专利名称：用于诱导脊椎动物发生免疫应答的、包含有涵盖了单种抗原ama1的异质性的大量蛋白质 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诱导脊推动物发生免疫应答的、包含有涵盖了单 种抗原的异质性的多种蛋白质变体的蛋白质组合物。本发明进一步涉 及蛋白质变体本身、编码该蛋白质变体的核酸、以及用于产生根据本 发明的蛋白质变体的表达载体和宿主细胞。根据本发明的蛋白质组合 物特别适用于提供针对引起痴疾的传染因子疟原虫属(例如恶性痴原 虫(/7a皿od/咖尸a/c/parwz7))的免疫应答。
在相当多的情况下，诸如疟原虫属或流感之类的传染因子通过改 变其一种或多种免疫应答诱导因子而逃脱了之前的获得性(保护性) 免疫应答。由于这种原因，之前的获得性(保护性)免疫应答(例如 通过接种或之前的感染)不再能够控制传染因子的形成。
在多数情况下，所述的(保护性)免疫应答诱导因子或抗原是传 染因子的一种或多种表面蛋白质，并且所述的变化涉及这些表面蛋白 质中的氨基酸取代。这种经取代的蛋白质可以被称为免疫应答诱导因 子或抗原的蛋白质变体或多态性蛋白质。
鉴于(保护性)免疫应答诱导蛋白质的生物学功能，氨基酸取代 通常限于氨基酸位置的特定的子集。例如，如果(保护性)免疫应答 诱导蛋白质的生物学功能依附于宿主细胞的外壁，则可以被取代以逃 脱宿主免疫系统的氨基酸位置的子集限于不影响所述依附作用的那些 氨基酸位置处。
此外，鉴于相关的生物学功能，在特定的氨基酸位置处，可行的 氨基酸取代的数量也是受限的。
例如，用酸性氨基酸(例如天冬氨酸(Asp))取代极性氨基酸(例如丝氨酸(Ser))可能会影响免疫应答诱导蛋白质的功能，并且就待逃 脱宿主免疫系统的传染因子而言，可能因此成为不合适的氨基酸取代。
此外，在抗原的特定位置处的某些特异性的氨基酸取代之间似乎 存在关联(linkage)或相关性(correlation)。换言之，在抗原的 某些位置处存在的例如丙氨酸(Ala)可以与抗原中附近的或远端的氨 基酸位置处的例如甘氨酸(Gly)是关联的(linked)或相关的。
然而，虽然在(保护性)免疫应答诱导蛋白质中可行的氨基酸取 代的数量受到了限制，但是这种蛋白质的可行变体的数量仍然很多。
这种蛋白质的实例为病毒传染因子流感的免疫原性血凝素(HA) 表面糖蛋白。在这种糖蛋白中可行的、可取代的氨基酸的位置如此之 多，使得每年都不得不对HA的最流行(区域)的蛋白质变体进行选择， 从而提供仅对那一年而言是有效的流感疫苗。
另一个实例是引起痴疾的传染因子恶性疟原虫的PfAMA-l蛋白质。
估计，疾疾每年导致多至500百万的临床病例和2百万人死亡。 最严重的发病率和死亡率发生在撒哈拉以南非洲地区、由恶性疟原虫 在儿童和孕妇引起感染中。
已经鉴定出多种有效的(保护性)免疫应答诱导因子用于疫苗的 研发，其中的一种是由单一拷贝的基因编码的恶性疟原虫顶膜抗原 1 (PfAMAl或AMA1)。
由啮齿类动物和非人灵长类动物疟疾模型中得到的证据显示，对 AMA1产生的抗体应答能够降低感染的水平，并且针对AMA1的抗体在 体外抑制无性寄生虫的增殖。
在病区(endemic area )，免疫系统会响应于感染而产生抗AMAl 的抗体，并且这些抗体可能与保护作用有关。
AMA-1(图l)为83 kDa的蛋白质，该蛋白质包含大的N-末端胞外 结构域、跨膜区域和大约50个氨基酸的C-末端细胞质尾部。所述的 胞外结构域包含16个保守的半胱氨酸残基，这些半胱氨酸残基形成了 限定潜在的3结构域结构的8个分子内二硫键。近期得到的AMA1的晶体结构证明这3结构域结构，但是表明在这些结构域之间存在相当大 的相互作用。
针对AMA1的抗体阻断裂殖子侵入红血-求、裂殖子在红血球表面 上的再定位，阻断蛋白水解过程，并且缺乏AMA1的无性血内阶段的寄 生虫显示是不能生存的，表明AMA1在红血球侵入过程中提供了重要 的、且并非多余的生物学功能。
AMA1还存在于发育的孢子体阶段，表明^使用AMA1来接种可以不 仅靶向无性红血球的发育。
但是，与流感的血凝素(HA)相似，已知AMA1容易进行氨基酸取 代，从而逃脱早期的获得性(保护性)免疫应答。
这可以通过在兔中的免疫应答研究来示例-说明，所述研究表明， 虽然从一抹痴疾菌抹得到的针对PfAMAl的抗体很好地抑制了同源菌 林的生长，但是对其他菌抹的抑制只达到可变的较低的程度。这表明 PfAMAl氨基酸取代或多态性可以减少基于PfAMAl的疫苗的效力。
针对传染因子(例如流感或疟原虫属)的相当明显的疫苗策略是 在一种疫苗的制备过程中包括所有已知的或者甚至所有理论可行的抗 原的蛋白质变体或多态形式，从而诱导针对所有已知的以及甚至未来 的传染因子的变体或多态形式的、有效(保护性)的免疫应答。
然而，这种疫苗策略是相当不切实际的，或者甚至是不可能的， 这是因为涉及大量的蛋白质变体或多态形式。仅仅就恶性痴原虫而言， 已经已知有AMA1蛋白质的300多种不同的蛋白质变体或多态形式。结 果，仅仅有效地针对已知的恶性痗原虫多态形式的疫苗的制备就已经 包括300多种蛋白质变体。
这种疫苗的制备不仅困难、费力和制造成本昂贵，甚至还使用了 当前的重组DNA技术，但是它们在诱导免疫应答方面的治疗效果仍是 不可靠的。当某些蛋白质变体或其部分存在于单一一种针对免疫系统 的疫苗制备物中时，这些蛋白质或其部分会固有地具有更大的免疫原 性，因此抑制了或甚至妨碍了针对免疫原性较小的蛋白质变体或其部 分的免疫应答的发展。此外，这种包含抗原的所有已知变体的疫苗制备物由于这种疫苗 制备物的进化压力而可能不会有效地针对可能形成的传染因子的未来 菌株。
因此，本发明的一个目的是提供一种适用于诱导脊推动物针对传 染因子的(保护性)免疫应答、从而避免上述缺点的蛋白质组合物或 疫苗制备物。
本发明的另 一个目的是提供一种适用于诱导脊推动物有效针对 (感染因子)多态性抗原的(保护性)免疫应答的蛋白质组合物或疫 苗制备物。
本发明的另一个目的是提供一种可以相对容易地制备的蛋白质 组合物或疫苗制备物。
本发明的另一个目的是提供一种相对便宜、并因此经济可行的蛋 白质组合物或疫苗制备物。
本发明的这些目的和其他目的、以及优点可以由所附的权利要求 书定义的蛋白质组合物来满足。
具体而言，本发明的这些目的和其他目的、以及优点可以由适用
于诱导脊推动物免疫应答的、包含单一抗原的2至IO种蛋白质变体的 蛋白质组合物来满足，其中所述抗原包含大量的可变氨基酸位置，其 中所述蛋白质变体的氨基酸序列以组合方式代表了在所述的可变氨基 酸位置处各种氨基酸的发生频率以及可变氨基酸位置之间的关联，并 且其中在单一的抗原中所述的发生频率为至少10%至20%,并且其中可 变氨基酸位置之间至少75%的关联由蛋白质变体的组合所代表。
使用上文所定义的蛋白质变体，本发明人出乎意料地发现单一的 疫苗制备物可以有效地针对已知的、可行的未来(高度)多态性传染 因子。
由于具有相对较少数量(即，2至IO种)的蛋白质变体，所以与 包含多态性传染因子的所有已知的天然蛋白质变体的蛋白质组合物或 疫苗制备物相比，所述的蛋白质组合物或疫苗制备物可以更容易地制 备并且更有成本效率。此外，相对较少数量(即，2至IO种)的蛋白质变体会减少或者 甚至除去某些蛋白质变体或其部分的任意免疫原性结构域。
根据本发明，所述的抗原包含包含多个可变氨基酸位置。该抗原 可以是传染因子(例如流感的血凝素或疟原虫属的AMA1 )的任何免疫 原性蛋白质，只要其包含大量的在自然界中可变的或取代的氨基酸位 置即可。
虽然本发明没有具体地限定可变的或取代的氨基酸位置的特点 数量，但是理论上遵循当可变氨基酸取代的数量增多时，优选地使 用本发明。这是因为可行的蛋白质变体的数量还会成比例地增加。
当可变氨基酸取代的数量至少为10、更优选的是至少为20、甚 至更优选的至少为30、最优选的至少为40或更多时，本发明可优选 的使用。
基酸位置的存在情况和数量。
例如，可以釆用序列之间的最大同源性来比对抗原的所有已知的 天然的变体。在已知的抗原中，在相应的位置处，如果存在多于l种 的氨基酸，则将该抗原中的氨基酸位置定义为可变的位置。
例如，对由500个氨基酸构成的传染因子的50种已知的免疫原 性蛋白质进行的比对表明，从N-末端开始计数，氨基酸位置4、 60、 45、 57、 256、 313、 345、 456、 457、 458、 478、 498和497可以包含 不同的氨基酸，换言之，在该位置处氨基酸在自然界中可以被另一种 氨基酸所取代。
如本文所用，"发生频率"被定义为一种氨基酸在天然的变体中 发生的百分率。换言之，如果在天然的变体中，在氨基酸位置45处， 20。/。为丙氨酸(Ala)、 45。/。为甘氨酸(Gly)、 35°/。为缬氨酸(Val),则对于 位置45而言，发生频率为20% Ala、 45% Gly和35% Val。
如本文所用，"可变氨基酸位置之间的关联"被定义为在可变位 置处的单一氨基酸或节段氨基酸与另 一个可变位置处的单一氨基酸或 节段氨基酸相结合的天然变体的统计学发生率，即P< 0.05。例如，如果在可变位置45、 46、 47和48处氨基酸序列"TEND"的发生与位 置123处的氨基酸缬氨酸(Val)的发生呈统计学相关，那么前者被称为 "关联的(linked)，，。
如本文所用，术语"以组合方式"被定义为采用最大同源性比对 的根据本发明的所有蛋白质变体的组合。
例如，用于可变氨基酸位置345处的"组合的"是指在该位置处 的所有存在的氨基酸都被考虑在内。如果在蛋白质变体中，在位置345 处，30。/。为丙氨酸(Ala)、 70。/。为缬氨酸(Val)，则用于该特定位置处的 组合是指在所组合的蛋白质变体中，发生频率70。/。为Ala、 30。/。为Val。
就所述的关联而言，如果这种具体的关联可以在任意的蛋白质变 体中找到，则认为该关联在组合中是保守性的。换言之，所述的关联 可以在至少一种蛋白质变体中找到。
如本文所用，术语"代表，，用于表示在根据本发明的蛋白质变体 中所反映的、在自然界中在特定位置处的氨基酸的发生频率。这并非 意味着天然的发生频率还应该在根据本发明的蛋白质变体的组合中找 到。
上述术语更加暗示了如果在某一可变位置处的氨基酸可以在自 然界中更频繁的找到，则这种更频繁的发生(如果可能的话)还应该 反映在根据本发明的蛋白质变体的组合中。
例如，如果在自然界中在位置456处，发现在60%的情况下氨基 酸为缬氨酸(Val)、 30%的情况下为甘氨酸(Gly) 、 10%的情况下为丝 氨酸(Ser)，假设有6个蛋白质变体用于所述的蛋白质组合，则在所述 的位置处Val优选地存在于3个蛋白质变体中，Gly优选地存在于2 个蛋白质变体中，Ser优选地存在于1个蛋白质变体中。
在上述情况下，其中仅使用4个蛋白质变体，则在所述的位置处 Val优选地存在于2个蛋白质变体中，Gly优选地存在于1个蛋白质变 体中，Ser优选地存在于1个蛋白质变体中，这反映了在大多数的情 况下，在所述的位置处Val是普遍的。
在特定的蛋白质组合物或疫苗制备物中的蛋白质变体的数量取决于抗原的氨基酸可变性或者已知序列变体的数量。这种可变性表明
需要使用至少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10种蛋白质变体。
根据本发明，蛋白质变体的数量与抗原的可变性之间的关系可以 通过所述抗原中可变氨基酸的位置(其显示了最大的可变性，即，不 同氨基酸的数量)来确定。
例如，如果氨基酸位置258处通过在该位置处指明3个可行的氨 基酸取代而显示出最大的可变性，则蛋白质变体的最小数量应该至少 为3，从而可以反映出在蛋白质变体的组合中的这种可变性。换言之， 需要至少3个代表了所述位置处3个可行的氨基酸的蛋白质变体。
如果60°/。的情况显示在所述位置处为Val， 20%的情况显示在所述 位置处为Gly或Ser，则优选的是，蛋白质变体的数量为4，其中2 个蛋白质变体在位置258处为Val， 1个蛋白质变体在所述位置处为 Cys， 1个蛋白质变体在所述位置处为Gly。
本发明人出乎意料地发现，通过利用发生频率和所述的关联，由 此仅考虑在可变位置处发生频率为至少10-20%(例如至少10、11、12 、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20%)的氨基酸，并且在蛋白质变体 的组合中在自然界中所发现的至少75% (例如75、 80、 85、 90、 95、 99、 100%)的关联是保守的，可以制备这样的蛋白质组合物，该蛋白 质组合物可以使用有限量的蛋白质而能够基本上反应(高度)多态性 天然蛋白质的免疫原性^普(repertoire)。
根据本发明的优选的实施方案，所述蛋白质组合物中的单种抗原 为痴原虫属物种的AMA1蛋白质，其中所述的瘙原虫属物种选自恶性 疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫，其中 优选的是恶性痴原虫。
如上文已经阐述的那样，痴原虫属AMA1蛋白质的已知变体的数 量已经完全超过了 300种。此外，在该蛋白质中，可变氨基酸位置的 数量完全超过40种。
由于本发明提供了一种能够使用有限数量的蛋白质变体来在免 疫原性方面涵盖所述的高度可变性的单一的蛋白质组合物，所以根据本发明的蛋白质组合物特别适用于基于AMA1蛋白质的疫苗。
在根据本发明的蛋白质组合物的特别优选的实施方案中，在所述 的蛋白质组合物中，恶性疟原虫的AMA1蛋白质的可变氨基酸位置为
162、167、172、173、175、187、190、196、197、200、201、204、
206、207、225、230、242、243、267、282、283、285、296、300、
308、332、393、404、405、407、435、439、448、451、485、493、
496、503、512、544。
本发明人发现，当在研发根据本发明的蛋白质组合物中考虑了这 些可变氨基酸位置时，在恶性疟原虫的天然变体中该蛋白质的基本上 所有相关疫原性变体都被涵盖在内。
根据本发明的蛋白质组合物优选包含选自SEQ ID No 1至12中 的至少3种蛋白质变体，更优选地包含选自SEQ ID No 1至6中的至 少3种蛋白质变体，最优选地包含选自SEQ ID No 1、 SEQ ID No 2 和SEQ ID No 3中的至少3种蛋白质变体。
在特别优选的实施方案中，本发明的蛋白质组合物的蛋白质变体 是连接的。这种连接可以采用本领域的技术人员公知的方法通过化学 方法或通过重组DNA技术来形成。
例如，可以使用连接体核酸序列通过(例如)PCR或连接来连接 编码不同蛋白质变体的分离的核酸序列。在将这种连接的构建体插入 到合适的表达载体中之后，编码连接的蛋白质变体的构建体以单个蛋 白质分子的形式表达，所述的蛋白质分子经适当的分离之后，可以并 入到所述的蛋白质组合物中。
鉴于根据本发明的蛋白质组合物的发明理念，本发明还涉及选自
SEQ ID No 1至12中的蛋白质变体，优选的是选自SEQ ID No 1至6 中的蛋白质变体，最优选的是选自SEQ ID No 1至3中的蛋白质变体。
类似地，本发明还涉及编码上述蛋白质变体、优选的蛋白质变体、 最优选的蛋白质变体、优选的SEQ ID No 12至24、更优选的SEQ ID No 12至18、最优选的SEQ ID No 12至14的核酸序列。
这些核酸序列可以适当地插入、连接或者重组到表达载体中，并处于合适的调控和增殖信号(例如复制的启动子、终止子、分泌信号、 增强子、复制起点，选择标记等)的控制之下，并且与这些调控和增 殖信号可操作地连接。
因此，本发明还涉及包含根据本发明的DNA序列的表达载体，优 选为pPicZalpha和pPIC9，从而可以在优选的曱基营养巴斯德毕赤酵 母(？/c力/a / a"or/50中表达蛋白质变体。
这种表达载体优选地被转化或转染，但是还可以预计到其整合到 合适宿主细胞的基因组中，从而允许表达根据本发明的蛋白质变体。 因此，本发明还涉及使用上文定义的表达载体转化或转染的宿主生物 体。所述的宿主生物体优选的为巴斯德毕赤酵母。
鉴于根据本发明的蛋白质组合物的有利免疫原性，本发明还涉及
根据本发明的蛋白质组合物在制备用于接种脊推动物(优选地针对疾 疾)的药物中的用途。所述的脊推动物优选为人。
根据本发明的蛋白质组合物可以采用用于生产蛋白质组合物的 方法来得到，所述的方法包括以下步骤
a) 测定抗原中可变氨基酸位置；各种氨基酸在所述的可变氨基 酸位置处的发生频率；以及所述的可变氨基酸位置之间的关联；
b) 测定包含不同氨基酸的最大数量X的可变氨基酸位置，其中 各种不同氨基酸的发生频率至少为10-20%;
c) 设计至少X种蛋白质的变体，这些变体以组合方式代表了各 种氨基酸在各个可变位置处的发生频率。
在优选的实施方案中，对至少X种蛋白质变体的设计进一步以组 合方式代表了可变氨基酸位置之间至少75%的关联。
在根据本发明方法的特别优选的实施方案中，步骤(c)包括设计 蛋白质变体L至Y,，其过程如下根据氨基酸的发生频率，向蛋白质 变体L中的可变氨基酸位置处分配在该位置处发生频率最高的氨基 酸，并向Y,分配在该位置处发生频率较低的氨基酸；向蛋白质变体L 至中的相应氨基酸位置处分配其余的氨基酸或相同的氨基酸，前 体条件是可变氨基酸位置之间建立的关联在至少75%的情况下是保守的。
使用详细地显示本发明的优选实施方案的实施例来进一步示例
说明本发明。在实施例中，参照以下附图，其中 附图
图1为恶性痴原虫AMA1蛋白质的图示；
图2示出了恶性痴原虫AMA1蛋白质的氨基酸发生频率的概况。 其指示出了氨基酸的位置、在所述位置处的氨基酸、它们的频率以及 AMA1序列的数量，其中所指示的氨基酸是已经被发现的；
图3示出了从可变氨基酸位置162开始的不同的可变氨基酸位置 之间的上游关联；
图4示出了从可变氨基酸位置162开始的不同的可变氨基酸位置 之间的下游关联；
图5示出了 DiCol、 DiCo2、 DiCo3与酵母表达的HB3-AMA1、 3D7-AMA1和FV0-AMA1，以及共同序列的比对，其中所述的共同序列来 自从Genbank数据库得到的356种PfAMAl序列的比对；
图6示出了在结构域1至3中在毕赤酵母属表达的序列之间的差 异。上部右侧等位基因之间的总体差异；下部左侧对于结构域的 差异；
图7板A示出了经纯4匕的DiCo的SDS-PAGE。'泳道1: Benchmark 标志物；泳道2: DiCo 1;'》K道3: DiCo 2;泳道4: DiCo 3;泳道5: DiCo混合物。板B示出了用4G2作为一级抗体的Western印迹。Lane 1:分子量标志物;泳道2: DiCol;泳道3: DiCo 2;泳道4: DiCo 3; 泳道5: DiCo混合物。样品没有被还原；
图8示出了针对多种AMA1变体的IgG抗体的水平。每种符号指 示单一的兔子。在各处理组中，相同的符号代表相同的动物。圆圏 兔子l;十字叉兔子2;三角兔子3;四方兔子4;菱形兔子
图9示出了根据疫苗抗原和测定菌株的，对于单个兔子，生长抑 制效价对比IgG浓度的情况。每种符号指示单一的兔子。在各处理组中，相同的符号代表相同的动物。圆圏兔子l;十字叉兔子2;三 角兔子3;四方兔子4;菱形兔子5;
图10示出了根据疫苗抗原和测定菌抹的，对于单个兔子，生长 抑制效价对比兔子的IgG浓度组的情况。空心圆圏DiCo混合物；十 字叉DiCo 1;三角DiCo 2;四方DiCo 3;菱形FV0-AMA-1。
实施例
使用恶性痴原虫AMA1进行免疫的涵盖多样性的方法；更广泛的 等位基因识別和生长抑制 概述
恶性疾原虫AMAl(PfAMAl)， 一种候选痴疾疫苗，是多态性的。据 信，这种多态性主要是在免疫选择压力下形成的，结果可能破坏了在 接种方面的尝试。
将主要得自病区中寄生虫的355种Pf AMA1序列进行比对和分析， 其显示在等位基因之间，622个氨基酸残基中的大约10%具有发生变化 的潜能(参见图2)。此外，已经鉴定了多态性残基间的关联(参见图3 和4)。通过上述分析，形成了考虑了关联的、3种涵盖多样性(DiCo) 的PfAMAl序列，并且当将这3种序列放在一起时，合并了所有氨基酸 可变性的80°/。。对于这3种DiCo序列中的每一种，构建合成的基因， 然后将该基因用于转化甲基营养巴斯德毕赤酵母，从而以50至100 mg/L的产量进行重组表达。所有这3种DiCo蛋白质都与还原敏感性 (reduction sensitive )单克隆抗体4G2具有反应性，表明DiCo具 有与天然的PfAMAl相似的构造。
使用FV0菌林的PfAMAl或者使用单独的或混合的DiCo对兔进行 免疫。测定抗体的效价和在体外抑制寄生虫生长的能力。当针对FV0 菌林的寄生虫进行测定时，使用DiCo混合物免疫的动物的表现与使用 FV0 AMA1免疫的动物相似，但是当针对其他菌林进行评估时，使用DiCo 混合物免疫的动物胜过4吏用FV0 AMA1免疫的动物。将由3种DiCo的 混合物诱导的生长抑制水平(70%)与FVO、 3D7和HB3所诱导的生长印制水平进行比较，表明充分涵盖了变化程度相当大的AMA1。
这种情况表明基于DiCo混合方法的疫苗提供了比使用单一的等
位基因进行免疫的更宽的功能免疫性。 材料和方法
涵盖多样性的AMA1序列在巴斯德毕赤酵母中的克隆
设计具有对于毕赤酵母的最佳密码子选择的合成基因用于包含 DiCol、 DiCo2和DiCo3的结构域I、 II和III的AMA1蛋白质(DNA2. 0， San Diego)。 使用引物XI (5' gcg aat tea ttg aaa ttg ttg aaa gat c 3', SEQ ID No: 26)和Y1 (5' ggg gta cca aca tct tat cgt aag ttg g 3、 SEQ ID No: 27)、 XI和Y2 (5' ggg gta ccg aca tgt tat cgt aag ttg gc 3'， SEQ ID No: 28)、以及分别用于DiCo 1、 2和3 的XI和Yl来对这些序列进4亍PCR扩增。
将PCR产物克隆到pPicZA载体(Invitrogen， Groningen)的 EcoRI-Kpnl位点中，由此，该载体的atg的起始密码子(Met)用于转 录起始，并将其用于转化大肠杆菌DH5细胞。在转化大肠杆菌DH5细 胞之后，分离质粒，并检查所期望的限制性位点的存在情况，然后根 据制造商的操作规程将其用于转化巴斯德毕赤酵母KM71H。
通过在29-30'C下、在有力的震动下，在含有lOmL甘油培养基的 50mL试管中培养48小时后，针对蛋白质生产来测试转化的巴斯德毕 赤酵母菌落。通过离心(在2500rpm下离心5分钟，台式离心机)收 获细胞，然后将所得细胞再次悬浮于4ml含有甲醇的培养基中，然后 在有力的震动下在29-30匸下培养24小时。在低速离心后，收获培养 物上清液，针对具有所需大小的蛋白质在SDS凝胶上对20 uL进行测 试。通过^f吏用还原敏感性单克隆抗体4G2的western印迹来证实其特 性。
蛋白质的产生
在3或7升的发酵罐(Applikon, Schiedam， The Netherlands) 中进行几轮发酵，初始体积分别为1和2升。将巴斯德毕赤酵母克隆 在30'C下，在BMGY(每升含有1%酵母提取物、2%蛋白胨、1. 34%酵母氮源、1%甘油、0. 4 mg生物素，0. 1 M K磷酸盐，pH 6. 0)中培养24 小时。使用50ml/升的培养物接种装有低盐发酵培养基(每升培养基 含有MgS0广7H20， 14. 9克;K2S04,， 18. 2克;CaCh， 0. 65克;KOH， 4.13 克，甘油40克，26. 7 ml 85% 1^04和12 ml PTM1孩史量盐溶液)的发 酵罐。
在分批阶段(batch phase)中，以1升/升初始培养基体积的量 喷射空气。在整个发酵过程中，将温度恒定保持在3(TC，并使用25% NH40H和85。/。 H3P04将pH保持在6. Q。在溶解氧水平返回至21%后，在 溶解氧水平降至(几乎)0之后(通常18至24小时)，开始分批补 料。
随后，在20至24小时内，向培养物中以32mL/小时/升初始培养 基体积的速率供入以12mL/升PTM1微量盐加强的50%甘油。在发酵的 分批补料阶段过程中，用100%的氧气喷射培养基，从而将溶解氧的浓 度保持在21%。最后，通过加入曱醇来诱导培养物。在第一个3小时 内，速率为1 mL/小时/升初始培养基体积，然后在3小时内将速率增 大至3mL/小时/升初始培养基体积，随后在该速率持续大约18小时。
如观察到的，用100%的氧气将氧水平保持在21%仅仅抑制某些蛋 白质的表达，在诱导阶段中，使用100%的氧气将氧水平保持在21%, 但连续向所述的培养基中喷射空气(其量为1升/升初始发酵培养基)。
在诱导之后，将培养基的pH升高至pH7. 8,并使用低温恒温器冷 却至15。C或更低。通过离心(25分钟，5000xg, 4。C)除去细胞，并用 Quixstand 中空纤维滤柱(GE Healthcare, Etten-Leur, The Netherlands)将培养物的培养基过滤通过0. 22 jam的过滤器，从而除
去所有残余的酵母细胞。
使用具有10kDa截留中空纤维柱体的Quixstand，将培养物上清 液(2升或更多升)中的蛋白质浓缩至大约lOOmL，并用等体积的去矿物 水进行稀释，然后再次浓缩。将上述过程重复4次。
然后，将所述的蛋白质结合到羟磷灰石柱(REF)上，其中所述的 柱中使用lmM的磷酸钠緩冲剂(pH 8.0)进行了平衡。然后将所述的蛋白质用50mM的磷酸钠緩冲剂(pH8. 0)由所述的柱上洗脱下来。将 该级份浓缩至小于lml，随后置于Superdex 75制备型尺寸排阻色语 柱(REF)上。将含有DiCo蛋白质的级份集中在一起，然后进行浓缩， 再过滤通过O. 22 ium的过滤器来进行除菌。 兔子的免疫
将兔子圏养，免疫，再才艮据国家动物福利条例(national animal welfare regulations), 由Eurogentec SA， Seraing， Belgium采 集血液样品。在第0、 28和56天，用毕赤酵母属表达的DiCo1(30 ju g)、 DiCo2 (30 iag)或DiCo3 (30 jli g) ， FVO PfAMA-1 D123 (30 ja g)或者DiCol、 DiCo2和DiCo3的混合物(每种物质10 ng,共30 ja g)对共5组、每组5只的兔子进4亍免疫。使用Montanide ISA 51 (SEPPIC: Paris, France)作为辅料。根据制造商提供的说明书来制备疫苗制剂 (50/50质量/质量)。通过ELISA，针对反应性对在第三次免疫后2个 星期(第70天)所得到的抗血清进行测试，并通过体外寄生虫抑制测定 来测试功能性能力。
ELISA
根据公开的方法(Kocken 2002)，在涂敷有500 ng/mL经纯化的 AMA1抗原的96孔平底微孔板(Greiner， Alphen a/d Rijn， The Netherlands)中对血清样品进行一 式两份的酶联免疫吸附测定 (ELISA)。
第二抗体为与碱性裤酸酵缀合的抗兔IgG(Pierce， Rockford， IL)。对每一个板使用标准曲线，并通过四参数的拟合来计算未知的效 价。效价可以以任意单位表示，其中1AU产生1. 0的OD。因此样品的 AU的量是在此量时OD达到1的稀释度倒数(reciprocal dilution)。
IgG的纯化
采用标准的方法ENRfu(8)，在蛋白质A柱(Sigma, St Louis, MO) 上对待用于寄生虫抑制测定的抗体进行纯化，然后使用Amicon浓缩器 (截留值30kDa)，交换到RPMI 1640中，再进行过滤除菌，之后在-20 'C下进行储存，直到使用。使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Nanodrop Technologies, Wilmington, DE， USA)测定IgG的浓度。 寄生虫
使用标准的恶性疟原虫培养技术，在由5% C02， 5% 02和90% N2 构成的气氛中，体外培养恶性疟原虫菌林NF54、 FCR3、 HB3。在前导 序列中，FCR3 AMA1(登记号:M34553)与FV0 AMA1 (登记号:AJ277646)
有1个氨基酸不同。
体外寄生虫抑制的测定(PIA)
使用具有体外成熟的恶性疟原虫裂殖体的96孔平底板 (Greiner)， 一式三份评估纯化的IgG抗体对寄生虫侵入的作用，其中 所述的恶性疟原虫裂殖体的起始寄生虫血症百分率为0. 2-0.4%，血细 胞比容为2.0%,并且所述96孔平底板含有总体积为100uL的处于 RPMI 1640中的10%正常人血清和20卩g mL—'庆大霉素。
在40至42小时后，将培养物再次悬浮，并将50 luL转移到200 jaL水冷的PBS中。然后将培养物离心，除去上清液，冷冻所述的平 板。按照之前所述(Kennedy 2002)，采用pLDH测定来估测寄生虫的生 长抑制。按照下式计算寄生虫的生长抑制率，并以百分率表示
100 一 ( ( 0d试验一0d背景)/( 0d对照一0d背景)x 100 )
对照IgG是从仅使用辅料免疫的兔子分离的。
统计分析
使用对数转换的IgG效价作为因变量而疫苗抗原作为自变量，采 用方差分析(ANOVA)来比较IgG的效价。采用线性混合效应模型对PIA 效价进行分析，从而可以在校正假重复的同时，同时比较多种IgG的 浓度(Paterson等)。
将PIA效价作为因变量输入，并将对数转换的IgG总量和处理组 作为自变量输入。针对各种测试的菌林拟合多种模型，并基于对数似 然值选择最佳的拟合模型。
结果
AMA变体中的多态性分析
在2005年1月3日得到的所有恶性疟原虫AMA1序列(完整序列和片段)来自在Pubmed数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/)中 的核苷酸检索。除去复制体(U84348 [3D7]、 AU087598 [FV0] 、 U33274 [3D7]和AF061332 [KF1916])，并将用于NF7菌林的2个部分序列 (U33280和M27957)结合起来。使用Excel macro比对随后的355条 序列，并鉴定多态性残基。
为了减小由测序错误而导致的合并数据的风险，将多态性位置定 义为这样的位置，该位置在序列之间变化使得355条序列中的2条或 多条序列在所述的位置处具有相同的氨基酸取代。采用该定义，622 个氨基酸位置中的64个位置被指定为是多态性的；其中前导序列中有 9处(aa 1-96; 9.4%)、结构域l中有33处(aa 97-315; 15.1°/。)、结 构域2中有8处(aa 316-425; 7. 3%)、结构域3中有11处(aa 426-545; 9.2%)、跨膜区域没有(aa 546-567; 0%)和细胞质尾部有3处(aa 568-622; 5.5%)。所述的比对还表明，在一个多态性位置处存在的特 定氨基酸通常与所述蛋白质下游(参见图4)及上游(参见图3)(即，分 别在C末端或N末端方向)存在的特定氨基酸相联系。
用于鉴定所述的关联而编写的软件显示在22个多态性位点处24 个残基为上游关联。各下游关联基团的最N末端的成员往往在所述的 位置处并非是主要的残基(在55种情况中的53种情况下)，但是该 残基往往与作为主要(共同)残基的下游残基关联。通常，在位置197 处，2种可行的氨基酸(G和D)显示为下游关联。位置172和283例外， 所述的主要的残基与下游残基关联，而在位置200处，主要的残基和 次要的残基均相联系。
在22个多态性位点处，观察到有26 (27)个残基为上游关联。所 述关联基团的最C末端的成员往往在所述的位置处并非为主要的残 基，而关联的上游残基通常为主要(共同)的残基。例外的是，在位置 197处，所有的残基都显示与位置196处上游关联。在位置285处的E 显示出不同寻常的上游关联，其原因在于E与非共有的L283关联，而 R503与非共有的残基M496上游关联。
设计人工基因以涵盖由多样性并且合并关联为了降低研发下游疫苗的复杂性，认为可以提供最多3种涵盖多 样性的序列(DiCo)。设计这些DiCo(DiCol、 DiCo2和DiCo3)(其中每 一个DiCo都包含结构域I、 II和III (aa 97-545))，使得当将这些 DiCo放在一起时，合并了天然残基的最大数量，前提条件是频率最低 的残基相联系，因此限制了所述的序列。因此，超过80%的氨基酸存 在于天然序列中的任何给定的位置处，并且在DiCo组合中可以找回大 部分关联。
为了将其限制为3种DiCo，将低于10%的序列显示出变化的12 个位置[残基121 (99% E)、 189 (92% L) 、 199 (99% R) 、 224 (99% M)、 228 (97% N)、 244 (92% D) 、 245 (96% K) 、 269 (96% K) 、 325 (98% H)、 330 (91% S)、 395 (92% K)和505 (96% F)]以及10-16%的序列 显示出变化的4个位置[173 (85. 7%N)、 175 (89. 6% D) 、 207 (83.7% Y)和407 (84. 4% Q)]排除在外。因此，在52个多态性位置处，最多 36个可变的位置(分别为结构域I、II和III中的22/33， 4/8和10/11 位置)被包含在DiCo蛋白质的设计中。
考虑到关联，设计3条主链。DiCol(SEQ ID No : l和4)完全顺 应下游和上游的关联。DiCo2(SEQ ID No: 2和5)石皮坏了下游关联，其 原因在于H296并非如同天然AMA1序列那样与D448关联、而是与N448 关联；并且DiCo2(SEQ ID No: 2和5)破坏了上游关联，其原因在于 D296受到了 N448的限制、同时H296被包含在内。DiCo3 (SEQ ID No 3 和6)至少并入了普通的氨基酸，并且两处限制的下游位置是不顺应 的。
通常，E206受到了 D197/D200/L201的限制，同时DiCo3并入了 K206。此外，通常N225受到了 L201的限制；在DiCo3中，并入了 1225。 两个上游关联是不顺应的H200和F201受到了 K206的限制，但是D200 和L201被包含在内。
随后，根据非关联的多态性残基的发生频率，将其分别并入到 DiCol、 DiCo2和DiCo3主链中。由于据信AMA1在疾原虫寄生虫中不 能是糖基化的，所以改变NxS/NxT基序，从而除去潜在的N-糖基化位点(SEQ ID No: 1至3)。按照之前所述改变非多态性残基(Kocken 2002) (T288 -> V， S373 -> D， N422 -> D， S423 -> K and誇9 -> Q)。 由于DiCo 1和DiCo2的N162是关联的多态性残基及潜在的N-糖基化 位点，所以可以将其改变成Q162，从而避免引入限制。
图5示出了在与HB3(SEQ ID NO: 30)、 3D7 (SEQ ID No: 29)和 FVO(SEQ ID NO: 31)菌林的AMA1以及共有序列(SEQ ID NO: 25)(其 来自所有355条输入序列的比对)的比对中的所有得到的DiCo序列 (SEQ ID No 1至3)。这些序列之间的差异概括于图6中，其中包括了 根据AMA1结构域的差异概况。DiCol与共有序列接近(差异仅在4个 位置处，所有位置都位于结构域I中)；如所预计的那样，DiCo2和 DiCo3明显不同于共有序列，并且整体而言，DiCo序列彼此相差相当 大。
DiCo在巴斯德毕赤酵母中的表达
在小规模发酵罐中进行表达得到了纯化前40mg/L或更高的蛋白 质水平。采用Ni-IMAC色i普来纯化DiCol。虽然6-His标记也可以被 并入到DiCo2和DiCo3中，但是它们不与Ni-IMAC结合，而替代以通 过依次的羟磷灰石和尺寸排阻色谦法来纯化。
针对完整性、通过SDS-PAGE的純化、和通过使用还原敏感性单
评估(参见图7)。所有3种DiCo蛋白质的主带都以所预计的大小(50 kDa)迁移，并与4G2发生反应。 一定比例的DiCol显示出更緩慢的迁 移带；如之前所报道(REF)的那样，在毕赤酵母属中表达的一些AMA1 分子可以发生O-糖基化。
通过具有对糖基化部分特异性的菌林进行的凝胶分析(数据未示 出)表明，上述情况可以在DiCol中发生，这种观察到的情况可以解 释迁移中所观察到的异质性。
就所有3种DiCo蛋白质而言，Western印迹分析还表明了二聚化 情况，这在之前的全长胞外结构域(aa 25-545) GMP产物中已经观察 到了，在这种情况下没有导致效力的损失。免疫和功能的评估
将每组5只的各组兔子都用30 jiig得自FV0菌林的、在毕赤酵 母中表达并经纯化的AMA1， DiCol、 DiCo2、 DiCo3或者3种DiCo每种 的10 ng混合物(DiCoMix)免疫3次。
通过ELISA测定针对免疫抗原和针对得自三种试验室菌抹的AMA1 的抗体水平(参见图8和9)。虽然这些DiCo序列均没有在自然界中观 察到，但是整体而言，它们均被来自兔子的抗体所识别，其中所述的 兔子用FV0 AMA1免疫，并引发了与FV0、 3D7和HB3抗原发生反应的 抗体，这进一步表明它们荻得了合适的构象。
使用DiCoMix免疫的兔子显示出这样的应答，其总体上与使用单 一成分进行免疫而得到的应答相当。此外，就所研究的所有抗原而言， 在使用DiCoMix进行免疫的组中，IgG效价的变化最小。在处理组之 间，对FV0、 3D7和HB3抗原所产生的应答没有明显的不同(p分别为 0. 27、 0. 48和0. 35)。
就DiCol而言，存在这样的趋势，即，FVO免疫的动物具有比DiCol 和DiCoMix组更低的效价(p-O. 09)。就DiCo2而言，使用DiCo2免疫 的动物往往比〗吏用DiCoMix和DiCol免疫的动物具有更高的效价，并 且DiCo3免疫的动物比使用DiCo2免疫的动物具有更低的效价 (p-O. 0035)。与使用DiCol、 DiCo2和DiCoMix免疫的动物相比,使 用DiCo3免疫的动物具有明显更高的DiCo3效价(p-0. 002)。
为了评估抗寄生虫的效果，将从兔血清(其在最终免疫后的2个 星期得到)纯化得到的IgG加入到3D7、 FCR3和HB3菌林的同步无性 血内阶段培养物中(参见图10)。 DiCoMix总是处于3个表现最佳抗原 的中，其在抑制测定中，以6mg/mL对所有3种测试菌林的抑制为约 70%。此外，DiCoMix的表现与FCR3的同源(FV0)抗原几乎相同。所有 单独的DiCo抗原在兔子中都引发了在抑制寄生虫生长方面具有活性 的抗体。DiCo3抗原对于FCR-3不是非常有效，但是尽管对于3D7和 HB3分别存在17或18个氨基酸的差异，DiCo3抗原仍诱导了针对3D7 和HB3的良好的功能应答。这些观察情况再次表明所有的抗原都获得了合适的构象。
对于FCR3菌林而言，在DiCo2组中观察到了最高水平的生长抑 制，然后分别是FV0、 DiCoMix、 DiCol和DiCo3。对于IgG的总体水 平加倍的各组而言，除了 DiCo3以外的所有组中，抑制水平都增加了 16%(95%CI: 13%至19%)，其中每次加倍IgG,抑制率的增加都明显降 低[-6. 3 (95% CI: -10. 5至-2. 0)]。在DiCoMix组中，在1 mg/mL的 IgG下，抑制水平估测为31%(95°/nCI: 18至45%)。对于DiCo2组而言， 存在这样的趋势，在lmg/fflL下抑制水平增加(16%更高95% CI: - 4 至35%)，而在DiCo3组中，在lmg/ml的IgG下，抑制水平明显更低 (-21%， 95% CI - 41至-2)。
对于HB3菌抹而言，在DiCoMix组中观察到了最高水平的生长抑 制，然后分别是DiCo3、 DiCol、 FV0和DiCo2。对于总IgG加倍的各 组而言，生长抑制水平增加了 12%(95% CI: 11至14)。就IgG对抑制 的效果而言，各组之间没有明显的差异。总IgG为lmg/ml下的抑制水 平估测为38%(95% CI: 27至49%)。对于DiCo2和FV0组而言，存在 这样趋势，即，在lmg/ml下抑制水平更低[分别为-13 (95% CI: -29 至3)和-14 (95% CI: -30至2)〗。
对于3D7菌株而言，在DiCo3与DiCoMix组中观察到了最高水平 的生长抑制，然后分别是DiCol、 FV0和DiCo2。对于总IgG加倍的各 组而言，抑制水平增加了 11%(95% CI: 10至12)。就IgG对抑制的效 果而言，各组之间没有明显的差异。总IgG为lmg/ml下的抑制水平估 测为46% (95% CI: 37至55%)。在总IgG为lmg/ml下，DiCo2和FV0 均具有明显更低的抑制[分别为-17 (95%CI: -30至-4)和-17(95°/。 CI: -30至-3)]。
讨论
基于恶性疟原虫AMA1的有效疫苗的研发是困难的，这是因为所 述疫苗候选物的多态性及施加在其上的免疫选择压力。期望有效的疫 苗诱导针对保守的决定因子以及最广泛等位基因特异性决定因子的应 答。在涵盖在AMA1中找到的足量的等位基因特异性决定因子中的失败最有可能促进了变体的突破，并由此损害了疫苗的效力。
在目前研究中的基于AMA1的疫苗是以AMA1(BPRC， NIH， WRAIR， PanCPII)的一种或两种天然的等位基因形式为基础，并因此不涵盖足 以防止某些等位基因逃脱的变化的量。
涵盖可以通过简单地延伸所包含的等位基因的数量来改善，而且 成本限制表面只有有限数量的等位基因可以被包含在内。这种情况在 几种不同的疫苗候选物有待结合时甚至变得更重要，如同在痴疾疫苗 中所包含的蛋白质的总数量和量也是有限的。
改善涵盖的备选方法是通过使用有限数量的、被设计为最佳地涵 盖了多态性的人工变体。通过本文所列的数据，我们可以推断，可以 制备涵盖多样性的序列，其中包括与所述的共有序列非常接近的序列。 所述的所有蛋白质均与构象敏感性单克隆抗体发生反应。此外，由 DiCo序列所产生的血清均与天然的等位基因发生反应，并且这些序列 引发了抑制寄生虫生长的抗体。表明，各种单一的DiCo蛋白质在构造 上均是正确的。
DiCo方法可能被认为是有些简单的，这是因为AMA1中的很多表 位是具有一定构造的，并且还可以是不连续的(晶体结构文献crystal structure papers, Thomas refs)。但是,通过合并大部分关联的残 基，天然的氨基酸的节段存在于各种单一的DiCo中，因此大量的具有 一定构造的表位可能是保守的。这可以从以下观察来确证，即，所有 单独的DiCo序列都诱导了针对所测试的3种试验室菌林的生长抑制抗 体。
所列出的数据表明3种人工等位基因的结合诱导了针对所研究的 3种菌抹的、 一定水平的生长抑制抗体，所述的水平与由同源抗原(例 如FCR3上的FVO抗原)所诱导的水平相当，从而表明通过所述的结合 涵盖了相当大量的多样性。
此外，尽管DiCo3抗原与3D7和HB3抗原分别具有17和18个氨 基酸的差异，但是DiCo3抗原仍产生了高水平(土 70%)的、针对3D7 和HB3菌抹的生长抑制抗体。DiCo蛋白质的另一方面在于它们可以结合到融合蛋白质中，从而 进一步减少疟原虫疫苗中的各种成分的量。而且，这种融合蛋白质可 以通过包含其他物质(优选为小的疫苗候选物)而被进一步延伸。一 种此类候选物为MSP1"，其与AMA1形成的融合蛋白质已经被生产。
可以制备完全合并了多种关联模式的3种DiCo。但是，本发明所 釆用的策略是将所观察到的普遍的、最普遍的残基分配到DiCol中， 并将最不普遍的残基分配到DiCo3中。这使得在DiCo2和3中具有大 量的关联中断。
权利要求
1.适用于诱导脊椎动物免疫应答的、包含单一抗原的2至10种蛋白质变体的蛋白质组合物，其中所述的抗原包含大量可变氨基酸位置，其中所述蛋白质变体的氨基酸序列以组合方式代表了各种氨基酸在所述的可变氨基酸位置处的发生频率，以及所述的可变氨基酸位置之间的关联，并且其中所述的发生频率在所述的单一抗原中至少为10％至20％，例如10％、11％、12％、13％......20％，并且其中所述的可变氨基酸位置之间至少75％的关联由蛋白质变体的组合来表示。
2. 根据权利要求1的蛋白质组合物，其中所述的单一抗原为选自 恶性痴原虫、间日痴原虫、i若氏痴原虫、三日疾原虫和卵形痴原虫中 的痴原虫属物种的AMA1蛋白质。
3. 根据权利要求1或权利要求2的蛋白质组合物，其中所述的可 变氨基酸位置为恶性疟原虫AMA1蛋白质的氨基酸位置162、 167、 172、 173、 175、 187、 190、 196、 197、 200、 201、 204、 206、 207、 225、 230、 242、 243、 267、 282、 283、 285、 296、 300、 308、 332、 393、 404、 405、 407、 435、 439、 448、 451、 485、 493、 496、 503、 512、 544。
4. 根据权利要求1至3中任意一项的蛋白质组合物，其包含选自 SEQ ID No 1至12中的至少3种蛋白质变体。
5. 根据权利要求1至4中任意一项的蛋白质组合物，其包含选自 SEQ ID No 1至6中的至少3种蛋白质变体。
6. 根据权利要求1至5中任意一项的蛋白质组合物，其包含具有 SEQ ID No 1、 SEQ ID No 2和SEQ ID No 3的3种蛋白质变体。
7. 根据权利要求1至6中任意一项的蛋白质组合物，其中所述的 蛋白质变体是连接的。
8. 选自SEQ ID No 1至12中的蛋白质变体。
9. 选自SEQ ID No 1至6中的蛋白质变体。
10. 选自SEQ ID No 1至3中的蛋白质变体。
11. 编码根据权利要求7至10中任意一项的蛋白质变体的核酸序列。
12. 根据权利要求11的核酸序列，其选自SEQ ID No 12至24。
13. 包含根据权利要求11或权利要求12的核酸序列的表达载体。
14. 根据权利要求13的表达载体，其中所述的表达载体为 pPicZalpha或pPIC9。
15. 使用根据权利要求13或权利要求14的表达栽体转化或转染 的宿主生物体。
16. 根据权利要求15的宿主生物体，其中所述的宿主生物体为巴 斯德毕赤酵母。
17. 根据权利要求1至6中任意一项的蛋白质组合物在制备用于 接种脊推动物的药物中的用途。
18.根据权利要求17的用途，其中所述的接种为41"对痗疾的接种。
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20. 根据权利要求17或权利要求18的用途，其中所述的脊推动 物为人。
21. 用于生产根据权利要求1至7中任意一项的蛋白质组合物的 方法，该方法包括以下步骤a) 测定抗原中的可变氨基酸位置；各种氨基酸在所述的可变氨 基酸位置处的发生频率；以及所述的可变氨基酸位置之间的关联；b) 测定包含有最大数量X的不同氨基酸的可变氨基酸位置，其 中所述的各种不同氨基酸的发生频率至少为10-20%;c) 设计X种蛋白质变体，这些变体以組合方式代表了各种氨基 酸在各个可变位置处的发生频率。
22. 根据权利要求21的方法，其中对所述的X种蛋白质变体的 设计进一步以组合方式代表了所述的可变氨基酸位置之间至少75%的 关联。
23. 根据权利要求21或权利要求22的方法，其中步骤(c)包括 设计蛋白质变体Y,至Y"其过程如下根据氨基酸的发生频率，向蛋 白质变体L中的可变氨基酸位置处分配在该位置处发生频率最高的氨 基酸，并向L分配在该位置处发生频率较低的氨基酸；向蛋白质变体 Y2至Yw中的相应氨基酸位置处分配其余的氨基酸或相同的氨基酸， 前体条件是可变氨基酸位置之间建立的关联在至少75%的情况下是保 守的。
全文摘要
本发明涉及适用于诱导脊椎动物免疫应答的、包含单一抗原的2至10种蛋白质变体的蛋白质组合物，其中所述的单一抗原为疟原虫属物种的顶膜抗原1(PfAMA1或AMA1)。所述的抗原具有多个可变氨基酸位置，其中所述蛋白质变体的氨基酸序列以组合方式代表了各种氨基酸在所述的可变氨基酸位置处的发生频率，以及所述的可变氨基酸位置之间的关联，并且其中所述的发生频率在所述的单一抗原中至少为10％至20％，例如10％、11％、12％、13％……20％，并且其中所述的可变氨基酸位置之间至少75％的关联由蛋白质变体的组合来表示。
文档编号C07K14/00GK101595127SQ200680056725
公开日2009年12月2日 申请日期2006年12月21日 优先权日2006年12月21日
发明者A·W·托马斯, B·W·法伯, C·H·M·考肯, E·J·瑞马克 申请人:大主教研究中心生物医学基金会