促造血的药物组合物及其制备方法

专利名称：促造血的药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种促进造血的药物组合物以及制备该药物组合物的方法。本发明还涉及该药物组合物在制备用于治疗造血功能受损状态的药剂中的用途。

背景技术：
造血是人体生命活动的重要部分。成年动物的造血组织主要位于骨髓中。在生理条件下，造血过程是造血干细胞(HSC)经增殖、分化、直至形成各种成熟血细胞的动态过程。临床上多种常见的血液系统疾病，例如再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症等，以及放疗和化疗引起的骨髓损伤都会导致骨髓造血功能受到抑制或衰竭，给机体健康带来严重危害。
造血干细胞移植(HSCT)能够促进造血重建，在一定程度上恢复骨髓的造血功能，已经成为诸如白血病、多发性骨髓瘤、再生障碍型贫血及一些遗传性贫血等血液系统疾病的重要治疗手段。近年来，HSCT还被逐渐用于乳腺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌等癌症放疗或化疗后的支持治疗。已知其他一些电离辐射损伤，比如急性放射病造成的骨髓抑制也可通过造血干细胞移植来治疗。本发明人先前的研究表明给患急性放射病的动物移植转染了细胞因子基因的造血干细胞能有效地促进骨髓造血重建[张勇等人，“中华放射医学与防护杂志”第28卷，第14-17页]。
但是，由于细胞扩增、转染效率、体内移植活力等问题的影响，单纯的造血干细胞移植对骨髓造血障碍的治疗效果并不令人满意。
中药制剂由于其较高的安全性，也被用于治疗一些血液系统疾病。其中使用较多的中药成分为皂矾。皂矾的主要成分是硫酸亚铁，还含有铜、砷、钴等刺激骨髓造血的微量元素。以皂矾为主药的皂矾复方丸常用于辅助治疗某些造血障碍型疾病，对辐射损伤动物的造血功能也有一定的改善作用[肖扬等人，“中药新药与临床药理”，第15卷，第387-389页]，但存在缓解慢、起效慢、治愈率低的缺点。


发明内容
本发明的目的在于提供一种药物组合物，该组合物包含造血干细胞和皂矾以及药学上可接受的介质，具有显著促进造血重建、恢复骨髓造血功能的作用。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种药物组合物在制备治疗造血功能受损状态的药剂中的用途。
在本发明的实施方案中，所述造血干细胞为CD34+造血干细胞。在本发明优选实施方案中，该CD34+干细胞为CD34+脐带血干细胞。
在本发明另一实施方案中，所述造血干细胞可以是导入了表达载体的造血干细胞，其中所述表达载体携带至少一种细胞因子基因。
在本发明的优选实施方案中，所述表达载体携带的细胞因子选自Flt3配体(Flt3 ligand，FL)、白介素-3(IL-3)或其组合。更优选地，所述表达载体为pIRES2-EGFP-IL-3、pIRES2-EGFP-FL或其组合或pIRES2-EGFP-FL-IL-3。最优选地，所述载体为pIRES2-EGFP-FL-IL-3。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物中的药学上可接受的介质选自缓冲液、生理盐水、细胞培养基、平衡盐溶液或其组合。
在本发明的实施方案中，本发明的药物组合物的制备方法包括分离纯化造血干细胞并将其重悬在药学上可接受的介质中；将皂矾溶于药学上可接受的介质中；将上述细胞重悬液与皂矾溶液混合。
在本发明的另一实施方案中，本发明的药物组合物的制备方法包括分离纯化造血干细胞；将携带细胞因子的表达载体导入所述干细胞，筛选转染阳性细胞；将所述转染阳性细胞重悬在药学上可接受的介质中；将皂矾溶于药学上可接受的介质中；然后将上述细胞重悬液与皂矾溶液混合。
在本发明提供的药物组合物中，造血干细胞和皂矾具有协同促进造血的作用，使该药物组合物在造血重建中具有起效快、有效率高、治愈率高的优点。
在本发明的实施方案中，所述药物组合物与单纯的造血干细胞移植或单独给予皂矾相比，显著提高了个体的生存率及外周血细胞的数量，显示了本发明的组合物在治疗造血功能受损状态中的优势。尤其是，本发明的pIRES2-EGFP-FL-IL-3比单独使用pIRES2-EGFP-IL-3、pIRES2-EGFP-FL或其组合显示出更好的效果。
附图简要说明

图1显示IL-3的PCR产物电泳图。第1泳道为分子量标志物，第2、3泳道为IL-3的PCR产物。
图2显示重组体pIRES2-EGFP-IL-3的酶切结果。第1泳道为分子量标志物；第2泳道为未经酶切的重组体pIRES2-EGFP-IL-3；第3泳道是经HindIII单酶切的重组体pIRES2-EGFP-IL-3；第4泳道是经BglII+Xmal双酶切的重组体pIRES2-EGFP-IL-3。
图3显示重组体pIRES2-EGFP-FL的酶切结果。第1泳道为分子量标志物(DL2000)；第2泳道为经SalI和BglII双酶切的pUMVC3-hFL(3.9kb+0.8kb)；第3泳道是未经酶切的重组体pIRES2-EGFP-FL(6.0kb)；第4泳道是经NheI+XhoI双酶切的重组体pIRES2-EGFP-FL(5.25kb+0.75kb)。
图4显示重组体pIRES2-EGFP-FL-IL-3的酶切结果。第1泳道为分子量标志物(DL2000)；第2泳道为重组体pIRES2-EGFP-IL-3(7.5kb)；第3泳道是重组体pIRES2-EGFP-FL(6.0kb)；第4泳道是IL-3片段(2.5kb)；第5泳道是重组体pIRES2-EGFP-FL-IL-3(8.2kb)；第6泳道是经XmalI+XhoI双酶切的pIRES2-EGFP-FL-IL-3(6.0kb+2.2kb)；第7泳道是经NheI+KpnI双酶切的pIRES2-EGFP-FL-IL-3(4.7kb+3.5kb)。
图5通过半定量RT-PCR分别检测IL-3、FL在导入了pIRES2-EGFP-IL-3、pIRES2-EGFP-FL载体的CD34+细胞内的表达。A，第1泳道为分子量标志物，第2泳道为未转染细胞，第3泳道是用PBS代替模板得到的PCR产物，第4、5泳道是转染了IL-3的CD34+细胞；B，第1泳道为分子量标志物，第2泳道为未转染细胞，第3-5泳道是转染了FL的CD34+细胞。
图6显示在导入了pIRES2-EGFP-IL-3、pIRES2-EGFP-FL或pIRES2-EGFP-FL-IL-3载体的CD34+细胞内，FL及IL-3的蛋白表达。A，在导入pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL两种载体的CD34+细胞中，IL-3的蛋白表达，第1泳道为对照，第2泳道为双载体转染细胞；B，在导入pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL两种载体的CD34+细胞中，FL的蛋白表达，第1泳道为对照，第2泳道为双载体转染细胞；C，在导入pIRES2-EGFP-FL-IL-3载体的CD34+细胞中，IL-3的蛋白表达，第1泳道为对照，第2泳道为共表达载体转染细胞；D，在导入pIRES2-EGFP-FL-IL-3载体的CD34+细胞中，FL的蛋白表达，第1泳道为对照，第2泳道为共表达载体转染细胞。

具体实施例方式 本发明的一方面提供了促进造血的药物组合物，该药物组合物包含造血干细胞和皂矾以及药学上可接受的介质。
本发明所述的“造血干细胞”可以是骨髓造血干细胞、外周血干细胞、脐带血干细胞，优选脐带血干细胞。脐带血干细胞免疫细胞的抗原性较弱，与移植有关的移植物抗宿主病的发生相对骨髓和外周血少而轻，且采集保存容易，对供者无任何伤害。因此，脐带血被认为是理想的造血干细胞来源。
在本发明的一个实施方案中，所述造血干细胞为CD34+造血干细胞。
在本发明优选实施方案中，该CD34+干细胞为CD34+脐带血干细胞。
“CD34”是指高度糖基化的I型跨膜蛋白，其选择性分布在造血干细胞表面，随着造血细胞的不断分化成熟，其表达也逐渐减少直至消失。研究者通常把CD34+细胞作为进行HSC生物学特性研究与临床应用的源细胞。
在本发明另一实施方案中，造血干细胞可以是导入了表达载体的造血干细胞，其中所述表达携带至少一种细胞因子基因。
本发明所述的“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定的核酸在宿主细胞中转录的特异性核酸元件。本发明的表达载体可以是诸如pI RES2-EGFP、pcDNA3.1、pCI-neo、pDC516、pVAC、pcDNA4.0、pGEM-T、pDC315的质粒载体，或者是诸如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体的病毒载体。病毒载体因其易整合到靶细胞染色体内，导致安全性差。因此，在本发明的优选实施方案中，所述表达载体为质粒载体，优选pIRES2-EGFP载体，因为后者包含①增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，易于与目的基因融合以及便于检测；②含有SV40ori复制元件，有可能随宿主细胞分裂，跟随胞浆遗传给子代细胞，可以在一定程度上保证目的基因稳定传递；③含有IRES，能够增强目的基因翻译水平的表达。
本发明所述的“细胞因子”是指对造血干细胞的生存、调亡、增殖和分化起着重要调控作用的蛋白质家族。细胞因子通常是通过在其靶细胞表面结合特异的受体以激活信号转导通路。所述细胞因子的实例包括，但不限于，诸如FL、IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)和干细胞因子(SCF)等作用于G0期的细胞因子，例如IL-3、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4等作用于分化状态的HSC的细胞因子，以及例如促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和IL-5等作用于分化后期的细胞因子。其中FL是新近发现的，能够刺激早期造血的细胞因子，其能够调节最原始的造血干/祖细胞的增殖和分化，可与多种细胞因子协同作用，提高造血功能。IL-3又称多系集落刺激因子，它主要由激活的T淋巴细胞所产生，对造血细胞具有广谱的刺激分裂和分化的作用。IL-3在FL或SCF存在下，能够有效扩增有核细胞总数，是增强造血及集落形成细胞的关键性调节因子。
在本发明的优选实施方案中，所述表达载体携带的细胞因子选自IL-3、FL或其组合。
本发明所述的“药学上可接收的介质”是指不干扰活性成分的生物活性有效性的载体。本发明的介质包括但不限于细胞培养基、缓冲液、生理盐水和平衡盐溶液。细胞培养基的实例包括BME、MEM、DMEM、IMEM、HAM F12、PRMI1640、M199等。缓冲液的实例包括磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐以及碳酸盐。所述介质还可进一步包括药学上可接受的赋形剂、佐剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂等的一种或多种成分。
在本发明的实施方案中，所述介质为等渗缓冲液，优选为等渗磷酸盐缓冲液(PBS)。
本发明的另一方面提供了促造血的药物组合物的制备方法，它包括分离纯化造血干细胞并将其重悬在药学上可接受的介质中；将皂矾溶于药学上可接受的介质中；将上述细胞重悬液与皂矾溶液混合。
本发明的另一方面提供了促造血的药物组合物的制备方法，其包括分离纯化造血干细胞；将携带细胞因子的表达载体导入所述干细胞，筛选转染阳性细胞；将所述转染阳性细胞重悬在药学上可接受的介质中；将皂矾溶于药学上可接受的介质中；将上述细胞重悬液与皂矾溶液混合。
在本发明中，重悬细胞的介质与溶解皂矾的介质可以相同或不同。在本发明的优选实施方案中，重悬细胞的介质与溶解皂矾的介质相同，且为等渗磷酸盐缓冲液。
在本发明的实施方案中，造血干细胞的重悬浓度为5×104/ml至1×107/ml，优选为5×105/ml至5×106/ml，最优选为2.5×106/ml。
在本发明的实施方案中，皂矾的溶解浓度为0.5mg/ml至50mg/ml，优选为2mg/ml至10mg/ml，最优选为5mg/ml。
在本发明的实施方案中，细胞重悬液与皂矾溶液的混合体积比为1:2至3:1，优选体积比为1:1至2:1，最优选为2:1。
在本发明的实施方案中，所述表达载体可以是质粒载体或病毒载体，优选是质粒载体，且最优选为pIRES2-EGFP质粒载体。所述“转染阳性细胞”是指成功导入了表达载体的细胞。所述表达载体携带促造血细胞因子的基因，在干细胞内表达细胞因子。
在本发明的另一实施方案中，将携带细胞因子基因的表达载体导入分离纯化的干细胞，优选CD34+干细胞，最优选CD34+脐带血干细胞。
本发明的另一方面提供了促造血的药物组合物在制备治疗造血功能受损状态的药剂中的用途。
本发明所述的造血干细胞与皂矾的“协同”作用是指包含造血干细胞和皂矾的药物组合物对造血重建的促进作用明显强于单纯的造血干细胞移植或单独的皂矾的作用。
本发明所述的“造血功能受损状态”是指骨髓造血功能受到抑制，导致一种或多种血细胞的生成数量降低到危害机体健康的状态。本发明的造血功能受损状态包括但不限于再生障碍性贫血、白细胞减少症、血小板减少症、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、放疗和化疗引起的骨髓损伤以及诸如急性放射病的其他电离辐射损伤导致的骨髓造血障碍。“急性放射病”是指全身短时间内受到1戈瑞(Gy)以上照射后发生的全身性疾病，主要表现为造血功能障碍。
在本发明的一个实施方案中，在几分钟内给予严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠2.0-8.0Gy的照射，复制急性辐射损伤的动物模型；骨髓病理结果显示，骨髓造血功能衰竭程度与辐射剂量呈正相关。在本发明优选的实施方案中，给予SCID小鼠8.0Gy(剂量率为1.07Gy/min)的照射，以便更好地观察本发明药物组合物的效果。
在本发明的实施方案中，将药物组合物给予个体的方法可以是静脉注射或静脉点滴，优选静脉注射。
本发明所述的“个体”，是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。
上述公开内容总体上描述了本发明，通过下面的实施例进一步示例本发明。描述这些实施例仅为说明本发明，而不是限制本发明的范围。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本发明的范围。
实施例1 分离与纯化脐带血干细胞，获取CD34+细胞 无菌采取正常足月顺产男性新生儿脐带血(由第三军医大学附属西南医院提供)，用肝素抗凝，经Ficoll淋巴细胞分离液(密度1.077g/ml)分离单个核细胞，以含有10％胎牛血清的IMDM洗涤2次，重悬于300μl含有0.5％BSA和2mmol/L EDTA的PBS溶液中，用免疫磁珠分选系统(mini-MACS)从单个核细胞中分离出CD34+细胞。具体方法如下在上述细胞重悬液中分别加入100μl封闭液(3％羊血清)和抗CD34单抗，混匀，4℃放置15min。用10ml上述PBS缓冲液离心洗涤后，加入100μl羊抗鼠IgG免疫磁珠，4℃放置15min。将细胞用上述方法洗涤后重悬于1ml PBS缓冲液中，滴加到置于磁场的分离柱中，使细胞悬液自然流出。用所述缓冲液洗柱4次，每次0.5ml。将分离柱移出磁场，加入1ml缓冲液，使用分离柱针芯将细胞推出。所得细胞主要为CD34+细胞。
分别取筛选前及筛选后的1×105个单个核细胞与藻红蛋白(PE)标记的抗CD34单抗于4℃下孵育30min。将细胞用缓冲液洗涤后，用300μl的2％多聚甲醛固定30min。弃去多聚甲醛，将细胞用缓冲液洗涤后，再用常规免疫组化的方法测定CD34+细胞百分率。
结果筛选前的单个核细胞中，CD34+细胞仅为0.62％-9.05％，平均为3.24％±0.46％(x±sx)。筛选后的单个核细胞中，CD34+细胞为46.42％-95.61％，平均为79.35％±5.24％(x±sx)。筛选纯化前后CD34+细胞浓度平均增加了24.49倍。
实施例2 IL-3、FL及共表达FL和IL-3双顺反子真核载体的构建 真核表达载体pIRES2-EGFP购自Clontech公司产品。大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存。含全长鼠IL-3cDNA(2.5kb)质粒MXIL-3neo由瑞士巴塞尔大学Moroni教授惠赠；含全长人FL cDNA(0.8kb)质粒pUMVC3-hFL购自美国Michigan大学基因治疗中心。
1.pIRES2-EGFP-IL-3的构建 1)IL-3目的片段的扩增利用引物设计软件Primer5.0设计引物如下 上游5-GGAATTCCCTGTGGCTTCTTCA-3(SEQ ID NO1)(含EcoRI位点)； 下游5-TCCCCGCGGGGAAAACCCATTTGTTC-3(SEQ ID NO2)(含SacII位点)。
以MXIL-3neo质粒为模板进行PCR反应，反应条件为94℃变性5min(1个循环)；94℃变性30sec，56℃退火1min，72℃延伸3min(30个循环)；最后72℃延伸10min。结果如图1所示，扩增得到2501bp的IL-3片段(图1)。
2)将IL-3片段定向克隆至pIRES2-EGFP载体分别利用EcoRI、SacII双酶切PCR产物IL-3片段和pIRES2-EGFP，回收后连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，从卡那抗性平板上挑取数个单菌落提取质粒DNA。分别用HindIII单酶切和BglII+Xmal双酶切重组体进行鉴定，并进行DNA测序证实。阳性重组体命名为pIRES2-EGFP-IL-3。
重组体pIRES2-EGFP-IL-3酶切结果如图2所示，HindIII单酶切在pIRES2-EGFP的623、892bp处和IL-3片段的801bp处有HindIII位点，因此阳性重组体经该酶切后出现0.8kb、1.7kb和5.0kb的三个片段。BglII+Xmal双酶切在pIRES2-EGFP的621、657bp处分别有BglII、Xmal位点，因此阳性重组体经该双酶切后出现2.2kb和5.3kb二个片段。DNA序列测定表明IL-3基因的核苷酸序列与GenebankK03233的完全一致。
2.pIRES2-EGFP-FL真核表达载体构建 1)FL目的片段的扩增利用Primer5.0设计引物如下 上游5-ATTGTGGCTTACCCTTGGTCTTCA-3(SEQ ID NO3)； 下游5-GTTGCGGGGAACTCCCCATTTGTTC-3(SEQ ID NO4)。以PUMVC3-hFL质粒为模板进行PCR反应，条件为94℃变性5min(1个循环)；94℃变性30sec，56℃退火1min，72℃延伸3min(30个循环)；最后72℃延伸10min。
2)FL双顺反子真核表达载体构建SalI和BglII双酶切pUMVC3-hFL，得到全长人FL序列(0.8kb)，两端抹平后克隆至pIRES2-EGFP载体的BglII位点。NheI和XhoI酶切鉴定后，将正向连接的重组体命名为pIRES2-EGFP-FL。
酶切结果如图3所示，pUMVC3-hFL经SalI+BglII酶切后得到3.9kb+0.8kb片段，重组体pIRES2-EGFP-FL经NheI+XhoI酶切后得到5.25kb+0.75kb片段。DNA序列测定表明FL基因的核苷酸序列与GenebankK03233的完全一致。
3.pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表达载体构建 利用EcoRI和SacII位点双酶切已构建成功的pIRES2-EGFP-IL-3，回收IL-3目的片段后克隆至pIRES2-EGFP-FL的对应位点。分别使用XhoI和XmalI双酶切、NheI和KpnI双酶切鉴定，将阳性重组体命名为pIRES2-EGFP-FL-IL-3。
酶切结果如图4所示，经XmalI+XhoI酶切后，该重组体出现6.0kb和2.2kb两个片段；经NheI+KpnI酶切后，出现4.7kb和3.5kb两个片段。DNA测序表明结果正确，无移码等错误。
实施例3 基因转染 取处于指数生长期的经分离纯化的脐带血CD34+细胞，当其融合至60-80％时进行转染。将5μl质粒载体DNA(53μg/ml)加入20μl转染缓冲液(20mmol/L HEPES，150mmol/L NaCl，pH7.4)中混匀，得到A液；将15μl DOTAP脂质体加入35μl上述转染缓冲液中混匀，得到B液；室温下将A液和B液轻轻混均，1,200rpm离心30sec，静置15min，将之缓慢配入含10％胎牛血清的IMDM中。将培养瓶中培养液吸弃，用0.01mol/L PBS洗1次细胞，然后将含有转染体系的培养液加入培养瓶中，于37℃、5％ CO2培养箱内温育24h，之后换液。将G418按800μg/ml浓度加入培养瓶中约1月，半月换1次液，维持G418浓度不变。将筛选后的细胞扩增备用。
实施例4 转染质粒的鉴定 1.检测EGFP的绿色荧光 将普通盖玻片泡酸、洗净、烘干后，放入直径6cm培养皿中，经60Coγ-射线常规照射消毒。用0.25％胰酶消化转染了细胞因子基因的细胞，然后将细胞以约1×105/ml的浓度，接种于上述照射消毒的培养皿中。24h后弃去培养液，用0.01mol/L的PBS洗涤细胞2次。然后取出盖玻片，置于载玻片上，在488nm的蓝色激光激发下，用荧光显微镜观察EGFP的绿色荧光。
结果显示，荧光显微镜下可见细胞的胞体均发出绿色荧光，表明质粒成功导入CD34+细胞中。
2.半定量RT-PCR检测FL及IL-3的表达 ①利用Invitrogen公司的一步法总RNA提取试剂盒，提取实施例3中的经转染筛选并扩增的细胞的总RNA。
②引物的设计与合成应用Primer5.0软件设计引物如下， IL-3上游(P1)5-TGTTTCCACTCCGTCCAT-3(SEQ ID NO5)； 下游(P2)5-CCAAAGCAGGGCTCTTAC-3(SEQ ID NO6)。(Tm53℃；30个循环；585bp)； FLP15-CTGGAGCCCAACAACCTATC-3(SEQ ID NO7)； P25-TCTGGACGAAGCGAAGACA-3(SEQ ID NO8)。(Tm 57℃；27个循环；353bp)。
③RT-PCR采用两步法进行逆转录扩增。反转录42℃ 30分钟，99℃ 5分钟，5℃ 5分钟，1个循环。PCR94℃预变性4分钟；然后94℃变性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共40个循环；最后72℃延伸10分钟补齐末端。
结果如图5所示，以正常未转染细胞为对照，转染后CD34+细胞的IL-3(图5A)和FL表达(图5B)均明显上调。
3.Western blot检测FL及IL-3的蛋白表达情况 提取实施例3中经转染筛选并扩增的细胞的总蛋白，用Lowry法测定蛋白质含量。取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，将蛋白转至PVDF膜上。将膜用TBST(TBS，0.05％Tween20)稀释的封闭液(5％脱脂奶粉)室温封闭1小时后，用1:800的IL-3一抗(Sigma)稀释液(稀释于TBST中)或1:500的FL一抗(Sigma)稀释液4℃孵育过夜。一抗孵育结束后，用TBST洗膜3次，每次10分钟。再分别用1:300的对应的二抗(兔抗人)稀释液(稀释于TBST中)于37℃孵育1h。然后用TBST洗膜3次，每次l0分钟。接着将膜在TBST稀释的1:500的辣根酶链亲合素三抗稀释液中于37℃孵育1h。最后用DAB显色，将显色清晰条带的PVDF膜置于Gel Doc2000凝胶扫描系统上分析，以样本扫描值/对照扫描值的比值进行统计分析。
结果如图6所示，同时导入pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL两种载体的CD34+细胞中，IL-3蛋白的表达高于对照组(图6A)，FL蛋白的表达高于对照组(图6B)；导入pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表达载体的CD34+细胞中，表达的IL-3和FL蛋白也均高于对照组(图6C，6D)。
实施例5 包含CD34+脐带血干细胞的药物组合物的制备 皂矾购自陕西郝其军制药有限公司；CD34+脐带血干细胞由实施例1获得。制备步骤如下 (1)将来自实施例1的5×105个CD34+脐带血干细胞重悬在200μl等渗磷酸盐缓冲液(0.03mol/L，pH 7.4)中，得到浓度为2.5×106/ml的干细胞悬液。
(2)将500μg皂矾溶于100μl上述磷酸盐缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的皂矾溶液。
(3)将上述干细胞悬液与皂矾溶液混合，即得到药物组合物注射液。
实施例6 包含导入了表达载体的CD34+脐带血干细胞的药物组合物的制备 皂矾购自陕西郝其军制药有限公司；导入了表达载体的CD34+脐带血干细胞来自实施例3。
1.包含同时导入了pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL两种载体的CD34+脐带血干细胞的药物组合物的制备 如实施例5的制备方法，将5×105个导入了pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL表达载体的CD34+脐带血干细胞重悬在200μl等渗磷酸盐缓冲液(0.03mol/L，pH 7.4)中，得到浓度为2.5×106/ml的转染了IL-3基因的细胞悬液；将500μg皂矾溶于100μl上述磷酸盐缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的皂矾溶液；将上述两种液体混合，得到300μl药物组合物注射液。
2.包含导入了pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表达载体的CD34+脐带血干细胞的药物组合物的制备 与上面的制备方法基本相同，不同之处在于CD34+脐带血干细胞导入的是pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表达载体。
实施例7 观测来自实施例5的本发明的药物组合物的疗效 实验对象48只4-6周龄，体重18-20g的SCID雌性小鼠(第三军医大学动物所提供)。
实验方法小鼠饲养于无菌层流柜中。饲料经60Co照射，饮用水及垫料均经高压消毒无菌处理，给药前3天开始饮用经高压消毒酸化后加入二性霉素B(80mg/L)和环丙沙星(80mg/L)的水。对小鼠的所有操作均在无菌层流条件下进行。小鼠置于无菌透气的塑料盒中，外罩无菌消毒巾，用60Coγ射线一次全身性照射2.0-8.0Gy(剂量率为1.07Gy/min)，复制辐射损伤的动物模型。在辐射后4小时内通过尾静脉注射给药，此后维持抗生素饲服。
实验分组经过照射的48只小鼠随机分为空白组、CD34+脐带血干细胞组(CD34组)、皂矾组、药物组合物组，每组12只动物。其中CD34组的每只小鼠给予300μl细胞悬液，含有5×105个来自实施1的CD34+脐带血干细胞；皂矾组的每只小鼠给予300μl皂矾溶液(含皂矾500μg)；药物组合物组的每只小鼠给予300μl来自实施例5的药物组合物，即包含皂矾和CD34+脐带血干细胞的组合物。
观测指标观察小鼠生存情况；给药后第2周、4周和6周尾静脉取血进行血常规检测。
统计学处理所有数据以x±s表示，SPSS10.0软件进行统计学处理，小鼠存活率用χ2检验，其余数据用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
实验结果 各组小鼠存活率如表1所示，空白组小鼠在2周内因造血功能衰竭而全部死亡；CD34+组和皂矾组的存活率随时间延长而降低；药物组合物组的存活率显著高于同期各组。
外周血常规检测结果如表2所示，空白组因全部死亡没有相关数据；第2周和第4周时，药物组合物组的白细胞数量、红细胞数量及血小板数量显著高于CD34组和皂矾组(p<0.05)，有显著的统计学意义；第6周时除空白组外的其余组的各指标之间无明显区别，这可能是因为每组能够存活到6周的小鼠的造血恢复程度都较理想。
这些数据表明，本发明的药物组合物与CD34+脐带血干细胞和皂矾相比，对辐射损伤导致的造血功能受损状态具有明显的治疗作用。
表1 各组小鼠存活数量及存活率
注与对照组比较，aP<0.01；与CD34组比较，bP<0.05；dP<0.01；与皂矾组比较，cP<0.01 表2 各组小鼠外周血常规检测结果(x±s)
注药物组合物组ab表示对于第2周和第4周的各指标，药物组合物组与CD34组相比，aP<0.05；与皂矾组相比，bP<0.01。
实施例8 观测来自实施例6的本发明的药物组合物的疗效 实验对象80只4-6周龄，体重18-20g的SCID雌性小鼠(第三军医大学动物所提供)。
实验方法与实施例7相同。
实验分组经过照射的80只小鼠随机分为导入双载体的CD34+脐带血干细胞组(A组)、导入pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表达载体的干细胞组(B组)、皂矾组(C组)、包含皂矾以及导入了双载体的干细胞的药物组合物组(D组)、包含皂矾和导入了共表达载体的干细胞的药物组合物组(E组)，每组16只动物。因为不经治疗的小鼠两周内全部死亡，故未设空白对照组。5个组的每只小鼠都通过尾静脉给予300μl注射液，其中A组的小鼠给予细胞悬液，其含有5×105个导入了pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL两种载体的CD34+脐带血干细胞；B组小鼠也给予细胞悬液，其含有5×105个导入了pIRES2-EGFP-FL-IL-3表达载体的CD34+脐带血干细胞；C组小鼠给予皂矾溶液(含皂矾500μg)；D组给予药物组合物，其包含皂矾和导入了pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL两种载体的CD34+脐带血干细胞；E组小鼠也给予药物组合物，该组合物包含皂矾和导入了pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表达载体的CD34+脐带血干细胞。
观测指标与实施例7相同。
统计学处理与实施例7相同。
实验结果 各组小鼠存活率如表3所示，E组的存活率在第2、4和6周均显著高于A、B、C组(p<0.05)；D组的存活率在不同时期均高于A、B、C组，但低于同期的E组的存活率。
外周血常规检测结果参见表4，第2周和第4周时，E组的白细胞数量、红细胞数量及血小板数量均高于A、B、C和D组(p<0.05)，有显著的统计学意义；D组中的各指标高于A、B和C组，但均低于同期的E组。
该结果表明，本发明的药物组合物与单独转染了细胞因子基因的CD34+脐带血干细胞相比，能够显著提高辐射损伤动物的存活率，对造血重建具有明显的促进作用。同时该结果也表明，皂矾与pIRES2-EGFP-FL-IL-3共表达载体的协同作用比皂矾与pIRES2-EGFP-IL-3和pIRES2-EGFP-FL质粒载体的协同作用更为突出。
表3 各组小鼠存活数量及存活率
表4 各组小鼠外周血常规检测结果(x±s)
可以理解，尽管本发明以某种形式被说明，但本发明并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化。这些变化都在本发明要求保护的范围内。
序列表
<110>第三军医大学西南医院血液科
张勇
杜宏伟
郭朝华
董世武
<120>促造血的药物组合物及其制备方法
<130>08C11137CN
<160>8
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>1
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>2
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>3
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>4
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>5
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>6
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>7
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR的引物序列
<400>8
权利要求
1.一种药物组合物，它包含造血干细胞和皂矾，以及药学上可接受的介质。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述造血干细胞为CD34+造血干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于所述造血干细胞是导入了表达载体的造血干细胞，其中所述表达载体携带至少一种细胞因子基因。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述细胞因子选自Flt3配体、白介素-3或其组合。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述表达载体为同时表达Flt3配体、白介素-3的pIRES2-EGFP-FL-IL-3。
6.制备权利要求1-5任一项所述的药物组合物的方法，其包括分离纯化造血干细胞并将其重悬在药学上可接受的介质中；将皂矾溶于药学上可接受的介质中；将上述细胞重悬液与皂矾溶液混合。
7.制备权利要求6所述的药物组合物的方法，其还包括将携带细胞因子基因的表达载体导入所述干细胞。
8.权利要求1-5中任一项所述的药物组合物在制备治疗造血功能受损状态的药剂中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述药物组合物中的皂矾和造血干细胞具有协同促进造血的作用。
10.根据权利要求8所述的用途，其中所述造血功能受损状态选自再生障碍性贫血、白细胞减少症、血小板减少症、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤以及电离辐射损伤、化疗引起的造血障碍。
全文摘要
本发明涉及一种促进造血的药物组合物，其包含造血干细胞和皂矾，其中所述造血干细胞优选为导入了携带细胞因子基因的表达载体的细胞。本发明还涉及该药物组合物的制备方法以及在制备用于治疗造血功能受损状态的药剂中的用途，其中造血干细胞和皂矾具有协同促进造血的作用。
文档编号A61K35/14GK101530427SQ200910006209
公开日2009年9月16日 申请日期2009年2月3日 优先权日2009年2月3日
发明者勇 张, 杜宏伟, 郭朝华, 董世武 申请人:重庆西南医院