包含药物的纳米颗粒的制作方法

专利名称：包含药物的纳米颗粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含吡格列酮(Pioglitazone)或其盐的纳米颗粒，和包含该纳米颗 粒的药物制剂和支架(stent)。发明背景 随着包括药物洗脱支架(DES)的冠状动脉介入治疗(经皮冠状动脉介入治疗； PCI)技术的进步，通常是所关心的问题的PCI后再狭窄已经减少。然而，目前世界上使用的 DES包含免疫抑制剂(例如西罗莫司)或抗癌剂(例如紫杉醇)，与常规裸金属支架(BMS) 相比，尽管DES可以抑制再狭窄，但是已经报道了其在长期的预后显示出较高的急性冠状 动脉综合征(ACS)发病率，这是一种比BMS更致命性的病理学，并且也已阐明其没有改善重 要予页后(vital prognosis)。因此，推测的原因为，尽管急性冠状动脉综合征主要是由于动脉硬化斑块破裂 (斑块破裂)引起，其是一种相对轻度至中度的损害，而不是严重的狭窄损害(其通常为 PCI的目标)，但是，使用免疫抑制剂或抗癌剂的DES通过经由防止平滑肌细胞生长抑制新 内膜(neointimal)增厚来抑制再狭窄，并且其非特异性细胞增殖抑制作用防止了血管内 皮再生并且形成了变成血栓的非稳定性斑块，从而增加了 ACS的发病率。因此，为了改善重要预后，防止引起急性冠状动脉综合征的斑块破裂很重要，并且 发展具有新内膜增厚抑制作用和斑块稳定作用(通过不防止血管内皮再生)等等的支架被 认为是一种有效的治疗策略。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是一种核受体，其由配体活化并且起转录 因子作用。PPAR具有亚型a、γ和β/δ，并且深度参与碳水化合物、脂质等的代谢和细胞 分化。已知在动脉硬化损害中，PPAR γ在血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞和T淋 巴细胞上表达。在动脉硬化中，认为PPARY激动剂通过直接作用而给予抗动脉硬化作用，所述直 接作用比如·通过例如，抑制内皮细胞中的粘着因子比如ICAM-1、VCAM-I等的表达来保护和 改善内皮功能等，·抑制平滑肌细胞的迁移和生长和平滑肌细胞中MMP(基质金属蛋白酶)生成，·抑制单核细胞分化和炎症细胞因子生成，·促进在巨噬细胞等中ABCAl介导的胆固醇逆转运。吡格列酮，其是一种胰岛素敏化剂，具有PPAR γ激动剂作用和细胞凋亡抑制作 用，并且已知可用于治疗动脉粥样硬化疾病、预防或治疗旁路手术后的血管再闭塞和再 狭窄、和预防或治疗介入(经皮穿刺冠状动脉成形术、经皮冠状动脉血管重建、支架术、 冠状动脉内窥镜检查、血管内超声、经皮穿刺冠状动脉血栓溶解疗法等)后的血管增厚 (W099/25346,W002/087580 等)。而且，作为药物递送系统，包封核酸化合物的纳米颗粒(JP-A-2007-119396)和用 包封生理活性物质的纳米颗粒涂层的药物洗脱支架(JP-A-2007-215620)是已知的。
发明内容
预期向不稳定的斑块选择性递送PPAR γ激动剂将会防止斑块破裂和继发的急性 冠状动脉综合征，及改善重要预后。然而，已知具有PPARy激动剂作用的格列酮(glitazone)药物可引起作为全身给 药(口服给药)副作用的水肿。因此，使用药物递送系统(DDS)有效地递送少量药物至靶器官(血管)可以使全 身性副作用最小，并且提供有希望的治疗，即使是对于不能使用格列酮药物的患者。本发明旨在提供一种可用于预防或治疗动脉硬化疾病的新的药物制剂。本发明人已经发现可以通过使用包含吡格列酮或其盐的纳米颗粒将吡格列酮 (其是一种PPAR γ激动剂)或其盐有效地递送到不稳定的斑块，以抑制斑块破裂的发生，并 且其可是可用于预防或治疗动脉硬化疾病的药物制剂。因此，本发明涉及(1)纳米颗粒，其包括吡格列酮或其盐和生物相容性(biocompatible)聚合物；(2)前述(1)的纳米颗粒，其中所述生物相容性聚合物为乳酸_乙醇酸共聚物；(3)前述⑴的纳米颗粒，其中吡格列酮或其盐的含量以吡格列酮计为0. 1至 IOwt % ；(4)前述(1)的纳米颗粒，其用于预防或治疗动脉硬化疾病；(5)前述(4)的纳米颗粒，其用于肠胃外给药；(6)包括前述(1)的纳米颗粒的药物制剂，其用于预防或治疗动脉硬化疾病；(7)用于肠胃外给药的包括前述(1)的纳米颗粒的药物制剂，其用于预防或治疗 动脉硬化疾病；(8)载有前述(1)的纳米颗粒的支架；(9)载有前述(1)的纳米颗粒的支架，其用于预防或治疗动脉硬化疾病；(10)预防或治疗哺乳动物中动脉硬化疾病的方法，包括向哺乳动物给药有效量的 前述(1)的纳米颗粒；(11)前述(1)的纳米颗粒在制备用于预防或治疗动脉硬化疾病的药剂中的用途；(12)预防或治疗哺乳动物中动脉硬化疾病的方法，包括将前述(8)的支架放置在 哺乳动物的血管中；(13)前述(1)的纳米颗粒在制备用于预防或治疗动脉硬化疾病的支架中的用途，寸。另外，本发明涉及(14)前述(1)的纳米颗粒，进一步包括阳离子聚合物；(15)前述(14)的纳米颗粒，其中所述阳离子聚合物为脱乙酰壳多糖；(16)载有前述(14)的纳米颗粒的支架；(17)载有前述(14)的纳米颗粒的支架，其用于预防或治疗动脉硬化疾病，等。本发明的纳米颗粒具有通过有效地递送吡格列酮或其盐至不稳定的斑块抑制斑 块破裂发生的作用，和在血管损害部位的稳定的长期滞留作用，以及对血管损伤之后新内 膜形成的抑制作用。因此，本发明的纳米颗粒可用于预防或治疗动脉硬化疾病、支架内再狭窄等。使用本发明的纳米颗粒，可以有效地将少量药物递送到靶器官(血管)，其使得能够 减少全身性副作用。另外，因为药物可以从纳米颗粒逐渐释放，所以可以提供持续性更优良 的药物制剂。在腿局部缺血中，PPARy激动剂被认为在局部缺血组织中，通过直接作用显示 出血管生成作用，所述直接作用例如通过内皮细胞中eNOS的经促进的表达的内皮功能保 护_改善作用。
本发明的纳米颗粒通过特异性地并且有效地递送吡格列酮或其盐至局部缺血部 位的血管内皮细胞而具有改善和保护内皮功能的作用。其作用机制被认为是基于eNOS的 经促进的表达。因此，本发明的纳米颗粒可用于治疗局部缺血性疾病。使用本发明的纳米 颗粒，可以有效地将少量药物递送到局部缺血性器官(血管的内皮细胞)，其使得能够减少 全身性副作用。而且，因为药物可以从纳米颗粒逐渐释放，所以可以提供持续性更优良的药 物制剂。而且，本发明的药物制剂和支架也具有抑制斑块破裂发生的作用。因此，它们可用 于预防或治疗动脉硬化疾病、支架内再狭窄等。特别地，载有本发明的纳米颗粒的支架具有抑制支架术后新内膜形成的作用，并 且可用于预防或治疗动脉硬化疾病、支架内再狭窄等。而且，本发明的纳米颗粒、药物制剂和支架也具有抑制单核细胞趋化因子(MCP-I) 生成的作用。因此，它们可用于预防或治疗涉及MCP-I的疾病，例如用于预防或治疗炎症疾病。发明详述本发明的纳米颗粒包括吡格列酮或其盐和生物相容性聚合物，并且形成为具有纳 米尺寸的颗粒(纳米球)。虽然本发明的纳米颗粒的制备方法不受特别地限制，只要其可以将吡格列酮或其 盐和生物相容性聚合物处理成平均颗粒尺寸少于1，OOOnm的颗粒，但是可以优选地使用球 形结晶方法(spherical crystallization method)，其为一种非高剪切力颗粒制备方法。所述球形结晶方法是一种这样的方法，其通过在化合物合成的最后阶段控制晶体 的形成/生长过程来设计球形晶体颗粒，和通过直接控制其性质加工所述颗粒。球形结晶 方法中的一种是乳液溶剂扩散方法(emulsion solvent diffusion method，ESD方法)。ESD方法是一种通过下述原理制备纳米球的技术。在该方法中，使用两种溶剂可 以将乳酸-乙醇酸共聚物(在下文中称为PLGA)等溶解的良溶剂，其是包含药物的基础聚 合物，和相反不能溶解PLGA的不良溶剂。作为良溶剂，有机溶剂比如丙酮等，其溶解PLGA 并且可与不良溶剂混溶。作为不良溶剂，通常使用聚乙烯醇的水溶液等。作为操作步骤，首先将PLGA溶于良溶剂中，并且向其中加入药物溶液并与良溶剂 混合，同时防止PLGA沉淀。将得到的包含PLGA和药物的混合物滴加至不良溶剂中，同时搅 拌。结果，该混合物中的良溶剂(有机溶剂)快速扩散和转移到不良溶剂中，其进而引起良 溶剂在不良溶剂中的自乳化，形成具有亚微粒尺寸的良溶剂的乳滴。而且，因为由于良溶剂 和不良溶剂的相互扩散引起乳液中的有机溶剂连续地扩散到不良溶剂中，PLGA和药物在所 述乳滴中的溶解度降低，最后，产生包含药物的球形晶体颗粒PLGA纳米球。根据上述球形结晶方法，因为可以通过物理化学方法形成纳米颗粒和得到的纳米颗粒基本上是球形的，所以可以容易地形成均勻的纳米颗粒而不需要考虑残留催化剂和起 始材料化合物问题。此后，在减压下蒸发有机溶剂(良溶剂)(溶剂蒸发步骤)，得到包含药 物的纳米颗粒粉末。得到的粉末直接填充到容器中，或者，当必要时，在通过冷冻干燥等形 成可再分散的聚集颗粒(复合颗粒)形成复合物(复合物形成步骤)之后，填充到容器中。根据将包含在纳米颗粒中的药物、生物相容性聚合物的种类等来确定良溶剂和不 良溶剂的种类，并且不受特别地限制。因为使用生物相容性纳米颗粒作为将作用于人体的 药物制剂的起始材料，因而需要使用对人体具有高安全性和引起更少环境负担的生物相容 性纳米颗粒。 这样的不良溶剂的实例包括水和加入表面活性剂的水，例如，优选地使用聚乙烯 醇水溶液(加入作为表面活性剂的聚乙烯醇的水)。不同于聚乙烯醇的表面活性剂的实例 包括卵磷脂、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等。当剩余过量的聚乙烯醇时，可以在溶剂蒸发 步骤之后进行通过离心等除去聚乙烯醇的步骤(除去步骤)。所述良溶剂的实例包括具有低沸点的几乎不溶于水的有机溶剂，如卤代烷烃、丙 酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、环己烷、苯、甲苯等。例如，优选地使用对环境和人体和引起 较少不利影响的丙酮，和丙酮与甲醇的混合物。聚乙烯醇在水溶液中的浓度、丙酮和甲醇的混合比例和结晶条件都没有特别地限 制，并且可以根据将包含在纳米颗粒中的药物的种类、球形成粒的晶体的颗粒大小(本发 明中为纳米级)等适当地确定。随着聚乙烯醇在水溶液中的浓度增加，聚乙烯醇对纳米颗 粒表面的粘附变得更优异，并且干燥后在水中的再分散性变得更加得到改进；然而，当聚乙 烯醇在水溶液中的浓度超过给定的水平，不良溶剂的粘度增加，不利地影响良溶剂的扩散 性。尽管取决于聚乙烯醇的聚合度和皂化值将会发生变化，但是，在纳米颗粒形成之 后蒸发有机溶剂和通过冷冻干燥等粉末化纳米颗粒的情况下，聚乙烯醇在水溶液中的浓度 优选地不少于0. Iwt %且不超过IOwt %，更优选地为约2wt%。在纳米颗粒形成之后从悬浮 液中蒸发有机溶剂和该纳米颗粒被用于在支架上承载该纳米颗粒的步骤的情况下，聚乙烯 醇在水溶液中的浓度优选地设置为不超过0. 5wt%，特别优选地约0. Iwt %。另外，当通过下述电泳或喷雾法将纳米颗粒承载在支架上时，优选地将阳离子聚 合物加入到不良溶剂中以使纳米颗粒表面带正电荷。所述阳离子聚合物的实例包括脱乙酰壳多糖和脱乙酰壳多糖衍生物；其中多个阳 离基团键合到纤维素的阳离子纤维素；聚氨基化合物，比如聚乙烯亚胺、聚乙烯基胺、聚烯 丙基胺等；聚氨基酸，比如聚鸟氨酸、聚赖氨酸等；聚乙烯基咪唑、聚(乙烯基氯化吡啶輸 )、烷基氨基甲基丙烯酸酯季盐聚合物(DAM)、烷基氨基甲基丙烯酸酯季盐_丙烯酰胺共聚 物(DAA)等，并且特别优选地使用脱乙酰壳多糖或其衍生物。脱乙酰壳多糖是一种天然聚合物，其中键合了许多葡糖胺(一种具有氨基的糖) 分子，并且包含在虾、蟹和昆虫的壳中。因为脱乙酰壳多糖特征性地具有乳液稳定性、形状 保持性、生物可降解性、生物相容性、抗菌性等，所以其广泛地用作化妆品、食品、服装材料、 药品等的起始原料。通过将脱乙酰壳多糖加入到不良溶剂中，可以制备对活生物没有不利 影响的高度安全的纳米颗粒。使用具有通过部分地季铵化脱乙酰壳多糖(其本性是阳离子的)实现的较高的阳离子度(cationicity)的脱乙酰壳多糖衍生物(阳离子脱乙酰壳多糖)，比如N_[2_羟 基-3-(三甲基铵)丙基]脱乙酰壳多糖氯化物等等，是优选的，因为颗粒之间的排斥力变 得更强和颗粒的稳定性得到增加。
另外，为了改善药物在良溶剂中的亲和力和分散稳定性，可以将阳离子脂质比如 DOTAP等加入该良溶剂中以与药物形成络合物。然而，应当谨慎地确定其加入量，因为在细 胞中释放的阳离子脂质可引起细胞毒性。可以在通过冷冻干燥等的粉末化期间将如上所述获得的纳米颗粒加工成可再分 散的聚集的颗粒复合物(纳米复合物)。在这种情况下，优选地与有机物质或无机物质形成 可再分散的复合物，并干燥具有所述纳米颗粒的复合物。当使用糖醇或蔗糖时，例如糖醇或 蔗糖变为赋形剂，并且可以增强所述纳米颗粒的操作性能。糖醇的实例包括甘露糖醇、海藻 糖、山梨醇、赤藓醇、麦芽糖醇(maltitose)、木糖醇(xylitose)等。在这些中，海藻糖是特 别优选的。通过形成复合物，可以获得复合物颗粒，其是一种在使用前可容易地操作的纳米 颗粒的聚集颗粒，并且当使用中与水接触时，返回到纳米颗粒并且恢复高反应性等性质。可 选地，可以使用流化床干燥制粒方法(例如，使用Aglomaster AGM，由Hosokawa Micron Corporation制造)代替冰冻干燥法来形成使得能够以可再分散状态整合的复合物。作为将在本发明中使用的生物相容性聚合物，对活生物刺激轻微和毒性低、生物 相容且可生物降解(在给药之后分解和被代谢)的聚合物是期望的。另外，其优选是以缓 释方式逐渐释放被包封的药物的颗粒。作为这样的材料，PLGA可以是特别优选使用的。PLGA的分子量(重均分子量)优选地为5，000至200，000,更优选地为15，000至 25，000。乳酸乙醇酸的组成比为1 99至99 1，乳酸乙醇酸优选地为1 0.333。 因为乳酸和乙醇酸的含量在25wt %至65wt %的PLGA是非晶的且可溶于有机溶剂比如丙酮 等中，所以其是优选使用的。可生物降解的、生物相容的聚合物的实例进一步包括聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸 (PLA)、聚天冬氨酸等。另外，也可以使用其共聚物比如天冬氨酸-乳酸共聚物(PAL)和天 冬氨酸-乳酸-乙醇酸共聚物(PALG)，并且所述聚合物也可以具有可以转变成带电基团的 基团或官能团，比如氨基酸。不同于以上的生物相容性聚合物的实例包括聚链烯(polyalkylene)比如聚乙烯 和聚丙烯、聚乙烯基化合物比如聚乙烯醇、聚乙烯醚和聚乙烯基酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙 二醇、聚氧化乙烯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、纤维素及其 它多糖、以及肽或蛋白质、和其共聚物及它们的混合物。之后，将得到的纳米颗粒悬浮液直接地再分散在水中并用于接下来的纳米颗粒附 着步骤，或者，当必要时，在减压下在蒸发有机溶剂(其为良溶剂)(溶剂蒸发步骤)之后， 和进一步地，当必要时，通过冷冻干燥等粉末化该纳米颗粒后，再分散在水中，并用于接下 来的纳米颗粒附着步骤。将悬浮液形式的纳米颗粒直接用于下一步骤中是优选的，因为由 于不存在冷冻干燥等可以简化制备步骤，并且可以减少加入到不良溶剂中的聚乙烯醇的
Mo当粉末化纳米颗粒时，优选将它们与粘合剂(例如海藻糖等)一起转化成可再分 散的聚集的颗粒复合物以得到复合物颗粒，因为可以获得在使用前容易操作的纳米颗粒的聚集颗粒，当使用中与水接触时，其返回到纳米颗粒(水溶解了粘合剂)。 当通过下述的电泳法或喷雾法将纳米颗粒承载在支架上时，优选地将得到的纳米 颗粒与阳离子聚合物的溶液混合，以使纳米颗粒表面带正电。作为阳离子聚合物，可以提及 类似于上述实例的那些。特别地，优选地使用脱乙酰壳多糖或其衍生物。作为用于阳离子 聚合物溶液的溶剂，可以提及作为前述的“不良溶剂”示例的那些。特别地，优选地使用阳 离子聚合物的水溶液。阳离子聚合物在所述溶液中的浓度优选地不少于0. 01wt%，且不超 过 1. 0wt%。对将在本发明中使用的包含药物的纳米颗粒没有特别地限制，只要其具有的平均 颗粒尺寸小于l，000nm。为了增加向受影响部分的递送效率，平均颗粒尺寸优选地设定为不 超过600nm，更优选地不超过500nm，仍然更优选IOOnm至400nm等。在本发明中，纳米颗粒的平均颗粒尺寸指通过动态光散射方法测定的平均颗粒尺 寸。对吡格列酮的盐没有特别地限制，只要其为可药用盐，并且所述盐的实例包括与 无机酸的盐(例如，与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐)；与有机酸的盐(例如，与甲 酸、乙酸、三氟乙酸、邻苯二甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲 磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的盐)，等。优选的为盐酸盐。可以通过调节在纳米颗粒形成期间加入的药物量、加入的阳离子聚合物的种类和 量、及形成纳米颗粒的生物相容性聚合物的种类来控制吡格列酮或其盐在纳米颗粒中的含 量。吡格列酮或其盐在纳米颗粒中的含量优选地以吡格列酮计为0. 1至10wt%，更优选地 为 1 至 IOwt % ο因为通过把本发明的纳米颗粒承载在支架上可以将药物(吡格列酮或其盐)安全 有效地递送到靶位点(血管)，所以所述方法可以是一种用于预防或治疗动脉硬化疾病等 的有效方法。作为在支架上承载纳米颗粒的方法，可以使用包括通过在纳米颗粒悬浮液中浸 渍、雾化涂覆(mist coating)等将纳米颗粒物理附着在支架体上的方法。可选地，也可 以使用包括将阳离子聚合物化合物加入到纳米颗粒中以使纳米颗粒表面带正电，和电附 着纳米颗粒以坚固并且均勻地涂覆支架体的方法。这样的方法的实例包括(1)电泳，包 括在生物相容性纳米颗粒悬浮液中带电(electrification)，支架体作为负极(negative electrode)，和(2)喷雾法，包括将包含生物相容性纳米颗粒的滴附着到带负电的支架表 面上。可以根据在JP-A-2007-215620中描述的方法实施这些方法。支架体的形状可以通过编织和模制纤维材料、用激光将金属管切成网状结构等形 成，或者，可以使用常规已知的各种形状，比如冠型、圆柱型等。所述支架体可以是球膨胀 型(balloon expansion type)或自膨胀型，并且可以根据应用部位适当地确定支架体的尺 寸。例如，当用于心脏冠状动脉时，膨胀前的外径通常优选地为1.0至3. 0mm，长度为约5.0 至 50mm。而且，当纳米颗粒通过电泳附着时，所述支架体需要由导电材料比如金属等制成。 用于支架体的金属的实例包括不锈钢、镁、钽、钛、镍-钛合金、Inconel (注册商标)、金、钼、 铱、钨、钴合金等。当所述支架是自膨胀型时，超弹性(superelastic)合金等等比如镍-钛 等是优选的，因为需要恢复原始形状。另一方面，当其为球膨胀型时，在膨胀之后不容易恢复原始形状的不锈钢等是优选的，并且优选地使用在抗腐蚀性方面最优良的SUS316L。不用于金属的导电材料的实例包括导电聚合物，比如聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩、聚 异硫茚(polyisothianaphtene)、聚亚乙基二氧基噻吩等，导电陶瓷等。可选地，可以使用通 过加入导电填充剂、或通过由涂覆等进行的表面导电处理赋予导电性的非导电树脂。当不可生物降解的材料比如不锈钢等用作支架体材料时，因为由于长期支架术可 能在血管内壁上发展出炎症，因而可能引起再狭窄，所以需要每几个月就进行经皮穿刺冠 状动脉成形术(PTCA)以再次实施支架术，其对患者带来了沉重负担。然而，因为在支架术 之后，由镁(一种可生物降解的金属)制造的支架体在体内逐渐降解和在几个月内消失，所 以可以抑制由于支架术引起的炎症发展。特别地，通过将由可生物降解的聚合物比如PGA、PLA、PLGA、PAL等作为生物相容 性聚合物形成的纳米颗粒附着到镁支架体，可以提供在支架术后在给定时期内在体内完全 消失并且对于活生物负担较少的药物洗脱支架(drug eluting stent，DES)。在这种情况 下，用于形成所述纳米颗粒的可生物降解的聚合物优选地具有 比在下述浸渍步骤中渗透到 纳米颗粒层中的可生物降解的聚合物的生物降解速率低的生物降解速率。在此，因为在电泳期间每单位小时吸引到支架表面的纳米颗粒的量随着更高的电 压施加到正极(positive electrode)和负极之间而增加，所以可以在短时间内在支架表面 上形成纳米颗粒层。另一方面，因为大量纳米颗粒发生附着，所以难以形成均勻的纳米颗粒 层。因此，在电泳期间施加的电压可以根据期望的纳米颗粒层的均勻性和形成效率适当地 设定。现在解释喷雾法。所述喷雾法包括通过带电，将带正电荷的生物相容性纳米颗粒 的微细悬浮液滴电附着到带负电的支架体表面。其实例包括包括通过超声作用雾化纳米 颗粒悬浮液的超声雾化方法、包括使用喷雾器或喷枪将纳米颗粒悬浮液吹到支架表面的喷 雾法或喷枪法，等。在所述喷雾法中，支架体通过带电也带负电荷。因此，与在电泳的情况下相同，与 无支架体带电的喷雾处理相比，带正电荷-改性的纳米颗粒层的附着明显更坚固，可以制 备显示支架体和纳米颗粒之间的良好粘附性并且抗腐蚀性优良的DES。另外，因为滴中的纳 米颗粒主动附着到支架体，所以也可以增加纳米颗粒到雾化的或喷雾的滴很难直接附着的 支架侧面和背面的附着效率。省略了对进行喷雾法的支架体的形状和材料的说明，因为其 与电泳的情况相同。而且，除了通过电泳或喷雾法在支架表面上形成纳米颗粒层的步骤之外，也可以 设定在其上层压纳米颗粒层的步骤(在下文中称为第二附着步骤)。在该第二附着步骤中， 因为沿着在支架表面上形成的均勻的纳米颗粒层层压新的纳米颗粒层，所以即使增加每单 元小时附着的纳米颗粒的量，也可以均勻有效地形成具有期望层厚度的纳米颗粒层。前述 的电泳、超声雾化方法、喷雾法、喷枪法等可以用于所述第二附着步骤。当超声雾化方法、喷 雾法、喷枪法等用于该第二附着步骤时，支架体优选地是带负电的，以更有效并且坚固地层 压纳米颗粒层。在没有任何处理的情况下，在安装在体内后在短时间内，在支架表面上形成的纳 米颗粒层立刻溶解，药效的持续性控制变得困难。另一方面，当完全干燥所述纳米颗粒层 时，纳米颗粒更坚固地互相聚集形成不溶性纳米颗粒涂层，其可防止纳米颗粒从支架表面溶解和结合到细胞中。因此，如上所述，优选地在支架表面上形成纳米颗粒层，在该层被完 全干燥之前将纳米颗粒层浸入可生物降解的聚合物的溶液中(浸渍步骤)，并且通过干燥 固化该层(干燥步骤)。 当将在支架表面上形成的且在完全干燥之前的纳米颗粒层浸入可生物降解的聚 合物的溶液中时，所述可生物降解的聚合物溶液渗透到形成纳米颗粒层的纳米颗粒之间的 间隙中。当干燥用于溶解所述可生物降解的聚合物的溶剂和保留在所述纳米颗粒层中的水 时，形成可生物降解的聚合物层。结果，由于所述可生物降解的聚合物，每个纳米颗粒保持 没有发生聚集，并且由于在将DES安装在体内之后所述可生物降解的聚合物层的降解，所 述纳米颗粒逐渐地洗脱出来。所述可生物降解的聚合物的实例包括衍生自微生物的聚合物，比如聚羟基丁酸 酯、聚羟基戊酸酯等、胶原、醋酸纤维素、细菌纤维素、高-直链淀粉玉米淀粉、淀粉、天然聚 合物比如脱乙酰壳多糖等，等等。在这些中，更优选地使用在体内降解速率比用于形成纳米 颗粒的生物相容性聚合物比如PLGA等快的胶原等。通过合适地选择这样的可生物降解的 聚合物的种类、分子量等，附着于支架表面的纳米颗粒的洗脱速率变成可控制的。虽然也可 以使用PGA、PLA、PLGA、PAL等作为可生物降解的聚合物，但是使用具有较小分子量的那些 以超过纳米颗粒的降解速率。在如上获得的DES中，因为承载在支架体上的纳米颗粒具有带正电荷的表面，所 以在从支架表面上洗脱之后其细胞粘附力增加。因此，可以增加纳米颗粒向其中放置支架 的损害部位中的细胞的引入效率。而且，通过将药物(吡格列酮或其盐)加入到其中浸渍纳米颗粒层的可生物降解 的聚合物溶液中，包含在所述纳米颗粒外部的可生物降解的聚合物层中的药物可以快速地 起作用，而包含在所述纳米颗粒内部的药物可以缓慢并且持续地起作用。可以根据所需的 瞬即效应、持续性水平等适当地确定纳米颗粒和支架的药物含量。S卩，当需要在给药之后效果的长期持续性时，药物只需要包含在纳米颗粒的内部， 而当需要在给药后立即表现出效果时，药物也只需要包含在纳米颗粒外部的可生物降解的 聚合物层中。本发明的支架中吡格列酮或其盐的含量优选地为1至lOOOyg，更优选10至 50 μ g，以吡格列酮计。本发明的包含药物的纳米颗粒可以根据常规方法安全地单独给药或者以包含药 理学可接受载体的药物制剂(药物组合物)的形式给药，例如片剂(包括糖衣片、薄膜包衣 片等)、粉末剂、颗粒剂、胶囊、液体、乳剂、混悬剂、注射剂、吸入剂、栓剂、缓释制剂(例如， 舌下片、微胶囊等)、硬膏剂、口腔崩解片、口腔可分解的膜剂等，口服或肠胃外给予(例如， 皮下、局部、直肠、静脉内、动脉内、气管内、经肺给药等)。本发明的药物制剂优选地肠胃外 给药，更优选地静脉内给药、动脉内给药、气管内给药、经肺给药等。上述药理学可接受的载体的实例包括通常用作制剂物质的各种有机和无机载体 物质，比如用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂，用于液体制剂的溶剂、增溶 剂、助悬剂、等渗齐U (isotonicity agent)、缓冲剂和缓和剂(soothing agent)等。当必要 时，视情况而定也可以使用适量的常用添加剂，比如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、吸 附剂、润湿剂等。
所述赋形剂的实例包括乳糖、蔗糖、D-甘露糖醇、淀粉、玉米淀粉、结晶纤维素、轻 质无水硅酸等。润滑剂的实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、胶态二氧化硅等。所述粘合 剂的实例包括结晶纤维素、蔗糖、D-甘露糖醇、糊精、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚 乙烯基吡咯烷酮、淀粉、蔗糖、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等。所述崩解剂的实例包 括淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代的羟 丙基纤维素等。所述溶剂的实例包括注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇(macrogol)、芝麻油、 玉米油、橄榄油等。所述增溶剂的实例包括聚乙二醇、丙二醇、D-甘露糖醇、苯甲酸苄酯、 乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。所述助悬剂的实例包括表面活 性剂，比如硬脂基三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、氨基丙酸月桂基酯、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索 氯铵、单硬脂酸甘油酯等；亲水性聚合物，比如聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纤维素 钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等，等等。所述等渗剂的实例 包括葡萄糖、D-山梨醇、氯化钠、甘油、D-甘露糖醇等。所述缓冲剂的实例包括缓冲剂比如 磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等，等等。所述缓和剂的实例包括苯甲醇等。所述防腐剂 的实例包括对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。所述抗氧化 剂的实例包括亚硫酸盐、抗坏血酸、α-生育酚等。
吡格列酮或其盐的剂量根据给药对象、给药途经和症状而变化，并且没有特别地 限制。例如，对于向成年患者动脉内给药以治疗动脉硬化疾病而言，活性成分吡格列酮的剂 量为约1至约560mg，优选约1至约200mg，更优选约1至约lOOmg，其取决于所述症状理想 地以每天约1至3个部分给药。在本发明的药物制剂(药物组合物)中吡格列酮或其盐的含量为整个制剂(组合 物)的约0. 1至约IOwt %。本发明的纳米颗粒具有优异的斑块破裂发展抑制作用、斑块稳定作用、单核细胞 趋化因子(MCP-I)生成抑制作用、在血管损伤部位的稳定的长期滞留作用、在血管损伤之 后的新内膜形成抑制作用、在局部缺血部位中的血管生成促进作用等。本发明的纳米颗粒、药物制剂和支架是低毒性的，并且可用于预防或治疗例如动 脉硬化疾病。所述动脉硬化疾病的实例包括动脉硬化(例如动脉粥样硬化等)、心肌梗死、 (急性)冠状动脉综合征比如不稳定型心绞痛等、外周性动脉阻塞、经皮穿刺冠状动脉成形 术(PTCA)后的再狭窄、支架术后的再狭窄、心脏局部缺血性疾病(例如心绞痛等)、间歇性 跛行、脑中风、脑梗死、脑栓塞、脑出血、腔隙性脑梗死、脑血管性痴呆、高胆固醇血症、高甘 油三酯血症、低HDL血症(hypoHDL-emia)、高脂血症等。另外，本发明的纳米颗粒、药物制剂和支架也可以用于预防或治疗支架内再狭窄。而且，本发明的纳米颗粒、药物制剂和支架可用于预防或治疗涉及MCP-I的疾 病(例如炎症疾病等)。所述炎症疾病的实例包括肺病，比如肺纤维化、慢性阻塞性肺病 (COPD)、肺动脉高压等，等等。
实施例通过参照实施例和试验实施例，将在下文中更详细地阐述本发明，所述实施例和 试验性实施例不应当被看作是限制性的。实施例1
包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒的制备配制0. 5界1%聚乙烯醇(Gosenol EG-05 (注册商标)，由 The Nippon Synthetic Chemical Industry Co.，Ltd.制备)的水溶液，将其用作不良溶剂。另外，将乳酸-乙醇 酸共聚物(PLGA7520，乳酸/乙醇酸=75/25，重均分子量20，000，Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (Ig)溶于丙酮(40mL)中，并且与在甲醇(20mL)中的吡格列酮盐酸盐 (40mg)混合，将该混合物用作聚合物溶液。在40°C，以4mL/min将该溶液滴加到之前获得的 不良溶剂中，同时以400rpm搅拌，得到包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒悬浮液。在减压下，蒸发丙酮和甲醇1. 5小时，冷冻干燥残余物，得到包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒粉末。获得的粉末在水中的再分散性良好。通过动态光散射方法测量所述纳米颗粒粉末 在再分散于净化水中之后的平均颗粒尺寸，实测值为314nm。吡格列酮在所述纳米颗粒粉末 中的含量为2. 37wt%。试验实施例1在ApoE-敲除(knockout)小鼠中的斑块破裂抑制作用使用在实施例1中获得的包含吡格列酮的纳米颗粒，在ApoE-敲除小鼠中试验斑 块破裂抑制作用。(1)试验动物雄性ApoE-敲除小鼠(C57B1/6J 来历(background))购自 Jackson Laboratory (USA)并使用。允许小鼠饮水，并饲喂正常饮食，直到开始试验。(2)饮食和血管紧张素II给予从第16周龄开始，给予ApoE-敲除小鼠高脂肪饮食(包含21%的猪油和0. 15% 的胆固醇)，和从第20周龄开始腹膜内给予血管紧张素II (1. 9mg/kg/天)。(3)给药方法和剂量向对照组给药不含药物的PLGA纳米颗粒(8. 75mg/小鼠/周)。向包含吡格列酮的纳米颗粒组给药在实施例1中获得的包含吡格列酮的PLGA纳 米颗粒(8. 75mg/小鼠/周，以吡格列酮计包含210 μ g，相当于7mg/kg/周)。将各纳米颗粒(8. 75mg)悬浮在磷酸盐缓冲的盐水(0. 5mL)中，从第20周龄至23 周龄静脉内给药，每周一次，总共四次。(4)评价方法在给予血管紧张素II 28天之后，经由心脏用磷酸盐缓冲的盐水和缓冲的中性福 尔马林洗涤并固定右头臂动脉，并分离。制备石蜡切片，用Elastica van Gieson染色，并 且评价斑块破裂和纤维帽的厚度。(5)结果结果显示在表1中。表1对照组 包含吡格列酮的纳米 _颗粒组_
急性斑块破裂7/11(64%) 1/8 (13%)* v J 、 , 全部斑块破裂(/小鼠) 3.1 士 0.4 1.1 士 0.4* 埋入的纤维帽(/小鼠) 2.8±0.4 0.9±0.3* 纤维帽的厚度(μηι)_1.6士0.3 3.6 士 0.8*_*P<0. 05vs 对照组由此，发现给药包含吡格列酮的纳米颗粒显著地抑制动脉硬化模型-ApoE-敲除 小鼠中斑块破裂的发展。另外，也发现给药包含吡格列酮的纳米颗粒显著地增加纤维帽的 厚度和稳定斑块。试验实施例2对THP-I生成单核细胞趋化因子(MCP-I)的抑制作用(1)试验方法用包含0.5%胎牛血清和青霉素的RPMI培养基调节人单核细胞细胞 系 THP-I (从 Health Science Research Resources Bank, Japan Health Sciences Foundation获得)至5 X IO5个细胞/孔/500 μ L，并接种在48孔板上(第0天)。在第1 天，加入吡格列酮盐酸盐或在实施例1中获得的包含吡格列酮的PLGA纳米颗粒(浓度以吡 格列酮计1. 0，10 μ M)，并且在第2天，通过加入LPS 1 μ g/ml进行刺激。(2)评价方法在第3天，收集上清液，并使用人MCP-I ELISA试剂盒(BI0S0URCE)测定MCP-I。(3)结果发现，使用包含吡格列酮的纳米颗粒，可以通过给药较少量的吡格列酮获得MCP-I 生成抑制作用。试验实施例3通过类似于实施例1中方法的方法，制备包含异硫氰酸荧光素(FITC)-的纳米颗 粒(荧光染料)，并且试验静脉注射至ApoE-敲除小鼠之后的体内动力学。(1)包含FITC的纳米颗粒通过与实施例1中相同方式的处理，不同在于使用FITC(IOOmg)代替吡格列酮盐 酸盐，获得包含FITC的纳米颗粒粉末。(2)试验动物雄性ApoE-敲除小鼠(C57B1/6J 来历)购自 Jackson Laboratory (USA)并使用。 允许小鼠饮水，并饲喂正常饮食，直到开始试验。(3)饮食和血管紧张素II给予从第16周龄开始，给予ApoE-敲除小鼠高脂肪饮食(包含21%的猪油和0. 15% 的胆固醇)，和从第20周龄开始腹膜内给予血管紧张素II (1. 9mg/kg/天)。(4)给药方法、剂量和评价方法将在(1)中获得的包含FITC的纳米颗粒(8.75mg)悬浮在磷酸盐缓冲的盐水(0. 5mL)中，并且静脉内给药至小鼠(21周龄)。在2小时之后，收集静脉血，在红细胞溶血 之后用抗-CDl Ib或抗-Gr-I抗体染色白细胞和通过流式细胞仪检查，所述抗体用TexasRed 标记。而且，48小时后，分离右头臂动脉，制备石蜡切片，通过HE染色和FITC免疫染色鉴定 在动脉硬化斑块中显示FITC吸收的巨噬细胞。
(5)结果当将包含FITC的纳米颗粒静脉内注射给小鼠时，2小时后，在外周血中的CD 1 Ib (+) Gr-K-)单核细胞中观察到选择性FITC吸收。当48小时后分离右头臂动脉和进行 组织学检查时，在头臂动脉和动脉硬化损害中的巨噬细胞中观察到FITC免疫染色。由此，发现本发明的纳米颗粒能够是单核细胞/巨噬细胞选择性载体。试验实施例4通过包含吡格列酮的纳米颗粒控制巨噬细胞基因表达试验静脉注射在实施例1中获得的包含吡格列酮的纳米颗粒对巨噬细胞基因表 达的影响。(1)试验动物从Jackson Laboratory (USA)购买雄性 ApoE-敲除小鼠(C57B1/6J 来历)并使用。 允许小鼠饮水，并饲喂正常饮食，直到开始试验。(2)饮食和血管紧张素II给予从第16周龄开始，给予ApoE-敲除小鼠高脂肪饮食(包含21%的猪油和0. 15% 的胆固醇)，和从第20周龄开始腹膜内给予血管紧张素II (1. 9mg/kg/天)。(3)给药方法和剂量向对照组给药不含药物的PLGA纳米颗粒(8. 75mg/小鼠/周)。向包含吡格列酮的纳米颗粒组给药在实施例1中获得的包含吡格列酮的PLGA纳 米颗粒(8. 75mg/小鼠，以吡格列酮计包含210 μ g，相当于7mg/kg体重)。将各纳米颗粒(8. 75mg)悬浮在磷酸盐缓冲的盐水(0. 5mL)中，在第21周龄通过 静脉注射一次给药。(4)评价方法与静脉注射PLGA纳米颗粒或包含吡格列酮的纳米颗粒同时，腹膜内给药巯基乙 酸盐培养基(Difco，2mL)。在3天之后，收集腹膜内巨噬细胞，并且提取mRNA。通过RT-PCR 测量对照组和包含吡格列酮的纳米颗粒组的巨噬细胞中的各种基因表达，并比较表达水平。(5)结果与对照组巨噬细胞相比，在包含吡格列酮的纳米颗粒组巨噬细胞中显示显著增加 或抑制的表达的基因显示在表2中。在包含吡格列酮的纳米颗粒组巨噬细胞中，促进胆固 醇的逆转运的ABCAl的表达增加，而CC趋化因子比如MCP-1、RANTES等(其是单核细胞趋 化因子)的表达受到抑制。表2具有经促进的表达的基因倍数具有被抑制的表达的基因倍数 ATP-结合盒 Al (ABCAl) 1.91 CCL2/MCP-1 0.44 _CL5/RANTES _0.21由此，发现给药的包含吡格列酮的纳米颗粒被选择性地递送到ApoE-敲除小鼠体 内的单核细胞/巨噬细胞，并且可以控制基因表达，包括MCP-I抑制。试验实施例5 在小鼠血管损伤模型中新内膜形成抑制作用使用在实施例1中获得的包含吡格列酮的纳米颗粒，试验在小鼠血管损伤模型中 新内膜形成抑制作用。(1)试验动物从CLEA Japan, Inc.购买雄性野生型小鼠(C57B1/6J)。允许小鼠饮水和消耗食 物，并饲喂正常饮食直至开始试验。(2)血管损伤模型的制备用戊巴比妥深麻醉8-至10-周龄野生型小鼠，并暴露右侧股动脉。用6-0丝线结 扎血管两端，以暂时性切断血液流动。切开支路(branch)，在髂动脉侧插入线材(wire)(直 径 0. 15 英寸，No. C-SF-15-15, COOK) 5mm 以损害血管。(3)给药方法和剂量在线材损害之后，将试验动物分成溶剂对照组和包含吡格列酮的纳米颗粒组。除 去所述线材，经5分钟，从所述支路各自动脉内给药100 μ L的溶剂和包含吡格列酮的PLGA 纳米颗粒溶液。溶剂对照组仅给药溶剂(磷酸盐缓冲的盐水)，仅一次。包含吡格列酮的纳米颗粒组给药在实施例1中获得的包含吡格列酮的PLGA纳 米颗粒一次(以纳米颗粒计，包含0. 5mg/小鼠，对应于吡格列酮的浓度0. 015mg/小鼠 (0. 5mg/kg体重))。在给药之后，结扎支路部分，恢复血液流动，并缝合皮肤。在线材损害之后，立即形成高剂量(临床剂量的10倍量)吡格列酮盐酸盐(以吡 格列酮计，0. 15mg/小鼠(5mg/kg体重))单次腹膜内给药组。(4)评价方法在血管损伤之后28天，经由心脏洗涤右侧股动脉并用磷酸盐缓冲的盐水和缓冲 的中性福尔马林固定，并分离。制备石蜡切片，用Elastica van Gieson染色，免疫组织化 学染色增殖细胞核抗原(PCNA)，并评价内膜/中膜比、新内膜面积、中膜面积和细胞增殖。 对于免疫组织化学染色，计数增殖的细胞和计算其与总细胞数的比值。(5)结果结果显示在表3和表4中。与溶剂对照组相比，给药包含吡格列酮的纳米颗粒引 起内膜/中膜比和新内膜面积显著减小。另外，包含吡格列酮的纳米颗粒比吡格列酮盐酸 盐更强地抑制平滑肌细胞增殖。因为，由于平滑肌细胞从中膜至内膜的迁移和增殖引起新 内膜形成的发展，所以显示出包含吡格列酮的纳米颗粒的增殖抑制作用对新内膜形成抑制 的贡献。
表权利要求
纳米颗粒，其包括吡格列酮或其盐和生物相容性聚合物。
2.权利要求1的纳米颗粒，其中所述生物相容性聚合物为乳酸-乙醇酸共聚物。
3.权利要求1的纳米颗粒，其中所述吡格列酮或其盐的含量以吡格列酮计为0.1至 IOwt %。
4.权利要求1的纳米颗粒，其用于预防或治疗动脉硬化疾病。
5.权利要求4的纳米颗粒，其用于肠胃外给药。
6.包括权利要求1的纳米颗粒的药物制剂，其用于预防或治疗动脉硬化疾病。
7.用于肠胃外给药的包括权利要求1的纳米颗粒的药物制剂，其用于预防或治疗动脉 硬化疾病。
8.载有权利要求1的纳米颗粒的支架。
9.载有权利要求1的纳米颗粒的支架，其用于预防或治疗动脉硬化疾病。
10.用于预防或治疗哺乳动物中动脉硬化疾病的方法，包括向所述哺乳动物给药有效 量的权利要求1的纳米颗粒。
11.权利要求1的纳米颗粒在制备用于预防或治疗动脉硬化疾病的药剂中的用途。
12.用于预防或治疗哺乳动物中动脉硬化疾病的方法，包括将权利要求8的支架放置 在该哺乳动物的血管中。
13.权利要求1的纳米颗粒在制备用于预防或治疗动脉硬化疾病的支架中的用途。
全文摘要
本发明涉及包含吡格列酮或其盐和生物相容性聚合物的纳米颗粒、用于预防或治疗动脉硬化疾病的包含所述纳米颗粒的药物制剂和载有所述纳米颗粒的支架。使用本发明的纳米颗粒，可以抑制动脉硬化斑块的破裂，并且其可用于预防或治疗动脉硬化疾病。
文档编号A61L31/00GK101969934SQ20088012679
公开日2011年2月9日 申请日期2008年12月12日 优先权日2007年12月13日
发明者江头健辅 申请人:国立大学法人九州大学