专利名称：1-甲基-2-氨基对苯二酸盐的医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及对转移肺瘤有治疗活性的化合物的应用，具体是可有效
抑制肿瘤细胞的趋化运动和黏附能力的 一种1-甲基-2-氨基对苯二酸盐 的医药用途。
背景技术：
扩散转移是恶性肿瘤的一个重要特征，也是导致恶性肿瘤患者低治 愈率、高死亡率的重要原因，它的发生取决于肿瘤细胞的生物学特征、宿 主微环境及两者相互作用的时空关系。趋化因子及其受体能够直接或间接 的影响着肿瘤细胞的运动、增殖、凋亡、侵袭，细胞间相互粘连，瘤细胞 与基质的相互作用，肿瘤血管形成等，在肿瘤的扩散转移过程中发挥着重 要作用。因此，阻断肿瘤细胞的趋化运动可以有效地控制肿瘤转移。
《Cancer Res》.1999: 59: 5475—5478.，报道表皮生长因子及其受体 (EGF/EGFR )能够诱导细胞的趋化运动在肿瘤的生长和转移中可能起着相 当重要的作用。
《Breast Cancer Res Treat》.1994; 29: 127—38,净艮道研究发3见， 多数乳腺癌细胞中都有EGFR的高表达且多与临床预后不良密切相关。以 EGFR为靶点设计的特异性抗EGFR的封闭抗体阻断EGFR的功能后，能够有效 抑制小鼠体内多种高表达EGFR的肿瘤细胞的生长和转移。
PKC《是PKC家族中的一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是EGFR下游的重 要信号分子，属于非典型的PKC。研究发现，PKC《在EGF介导的人类乳腺 癌细胞趋化运动中具有重要的作用，是唯——个必需的PKC亚型。
《Cancer Res》2005; 65: (4). February 15， 2005)。介绍PKC《 的特异性抑制剂可以通过阻断EGF诱导的Actin聚合和细胞翁附从而抑制 细胞的趋化运动。因此PKC《有望成为抗癌药物治疗肿瘤转移的一个新的 靶点。然而，EGF介导的PKC《活化的分子机制仍然不明，需要进一步研究 探讨。
此外，很多报道已经显示PKC ^在多种信号转导途径中也发挥作用， 如分裂素-激活酶级联反应，NF-kB的活化，核糖体S6蛋白酶信号和细 胞极性途径。
美国Invi trogen公司的筛选PKC《抑制剂的经典试剂盒-Z'-LYTE Kinase Assay Kit-Ser/Thr 7 P印tide提供了 一项稳、定的、室温条4牛下 通过香豆素和荧光素间的荧光共振能量转移(FRET)进行检测激酶抑制 剂的筛选技术。
1-曱基-2-氨基对苯二酸盐(l-Methyl-2-aminoterephthalate)系由美国.西格玛.奥德里奇(sigma. Aldrich ) 7>司生产的一种可以有效抑 制PKC《表达及其磷酸化的小分子化合物，
其分子量(MW) =195. 17;
分子式4-(H02C)C6H3(NH2)C02CH3;
分子结构式
l-曱基-2-氨基对苯二酸盐的制备方法
1. 将2-硝基对苯二酸曱酯(1克)溶于10毫升的乙醇中，并添加 0. 1克的苯丙氨酸脱氨酶和碳(5%干燥量)。
2. 该混合物于室温中进行混匀，并在50psi氬气作用下至反应完成。
3. 反应混合液经过滤后，在真空中浓缩。
4. 最终，残余液再经过重结晶作用而生成纯化的1-曱基-2-氨基对 苯二酸盐。
发明内容
本发明就是为了解决恶性肿瘤的扩散转移问题，针对PKC《这一耙点， 利用药物筛选试剂盒筛选出能降低其表达的d、分子化合物，并从体外细胞 培养方面明确该化合物可以有效地抑制EGF诱导的乳腺癌细胞的趋化运动 和黏附能力。
本发明的目的旨在提供1-甲基_2-氨基对苯二酸盐在制备抑制肿瘤 转移药物制剂中的应用。
1-曱基-2-氨基对苯二酸盐有效抑制丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶C及其 磷酸化。
l-曱基-2-氨基对苯二酸盐有效抑制肿瘤细胞的趋化运动和黏附能力。
l-曱基-2-氨基对苯二酸盐降低乳腺癌细胞的迁移能力和EGF诱导的
黏附能力，抑制趋化运动所需的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶c和其下游信号
分子cofilin的活化。
本发明采用的技术方案是应用筛选PKC〈抑制剂的试剂盒筛选出可以 抑制PKC《表达及其磷酸化的小分子化合物l-曱基-2-氨基对苯二酸盐；并用该化合物针对乳腺癌MDA-MB-2 31细胞进行一 系列细胞功能实验，如MTT 实验检测l-曱基-2-氨基对苯二酸盐对乳腺癌细胞MDA-MB-2 31的细胞毒性 作用及对增殖的影响；检测1-甲基-2-氨基对苯二酸盐对PKC《表达的影响， 以及低表达PKC《的细胞抹的趋化运动能力；检测PKC〈降表达的癌细胞的迁 移能力和对EGF诱导的勦附能力；检测PKC《降表达的癌细胞的F-actin聚合 的情况；检测EGF诱导下PKC《降表达的细胞中cofilin的活化等。从而，确 定l-曱基-2-氨基对苯二酸盐能够降低癌细胞的迁移能力和EGF诱导的黏 附能力、抑制趋化运动所需的cof i 1 in的活化。
本发明从以上工作的结果中得出PKC《确实参与了肺瘤细胞的趋化 运动，并且在其中具有重要作用，降低该酶的表达水平进而减弱其活化 水平可以有效抑制EGF诱导的癌细胞的趋化运动和黏附能力，因此PKC《 有望成为设计高效、特异的抗癌药物的关键靶点。
本发明利用筛选PKC《抑制剂的试剂盒筛选出能有效降低肿瘤细胞中 PKC《表达水平的小分子化合物l-甲基-2-氨基对苯二酸盐，并以PKC《为靶 点降低癌细胞的迁移能力和EGF诱导的黏附能力，使现有的小分子化合物 1-甲基-2-氨基对苯二酸盐成为具有抑制肿瘤转移的新用途的药物。
图l是用试剂盒检测1-曱基-2-氨基对苯二酸盐对PKC《抑制作用的折 线图2是MTT连续三天检测不同浓度的1-甲基-2-氨基对苯二酸盐对MDA
-MB - 231细胞毒性作用的折线图3是不同浓度的化诱因子EGF对各组细胞的趋化指数统计图4是用划痕实验检测各组细胞迁移距离的统计图5和图6是用黏附实验检测各组细胞翻附细胞数目的统计图7是用F-ac t in聚合实验检测各组细胞F-ac t in聚合能力的统计图8是用免疫印迹的方法检测细胞中cofilin蛋白总量表达水平和磷
酸化cof i 1 in蛋白表达水平的的SDS-PAGE电泳图。
具体实施例方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。 利用药物筛选的经典试剂盒-Z，-LYTE Kinase Assay Kit-Ser/Thr 7 P印t i de筛选出能抑制PKC;表达的小分子化合物1 -曱基-2-氨基对苯二酸盐。
人乳&泉癌MDA-MB-231细胞购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC),ATCC⑧Number: HTB—26 ; 2—硝'基对苯二酸 曱酯((:91^06)购自香港先进技术工业有限公司(advtechind),产品货 号1154106， CAS号:35092—89—8;趋^f匕小室购自Neuro Probe/>司；EGF购自P印rotech/厶司；0. 01°/。Fibronectin来自Sigma/>司；兔4元人P-cofilin多克隆抗体和羊抗人cofilin多克隆抗体均购自Santa Cruz公司。
实施例1:药物筛选试剂盒筛选出PKC《的抑制剂1 -曱基-2-氨基对苯二酸盐。
美国Invitrogen公司筛选PKC《抑制剂的经典试剂盒-Z'-LYTE Kinase Assay Kit-Ser/Thr 7 P印tide提供了 一项稳、定的、室温条件下通过香豆素和荧光素间的荧光共振能量转移(FRET)进行;险测激酶抑制剂的筛选技术。Z'-LYTETM技术的原理是基于磷酸化和非磷酸化肽段对溶蛋白酶裂解的不同敏感性，底物肽段的两端是用香豆素和荧光素两种荧光基团标记形成一组FRET。首先在初始激酶反应中，PKC《激酶转移ATP的Y-磷酸基到底物合成肽的一个单独的丝氨酸或苏氨酸残基上形成磷酸化的肽l殳。在Development反应中， 一种位点特异性的蛋白酶识别并裂解非磷酸化肽段，而磷酸化肽段不能被蛋白酶裂解。非磷酸化肽段的裂解断开了肽—歐上供体(香豆素)和受体(荧光素)两端荧光基团间的FRET,而没有裂解的磷酸化肽段仍然保持FRET。最终计算激发波长400腿，发射波长445nm，520腿时的供体发射荧光和受体发射荧光的比值，见于下面的方程式。
香豆素发射荧光(445 nm)
发射比率=--
焚光素发射荧光(520 nm)
可以看出，磷酸化肽段(没有激酶抑制剂)的Emission Ratio值会较低，而非磷酸化肽段(有激酶抑制剂)的EmissionRatio值较高。加入小分子化合物1-甲基-2-氨基对苯二酸盐使整个反应得到了较高的Emission Ratio值，说明1-曱基-2-氨基对苯二酸盐有抑制PKC《的作用(如图l)。
实施例2:检测1-甲基-2-氨基对苯二酸盐对乳腺癌细MDA-MB-231的毒性作用及对增殖的影响。
首先将MDA-MB-231细胞消化计数，以每孔2000个细胞均匀铺于3块96孔板中。待细胞贴壁生长过夜后，将不同浓度的1-曱基-2-氨基对苯二酸盐分别加到各实验孔中，每个浓度均设3个复孔。然后3块板子分别在加药后24小时，48小时和72小时加MTT， 4小时后DMS0溶解，酶标4义上4企测波长为570腿时细胞的OD值，每实验重复3次。如图2所示24和48小时细胞的增殖变化不大；而72小时药物浓度为20uM时有较高的OD值，随着浓度增大OD值减小，IC5。在160uM左右。表明1-曱基-2-氨基对苯二酸盐在短时间内对细胞没有明显的细胞毒性，也没有抑制细胞的增殖，而随着时间的推移高浓度时对细胞有一定的抑制作用。
实施例3: PKC《降表达的细胞趋化运动能力减弱。将不同浓度的化学诱导因子EGF加到趋化小室下层板的孔中，上层小室加MI)A-MB-231细胞，用滤膜分隔上下小室。孵育后去除膜上层非特异趋化的细胞后，将膜固定、Diff-Quick染色后显微镜下计数趋化细胞数(400x视野)。每孔取随机3个视野的总和作为该孔的趋化细胞数。样品孔与对照孔的趋化细胞数的比率即为趋化指数。结果用3个孔的平均趋化指数土标准差(Mean土SD)表示。每个实验至少重复3次。如图3所示表皮生长因子EGF能够以剂量依赖方式诱导MDA-MB-231细胞的趋化运动，对照细胞的趋化指数在10以上，但用l-曱基-2-氨基对苯二酸盐处理3小时和6小时的细胞受EGF诱导的趋化运动指数分别降到8和4左右。表明针对PKC《的小分子化合物1-甲基-2-氨基对苯二酸盐使乳腺癌细胞对EGF诱导的趋化运动能力减弱。
实施例4: PKC〈降表达的癌细胞的迁移能力降低。将MDA-MB-231细胞胰酶消化终止后均匀铺于一个六孔板中，次日，药物组加入l-曱基-2-氨基对苯二酸盐进行处理，而对照组加入相应的DMSO溶剂。作用15个小时后，用10uL枪头在每孔中央轻轻地均匀用力划一道痕，换液。显微镜下测量划痕两边的细胞24小时内在5个时间点迁移的绝对位移。结果如图4所示化合物1-曱基-2-氨基对苯二酸盐处理后的细胞的迁移距离明显减少，说明1-曱基-2-氨基对笨二酸盐通过抑制PKC《的表达使癌细胞的迁移能力降低。
实施例5: PKC〈降表达的癌细胞的黏附能力降低。将MDA-MB-2 31细胞胰酶消化后重悬于完全培养液中37度(^02培养箱放置20min,细胞分别用菌SO和l-曱基-2-氨基对苯二酸盐处理lh，每种细胞又分为两組。第一組细胞悬液直接滴到预先包被了fibronectin的盖玻片中央，37。C分别孵育5min， 10min和15min，然后用冷的PBS终止，并简单洗涤两次，用4"/。PFA固定；另一组细胞悬液在滴到玻片之前加入终浓度为10ng/ml的EGF,随后的操作步骤与第一组相同。在显微镜下计数黏附细胞数(200x视野)，每个玻片随机计数5个视野，结果用5个视野的平均数土标准差(Mean士SD)表示。每个实^^至少重复3次。结果如图5和图6所示对照细胞在EGF刺激后的细胞黏附数目约为未受刺激时的3倍多，但PKC《降表达的细胞在EGF刺激前后黏附细胞的数目增加不多。因此用1-曱基-2-氨基对苯二酸盐抑制PKC《的表达使肿瘤细胞的黏附能力下降。实施例6: PKC《降表达的癌细胞的F-act in聚合情况。将MDA-MB-231细胞消化均匀铺于35mm的小dish中培养l8h，用无血清培养基继续培养2h，再分别用l-甲基-2-氨基对苯二酸盐和DMSO溶剂处理1 h。 5 Ong/mLEGF的无血清培养基刺激特定的一段时间后用冷PBS终止反应。PBS洗涤两次后4"/。PFA固定5min， 0. 4。/。的Tritonx-100透^:处理20min，F-actin buffer洗两次；接着每个dish加入荧光染料Phol 1oidin568常温避光》文置lh, F-actin buffer换液洗5次，5min/次；最后每个dish再用甲醇4度萃取lh，之后全部曱醇分别吸入专用酶标板中，酶标仪检测在激发波长578誦，发射波长600nm时的荧光值。而后每个小dish再加入F-actinbuffer洗5次后，进行裂解细胞，煮样，超声，再离心。制得的样品，使用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。荧光信号用总蛋白量进行标准化。每组F-actin的值的计算采用各时间点的焚光值和无刺激时的焚光值的比值。计算公式如下
EGF刺激后的荧光值(A t;/ EGF无刺激时的荧光值对应蛋白定量 / 对应蛋白定量
结果如图7所示低表达PKC;的细胞在EGF刺激后的F-actin聚合明显要少于对照细胞。这说明l-曱基-2-氨基对苯二酸盐通过抑制PKC《的表达而^f吏F-a c t i n的聚合减少。
实施例7:免疫印迹方法确定EGF刺激后癌细胞中cofilin的活化。实验前24h种植MDA-MB-2 31细胞，在无血清培养基中继续培养2h后细胞分别用卜曱基-2-氨基对苯二酸盐和DMSO溶剂处理lh。用含50ng/mi EGF的无血清培养基剌激特定的 一段时间后用冷PBS终止反应。PBS洗涤两次后裂解细胞，煮样，超声，再离心。制得样品后，使用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。根据样品的浓度，取相同的蛋白总量进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将胶上蛋白电转到硝酸纤维素膜上，室温5%脱脂奶粉封闭2小时，简单洗涤后， 一抗(兔抗人P-cofilin多克隆抗体，羊抗人cofilin多克隆抗体)4度摇床过夜，浓度分别为l: 2000和1: 500稀释到1%脱脂奶粉中；抗兔和抗羊的二抗室温孵育l小时，最后用化学发光试剂盒检测。根据曝光后条带的宽窄和深浅判断蛋白的表达量。每个抗体至少通过3次免疫印迹进行检测。如图8所示，EGF可以诱导cofilin发生时间依赖的活化。对照细胞中，30秒时cofilin的活化最明显，但PKC《降表达的细胞对EGF诱导的cofi 1 i n的活化明显减弱。
权利要求
1.1-甲基-2-氨基对苯二酸盐在制备抑制肿瘤转移药物制剂中的应用；a.1-甲基-2-氨基对苯二酸盐有效抑制丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶C及其磷酸化；b.1-甲基-2-氨基对苯二酸盐有效抑制肿瘤细胞的趋化运动和黏附能力；c.1-甲基-2-氨基对苯二酸盐降低乳腺癌细胞的迁移能力和表皮生长因子及其受体诱导的黏附能力，抑制趋化运动所需的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶C和其下游信号分子cofilin的活化。
全文摘要
本发明公开了1-甲基-2-氨基对苯二酸盐的医药用途，属于对转移肿瘤有治疗活性的化合物的应用。1-甲基-2-氨基对苯二酸盐有效抑制丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶及其磷酸化；通过体外细胞功能实验发现它有效抑制肿瘤细胞的趋化运动和黏附能力；降低乳腺癌细胞的迁移能力和EGF诱导的黏附能力，抑制趋化运动所需的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶和其下游信号分子cofilin的活化。从而使现有的小分子化合物1-甲基-2-氨基对苯二酸盐成为具有抑制肿瘤转移的新用途的药物。
文档编号A61K31/196GK101637465SQ200910168828
公开日2010年2月3日 申请日期2009年8月21日 优先权日2008年8月29日
发明者静 吴, 宁 张, 张宝刚, 毅 杨, 郝希山 申请人:天津医科大学附属肿瘤医院