专利名称：磁共振肝靶向造影剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种放射诊断用注射剂，具体说涉及一种磁共振造影剂及 其制造方法。特别是涉及一种磁共振肝靶向造影剂及其制造方法。
背景技术：
当今，人类疾病已发生了重大变化，恶性肿瘤已成为威胁人类生命健 康的首要疾病，发病率及死亡率甚高。据报道，全世界有3.5亿以上传染 性肝炎病毒携带者，在中国大约有24000万肝炎病毒携带者，这是造成肝 癌的主要原因，其中有10%发展成为肝癌。鉴于多数癌症患者在被发现之 际已是中晚期、难以或不宜进行手术治疗。如何早期定位，定性诊断恶性 肿瘤，成了当今医学发展的趋势和研究的热点之一。随着科学技术的发展， 人们已经掌握了多种对肝脏诊断的方法，但肝脏占位性病变的鉴别诊断仍 是人们关注的难点，尽管MRI对病灶有较高的分辨能力，仍有许多病灶难 以检出或鉴别诊断困难。近年来，许多学者致力于小肿瘤的诊断上，因此 肿瘤影像诊断(MRI)技术在生物、医学领域等得到迅速发展和广泛应用。 MRI技术的基本原理与脉冲傅立叶变换核磁共振技术相似，不同的是 它增设了 一个线性梯度磁场，对样品磁核进行"空间编码",使处于不同空间 位置的同种磁核有不同的共振频率，再利用投影重建或傅立叶变换方法就 能得到磁核的空间分布图像。这种技术弥补了计算机X射线断层照像术(CT 扫描术)的不足,对检测组织坏死,局部缺血和各种恶性病变特别有效，并能对 其进行早期诊断，对人体各循环系统的代谢过程进行监测,其成像对比度明 显优于CT扫描术。
MRI技术是目前利用先进的超导磁共振仪来诊断疾病(特别是肿瘤) 的最先进的技术，它能较好地反映肿瘤的病理改变，显示的解剖结构清楚， 即能定位病灶，又有助于术前定性，因而在肿瘤的诊断及分期方面，可提 供更多的信息，其诊断效果优于CT。而纳米靶向造影剂，则为MRI技术 提供了 一条不可缺少的切实可行的对比介质，由于纳米靶向造影剂的使用， 使MRI在T2加权像上肿瘤侵入周围组织中的病变组织中信号强度影与周 围脂肪的高信号强度影对比明显，故显示周围组织受肿瘤侵犯较CT更为 明显准确。
但是，目前用于临床磁共振成像造影剂存在两大难题。 一是临床使用 的磁共振成像造影剂仅适合于脑、肾和血液系统的成像，但对肝、脾等系 统的成像效果较差。选择性分布是提高成像对比度的重要因素，因此寻找 高效且能定位于特定组织或器官的磁共振成像造影剂是该领域的重要发展 方向。二是半衰期较短，很容易从血液室中被清除掉，从而导致顺磁性金 属离子释放出来，而这些金属离子会产生毒性。为此人们研究了多种生物 体稳定释放系统，以期将磁共振成像造影剂局部释放于体内选定区域，且 可避免磁共振成像造影剂活性丧失，并能较长时间稳定释放，还能自行降 解，降解产物无毒，载体生物相容性好。
发明内容
本发明旨在制备MRI肝靶向纳米造影剂，以提高对肝、脾肿瘤的诊 断效果，降低造影剂对正常组织的毒副作用。 具体方案是
一种MRI肝靶向纳米造影剂，其特征是这种造影剂是以磁性纳米氧化 铁微粒为主要成分的超顺磁性造影剂，在MRI中使用的超顺磁造影剂是高 效的。它们的驰豫率R，和R2高于目前应用的钆配合物。在多数情况下， 这些超顺磁造影剂具有明显减少自旋-自旋驰豫时间和减少MRI信号的杰 出本领。这种信号强度的降低与磁粒子周围的磁场不均匀性有关。
这种造影剂是以磁性纳米氧化铁微粒为主要成分的超顺磁性造影剂， 所述的超顺磁氧化铁纳米粒表面用磷脂或糖酐进行修饰。这些表面修饰剂 是特别有用的，它们可以用于磁共振肝靶向造影剂的静脉注射剂的配方中。 用磷脂作为纳米反应器，该反应器不仅为制备纳米粒子提供了合适的空间， 而且在制备条件下还作为稳定剂和保护剂，起到了非常重要的作用；同样, 用糖酐作为表面修饰材料，在合成中它不仅作为稳定剂而且作为保护剂发 挥了非常重要的作用。具有磁矩的粒子经表面修饰后，是稳定的，能够抵 抗凝聚，在生理条件下可降解。
所述的糖酐为右旋糖酐或半乳糖酐。用柠檬酸或其盐作为稳定剂，甘 露醇、氯化钠或葡萄糖作为等渗调节剂。右旋糖酐或半乳糖酐，优选为右 旋糖酐，其分子量范围1000-70000，最好是在10000-70000。
磁性纳米氧化铁:碟脂:稳定剂:等渗调节剂:pH调整剂=1 -40:1 -50:2 -30:3 -60:4-45。
磁性纳米氧化铁:糖酐:稳定剂:等渗调节剂:pH调整剂=1 -40:1 -50:2 -30:3 -60:4-45。
所述的磁性纳米氧化铁微粒为Fe304或Fe203。
所述的磷脂为药用级的大豆磷脂、大豆脑磷脂、大豆肌醇磷脂、二 月桂磷脂酰胆碱、二亚酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈脂酰 磷脂酰胆碱或二豆寇酰磷脂酰胆碱；稳定剂为:柠檬酸，柠檬酸钠、柠檬酸 钾或柠檬酸铵；等渗调节剂:无机盐氯化钠(NaCl)或单糖(葡萄糖)或糖 醇如甘露醇或山梨醇；pH调整剂如磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲溶液。
该产品不仅应用于医疗、生物和工程等领域作为补血药(铁缺乏贫血)， 不透射线介质，血流测量剂或药物载体(特别是在磁场存在时)而且在其 它领域尤其是利用磁性的地方。例如，磁性离合器、磁性油或流体动力学 研究的介质。特别是本发明物在水中能形成一个稳定的水溶胶，低毒且易 生产，并且有广泛的应用前景，包括上边引证的应用和生产过程。
磁流体在广泛的意义上包括磁性氧化铁水溶胶是已知的。已有许多文 献描述了制造方法。
大概有两种生产磁性氧化铁水溶胶的生产方法。 一种是研磨法，如在 美国专利3, 700, 595中介绍的，在液体介质中如水或煤油在表面活性剂 存在下如油酸钠，使用球磨机直到磨成象溶胶一样的颗粒。另一种方法是480， 555中介绍的，在一个亚铁盐和一个铁盐 的混合物，其摩尔比为3:1-1:1,逐渐加到一个含有OH-类型的强碱阴离子 树脂的混合物中，pH7.5-9.5,生成的水溶胶通过降低pHl-3被稳定，最好 用表面活性剂来稳定。
本发明的目的之 一 是提供了 一种超顺磁性氧化铁纳米粒子的制备方 法；本发明的许多其它目的和优点从下面的描述中变得非常明显。
通过化学法制备的磁性氧化铁溶胶的使用在本发明中给出非常好的 结果。例如这样一个溶胶能被制备出来，通过混合含有一个铁盐和亚铁盐 的水溶液与一个水溶性碱反应。例如，NaOH、 KOH、 LiOH或NH3H20从 生成的产物中分离该固体，在水中重新分散该固体，然后加酸调pH,如必 要用流水透析。
这样一个溶胶也可以通过用一个强碱型离子交换树脂水溶液与一个混 合铁盐反应生产。维持pH在4.5-9.5,如必要按上述方法精制产品。通过 上述化学法形成的起始磁性氧化铁溶胶可以通过调整铁盐和亚铁盐的摩尔 比例来控制，要获得较高饱合磁通密度最好调整铁盐和亚铁盐的摩尔比 =1:2。按上述方法得到的起始磁性氧化铁溶胶可直接作为生产磁性配合物 的材料，这样获得的氧化铁溶胶被认为具有尖晶石结构。例如Fe304或 Fe203。
本发明超顺磁氧化铁纳米粒中右旋糖酐和铁的量通过下面方法测定。 铁含量观!l定
本发明超顺磁氧化铁纳米粒中含铁量可用原子吸收光谱法测定；可用分 光光度法测定；也可用电感偶合等离子发射光谱法测定。 右旋糖酐的含量测定
右旋糖酐的含量测定可用硫酸-蒽酮法测定。 磁性氧化物的粒径测定
(1) 核粒径
用高分辩电镜测定超顺磁氧化铁纳米粒的核粒径。
(2) 总粒径
用动力激光散射法测定超顺磁氧化铁纳米粒的总粒径。 磁性氧化物的磁性测定 用振动样品磁强计测定。磁矫顽力为零，说明产物是超顺磁性的。 用穆斯保尔光谱仪测定穆斯保尔光谱。对称的双峰说明产物是超顺磁性的。
本发明的超顺磁性氧化物，核粒径-5 7nm;总粒径40 50nm，磁化强 度在10 100emu/g。
急性毒性LDso(水溶胶静脉给药到小鼠)
一般的磁性化合物LD505~80mmol/kg;而本发明产品LD5030~80mmol/kg
(以铁计)。我们发现本发明超顺磁性氧化物静脉给药后，至少有部分累积 在网状内皮系统丰富的组织中，如肝脏。
如前所述，本发明超顺磁性氧化物被吸收进入每个网状内皮组织和器官。例如，肝脾，淋巴结和骨髓。配合物累积在这些器官的量受到粒径的 影响。例如粒径小时，药物进入淋巴结的量增加且半衰期延长。因此可以 通过改变反应条件制备出所需要的粒径和累积性质。
当本发明超顺磁性氧化物用做MRI对比剂时，要求使用其水溶胶的形 式。尽管超顺磁性氧化物的浓度在较宽范围内变化，浓度范围一般约为
1 4mmol/L最好是0.01 2 mmol/L(按铁计)。可以在水溶胶制剂中加入各种 生理上所能接受的助剂。如加入等渗剂如无机盐(NaCl),单糖(葡萄糖) 或糖醇如甘露醇或山梨醇，pH调整剂如磷酸缓冲液或杼檬酸缓冲溶液。
当本发明超顺磁性氧化物用做MRI对比剂时，使用量变化取决于诊断 位置，但范围通常约为1 mmol/kg，最好是2jamol/kg~l mmol/L(按铁计)。
做为本发明超顺磁性氧化物的给药方法，可以采用静脉内，动脉内，血 管内，肌肉内和皮下注射，在一些情况下，口服给药。
根据本发明制备的超顺磁性氧化铁的一个具体实例10 25% (w/v)右 旋糖酐的水溶液与超顺磁性氧化铁纳米粒混合，混合比例为铁盐和亚铁盐 的摩尔比为1:5最好是1.5:3。该反应进行的很平稳，只是通过加热这个反 应的混合物，反应最好在70 110°C，通常在回流下进行，反应在回流下 30-60分钟完成。
本发明超顺磁性氧化铁纳米粒具有磁性和饱合磁通密度大于0,通常 小于90emu/g，根据一个具体实例，提供了 一个饱合磁通密度5 80emu/g。
本发明超顺磁性氧化物如上所述，具有各式各样的杰出性质并且能够 用于医疗、生物和工程等领域。例如，做为磁靶向给药系统中的磁性载体， 如磁耙向脂质体、磁乾向微球，细胞分离，补血药，x-ray对比剂，MRI 对比剂等
本发明所k有的技术特点
MRI肝靶向纳米靶向造影剂具有如下特点 1:载药向靶运行，即靶向性非常好。
2:使药物长效化，延缓或控制药物释放，延长药物有效作用时间。
3:减小给药剂量，降低药物毒副作用。
4:与细胞膜亲合力强，可以增加药物透过细胞膜的能力。
图1为氧化铁纳米粒子TEM图片
图2为氧化铁纳米粒子电子衍射图
图3为超细超顺磁性氧化铁TEM图片
图4为超细超顺磁性氧化铁电子衍射图
图5为纳米耙向造影剂小鼠给药前肝和肿瘤磁共振成像图片
图6为纳米乾向造影剂小鼠给药后肝和肿瘤磁共振成像图片
具体实施例方式
实施例1
称取豆磷脂0.6g,用10ml乙醚溶解，置250ml三颈瓶中，挥散乙醚， 使豆磷脂在瓶壁上形成一层薄膜。加入FeCl3溶液50ml (1.0%)于250 ml三颈瓶中，搅拌。称取0.13gFeCl2,溶于50ml水中，转入三颈瓶中。滴加 1.5mol.L"NaOH溶液。同时快速搅拌。反应完毕后，离心分离，得磁性氧 化物。用JEM-2000EXII高分辨电子显微镜(high resolution transmission electron microscope)观察^米微粒的形貌和粒子大小。结果见Fig.l(a)、 Fig.l(b)显示了样品的形态，通过TEM观察及测量在豆磷脂与水组成的有 序体(双分子层脂质体)中生成的磁性氧化铁颗粒尺寸约为7nm。并且分 散得非常好。粒径7nm,在室温8kOe外场条件下，样品的饱合磁化强度(MJ 为G.SSemu.g-1,剩余磁化强度(Mr)为1.13emu.g"，矫顽力(He)为540e。 实施例2
将FeCb和FeCl2按摩尔比2:1混合加入到100ml水中，混合均匀后置 250ml三颈瓶中，同时开启搅拌器。向三颈瓶中加入IO克右旋糖酐溶液。 在70 ~ 80。C恒温水浴中，同时加入1.5mol七"NaOH溶液。混合物在80°C 陈化50min，然后冷却至室温。用HCl调pH5.0。沉淀和上清液进行离心 分离。沉淀用水洗涤三次，于70。C干燥至恒重。得磁性氧化物。TEM观察 结果见Fig.2(a)、 Fig.2(b)
粒径5nm，在室温8kOe外场条件下，样品的饱合磁化强(M》为 36.4emu/g,剩余磁化强度(M。为5.7emu/g,且不存在矫顽力(jHc), jHc为
0. 00e。 实施例3
取500ml铁盐和亚铁盐的混合溶液140ml。其中内含32gFeCl2.4H20和 75.5gFeCl3.6H20,加入到500ml 3mol.L1 NaOH溶液，其中内含1000克右 旋糖酐。生成的混悬液，在100。C加热IO分钟，同时搅拌，冷却后离心 IO分钟，上清液用水稀释使总体积为2L，之后，将其加入到500mllM的 柠檬酸钠溶液中，该混合物用lOmM的柠檬酸铵缓冲溶液透析，再用氨水 调整到pH-8.2，加入甘露醇l克，121。C高压灭菌30分钟，获得肝靶向纳 米造影剂。 实施例4
取50只小鼠，雌雄各半，随机分5组，每组10只，组间剂量比0.85， 药液按等比(1:0.85)稀释法，每只鼠一次腹腔注射0.2ml/10g。观察七天， 记录死亡结果和毒性表现症状，用简化机率法进行计算。LD50 I.lxl05±2.4xl02 mg/kg。
造影剂腹腔注射后，七天内小鼠的中毒症状表现(1)中枢神经系统 呆滞，对刺激反应迟缓，震颤；(2)自主神经系统流泪；(3)呼吸系统 呼吸缓慢；(4)胃肠系统排泄物稀、多、粘；(5)生殖系统会阴发黑； (6)皮肤变暗。(7)眼眼球突出，混浊。(8)其它体重明显下降， 食量减少，至死亡。死亡主要发生时间在96hrs内。 实施例5
1. 瘤株
smmc7721肝癌瘤株由中国科学院上海生物研究所细胞库提供，每周 腹腔注射l次传代。2. 肝癌实体瘤模型制作
取小鼠30只，每只小鼠左腋窝皮下接种0.2ml含1.4><107个瘤细胞的生 理盐水混悬液，7天后待肿瘤长到直径为1 1.5cm时用于实验。
3. 磁共振成像
动物活体MRI实验均在美国GE公司生产的1.5T超导型MR仪上进行， 快速自旋回波序列(fast spin echo, FSE ) ，L加权像TR/TE=400/17ms， T2加 权像TR/TE-300/89.2ms，观察野12x12cm,扫描层厚3mm,层隙为零，成像 矩阵256x192,信号釆集釆用3英寸表面线圈。实验动物釆用小白鼠6只 (体重20g±2g)将接种上肝癌的小鼠分成二组,腹腔注射戊巴比妥(按 45mg/kg给药)麻醉，固定在动物架上，立即采样，分别观测尾静脉注射药 物前后MRI，第一组对照组，尾静脉注射巿售Gd-DTPA水溶液；第二组，
尾静脉注射造影剂。将注射药物后的小鼠进行磁共振扫描成像，观察肿瘤 部位与正常组织间的区别，同时对两组成像效果进行比较。
为图5增强NTCA前扫描，见肿瘤与肝脏均呈中等偏低信号，两者信号 强度无明显差别。图6为增强NTCA后扫描，见肿瘤与肝脏信号显著下降(负 性增强)，信号强度明显低于肿瘤，两者有明显差别。它明显增强了肝肿瘤 部位与正常组织间的对比度，影像学研究表明NTCA可做为肝靶向造影剂。
权利要求
1.一种磁共振肝靶向造影剂，其特征在于这种造影剂是以磁性纳米氧化铁微粒为主要成分的超顺磁性造影剂，所述的超顺磁氧化铁纳米粒表面用磷脂或糖酐进行修饰，用磷脂作为纳米反应器，用糖酐作为表面修饰材料。
2. 根据权利要求1所述的一种磁共振肝靶向造影剂，其特征在于:磁 性纳米氧化铁:磷脂=1 -40:1 -50。
3. 根据权利要求l所述的一种磁共振肝靶向造影剂，其特征在于:还 包括糖酐、稳定剂、等渗调节剂、pH调整剂，其重量配比为:磁性纳米氧 化铁:糖酐:稳定剂:等渗调节剂:pH调整剂=1 -40:1 -50:2-30:3 -60:4-45。
4. 根据权利要求1所述的磁性纳米氧化铁微粒为Fe304或Fe203;所 述的磷脂为药用级的大豆磷脂、大豆脑磷脂、大豆肌醇磷脂、二月桂磷 脂酰胆碱、二亚酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈脂酰磷脂酰 胆碱或二豆寇酰磷脂酰胆碱；所述的糖酐为右旋糖酐或半乳糖酐。
5. 根据权利要求1所述的一种磁共振肝靶向造影剂，其特征在于:所 述的稳定剂为:梓檬酸，柠檬酸钠、柠檬酸钾或柠檬酸铵；所述的等渗调 节剂无机盐氯化钠或葡萄糖或糖醇；所述的pH调整剂为磷酸缓冲液或柠 檬酸缓冲溶液。
6. 根据权利要求1或4所述的一种磁共振肝靶向造影剂，其特征在于 糖酐优选为右旋糖酐，其分子量范围1000-70000。
7. 根据权利要求l所述的一种磁共振肝靶向造影剂，其特征在于所 述的磁性氧化铁纳米粒的平均粒径为5 - 7纳米，总粒径为30 - 100纳米， 磁化强度在10~100emu/g。
8. —种如权利要求1所述的磁共振肝靶向造影剂的制备方法，其特 征在于采用共沉淀法制备，在常温常压下进行，10 25% (w/v)磷脂或 糖酐的水溶液与超顺磁性氧化铁纳米粒混合，混合比例为铁盐和亚铁盐的 摩尔比为1:5,加热70 110。C，回流下30-60分钟完成。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，公开了一种磁共振肝靶向造影剂及其制备方法。这种造影剂是以磁性纳米氧化铁微粒为主要成分的超顺磁性造影剂，所述的超顺磁氧化铁纳米粒表面用磷脂或糖酐进行修饰，用磷脂作为纳米反应器，用糖酐作为表面修饰材料。磁性纳米氧化铁∶磷脂＝1-40∶1-50，此外还包括糖酐、稳定剂、等渗调节剂、pH调整剂。并采用共沉淀法制备，在常温常压下进行。本发明是关于体内使用的生物可降解和可代谢的超顺磁金属氧化物作为MR造影剂。这些磁性氧化物是以超顺磁粒子分散体或超顺磁流体的形式存在于生理上可接受分散介质中，它们可以富集在特殊的靶向器官被成像。
文档编号A61K49/06GK101537192SQ20091001132
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者李铁福, 邓英杰 申请人:沈阳药科大学