专利名称：一种红景天所含苯丙素类化合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种天然化合物，更具体地说，本发明涉及一种从红景天中提取分离
得到的新颖的苯丙素类化合物。同时，本发明还涉及所述化合物的制备方法及其在制药中 的应用。 红景天(Rhodiola rosea L.)为多年生草本，高10-20厘米，属于蔷薇科红景天属 植物，主要分布在东北、甘肃、新疆、四川、西藏及云贵等省。根及根茎可入药，具有滋补强 壮、扶本固正、抗疲劳、抗衰老等作用。红景天属植物含有含挥发油、果胶、谷甾醇、鞣质、苯 三酚、间苯三酚、蒽醌、草酸、氢醌、对苯二酚，阿魏酸、儿茶素、儿茶酸、香豆素、黄酮类和甙 类化合物。红景天甙(salidroside)是研究最多的有效成分。 苯丙素类(phenylpropanoids)是指基本母核具有一个或几个C6_C3单元的天然有 机化合物类群，广泛存在于天然植物中。已知苯丙素类化合物具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗病 毒、抗氧化、保肝护肝和碱基修复等作用，对于糖尿病及相关疾病，以及对由于身心压力所 致的性功能障碍，学习、记忆能力低下等都具有明显的改善作用。本发明从红景天中分离得 到一种新的苯丙素类化合物，该化合物具有明显的抗HIV-1和抗氧化活性。
发明内容
本发明是基于这样一种发现而完成的，即通过对红景天的化学成分进行深入研 究，获得一种结构新颖的化合物，并进行了抗HIV-1活性和抗氧化活性筛选，揭示了其良好 的药用价值。 本发明的目的在于提供一种新的具有药用价值的苯并素类化合物。
本发明的另一 目的是提供一种所述新化合物的制备方法。 本发明进一步的目的是提供所述新化合物在制备抗爱滋病(HIV)和抗氧化的药 物方面的用途。 本发明的目的通过下述技术方案予以实现。 *除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。 A.本发明从红景天中分离出了一种新化合物，该化合物用下述结构式表示<formula>formula see original document page 3</formula>
该化合物被命名为2-羟基-1-(3，4-亚甲二氧基，5-甲氧基苯基)-l-丙酮；
背景技术：
英文名2_hydroxyl_l_(3，4_methylenedioxyl_5_methoxyphenyl)-l-propanon B.本发明提供了所述的苯丙素的制备方法，该方法采用下述步骤
(1)以红景天为原料，将其全株晾干，粉碎至20 40目； (2)以70%丙酮为溶剂用超声提取3 5次，每次30 60分钟，提取液合并、过 滤，减压浓縮提取液得到浸膏； (3)浸膏用80 200目的硅胶干法装柱进行硅胶柱层析粗分，将氯仿丙酮按
20 : i 7 : 3的配比，进行梯度洗脱，收集各个部分洗脱液并浓縮；洗脱液的3 : 2部分
进一步用高效液相色谱法分离纯化，流速为2. 5 3. 5mL/min，以甲醇/水为流动相，逐步调 整二者比例逐级细分，即得到所需的苯丙素类化合物。 C.对该化合物进行了抗HIV-1活性筛选，化合物显示出良好的抗HIV-1活性，其治 疗指数为86.5。 D.对该化合物进行了抗氧化活性筛选，化合物显示出良好的抗氧化活性。其半数
清除浓度IC50测定结果为10. 6 ii g/L。 与现有技术相比，本发明具有以下突出优点 1.红景天在我国分布广泛，原料丰富、价格便宜；而且本发明化合物的苯丙素在 红景天中含量相对较高，容易得到； 2.采用了常规柱层析和高效液相色谱结合的制备方法，化合物制备操作流程简 单，所获得的本发明化合物纯度高，后续的工业化生产容易实现； 3.本发明化合物展现出良好的抗艾滋病和抗氧化活性，可为医药工业提供有药用 价值的新化合物或先导化合物。
图1是本发明化合物的核磁共振氢谱CH NMR);
图2是本发明化合物的核磁共振炭谱(13C NMR)。
图3是本发明化合物的主要HMBC相关。
具体实施例方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
实施例1 以云南省大理州的红景天为原料。将其全株(包括根、茎、叶)晾干，粉碎到40目， 粉碎后的样品用70%丙酮超声提取4次(植物原料和丙酮的重量比为l : 5)，每次20分 钟；提取液合并、过滤，减压浓縮提取液得浸膏，浸膏用粗硅胶(80目)拌样，用100目的硅
胶干法装柱进行硅胶柱层析粗分，用氯仿丙酮(20 : i — 7 : 3)进行梯度洗脱，收集各 个部分的洗脱液并浓縮。氯仿丙酮3 : 2洗下的部分用高效液相色谱分离纯化，流速为
3mL/min，以甲醇/水为流动相，逐步调整二者比例逐级细分，即得到所需苯丙素化合物。
实施例2
4
重复实施例1的过程，但有以下不同将原料粉碎到30目；粉碎后的样品用70% 丙酮超声提取3次(植物原料和丙酮的重量比为l : 6)，每次30min;用150目的硅胶干法
装柱进行硅胶柱层析粗分，用氯仿丙酮(20 : i — 7 : 3)进行梯度洗脱，收集各个部分
的洗脱液并浓縮。氯仿丙酮3 : 2洗下的部分用高效液相色谱分离纯化，流速为2.5mL/ min，以甲醇/水为流动相，逐步调整二者比例逐级细分，即得到所需苯丙素化合物。
实施例3 重复实施例1的过程，但有以下不同将原料粉碎到25目；粉碎后的样品用70% 丙酮超声提取5次(植物原料和丙酮的重量比为1 : 3)，每次50min;提取液合并、过滤， 减压浓縮提取液得浸膏，用200目的硅胶干法装柱进行硅胶柱层析粗分，用氯仿丙酮
(20 : 1 —7 : 3)进行梯度洗脱，收集各个部分洗脱液并浓縮。氯仿丙酮3 : 2洗下的
部分用高效液相色谱分离纯化，流速为3. 5mL/min，以甲醇/水为流动相，逐步调整二者比 例逐级细分，即得到所需苯丙素化合物。
实施例4 —对本发明化合物结构的鉴定 该化合物为白色固体；紫外光谱(溶剂为甲醇)，A max(log e ) 272 (2. 96)， 210(5. 62)nm ;红外光i普(溴化钾压片)v max2926， 2858， 1635， 1584， 1528， 1468， 1416， 1138， 868cm—1 ;HRESMS显示其准分子离子峰m/z 233. 0429 [M+Na] + (calcd 233. 0426)，结合NMR 谱确定其分子式为Q。H^5，不饱和度为5。 ^和13C NMR谱(见附图-1和附图_2，数据归 属见表-1)显示分子中有1个苯环(苯环上有1个甲氧基、1个亚甲二氧基、2个次甲基双 键碳)，1个羰基，1个氧化的次甲基，1个甲基。HMBC(附图-3)相关谱可证实该化合物的结 构，通过SCIFINDER查询和文献检索证实该化合物为新化合物。
表-1化合物的^和13C NMR数据(CDC13)
No.5i (mult,/, Hz)(肌ilt.)No.& (咖lt, /, Hz)(mult.)
1133. 2 s7199. 9 s
26. 82s106.2 d84. 86 m70. 2 d
3150. 1 s91. 72 d, / = 6. 822. 7 q
4135.2 s-0CH20-5.86 s101. 2 t
145. 8 s5-OCH]3. 73 s55. 8 q
66. 66s109. 7 d8-OH2. 49 brd 实施例5 —对本发明化合物的抗HIV活性检测
l.HIV-l感染性滴定 按Johnson & Byington所述方法改良进行滴定；按Reed & Muench方法计算病毒 的TCID5。(50% Tissue Culture Infection Dose)。
2.样品对C8166宿主细胞的细胞毒性检测 4X105/ml C8166细胞悬液lOOul与待测化合物溶液混合，设三个重复孔。同时 设置不含化合物的对照孔，温度37°C，5% C02培养三天，采用MTT比色法检测细胞毒性。 ELx800 ELISA仪测定0D值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CC5。值(50% Cytotoxic Concentration)，即对50%的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的化合物浓
5度。 3.样品对HIV-1IIIB诱导C8166细胞病变(CPE)的抑制试验 将8X 105/mL C8166细胞50 ii L/孔接种到含有100 ii L/孔倍比稀释化合物的96 孔细胞培养板上，然后加入50yL的HIV-lme稀释上清(M. 0.1.0.0016)。设三个重复孔。 同时设置不含化合物的正常细胞对照？L。 371:，5%0)2培养三天，倒置显微镜下(100X)计 数合胞体的形成。EC5。(50% EffectiveConcentration)为抑制合胞体形成50%时的化合 物浓度。 4.样品对HIV感染细胞的保护作用试验 将8X 105/ml MT4细胞50ul/孔接种到含有100 ii 1/孔倍比稀释化合物的96孔 细胞培养板上，培养板的一半孔加入50 ill的HIV-1IIIB稀释(M. 0. I. 0. 006)，另一半孔加 入50 培养基。每个浓度梯度2个重复孔，同时设置不含化合物的对照孔和空白对照孔， 37°C，5% C02培养，第三天每孔补加100 ill新鲜培养基，第五天或第六天采用MTT比色法 检测细胞存活率。ELx800ELISA仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。用公 式计算出化合物对正常细胞的毒性和对HIV-lme感染细胞的保护作用。
5.计算公式 根据实验结果绘制剂量反应曲线，按Reed&Muench法计算出化合物抑制病毒的 50%有效浓度(EC5。)，50X抑制细胞生长浓度(CC5。)及抗HIV-1活性的治疗指数TI值 (Therapeutic index)为TI = CC50/EC5。。 细胞生长存活率(％ )=实验孔OD值/对照孔OD值X 100 细胞生长抑制率(％ ) = (1-实验孔OD值/对照孔OD值)X 100 HIV-l致细胞病变的抑制率(％) = (l-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)X100 感染细胞的保护率(％ )=(实验孔OD值-阳性对照孔OD值)/ (阴性对照孔OD值-阳性对照孔OD值)X 100
6.实验结果 实验结果清楚地表明，该化合物显示出一定的抗HIV-1活性，其治疗指数为55. 2，
揭示了本发明的化合物在制备抗爱滋病的药物中具有良好的应用前景。 实施例6 —化合物抗氧化活性检测 抗氧化活性以清除DPra自由基能力的大小表示；以50ii g/mL为初筛浓度，测定 其清除脂性自由基DPra的活性。取一块costar 96孔板，加入新鲜配制的DPffl乙醇溶液 (6. 5X 105mol/L) 190 y L/孔，加入待测样品10 y L/孔，空白孔加10 y L生理盐水，充分混 匀，用封板膜封板后室温下避光静置30分钟，于UV2401分光光度计上测定仪上测定各孔吸 光度值，测定波长为517nm ;样品对脂性自由基DPffl清除率按下式计算
DPra清除率(％) = (A空白-A样品)/A空白X100%
A空白空白对照组吸光度值；A样品加样品组吸光度值。 样品平行5次检测，计算半数清除浓度IC50， IC50测定结果为9. 68 y g/L，表明化 合物具有良好的抗氧化活性。 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种具有下述结构式的苯丙素类化合物
2. —种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，该方法采用以下步骤(1) 以红景天为原料，将其全株晾干，粉碎到20 40目；(2) 以70%丙酮为提取剂用超声提取3 5次，每次30 60分钟；提取液合并、过滤， 减压浓縮提取液得浸膏；(3) 浸膏用80 100目的硅胶拌样，然后用200 300目的硅胶干法装柱进行硅胶柱层析粗分，将氯仿丙酮按20 : 1 7 : 3的配比，进行梯度洗脱，收集各个部分洗脱液；洗脱液的3 : 2部分用高效液相色谱法分离纯化，流速为2. 5 3. 5mL/min，以甲醇/水为 流动相，逐步调整二者比例逐级细分，即得到所需的苯丙素。
3. 权利要求1所述的苯丙素类化合物在制备治疗或预防爱滋病的药物中的应用。
4. 权利要求1所述的苯丙素类化合物在制备抗氧化的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新的红景天所含的苯丙素类化合物及其制备方法和应用。该化合物具有新颖通式(I)的结构，系将红景天全株晾干粉碎，粉碎后以70％丙酮分次用超声提取，合并提取液，过滤，将萃取液浓缩成浸膏，然后用硅胶柱层析初分，采用高效液相半制备色谱进一步分离，即可获得所需化合物。对该化合物进行了抗HIV-1活性筛选，实验结果显示出良好的抗HIV-1和抗氧化活性，其HIV-1治疗指数为55.2，抗氧化半数清除浓度IC50为9.68μg/L。
文档编号A61K31/357GK101696202SQ200910095109
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月28日 优先权日2009年10月28日
发明者何顺琴, 曹靖丽, 杨光宇, 杨海英, 胡秋芬, 薛景娇 申请人:云南民族大学;