正义单链RNA包膜病毒的2-氨基-2,7-双脱氧-α-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基抑制剂的制作方法

专利名称：：正义单链RNA包膜病毒的2-氨基-2,7-双脱氧-α-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及病毒感染的治疗，具体指正义单链RNA包膜病毒感染。
背景技术：
：正义单链RNA包膜病毒，例如，黄病毒科的成员，人类和动物种群目前健康有关的问题。例如，丙型肝炎病毒(HCV)是慢性肝病的主要原因，导致肝硬化和肝癌(1)。这是世界范围约1.7亿个体的主要病原体感染(1，2)。另外一个正义单链RNA包膜病毒的例子是登革热病毒。登革热病毒(DV)感染包括一个由四个血清型DV(1-4型)之一感染引起的疾病的频谱，发生在世界上许多热带和亚热带地区。登革热的地理分布已传播持续了30年，包括100多个国家(WH0(3))。基于感染DV的数字(约5000万/年)以及每年成千上万严重登革热病例的事实(WHO,(3))，在2005年，美国疾病控制中心(CDC)认为登革热是影响人类的最重要的蚊子传播的病毒性疾病。DV的全球分布比得上疟疾，估计有25.0亿人在疫情传播的高危地区居住。每年都有成千上万登革出血热(DHF)的病例报道，达到病例约5%的死亡率，其中大多数是儿童和年轻人。由于这些病毒造成的健康问题，有必要研究正义单链RNA包膜病毒，以便找到治疗或抑制病毒感染的适当方法。用于研究这样的病毒的一个模型系统是复制子。病毒复制子是RNA分子，或RNA区域，即来自单一复制源的复制。丙型肝炎病毒RNA复制子装备有新霉素抗性基因，允许丙型肝炎病毒细胞内复制的抑制剂的筛选和鉴定。但是，由于复制子不进行完整的复制周期，药物筛选程序和单靠这些化验为基础的行动研究机制可能无法识别靶向病毒复制周期早期(病毒粒附着，进入，脱壳)或晚期(病毒颗粒组装，出口)阶段的化合物。此外，可能负面影响新霉素抗性的药物有可能也会抑制丙型肝炎病毒RNA复制子的病毒复制，而不会影响任何病毒机制，从而需要附加的筛选以过滤出假阳性。在这方面，氨基苷类，如新霉素类似物，利用该丙型肝炎病毒复制子筛选通常不会被认为是潜在抗病毒药物。鉴于研究丙型肝炎病毒的问题，其他的病毒可能是更好的研究模型。其中一种丙型肝炎病毒的此类模型是牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。BVDV通常用作丙型肝炎病毒感染的替代模型。BVDV是一种正义单链RNA包膜病毒，属于黄病毒科科(4)。BVDV是已知能导致感染的动物消化道严重病变随后死亡(5，6)。可以从感染动物分离出两种生物型细胞病变(cpBVDV)和非细胞病变(ncpBVDV)(7)。但是，只有cpBVDV诱导细胞病理学敏感细胞类型，如马-达氏牛肾(细胞(MDBK)。因为各种原因BVDV是一种良好的HCV模型。牛病毒性腹泻病毒具有类似丙型肝炎病毒的结构组织(8)。与HCV—样，BVDV可利用低密度脂蛋白受体进入细胞，使用功能类似的内部核糖体进入位点(IRES)转录，利用具有同源NS3蛋白酶的NS4A辅助因子，具有类似NS3解旋酶/核苷三磷酸酶(NTPase)以及机械地类似NS5BRNA依赖的RNA聚合酶，并有显然类似机制的病毒粒子成熟、组装和出口(8)。由于大量与这些病毒相关的人类的问题，迫切需要预防和/或治疗正义单链RNA包膜病毒感染的组合物和方法。
发明内容本发明的一个实施例是式11的化合物Kg￡3其中I^包括H、环烷基、碳水化合物、肽或核苷酸基团其中R2和R3各独立地包括H、烷基、环烷基、羟烷基、烷氧基烷基、卣代烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烯基、烯基烷基、炔基、炔基烷基、酰基、芳酰基、杂芳酰基、氨基羰基和烷氧基羰基，所有这些基团可以任选地被以下基团取代羟基、烷氧基、烷基、卣代烷基、卣代烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、烷硫基、烷基亚硫酰基、烷基磺酰基、氰基、硝基和/或卤素其中R4、R5和R6各独立地包括0R2、卤素、S(0)nR8、CR9R1(IRU、CH20R、CN、C02R、C0NR12R13和NR12R13，其中R和R8-R13独立地选自以下组成的群组H、烷基、环烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、芳烷基、杂芳基烷基，并且n=0-2附带条件是当R2和R3=H，且R4、R5和R6=OH时，&不包括H。优选的化合物包括那些化合物，其中&选自链霉胺或2-脱氧链霉胺组成的群组，R2和R3是H，以及R4、R5和R6是0H。本发明的另一个实施例是一种用于治疗正义单链RNA包膜病毒感染的组合物，包括氨基糖苷成分2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖，或其类似物。所述组合物降低病毒颗粒的传染性。所述的组合物可用于治疗选自以下组成的群组中的病毒丙肝病毒(HCV)、西尼罗病毒(WNV)、黄热(YFV)、登革热病毒(DV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、马动脉炎病毒(EAV)和辛德毕斯病毒(SINV)，或所述的病毒的组合。所述组合物的所述氨基糖苷可以包括未修饰的2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基成分，或其类似物。优选的组合物包括遗传霉素或作为氨基糖苷的其类似物。可以在所述2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基成分的氨基或羟基基团上利用修饰基团官能化。所述修饰基团选自以下组成的群组烷基、环烷基、羟烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烯基、烯基烷基、炔基、炔基烷基、酰基、芳酰基、杂芳酰基、氨基羰基和烷氧基羰基，所有这些基团可以任选地被以下基团取代羟基、烷氧基、7烷基、卣代烷基、卣代烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、烷硫基、烷基亚硫酰基、烷基磺酰基、氰基、硝基和/或卤素。此外，所述2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖_吡喃庚糖基成分的羟基或氨基基团中的一个可以被利用选自以下群组的取代基取代卤素、S(0)nR、NR"2、0R、酰氧基(0acy1)、CI^I^Rs、CH20R、CN、C02R、C0NR凡，其中R、&、R2、R3独立地选自以下组成的群组H、烷基、环烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、芳烷基和杂芳基烷基，并且n二0-2。具体地，6-0H可以被这样取代。同样，所述2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基成分的所述2-氨基基团可以被利用酰基基团进行官能化，所述酰基基团包括脂肪酸。所述2-氨基基团也可以被烷基化，例如被甲基化。本发明的所述的组合物可以进一步包括药剂学上可接受的载体且该载体无结合至核糖体RNA的组分并抑制包膜病毒蛋白质的转译，和/或病毒颗粒的组装或释放。所述氨基糖苷成分存在的浓度以重量计从约0.001%到约40%，并可以进一步包括至少一种选自以下组成的群组的添加剂抗菌剂、稳定剂、抗真菌剂、止痛剂、抗氧化剂、缓冲剂、遮光剂、化妆用齐U、芳香齐U、润滑齐U、油齐U、增湿齐IJ、醇、干燥齐IJ、防腐齐IJ、乳化齐IJ、增稠齐IJ、清洁齐IJ、增塑剂、渗透促进剂，或它们的混合物。所述的组合物还可以进一步包括至少一种选自以下组成的群组的附加抗病毒剂干扰素、三氮唑核苷和正亚氨基糖。本发明的另一实施例是一种用于治疗多细胞生物体中正义单链RNA包膜病毒感染的方法，包括给感染了正义单链RNA包膜病毒的所述的多细胞生物体施用一组合物，该组合物包括氨基糖苷成分2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖，或其类似物，以及药剂学上可接受的载体。所述组合物的所述氨基糖苷降低病毒颗粒的传染性。所述方法的所述组合物在包括至少一日的时间段内至少每日被施用一次。本发明的再一个实施例是一种用于治疗多细胞生物体中正义单链RNA包膜病毒感染的方法，包括首先诊断所述正义单链RNA包膜病毒在所述生物体内表现的临床症状，随后给所述生物体施用一组合物，该组合物包括氨基糖苷成分2-氨基-2，7-双脱氧_a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖，或其类似物，以及药剂学上可接受的载体。临床症状包括可检测的体液中的病毒抗体存在、体液中的病毒滴度的诊断水平、疼痛、肿胀、发高烧、炎症、发红、麻剌感、痒、皮肤损伤、或它们的组合。所述组合物的施用可以是局部、口服、舌下、粘膜、经膜、皮下、静脉、肌肉、含服、肠外、阴道、肛门、经皮、侧脑室注射、经由离子电泳作用，或它们的组合。本发明的还以实施例是一种用于防止正义单链RNA包膜病毒感染传播的方法，包括给感染了正义单链RNA包膜病毒的生物体以生理学上适当的方式施用一组合物，该组合物包括氨基糖苷成分2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖，或其类似物，以及药剂学上可接受的载体。所述组合物的所述氨基糖苷降低病毒颗粒的传染性。图1表示在72小时感染后遗传霉素对NADL介导的细胞毒性保护。(顶部画面)遗传霉素(geneticin)(31-250yg/ml)对MDBK细胞生活力没有影响。(底部画面)遗传霉素(1.5-25i!g/ml)治疗改善受感染细胞的生活力，相比未受治疗的感染细胞。图2表示遗传霉素抑制感染了BVDV的NADL或NY-1株的MDBK细胞内的病毒载量。画面A)遗传霉素，6、12和25iig/ml，在24和48小时感染后对NADL的活性病毒滴度的影响。画面B)遗传霉素，6、12和25iig/ml，在24和48小时感染后对NY-l的活性病毒滴度的影响。图3表示遗传霉素介导的对NADL的细胞保护作用，相比卡那霉素和庆大霉素。画面A)本研究使用的卡那霉素、庆大霉素和遗传霉素结构图。画面B)只有遗传霉素提供对MDBK细胞内BVDV的NADL株的细胞保护作用(所有治疗每剂药12yg/ml)。干扰素正控制在100IU使用。图4表示遗传霉素对病毒翻译和NS3或RNA复制过程没有影响。画面A表示利用NS3的主要抗体(Mab20.10.6)的免疫印迹分析。画面B表示在6和12yg/ml遗传霉素存在下感染BVDV的NADL株的MDBK细胞的细胞内病毒RNA逆转录酶定量PCR分析。发明详细描述遗传霉素(G418，图3A)是由革兰氏阳性土壤细菌红橙小单孢菌生产的氨基糖苷类抗生素。氨基糖苷类是修饰的糖类，氨基基团被糖类羟基基团中的一个取代。遗传霉素已被主张用作人类抗寄生虫剂(9)。此外，遗传霉素(10)或相关的庆大霉素(11)的施用已经证明在治疗遗传性疾病患者中有帮助(12)。遗传霉素是含新霉素的含2-氨基-2，7-双脱氧-a_D_甘油_D_葡糖-吡喃庚糖基类似物，广泛用于选择转染真核细胞(13，14)。遗传霉素也可用于黄病毒科病毒的稳定病毒复制子的转染；然而，没有关于遗传霉素对这些RNA病毒的效果的现有信息。本发明表明，遗传霉素确实是抗病毒剂，由MDBK细胞对cpBVDV(NADL)的细胞病变效应和cpBVDV(NADL)和ncpBVDV(NY-l)生产的抑制证明，用约4微克/毫升EC5。。遗传霉素抗病毒效果是浓度依赖性(图1)。用于抗BVDV活性的EC5。浓度为4微克/毫升(表1)，并在12.5微克/毫升，它增加未感染控制细胞的水平的细胞活力。遗传霉素的这种抗病毒和细胞保护活性可以与那些干扰素相比，其在100IU抑制BVDV导致的CPE，其是用于BVDV体系中干扰素的抗病毒活性的EC9。[20，21]。在如400微克/毫升以上的高剂量，遗传霉素被证明具有细胞毒性，由在这些浓度细胞活性的下降曲线反映。本发明还表明，遗传霉素阻碍与NADL介导的细胞病理学相关的单分子层破裂。遗传霉素的这种抗病毒活性感染后72-120小时可以观察出，表明病毒的传播受到抑制。此外，病毒复制的特性，通过测量进入细胞细胞培养基的传染性病毒，表明在感染后24和48小时，遗传霉素(6-25微克/毫升)抑制BVDV的NADL和NY_1株二者的病毒产量10到100倍(图2)。在感染的第一个48小时遗传霉素明显减少病毒产量至低于10%控制水平。虽然不想以任何具体的理论进行限制，根据在我们研究中使用的病毒滴度方法的事实，只有测量进入培养基中的活性传染性颗粒的释放，人们可以得出遗传霉素抑制病毒释放或降低病毒颗粒的传染性。遗传霉素在浓度为25微克/毫升对病毒蛋白NS3，BVDV转译的标记物没有影响，在10的多重感染(MOI)感染后24小时(图4)。24小时时间点被用来证明稳定的BVDV转译，因为高MOI(例如，MOI值为10)和稍后的时间点，病毒细胞病理学和细胞死亡发生，使分析不可靠的[14]。此外，遗传霉素不阻止NS2-NS3蛋白的处理(图4)，其通常被观察为BVDV的非致细胞病变株，表明遗传霉素介导的细胞保护作用不是由于对病毒蛋白处理的抑制。另外，120kDa条带的NS2-NS3，通常在感染ncpBVDV过程中被观察到，不能在遗传霉素处理或感染NADL的未经处理细胞中找到。这些数据表明，遗传霉素尽管蛋白质合成抑制剂(15，16)，但是不直接通过抑制转译或复制而抑制病毒产量。此外，由于病毒进入在转译之前，所以极不可能的是遗传霉素在转译之前阻止病毒生理反应。此外，假定转译与RNA数量成比例，则遗传霉素不可能阻止RNA转录。因此，遗传霉素控制活性病毒的组装或释放，或者它降低病毒颗粒的传染性。该结论也得到菌斑测定的支持，其中均匀6和12微克/毫升的遗传霉素显着减小菌斑大小，而不影响菌斑数量。氨基糖管类被认为通过干涉病毒进入以及抑制病毒RNA的转译来抑制病毒复制(17-19);但遗传霉素对BVDV的抗病毒行为是唯一不同的，因为其机制似乎与随后的病毒转译、处理和复制的时间有关。要确定是否遗传霉素调控病毒RNA的复制，用RT-qPCR测定病毒RNA的细胞内累积。在用BVDV(M015)感染后24小时，并缺乏或存在不同浓度遗传霉素情况下细胞内病毒RNA的数量无差异。此外，抗病毒浓度的遗传霉素无法抑制病毒RNA在感染24小时在细胞内累积后也提示需要病毒RNA合成的病毒NS5B被成功地转译和处理。因此，病毒RNA的复制不由遗传霉素调控。表1显示遗传霉素的抗病毒活性的总结。细胞病变效应检测(CPEA)是病毒引起细胞死亡的测定；产生的值保护50%的细胞免受病毒引起死亡的药物有效浓度(EC5。)。产量减少检测是感染的细胞释放的活性感染性病毒颗粒数目的测定；产生的值是降低病毒滴度50%的药物有效浓度(EC5。)。杀死50%细胞所需的细胞中毒浓度被定义为(1:5。，且是对药品内在毒性的测定。虽然不想以任何特定的理论进行限制，目前的数据表明遗传霉素以及可能的其它含有2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖成分的抗病毒剂减小了病毒颗粒的感染性并抑制病毒的传播和改善病毒感染的症状。表1.遗传霉素对黄病毒和瘟病毒的抗病毒活性的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>aDV=登革热病毒，YFV=黄热病毒，BVDV=牛病毒性腹泻病毒bBHK=幼仓鼠肾，BND=宽吻海豚细胞，MDBK=马-达氏牛肾eCPEA=细胞病变效应检测(CPEA)，检测细胞死亡；EC5。=保护50%的细胞免受病毒引起死亡的药物有效浓度产量减少检测是感染的细胞释放的活性感染性病毒颗粒数目的测定；产生的值是降低病毒滴度50%的药物有效浓度dYRA=产量减少检测。检测感染的细胞释放的活性感染性病毒颗粒数目的减少EC5。=使病毒滴度降低50%的药物有效浓度6CC5。=杀死50%细胞所需的细胞中毒浓度fnd=未定遗传霉素具有不可逆转的耳毒性和肾毒性的可能，如大多数氨基糖苷类一样。毒性较低的新类似物将大大有助于治疗和/或与预防正义单链RNA包膜病毒感染。斜勾-雄條藩成,分遗传霉素的结构-功能分析，与其接近结构类似物卡那霉素B和庆大霉素比较，发现只有遗传霉素具有对cpBVDV活性，通过显著提高感染细胞的活力显示(图3)。此外，庆大霉素和卡那霉素再实验浓度下降低感染细胞的细胞活力。所有这三个化合物结构上有共同的环n(2-脱氧链霉胺类)，表明遗传霉素的正义单链RNA包膜的抗病毒活性与环II没有关系。此外，庆大霉素和遗传霉素关于环III是相同的，从而排除它作为抗病毒成分。因此，环I，2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖(式I)，似乎确定遗传霉素作为正义单链RNA包膜的抗病毒剂的特性。当确认时，不包含2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖成分的其它有关氨基糖苷类，如巴龙霉素，没有对BVDV的抗病毒活性。此外，结构上不相关的抗生素，例如，四环素和夫西地酸，对BVDV无效。此结构-功能分析不同于蛋白质合成的氨基糖苷类抑制，通过结合到30S核糖体的A点(20)，对此遗传霉素特性约束与环II的存在相关(图3A)(21)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>式I关于环I的化学结构，遗传霉素的2-氨基-2，7-双脱氧_a-D-甘油_D_葡糖-吡喃庚糖成分，吡喃糖环的碳_3和碳_4(式I和图3A)用羟基取代，并在两个取代中相同和配置为卡那霉素的环I的结构(图3A)，其没有抗病毒活性。然而，对于遗传霉素，在2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖成分的碳_6上的取代不同于卡那霉素的环I，醇作为通过碳-6的附加甲基取代的仲醇。因此，这两个化合物的结构相关的差异与吡喃糖环外部的碳原子，碳_6的官能化相关。仲羟基加上位置_6上甲基取代的组合给遗传霉素至小亚基核糖体最低的亲和力(明哥特_勒克莱尔等，1999年；普菲斯特PS等2005)。这些观察表明，对遗传霉素抗病毒活性的结构要求不同于那些确定转译的抑制，并支持结论2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖成分负责遗传霉素的正义单链RNA包膜抗病毒活性。本发明的一个实施例提供下式II表示的抗病毒化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>式II其中&包括H、环烷基、碳水化合物、肽或核苷酸基团其中R2和R3各独立地包括H、烷基、环烷基、羟烷基、烷氧基烷基、卣代烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烯基、烯基烷基、炔基、炔基烷基、酰基、芳酰基、杂芳酰基、氨基羰基和烷氧基羰基，所有这些基团可以任选地被以下基团取代羟基、烷氧基、烷基、卤代烷基、卣代烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、烷硫基、烷基亚硫酰基、烷基磺酰基、氰基、硝基和/或卤素其中R4、R5和R6各独立地包括0R2、卤素、S(0)nR8、CR具。Rn、CH20R、CN、C02R、C0NR12R13和服12113，其中R和R8-R13独立地选自以下组成的群组H、烷基、环烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、芳烷基、杂芳基烷基，并且n=0-2附带条件是当R2和R3=H，且R4、R5和R6=0H时，&不包括H。本发明优选的化合物包括式H表示的那些化合物，其中&选自H和环己胺类似物链霉胺和2-脱氧链霉胺组成的群组，R2和R3是H，以及R4、R5和R6是0H。此处所述的术语"低烷基"包括支链和直链Q到C6烷基。术语"环烷基"包括C3到Q。环烷基，例如环丙基、环己基和环癸基。术语"脂肪酸"包括饱和或不饱和、直链或支链的Q-C^羧酸。组合物本发明的另一个实施例提供包括或基本上由抗病毒剂组成的组合物，其包括2_氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖成分和/或能抑制正义单链RNA包膜病毒传播和感染的其类似物，药剂学上可接受的载体，当以生理学上合适的方式试用至多细胞生物体，如人类或动物时，降低所述生物体内的RNA病毒的滴度并预防或改善所述生物体内感染有关的症状的发生。本发明的抗病毒剂可以包括2-氨基-2，7-双脱氧-a_D_甘油_D_葡糖-吡喃庚糖本身或其类似物。所述2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基成分可以如上述进行修饰或不修饰。一种优选的抗病毒剂是遗传霉素。所述的组合物的抗病毒剂存在的浓度以重量计从约0.001%到约40%，优选为以重量计从约0.1%到约1%。所述组合物也可以进一步包括一种或多种添加剂，例如抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、止痛剂、抗氧化剂、缓冲剂、遮光剂、化妆用剂、芳香剂、润滑剂、油齐U、增湿齐U、醇、干燥齐U、防腐齐U、乳化齐iJ、增稠齐iJ、清洁齐iJ、增塑齐iJ、渗透促进剂，或它们的混合物。此外，药剂学上可接受的载体无结合至核糖体RNA的组分并抑制包膜病毒蛋白质的转译，和/或病毒颗粒的组装或释放。可以使用各种载体，只要它们与人体或动物的血液和组织相容，以使所述组合物可以被注射或吸收而不导致有害的生理效果或干扰活性成分的功能。对于水溶性抗病毒剂，所述载体可以是水。此外，所述的组合物可以进一步包括附加抗病毒剂。具体而言，通过不同于遗传霉素及其类似物机制的行为抑制病毒复制的抗病毒剂，当其与本发明的抗病毒剂结合时，可以增强抗病毒反应并允许减少剂量，从而减小毒性和使不期望的副作用最小化。而且具有不同机制的行为的此类抗病毒剂的结合可以用于减小病毒发展耐药性的倾向。此类抗病毒剂的例子包括干扰素、三氮唑核苷和正亚氨基糖。本发明的一个代表性可注射实施例包括2-氨基-2，7-双脱氧-a_D_甘油_D_葡糖_吡喃庚糖和/或其类似物，浓度从约0.Olmg/mL至约500mg/mL，悬浮在等渗氯化钠的载体溶液中，该载体溶液包含适当的防腐剂，诸如约O.1至约1.5%苯甲醇，稳定剂，诸如约0.25至约1%羧甲基纤维素钠和约0.005至约0.1聚山梨醇酯80，加上足量氢氧化钠或盐酸以调节pH至约5.0至约7.5之间(所有百分比都以重量计)。病毒本发明含2-氨基-2，7-双脱氧-a_D_甘油_D_葡糖-吡喃庚糖基的抗病毒剂选择性用于正义单链RNA包膜病毒。负义单链RNA包膜病毒，例如流感病毒，以及双链DNA病毒，例如，单纯疱疹病毒(HSV)和乙型肝炎病毒(HBV)不受影响。典型的正义单链RNA包膜病毒包括丙肝病毒(HCV)、西尼罗病毒(WNV)、黄热(YFV)、登革热病毒(DV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、马动脉炎病毒(EAV)和辛德毕斯病毒(SINV)。正义单链RNA包膜病毒的一个科，黄病毒具有单分体、线性、正极性的单链RNA基因组、长度9.6-12.3kb。病毒颗粒被包覆且为球形。在所述科中有几个属，包括黄病毒属，具有黄热病病毒、西尼罗病毒和登革热病毒种；肝炎病毒属，唯一丙肝病毒种；以及瘟病毒属，包括牛病毒性腹泻病毒和马动脉炎病毒(EAV)种，其它感染非人类的哺乳动物。由黄病毒科所造成的主要疾病包括登革热、圣路易斯脑炎、西尼罗脑炎、黄热病和丙型肝炎。辛德毕斯病毒(SINV)是披膜病毒科的成员，在甲病毒亚科。该病毒由蚊子传播并导致人体辛德比斯热，症状包括关节痛、皮疹和不适。类似物关于遗传霉素的环I，2-氨基-2，7-双脱氧_a-D-甘油_D_葡糖-吡喃庚糖基成分(式I;同样式II，其中R15R2和R3=H，以及R4，R5和R6=OH)可以利用各种修饰基团进行官能化以形成与本发明的抗病毒剂一样活性的衍生物。例如，连接至碳-3，_4，和/或-6羟基可被官能化以形成衍生物。在非限制的例子中，羟基可以利用卤代烷或其它烷化剂烷基化以形成烷氧基团，使用本领域技术人员熟知的方法。作为选择，使用诸如酰氯或酸酐的酰化剂，例如醋酸酐，酰化羟基以形成酰氧基。同样，连接至碳-2的氨基可以被烷基化或酰基化以分别形成烷和酰胺基。例如，酰基基团可以是脂肪酸，具有4-28碳范围；和烷基基团可以是具有l-6碳范围的低烷基，如甲基、乙基、正丁基或正己基。附加的修饰或官能化基团包括烷基、环烷基、羟烷基、烷氧基、卣代烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、烯基、烯基烷基、炔基、炔基烷基、酰基、芳酰基、杂芳酰基、氨基羰基和烷氧基羰基，所有这些基团可以任选地被以下基团取代羟基、烷氧基、烷基、卣代烷基、卣代烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、烷硫基、烷基亚硫酰基、烷基磺酰基、氰基、硝基和/或卤素。本文中所使用的术语"类似物"包括上述衍生物，其中2-氨基-2，7-双脱氧_a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基成分已被利用各种修饰基团取代或官能化。该术语还包括下述的分子，其中一个核心分子的一个或多个功能团，例如，羟基或氨基，已被其它原子或基团取代。此外术语"类似物"也包括2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖与其他生物相关分子的轭合物，例如，肽和其他碳水化合物，如下所述。关于等量取代化学，2-氨基-2，7-双脱氧-a_D_甘油_D_葡糖-吡喃庚糖基成分的羟基和/或氨基基团可以利用卤素取代，如氟和氯。其它羟基和/或氨基取代可以包括S(0)nR、0R、酰氧基、CR^RpCH2OR、CN、C02R和CONR凡，其中R、&、R2、R3独立地选自以下组成的群组H、烷基、环烷基、烷氧基烷基、卤代烷基、芳烷基和杂芳基烷基，并且n=0-2，该合成方法对本领域技术人员是熟知的。修饰的具体有用方面是碳-6羟基基团，在吡喃糖环外部。式III的化合物是羟基基团的衍生物，如上所述。下面式IV的化合物是类似物，其中6-羟基基团已由另一功能基团(X)取代，如上所述。式III<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>式IV2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖与碳水化合物、脂肪酸、肽或核酸、以及它们的衍生物的轭合物，在治疗多细胞生物体特别是人类的正义单链RNA包膜病毒感染中也有用，降低病毒颗粒的传染性，从而抑制病毒的传播及改善的病毒感染症状。修饰或未修饰2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖基成分的轭合物可以包括但不限于碳水化合物、其它氨基糖、氨基糖等排物，例如，链霉胺和2-脱氧链霉胺、脂肪酸、肽和/或核酸、以及它们的衍生物和类似物。此处上文所述的结构修饰影响亲脂/亲水平衡(也称为LogP或LogK。J、水溶性、极性和其它直接与药物吸收和分布有关的理化特性。这种修饰可以提高本发明的抗病毒制剂的疗效。它们可能也有助于缓和潜在毒性。治疗的方法在另一个实施例中，本发明提供一种用于治疗多细胞生物体特别是人类的正义单链RNA包膜病毒感染的方法，包括给感染了RNA包膜病毒的生物体以生理学上适当的方式施用一组合物，其中该组合物包括至少一种抗病毒剂，其包括氨基糖苷成分2-氨基-2，7_双脱氧_a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖或其类似物，其可以抑制正义单链RNA包膜病毒组装、释放和/或传播，以及药剂学上可接受的载体。优选的抗病毒剂包括遗传霉素或其类似物。抗病毒效果是通过降低病毒颗粒的传染性实现。此治疗可以用于预防最初感染，减慢存在的感染进程或改善存在正义单链RNA包膜病毒感染或病毒爆发期的症状。所述抗病毒剂存在的浓度以重量计从约0.001%到约40%，优选以重量计约0.1%至约1%。所述的组合物至少每日被施用一次，并在包括至少一日的时间段。所述的治疗方法还包括诊断所述正义单链RNA包膜病毒在所述生物体内的临床症状的初步步骤。这些临床症状包括可检测的体液中的病毒抗体存在、体液中的病毒滴度的诊断水平、疼痛、肿胀、发高烧、炎症、发红、麻剌感、痒、皮肤损伤、或它们的组合。所述治疗正义单链RNA包膜病毒感染的方法还可包括一组合物的使用，该组合物进一步包括一添加剂，例如抗菌齐U、稳定齐U、抗真菌齐U、止痛齐U、抗氧化齐U、缓冲齐U、遮光齐U、化妆用齐U、芳香齐U、润滑齐U、油齐U、增湿齐U、醇、干燥齐U、防腐齐iJ、乳化齐iJ、增稠齐iJ、清洁齐iJ、增塑齐iJ、渗透促进剂，或它们的混合物。此外，所述治疗正义单链RNA包膜病毒感染的方法还可包括一组合物的使用，该组合物进一步包括附加抗病毒剂。具体而言，通过不同于遗传霉素及其类似物机制的行为抑制病毒复制的抗病毒剂，当其与本发明的抗病毒剂结合时，可以增强抗病毒反应并允许减少剂量，从而减小毒性和使不期望的副作用最小化。而且具有不同机制的行为的此类抗病毒剂的结合可以用于减小病毒发展耐药性的倾向。此类附加抗病毒剂的例子包括干扰素、三氮唑核苷和正亚氨基糖。所述组合物的施用可以是局部、口服、舌下、粘膜、经膜、皮下、静脉、肌肉、含服、肠外、阴道、肛门、经皮、侧脑室注射、经由离子电泳作用，或它们的组合。本发明的另一实施例提供防止正义单链RNA包膜病毒感染传播的方法。该方法包括给感染了正义单链RNA包膜病毒的生物体以生理学上适当的方式施用一组合物，其中该组合物包括至少一种含有氨基糖苷成分2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖或其类似物的抗病毒剂，以及药剂学上可接受的载体。通过降低病毒颗粒的传染性抑制病毒传播。优选的抗病毒剂是遗传霉素或其类似物。实例实例1.原料与方法化学药品所有的细胞培养用品获得自英杰(Invitrogen)(卡尔斯巴德，加利福利亚，美国)。除非列明，所有其他试剂都是由SigmaAldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)提供。细胞和病毒MDBK细胞(ATCC-CCL22)种在含4.5克葡萄糖4.5和10%马血清的达乐伯克改良培养基(DMEM)中，或在最低必需培养基(MEM)具有10%无BVDA抗体的照射胎牛血清。在细胞培养基或只在模拟感染的细胞培养基中，50到70%融合细胞的单层感染了斑纯化cpBVDV株NADL或ncpBVDV株NY-1。在我们的研究中使用的cpBVDV的滴度足以产生0.1到0.5感染(MOI)的输入多重性。经过利用病毒在细胞培养孵化l小时(5%二氧化碳，37°0的初步培养，培养基中已更改为新的无病毒培养基。对于氨基糖甙类或干扰素的实验，药品以所需最终浓度加入至50到70%的融合细胞单层并接着成长另外24到72小时。干扰素被用作积极抗病毒控制。细胞生活力MDBK细胞以密度l-2xl(f细胞/孔镀在96孔板中。在初始感染后1小时随后的一日，清洗细胞并将含有不同浓度的抑制剂添加至细胞并和培养所需时间。细胞生活力被使用刃天青(resaruzin)(奥尔马尔蓝色(almarBlue))指示剂染料评估[10]。染料转换(AFU)的定量分析测定用具有激发/发射=550/580nm荧光板读出器测量。对于毒性研究，细胞生活力表现为控制百分比(AFUtaated/AFU。。ntral)。细胞生活力的药物介导的保护表示如下的存活百分比％存活=[(AFUt咖ted)BVDV-AFU一jBVDV]/[(AFU。。—》模拟-(AFUe。ntral)BVDV]，其中(AFUteeated)BVDV是感染BVDV并用一定遗传霉素稀释液治疗的细胞的AFU，(AFUe。ntMl)BVDV是感染BVDV并不治疗的细胞的AFU，和(AFUe。ntral)是模拟感染并不治疗的细胞的AFU。50%有效浓度(EC5。)被定义为提供了对病毒引起细胞病变效应的细胞的50%保护的化合物的浓度，并利用对数内插法计算[11]。16[OO93]板生活力试验MDBK细胞被BVDV的NADL株感染，MOI为0.1并分布到胶原涂层，24孔板。在培养6小时后，在37t:和5%二氧化碳下用磷酸缓冲液(PBS)清洗细胞一次，随后将2.5%甲基纤维素加入含5X热灭活马血清的匿EM的培养基。5日后进行结晶紫染色。测定病毒滴度12孔组织培养板的每个孔种有1.5xl05MDBK细胞并在37。C具有5%二氧化碳下培养24小时。然后，在去除培养基和冲洗单层之后，细胞感染BVDV约1到2的M01以确保感染效率。接着病毒在4t:被吸收到细胞1小时并在增加生长培养基中遗传霉素所需的浓度之前用冷PBS冲洗。在感染后24小时和48小时，从每个孔收获0.25ml等分试样的上清液并在进一步病毒滴度分析之前在-7(TC下储存。要确定病毒滴度，制备收获的上清液的10倍稀释液(10—1到10—8)且50微升每份稀释液被置于8个直立孔中的每个孔，96孔板的每份稀释液含有50微升MDBK细胞。细胞然后在37t:培养96到120小时且孔由于病毒的细胞病变效应(CPE)而被记下，以根据里德-明希(Reed-Muench)确定病毒滴度[12]。对于ncpBVDV(NY-l)，滴度板在120h利用20%丙酮固定。用BVDVMAb20.10.6利用免疫过氧化物试验系统检测存在的病毒。病毒NS3蛋白免疫印迹(WesternBlot)分析在存在或不存在25微克/毫升遗传霉素情况下MDBK细胞感染BVDV的NADL株(MOI10)。根据以前的出版物[13]，18到24小时感染后时间点被选择以确定感染细胞中的病毒蛋白质。此外，以前曾表明在MDBK细胞中在36小时，具有高MOI，细胞单层恶化非常迅速，导致病毒诱导的细胞死亡[14]。因此，在24小时感染后，细胞培养液被去除，细胞用PBS洗几次。接着，2x浓縮的电泳样品缓冲液被加入，从盘上刮下细胞并转移至微型离心机。为了降低粘度，样本简短地经声波处理或通过26规针多次并煮沸5分钟。15微克溶菌样本连续10%SDS-PAGE，然后被转渍。在封闭液中封闭1小时(PBS中0.05%吐温20中5%奶粉)，膜被培养养具有一抗(MAb20.10.6)[15]1:1，000稀释在封闭液中60分钟，室温并并PBS中0.05%吐温20清洗。在利用二抗(抗'鼠IgG-HRP;西格玛)培育之后，l:200稀释封闭液60分钟，室温，NS3被利用阿默舍姆(Amersham)ECL试剂盒根据制造商的指示检测(阿默舍姆生物科学，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)。检测细胞内病毒RNA的RT-PCR技术定量使用感染后24小时时间点，因为整体病毒RNA合成在感染后48小时在感染细胞中下降约两至三倍，所述在感染细胞在病毒生产减少可能是由于在该高MOI观测的快速细胞死亡[14]。因此，在存在或缺席6和12微克/毫升遗传霉素情况下，在用BVDV的NADL株(MOI10)感染后24小时，培养基被从细胞单层去除并用PBS洗3次。使用RNAeasy试剂盒(恰根，瓦伦西亚，加利福利亚，美国)分离RNA。50微升RT定量PCR(qPCR)是根据先前的出版物[16]进行，利用相应核苷酸103'123(5-TAGCCATGCCCTTAGTAGGAC-3)的前置引子、相应核苷酸176196(5-GACGACTACCCTGTACTCAGG-3)的反置引子和TaqMan探针(6:羧基荧光素-AACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTT-6-羧基四甲基罗丹明)。PCR扩增包括在94。C变性40周期20s和退火和延长1分钟在62°C的ABI7000序列检测器。在三个复制反应中所有样本进行了分析。图1显示，遗传霉素对NADL介导的细胞毒作用保护在感染后72小时。顶部画面显17示遗传霉素(31-250微克/毫升)对MDBK细胞生活力无影响。细胞生活力表示为遗传霉素治疗细胞对控制(未治疗)细胞的细胞生活力百分比。底部画面显示遗传霉素(1.5-25微克/毫升)提高感染细胞的细胞生活力，相比未经处理的病毒感染细胞。细胞生活力表示为遗传霉素治疗的NADL感染的细胞对未治疗的感染细胞的细胞生活力百分比。细胞生活力在96孔板中估定，用刃天青(Resaruzin)(奥尔马尔蓝色)指示剂染料(22)。染料转换的定量分析测定用具有激发/发射=550/580nm荧光板读出器测量。误差线显示每一浓度的遗传霉素(n=6)的标准误差。实例2.图2显示遗传霉素抑制病毒载量在感染NADL或NY-1的MDBK细胞中。画面A显示遗传霉素，6、12和25微克/毫升，在感染后24、48和72小时对NADL的活性病毒滴度的影响。画面B显示遗传霉素，6、12和25微克/毫升，在感染后24、48和72小时对NY-1的活性病毒滴度的影响。根据里德_明希测定病毒滴度(斯佩克特，S.和隆茨，G.，1986年，临床病毒学手册，Elsevier科学出版有限公司，纽约，pp.194，斯奈德，M.L.，斯图尔特，W.C.，克雷瑟，J.l，PRV和TGE微型化中和试验，1981年，血清微型化技术，NVSL，USDA，埃姆斯，艾奥瓦州，pp.44-45)，分别使用NADL或NT-1的CPE或NS3Mab20.10.6。误差线表示每个时间点和遗传霉素(n=3)规定的浓度的标准误差。实例3.图3显示遗传霉素介导的对NADL的细胞保护作用，相比卡那霉素和庆大霉素。画面B显示只有遗传霉素提供对NADL的细胞保护作用。所有氨基糖苷类使用6，12和25微克/毫升。细胞生活力在96孔板中估定，用刃天青(奥尔马尔蓝色)指示剂染料(22)。染料转换的定量分析测定用具有激发/发射=550/580nm荧光板读出器测量。误差线显示每一氨基糖苷和指定浓度的标准误差。实例4.图4显示遗传霉素对NS3的转译和处理无影响。画面A:在缺席或存在25yg/ml遗传霉素情况下MDBK细胞感染BVDV的NADL株，并在感染后24小时，膜和胞液碎片被制备。样本经过SDS-PAGE和免疫印迹分析，利用NS3的一抗(Mab20.10.6)。画面B显示在存在6和12iig/ml遗传霉素情况下感染BVDV的NADL株的MDBK细胞中细胞内病毒RNA在感染后24小时的逆转录定量PCR分析。病毒RNA表达被定义为从遗传霉素处理的感染细胞收集的病毒RNA对从未处理的感染细胞检测的RNA的百分比。误差线表示每个指定的条件(n=3)的标准差。实例5.这个例子描述本发明的使用遗传霉素的注射用组合物。遗传霉素，O.l-10mg/kg，溶解在含1.0%防腐剂苯甲醇和1%羧甲基纤维素钠和0.05%吐温80作为稳定剂的等张氯化钠的无菌载体溶液中。利用氢氧化钠或盐酸调整PH到7.0。实例6.这个例子描述本发明的注射用组合物，使用2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖_吡喃庚糖和其它附加抗病毒剂干扰素。2-氨基-2，7-双脱氧-a-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖，O.l-10mg/kg，溶解在含1.0%防腐剂苯甲醇和1%羧甲基纤维素钠和0.05%吐温80作为稳定剂的等张氯化钠的无菌载体溶液中。利用氢氧化钠或盐酸调整18pH到7.0。加入干扰素IOOOIU。实例7.这个例子说明本发明所述的治疗登革病毒感染的方法。显示登革出血热(DHF)症状的病人每日注射实例5的组合物，注射7日。所述剂量范围从0.1到10mg/kg。实例8.这个例子说明本发明所述的治疗HCV感染的方法。病人被诊断为具有HCV的临床症状，包括血液中HCV的存在。该病人每日注射实例6的组合物，注射至少30日。本发明的抗病毒剂的剂量范围从0.1到10mg/kg。检测血液中HCV的存在。持续反应意味病人在体制治疗6个月保持无HCV。这并不意味着病人痊愈，但在体内活性HCV水平非常低且可能不造成很大损害。本领域技术人员将会认识到前述实例是为了举例说明本发明，而不是为了限制本发明于所揭示的具体形式。被本发明和所附权利要求包含的其它实施例可以被预想到。[cms]参考文献1.沃特HJ，瑟夫LB.丙型肝炎病毒感染恢复、持久性和后遗症长期结果的观点，西民肝病2000;20(1):17-35。2.科恩J.丙型肝炎的科学挑战，1999年7月2日;285(5424):26-30。3.登革热/登革出血热，威克利流行病学研究，2000年6月16日，75(24):193-6。4.利特MS，安德森DK，瑞特泽尔E.BVDV与黄病毒科成员病毒性比较，J.根.崴欧尔，1988年10月，69(pt10):2637-43。5.布朗利J.，克拉克MC，，霍华德CJ，致命牛粘膜病的实验生产，兽医研究，1984年6月2日，114(22):535-6。6.柏林SR，迈克鲁肯RC，卡特利MF，通过重复感染细胞病变BVDV感染非细胞病变B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物进一步包括至少一种附加抗病毒剂。45.如权利要求44所述的方法，其中所述的抗病毒剂选自以下组成的群组干扰素、三氮唑核苷和正亚氨基糖。46.如权利要求37所述的方法，其中所述的组合物进一步包括至少一种附加抗病毒剂。47.如权利要求46所述的方法，其中所述的抗病毒剂选自以下组成的群组干扰素、三氮唑核苷和正亚氨基糖。全文摘要本发明涉及一种化合物、组合物和方法，包括式(II)表示的氨基糖苷成分，用于治疗和预防正义单链RNA包膜病毒感染的传播。本发明的一个实施例使用遗传霉素或其类似物，包括2-氨基-2，7-双脱氧-α-D-甘油-D-葡糖-吡喃庚糖，作为抗病毒剂。本发明所述的化合物、组合物和方法应用于丙肝病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、登革热病毒、牛病毒性腹泻病毒、马动脉炎病毒和/或辛德毕斯病毒(SINV)导致的感染。文档编号A61K31/70GK101772347SQ200880101722公开日2010年7月7日申请日期2008年6月6日优先权日2007年6月7日发明者亚历山大·V·贝克,爱德华·J·杜博维,黑兹尔·H·司徒申请人:肝炎与病毒研究所