专利名称：用于给生物假体组织预加应力和加帽的方法
技术领域：
当出现天然的心瓣膜变窄时一一通常被称为狭窄，或当天 然的瓣膜渗漏或回流时一一例如当小叶钙化时，表明可以进行心瓣膜 置换。在一个治疗方案中，天然的瓣膜可以被切除并用生物或机械瓣 膜替换。与许多生物假体材料植入相关的一个问题是这些材料中的 结缔组织蛋白(即，胶原和弹性蛋白)在植入到体内后可以变成钙化的。 这种钙化可导致该生物假体发生不期望的硬化或降解。已经提出减轻戊二醛固定的生物假体的体内钙化或用其它 方法改进戊二醛固定方法的各种技术。包括其中的是在美国专利 4,729,139 (Nashef);美国专利4，885，005 (Nashef等)；美国专利4,648,881 (Carpentier等)；美国专利5,002,566 (Carpentier); EPl03947 (Pollock等) 和美国专利5，215，541(Nashef等)中所描述的方法。美国专利5,862,806 (Cheung)中提出的方法包括在应用化学还原剂例如氰基硼氢化钠或硼 氢化钠之前，对戊二醛处理的组织进行脱水。在美国专利6,471,723中 发现的钙化减轻技术包括加入各种胺官能，努力使戊二醛固定组织中 的醛基团解毒。这些化学品不是永久地连接到组织并且随着时间将扩 散出组织。在Connolly, J., J. Heart Valve Disease, 13: 487-493 (2004)中显 示结合乙醇处理应用还原剂有利于减轻钙化。该出版物指出使用还原 剂没有不利地影响该组织的形态学或组织收縮温度。
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最近，已经开发了通过在戊二醛中高温固定组织的钙减轻
的新技术并且在美国专利6,561,970 (Carpentier等)中描述，其与在美国 专利5,931,969 (Carpentier等)中描述的相对组织/流体运动结合。包括 调整戊二醛固定溶液的pH的另一种技术在美国专利6，878，168 (Carpentier等)中公开。 一种商用的实施方式，Edwards Lifesciences XenoLogiXTM组织处理，消除多至98%的磷脂，力图减少钙结合位点。 在也来自于Edwards Lifesciences的Carpentier-Edwards ThermaFixTM高 级心瓣膜组织方法中，使用热和化学处理以除去不稳定戊二醛分子， 这减少了钙结合位点，相对于只有戊二醛的对照，其导致钙摄入显著 减少。虽然这些已知技术中的一些已证明是稍微有效的，但是对
进一步改进以减轻植入物中使用的固定生物假体组织特别是心瓣膜的 长期植入后钙化的倾向仍存在需要。现有技术没有解决由于使用(植入) 环境可能发生的组织内变化。
发明概述本发明解决由于使用(植入)环境可能发生的组织内的某些
有害变化。即，当在正常使用期间组织被周期性地加应力时，产生某 些潜在的钙化、免疫系统攻击等的结合位点。本发明包括预加应力到 组织以暴露这些结合位点，并且随后给这些位点加帽或以其它方法中
和这些位点。图6为显示在加速磨损试验装置(AWT)中随着增加的循环 来自于整个假体心瓣膜的酸产生水平的图；和
10028]图7为显示存在的钙化缓和过程如何大大地降低在经受弯 曲循环的组织带(tissue strip)中的酸水平的图。
优选实施方式的描述现有的组织处理方法针对交联、微生物和在"静态"装置 中组织的其它方面，并且典型地包括使组织在戊二醛、吐温(聚氧乙烯 20山梨糖醇单油酸酯)、乙醇、甲醛和其它物质中浸渍，以缓和植入后 的钙化。一些现有技术方法包括在静态或动态(搅动)装置中加入各种化 学品，以便通过使用金属离子(也就是A产或Fe3+，参见美国专利 5，746，775， Levy)或整体封闭齐U(bulk blocking agents)(也就是2-氨基油 酸，参见美国专利4,976,733， Giradot)以降低交联组织的毒性或减轻钙 化。但是每一个这些现有技术过程方法仅应用于最初处理的组织而不 应用于"使用装置(service setting)"中的组织或组织装置。现有技术方 法局限于加入化学或生物制剂到临时附着于组织的交联组织，或者它们局限于在没有加入任何"加帽剂"的情况下仅还原或氧化组织(参见
美国专利5,862,806， Cheung)。与各种现有技术组织处理不同一一在现有技术中目标是固 定(也就是交联等)组织，本发明描述了另外的方法，通过该方法，由固 定过程形成的酸和其它可能的结合位点，以及从固定组织的弯曲和其 它体内使用相关的应力-诱导的损伤产生的"结合位点"和"可能的结 合位点"被"加帽"。通常用戊二醛、吐温(聚氧乙烯20山梨糖醇单油 酸酯)、乙醇、甲醛和其它物质处理的组织可以提供有用的组织固定。 然而，组织的固定将也产生能够与钙、磷酸酯、免疫原性因子、其它 钙化前体相互作用或吸引钙、磷酸酯、免疫原性因子、其它钙化前体 的"结合位点"。例如，在戊二醛固定组织后，有许多带负电荷的羧酸 基团形成，并且这些基团能够吸引钙离子(由于它们的负电荷并且与带 正电荷离子的静电相互作用)，导致组织钙化或不利的细胞相互作用。本发明的加帽方法包括组织的化学还原，当在弯曲之前、 期间或之后加帽剂存在时应用于组织时，组织的化学还原将永久地将 加帽剂与目标基团连接。例如，在弯曲期间，当醛基团形成时，添加 牛磺酸到组织将使牛磺酸基团加帽于(或覆盖)醛基团，并且还原剂 氰基硼氢化钠将减少醛和牛磺酸基团之间的临时希夫碱键。醛基团最 终替换为可有利于组织水合、柔韧性和细胞相互作用的磺酸盐基团。 另一优选的策略是给酸基团加帽并且包括加入EDC、硫代-NHS和乙醇 胺。当然，可以使用其它加帽剂替换乙醇胺，并且本领域技术人员知
15道除了氰基硼氢化钠之外的其它还原剂，而且它们被包括在本专利的 范围内。这种新的"被加帽"基团将显著地减少钙、磷酸酯、免疫原 性因子或其它类似物质的吸引。碳二亚胺盐酸盐(EDC)、 N-环己基-N'-(2-吗啉乙基)碳二亚胺 (CMC)、 1，3-二环己基碳二亚胺(DCC); 2-氯-l-甲基碘代吡啶(CMPI); 抗生素.，细胞募集剂；血液相容剂，例如肝素；抗炎剂；抗增殖剂； 免疫抑制剂；还原剂，包括氰基硼氢化钠、硼氢化钠、亚硫酸氢钠+乙 酰丙酮、甲酸+甲醛；和单环氧烷烃、二环氧烷烃或聚环氧烷烃。碳二亚胺盐酸盐
SNHS: N-羟基硫代琥珀酰亚胺
DSC: N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯
CMPI: 2-氯-l-甲基碘代吡啶
NaBF4:四氟硼酸钠
NaCNH3:氰基硼氢化钠
0043优选的加帽剂的作用不仅封闭将吸引钙、磷酸酯、免疫原 性因子、或其它类似物质的官能团，而且用优良的"生物功能性 (Biological functionality)"替换那些基团。生物功能性定义为组织成分 对植入材料的局部生物学的作用。组织处理的改进的生物功能性可以 包括组织总电荷(ovemllcharge)的减少、更好的血液相容性、增加的组 织水合、更好的细胞相互作用、更好的柔韧性等。例如，用牛磺酸加 帽于醛官能将阻止醛基团氧化成为酸并且将其替换为可有益于组织水 合、柔韧性和细胞相互作用的磺酸盐基团。被加帽的组织的期望生物 功能性将决定使用的成帽化合物的类型。另一方面，本发明在灭菌后提供自动加帽。例如，在y照 射灭菌之前，用特定的加帽剂(例如葡萄糖和牛磺酸)处理组织，在照射 后将产生加帽剂的活化。加入到组织的加帽剂将立刻有效地加帽于组 织内的目标，但是灭菌(也就是，用环氧乙烷或Y照射)将产生新的结合 位点，其随后将被组织内残留的加帽剂加帽。已知胶原的Y照射裂解 主链内的肽键并产生可能对组织有不良作用的新官能团。这些新官能 团是本发明中所述的目标或结合位点，并可以通过本文列举的加帽剂 加帽或封闭。除了在固定期间一些搅拌或加压外，在现有技术的瓣膜和 装配瓣膜中使用的组织不经受在植入后出现的应力或损伤量。实际上， 在固定和瓣膜组装后，组织典型地被静止地浸没在处理溶液中。在本 发明的情况下，如前面提到的"完全固定的生物假体组织"指己经受 到至少一些交联和/或其它处理以使其稳定和耐用的组织，其基本上准 备就绪进行植入。不同组织和不同交联处理要求不同的时间段以完全 固定生物假体组织，并且固定过程的持续时间因此是相对的。生物假 体组织的固定预期期望包括用通常为戊二醛的交联剂处理；或在 EDC/SNHS化学的情况中，用己二胺和/或辛二酸处理；或对于代那考 尔(Denacol)(环氧)化学，用丁二醇二縮水甘油醚处理。为了更好地理解为本发明处理方法基础的原理，基于实际 试验，提供了在
图1-5中的多个图表。如上提到的，本发明一般包括处 理受应力或损伤的(弯曲的)组织，使得钙或磷酸酯结合位点、或可能引 发钙化的其它这类位点被封闭。酸结合位点和组织钙化之间的相关性 是引人注目的(图2和Hauschka等PNAS 1975 72:3925)，并且众所周知 的事实是酸模板化(acidtemplating)指引多种种类的矿化。因此，在植入 时组织中增加量的游离酸和/或醛与这些结合位点的数目相关，并且因 此增加了钙化的可能性。组织中存在的游离酸和醛的量可以通过己知 的方法测量，特别是标准的分光光度检测。图1的图中间显示来自于经受处理A的总计10个组织样品测试的结果，处理A商业上被称为XenoLogiXTM组织处理方法，来自
于加利福尼亚州Irvine的Edwards Lifesciences。处理A包括首先用戊二醛固定，随后用包括交联剂例如甲醛、表面活性剂例如吐温-80 (聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)和变性剂例如乙醇在内的杀菌剂处理两次。受到处理A的组织的醛和酸的含量都小于单独用戊二醛处理的，其中醛含量减少了大约25%而酸含量减少大约50%。这种减少归因于磷脂的进一步还原，磷脂是酸结合位点的来源。为了帮助预防这种植入后损伤-钙化过程，本发明包括预处理、预损伤、或预加应力于组织并通过连接或加帽于生成的增加的钙化引发位点来缓和。
[0063优选的实施方式包括但不限于放置在加速心瓣膜模拟使用试验装置或其它模拟重复小叶运动的装置中的完整瓣膜，特征是由植入到患者中(使用条件)后的瓣膜可见的，例如在以下的方法中
1.固定的组织瓣膜在模拟的使用环境中循环，直到酸结合位点的
比率开始减小(也就是大约0.5到2百万次循环)，和随后被加帽。2. 固定的组织瓣膜在模拟的使用环境中循环，直到酸结合位点的比率开始减小，并且其在含有加帽剂的溶液中。
3. 实施方式1和2，但是其中灭菌步骤在弯曲/加帽过程期间或之后加入。
4. 实施方式1和2，但是其中处理被加速以减少整体处理时间。
5. 实施方式l、 2、 3、 4和5，但是其中加帽剂用于其它新形成的结合位点例如醛或生物免疫相关的位点。
6. 醛成帽溶液可以含有在pH 7.4的100mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液中的胺(50mM牛磺酸)和还原剂(50mM硼氢化钠)。
7. 酸成帽溶液可以含有大约50-200mM EDC、大约l-10mM硫代-NHS禾B 10-100mM乙醇胺。
[0064虽然发明已经以其优选方式描述，但是应该理解的是已经使用的语言是描述性的言语而不是限制性的。因此，在所附权利要求内可以进行改变，而不偏离发明的真正范围。
权利要求
1.处理生物假体植入组织以减少体内钙化的方法，其包括至少部分交联生物假体植入组织；然后加应力到该交联的组织；和应用钙化缓和剂到该受应力的交联的组织。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述钙化缓和剂包括具 有至少一种可以结合钙、磷酸酯、或免疫原性因子结合位点的成分的 加帽剂溶液。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述钙化缓和剂包括包 含长弹性分子的连接剂溶液。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述钙化缓和剂包括选 自下述的加帽剂胺，氨基酸，氨基磺酸盐，亲水性多官能聚合物，疏水性多官能聚合物，a-二羰基，酰肼类，N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯， 碳二亚胺，2-氯-1 -甲基碘代吡啶(CMPI)，抗生素，细胞募集剂，血液相容剂，抗炎剂，抗增殖剂，免疫原性抑制剂， 还原剂，和单环氧垸烃、二环氧烷烃或聚环氧垸烃。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述钙化缓和剂在下述 选择溶液的一种或组合中被递送水溶液， 有机溶剂，和 有机缓冲溶液。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述组织在加应力之前 被完全交联。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述组织包括安装和弯 曲在适当的流动产生装置中的预切割的心瓣膜小叶。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述组织包括弯曲在适 当装置中的组织大片。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述生物假体植入组织 包括生物假体心瓣膜，并且所述加应力的步骤包括使心瓣膜经受通过 它的脉冲流体流动。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述心瓣膜经受至少 100个循环的脉冲流体流动。
11. 根据权利要求9所述的方法，其中所述加应力的步骤包 括使所述生物假体植入组织经受模拟的植入后生理环境。
12. 根据权利要求9所述的方法，其中所述加应力的步骤包 括使所述生物假体植入组织经受至少一种应力促进环境参数。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述应力促进环境参数包括4-1500Hz范围中的快速脉冲流体流动。
14. 根据权利要求12所述的方法，其中所述应力促进环境参 数是26-65 °C的升高温度范围。
15. 根据权利要求12所述的方法，其中所述应力促进环境参 数是pH 4-7的酸性溶液。
16. 根据权利要求12所述的方法，其中所述应力促进环境参 数是pH 8-10的碱性溶液。
17. 根据权利要求12所述的方法，其中所述应力促进环境参 数是氧化溶液。
18. 根据权利要求12所述的方法，其中所述应力促进环境参 数包括选自以下的至少两种参数4-1500Hz范围中的快速脉冲流体流动；26-65'C的升高温度范围；pH4-7的酸性溶液；pH8-10的碱性溶液；禾口氧化溶液。
19. 根据权利要求1所述的方法，其中进行所述加应力的步 骤直到在所述生物假体组织上待被加帽的新暴露位点增加至少10%。
20. 根据权利要求1所述的方法，其中进行所述加应力的步 骤直到在所述生物假体植入组织中的损伤水平增加大约10%。
21. 根据权利要求1所述的方法，其中进行所述加应力的步 骤至少直到在所述生物假体植入组织中的酸生产率减少大约10%。
22. 根据权利要求1所述的方法，其中首先加应力到所述组 织和随后向其应用钙化缓和剂的步骤进行多次。
23. 根据权利要求1所述的方法，其中首先加应力到所述组 织和随后向其应用钙化缓和剂的步骤用不同的钙化缓和剂进行至少两
24. 处理生物假体植入组织以减少体内钙化的方法，其包括:周期性地加应力到所述生物假体植入组织直到在所述生物假体植入组织中酸生产率减少大约10%;然后应用钙化缓和剂到该受应力的组织。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述生物假体植入组 织包括生物假体心瓣膜，并且所述加应力的步骤包括使所述心瓣膜经 受通过它的脉冲流体流动。
26. 根据权利要求24所述的方法，其中进行所述加应力的步 骤直到所述生物假体植入组织的酸水平的增加速度稳定。
27. 根据权利要求24所述的方法，其中所述钙化缓和剂包括 具有至少一种可以结合钙或磷酸酯和/或免疫原性结合位点的成分的加 帽剂溶液。
28. 根据权利要求24所述的方法，其中所述钙化缓和剂包括 选自下述的加帽剂胺，氨基酸，氨基磺酸盐，亲水性多官能聚合物，疏水性多官能聚合物，a-二羰基j酰肼类，N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯， 碳二亚胺，2-氯-l-甲基碘代吡啶(CMPI)，抗生素，细胞募集剂，血液相容剂，抗炎剂，抗增殖剂，免疫原性抑制剂，还原剂，和单环氧烷烃、二环氧烷烃或聚环氧烷烃。
29. 根据权利要求24所述的方法，其中所述钙化缓和剂包括 包含长弹性分子的连接剂溶液。
30. 处理生物假体心瓣膜以减少体内钙化的方法，其包括 在模拟的流体流动系统中安装生物假体心瓣膜； 使所述生物假体心瓣膜经受至少100个循环的脉冲流体流动；然后应用*丐化缓和剂到所述生物假体心瓣膜。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中使所述生物假体心瓣 膜经受至少IOO，OOO个循环的脉冲流体流动。
32. 根据权利要求30所述的方法，其中首先使所述生物假体 心瓣膜经受脉冲流体流动和随后向其应用钙化缓和剂的步骤进行多
33. 根据权利要求30所述的方法，其中首先使所述生物假体 心瓣膜经受脉冲流体流动和随后向其应用钙化缓和剂的步骤用不同的 钙化缓和剂进行至少两次。
34. 根据权利要求30所述的方法，其中进行所述经受步骤直到所述生物假体植入组织的酸水平的增加速度稳定。
35. 根据权利要求30所述的方法，其中所述钙化缓和剂包括 具有至少一种可以结合钙、磷酸酯和/或免疫原性结合位点的成分的加 帽剂溶液。
36. 根据权利要求30所述的方法，其中所述钙化缓和剂包括 包含长弹性分子的连接剂溶液。
全文摘要
公开了对植入物中使用的生物假体组织的处理或对装配的生物假体心瓣膜的处理，以减少体内钙化。该方法包括预处理、预加应力、或预损伤固定的生物假体组织，其方式为模拟与植入后使用相关的损伤，同时，和/或随后应用钙化缓和剂例如加帽剂或连接剂到损伤的组织。加帽剂抑制组织中结合位点的形成，结合位点是由于损伤过程(使用应力)被暴露或生成的，并且另外在植入后将吸引钙、磷酸酯、免疫原性因子、或其它钙化前体。连接剂在组织结构中的预应力损害位点处将作为弹性加强或吸震弹簧成分。在一种方法中，在装配生物假体心瓣膜中的组织小叶通过模拟预先确定数量循环的实际流动情况被预处理，在此期间或之后将瓣膜暴露于加帽剂。
文档编号A61L27/36GK101678152SQ200880019892
公开日2010年3月24日 申请日期2008年6月10日 优先权日2007年6月11日
发明者D·多布勒, J·戴维森, J·达夫 申请人:爱德华兹生命科学公司