析介质(购自GE公司)用缓冲液A平衡不少于10倍柱体积，流速为2-aiil/min，紫外检测至基线；(3)将血清样品缓缓加入ftOteinG Agarose层析介质中，以不高于lml/min的速度上样；(4)待样品完全上完后，再用缓冲液A清洗层析介质至基线，不少于10倍柱体积，流速为2-3ml/min，紫外检测至基线；(5)用缓冲液B洗脱上样之后的层析介质，流速为3-^il/min，边洗脱边用缓冲液C及时中和至pH7-8，每1或2滴中和一次，收集洗脱峰；(6)洗脱后的蛋白立即用pH7. 2-7. 4的0. 01mol/L PBS缓冲液在2_8°C透析8-16小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，利用ftOteinG Agarose层析介质进行纯化。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(2)和(4)中，缓冲液的用量不少于10 倍柱体积，紫外检测确保介质已平衡清洗至基线。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤( 和中，缓冲液的流速均为 2-3ml/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(3)中，其上样的流速为不高于Iml/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(5)中，洗脱流速为3-^il/min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(5)中，洗脱时每1或2滴中和一次。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(5)中，洗脱时用缓冲液C中和洗脱液至 PH7-8。
9.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征是，所用缓冲液A为0.02mol/LPB，pH 7. 4 士 0. 1。
10.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征是，所用缓冲液Imol/ LGly-HCl，pH 2.7士0. 1。
11.根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征是，所用中和缓冲液C为lmol/L Tris-HCl, pH 9.0士0. 1。
全文摘要
本发明涉及Protein G亲和层析法纯化无颌类脊椎动物血清中的天然蛋白-intelectin。包括提取新鲜的日本七鳃鳗血清，将其与Protein GAgarose进行免疫沉淀反应，电泳检测得到两条特异性条带，分子量分别为66kD和40kD。沉淀得到的蛋白进行双向电泳后经质谱分析表明均为intelectin。序列比对显示intelectin与高等动物免疫球蛋白Fc段具有同源性，这为其能与Protein G Agarose共沉淀提供了证据。Intelectin是一种重要的免疫抗菌分子，本发明为实验室科学研究及生物制药提供了一种操作快速简便且经济有效的无颌类脊椎动物天然蛋白intelectin的纯化方法。
文档编号C07K14/435GK102399278SQ201110195298
公开日2012年4月4日 申请日期2011年7月4日 优先权日2011年7月4日
发明者冯波, 吴芬芳, 李庆伟 申请人:辽宁师范大学