专利名称：一种复方中成药的超高压液相检测方法
一种复方中成药的超高压液相检测方法技术领域
本发明提供了一种复方中成药的超高压液相检测方法，其为采用超高压液相来检 测复方中成药(又称大处方)制剂中有效成分的方法，尤其指含有白芍、人参、丹参、青蒿、 甘草、川芎、当归、黄芪、香附中的两种或两种以上成分的中成药中有效成分的超高压液相 检测方法。
背景技术：
中药复方是中医临床用药的主要形式和手段，方中各味药又含有多种化学成分， 这些固有的化学成分是中药复方发挥药效作用的物质基础，但方中任一活性成分并不能全 面反映中医用药所体现的整体疗效，这是中药复方与化学合成药品在制定质量标准过程中 的根本区别，所以宏观的综合分析成为中药复方发展的必然趋势。中药复方作为中医药的 精髓，已应用了上千年，从现代研究的角度，一个中药复方具有多成分、多作用、多靶点等特 点。在“素问”至真要大论中记载“主病之谓君，佐君之谓臣，应臣之谓使”。随着中药现代 化、国际化的深入发展，迫切需要建立一种对中药和中药复方产品从原料到成品进行质量 控制以及对其复杂成分检出的方法，指纹图谱应运而生。
“指纹”(finger printing)鉴定来源于法医学，每个人的指纹在微小的细节构造 中各有不同。依据这些差异，通过“比对”方式，可以确定鉴别每个人的特征。随着现代生 物技术的发展，出现了 DNA指纹图谱。通过DNA指纹图谱分析，能对人、动物、植物等生物体 进行鉴别鉴定。
植物药在质量控制方面使用指纹图谱(尤其是色谱指纹图谱)起源于20世纪70 年代。当前的中药指纹图谱(fringerprinting)借用DNA指纹图谱发展而来，是一种综合 的、可量化的色谱鉴定手段。最先发展起来的是中药化学成分色谱指纹图谱，而本领域一般 所述的指纹图谱若无特别提示均指的是高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。其是利用HPLC具 有的很高的分离度，把复杂的化学成分进行分离而形成高低不同的峰组成一张色谱图，这 些色谱峰的高度和峰面积分别代表了各种不同化学成分和其含量，和药效研究结果联系就 会产生中药谱效学。但是针对由多种药味组成的、药材涉及面广、化学成分复杂的中成药， 例如同仁乌鸡白凤丸，影响和干扰因素较多，目前普遍利用的HPLC技术建立指纹图谱所需 要的总时间较长，而且分离度难以达到较理想的状况。
超高效液相色谱技术(UPLC)是近年来发展较快的新型液相色谱检测技术，借助 于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术， 增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。
与高效液相色谱技术相比较，超高效液相色谱技术在以下方面得到改善
(1)提高色谱柱的性能，解决小颗粒填料的耐压问题、装填问题，包括颗粒度的分 布以及色谱柱的结构。
(2)采用了高压溶剂输送单元，降低整个系统死体积，解决超高压下的耐压及渗漏 问题。
(3)解决了给流动相、色谱柱迅速升温，降低由于温度梯度导致峰变形的问题。
(4)快速自动进样器，降低进样的交叉污染。
(5)高速检测器、系统控制及数据管理，优化流动池以解决高速检测及扩散问题， 解决高速数据的采集、仪器的控制问题。
UPLC技术最主要的特点体现在色谱柱颗粒度的更新上。色谱柱技术涵盖了如下几 方面的内容首先是填料的合成，以得到高质量的填料颗粒，包括耐高压、耐酸碱等等。其 次是颗粒的筛选，选出颗粒度分布尽可能窄的填料。最后是装填技术，以保证既堵住颗粒不 使其外流，又不至引起反压的大幅升高。
传统色谱柱填料的装填技术受两方面的影响，导致现有小颗粒填料色谱柱的性能 及质量均不能达到要求。首先是其颗粒度分布较宽，例如5μπι颗粒度填料中会有大量的 4 μ m以下及6 μ m以上的颗粒，因此通常用2 μ m筛板在色谱柱的出口拦截填料，阻止其外 漏。其次，如使用低于2 μ m的筛板，筛板的反压升高很快，甚至超过了填料所产生的反压。 因此，目前大多数3. 5 μ m、2. 5 μ m或更低颗粒度的填料还是使用2 μ m的筛板，只在柱头装 填一小段5μπι的填料。
UPLC色谱柱所使用的1. 7μπι填料与传统色谱柱相比内部有更多交联结构，机械 强度有显著提高。为了得到更好的耐压能力及传质作用，同时还优化其孔体积及孔径。UPLC 使用的筛分技术使1. 7 μ m填料分布很窄，同时运用新筛板，使色谱柱的性能有极大提高。 与HPLC相比，UPLC具有超强分离能力和速度、超高灵敏度、简单方便的方法转换及良好的 质谱入口。
超高效液相色谱UPLC具有超强分离能力和速度、超高灵敏度的特点，将此技术引 入指纹图谱中，大大缩短分析周期，提高分离度，同时分离出更多有效成分色谱峰，达到事 半功倍的效果。上述的超高压液相的特点显示了其在检测复杂成分时的独有的优势。
很多中成药是由多种药味组成的，如同仁乌鸡白凤丸由十九味药材组成，药材涉 及面广，化学成分复杂，仅靠其几个药材或活性成分作为其质量控制指标，难以全面控制药 品的内在质量状况，更不能对其真伪优劣做出判断。影响薄层鉴别的干扰因素较多，相应各 药材阴性样品多有干扰。目前利用HPLC技术建立指纹图谱所需要总时间普遍较长，且分离 度难达到较理想的状况。
研究并建立采用超高效液相色谱技术UPLC对同仁乌鸡白凤丸主要原料药材、中 间体和成品质量进行生产过程控制的方法，有利于提高产品内在质量的均一性、稳定性并 缩短生产和检验周期。本发明试图运用UPLC超高效液相技术建立同仁乌鸡白凤丸提取物 指纹图谱将更加快速、高效、高灵敏度地指认各味有效成分，有利于基础物质研究。利用建 立超高压液相的色谱指纹图谱来控制其质量比薄层鉴别、含量测定等常规标准更加全面客 观。发明内容
针对现有技术在中药成分检测方面存在的缺陷。发明人经过大量的实验，研究了 一种中药制剂中同时鉴别处方多种药材的检测方法，结果证明，与传统的薄层色谱鉴别方 法以及目前普遍应用的HPLC相比，本发明的方法避免现有薄层方法需要采用不同的前处 理方法制备供试品溶液和对照药材溶液后，再采用不同的展开剂系统分别实验的缺点，与HPLC相比又大大缩短分析周期，提高分离度，同时分离出更多有效成分色谱峰，鉴定结果更 客观准确。
本发明的贡献在于发明人将超高压液相指纹图谱应用于大处方的中药制剂质量 的整体分析与评价。以同仁乌鸡白凤丸为例，采用UPLC方法建立同仁乌鸡白凤丸制剂指纹 图谱，以对照药材色谱作为对照进行处方药材的鉴定，为中药指纹图谱分析和大处方药材 的质量控制提供新的思路。
本发明目的是提供一种含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中 至少两种的中成药的超高压液相检测方法，通过该方法可得到准确的检测结果，避免其他 杂质干扰，达到事半功倍效果，鉴定结果更客观难确。
本发明提供一种复方中成药的超高压液相检测方法，该复方中成药含有白芍、人 参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种药材或药材成分，该检测方法包 括
(1).供试品溶液的制备，称取供试品，加入相当于供试品5-10倍量的甲醇，溶解， 滤过，滤液回收溶剂并浓缩至干，残渣加与上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通过大孔树脂 吸附柱，以上述甲醇量的2-10倍的水洗脱，弃去水液，再用15-45% wt的与上述甲醇等量的 乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用75-95% wt的为上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脱，收集洗脱液， 蒸干，残渣用甲醇溶解并移至量瓶，加甲醇至刻度，过微孔滤膜，取续滤液，制成供试品的溶 液，所述供试品溶液的浓度为每ml相当于供试品0. I-IOg ；
(2).对照药材溶液的制备，取白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪和香 附中至少两种对照药材，按供试品溶液的制备制成对照药材溶液；
(3).超高压液相的色谱条件，以水为流动相A，乙腈为流动相B，用不同重量比例 的A与B混合，梯度洗脱；
(4).测定，吸取上述供试品和对照药材溶液各2 μ L，注入超高压液相色谱仪，测 定；
(5).结果检测，在供试品的色谱中，在与对照药材的色谱相同保留时间的位置上， 检视是否分别有相应的色谱峰。
本发明的检测方法采用样品先经过前处理再用超高效液相色谱的检测方法，改变 了通常对液相色谱中含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种药 材的样品处理方法，成功地消除了中成药制剂中待测成分以外的液相图谱中的杂峰，本发 明改善了 HPLC需要的时间普遍比较长、且分离度难以达到较理想的状况，使本发明采用超 高压液相得到的检测结果更精确稳定。为了辅助对照药材的对照效果，在本发明的优选实 施例中，所述的超高压液相检测方法还包括增加一个制备对照品溶液的步骤，对照品溶液 的制备包括分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rf、丹参酮ΙΙΑ、黄芪甲苷、芒柄 花素中至少两种与所述中成药中成分相对应的对照品，加甲醇，过微孔滤膜，取续滤液，得 到对照品溶液；相应地，在测定步骤中增加吸取对照品溶液2 μ L注入UPLC并测定的步骤； 以及在供试品色谱中，与对照品和对照药材的色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别 有相应的色谱峰。
在本发明所述的超高压液相检测方法中，所采用的检测器为紫外检测器和/或质 谱检测器。当所述的对照药材选自白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归中至少一种时，检测方法采用紫外检测器，检测波长为201-320nm ；所述的对照药材选自黄芪和/或香附 时，检测方法采用质谱检测器。
相应地，对照药材选自白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归中至少一种时，相 应的对照品选自芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rf、丹参酮II A中与上述对照药 材相对应的至少一种，该检测方法采用紫外检测器，检测波长为201-320nm ；对照药材选自 黄芪和/或香附，则相对应的对照品选自黄芪甲苷和/或芒柄花素，该检测方法采用质谱检 测器。
综上所述，本发明提供一种复方中成药的超高压液相检测方法，其为一种含白芍、 人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种成分的复方中成药的超高压液相 的检测方法，该检测方法优选包括
(1).供试品溶液的制备称取供试品，加入相当于供试品5-10倍量的甲醇，溶解， 滤过，滤液回收溶剂并浓缩至干，残渣加与上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通过大孔树脂 吸附柱，以上述甲醇量的2-10倍的水洗脱，弃水液，再用15-45% wt的与上述甲醇等量的乙 醇洗脱，弃去洗脱液，继用75-95% wt的为上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脱，收集洗脱液， 蒸干，残渣用甲醇溶解并移至量瓶，加甲醇至刻度，过微孔滤膜，取续滤液，制成供试品的溶 液；
(2).对照品溶液的制备分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rf、丹参 酮II A、黄芪甲苷、芒柄花素中至少两种与所述中成药中成分相对应的对照品，加甲醇，过 微孔滤膜，取续滤液，得对照品的溶液；
上述“芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素 中至少两种与所述中成药中成分相对应的对照品”是指针对本发明含有白芍、人参、丹参、 青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中两种或两种以上药材成分的中成药，选择与该中成药 所含药材成分相对应的对照品。
上述的对照品取适量即可，所述的适量是指芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb1、人参 皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素对照品加入甲醇后，制得的对照品溶液的浓度 在0. 01-0. 2mg/mL的范围内。例如加甲醇制成的对照品的溶液中，每ImL分别含芍药苷 0. 06mg/mL、甘草苷 0. 02mg/mL、人参皂苷 Rb1O. 2mg/mL、丹参酮 II A 0. 016mg/mL、人参皂苷 Rf 0. ang/mL、黄芪甲苷 0. ang/mL、芒柄花素 0. 02mg/mL。
(3)对照药材溶液的制备分别白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川弯、当归、黄芪、香 附中至少两种对照药材(与所测定的中成药所含有的成分相对应)，按供试品溶液制备方 法制成对照药材溶液；
(4).超高压液相的色谱条件，以水为流动相A，以乙腈为流动相B，按照不同比例 的A B洗脱；
本发明的检测方法采用紫外检测和/或质谱检测。其中紫外检测的波长选为 201-320nm，优选20H90nm，更优选约203nm和^Onm两个波长下检测；紫外检测器不能检 测所有的成分，当检测波长在201-205nm，紫外检测器可以检测白芍、人参、甘草、青蒿，当检 测波长在255j90nm，紫外检测器可以检测丹参、川芎、当归；而质谱检测器几乎可以检测 所有成分，因此，在本发明中，所采用的质谱检测器除检测上述紫外检测的药材外，还可检 测黄芪和香附。
(5).测定，吸取上述供试品溶液、对照品溶液和对照药材溶液各2 μ L，注入超高 压液相色谱仪，测定；
(6).结果检测，在供试品的色谱中，在与对照品和对照药材色谱相同保留时间的 位置上，检视是否分别有相应的色谱峰。
上述步骤(1)中过滤用的微孔滤膜优选为孔径小于0.45 μ m的微孔滤膜，例如 0. 1 0. 45 μ m的微孔滤膜，更优选0. 2 0. 4 μ m，例如0. 22 μ m、0. 35 μ m。
上述一种含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种成分 的复方中成药的超高压液相的检测方法，具体步骤包括
1.供试品的溶液的制备精密称取供试品(例如6g)，加入相当于供试品5-10倍 量的甲醇(优选相对于6g供试品，甲醇量为约50mL)，溶解，优选超声处理(功率300W，频 率50kHz) 30分钟，滤过，滤液回收溶剂并浓缩至干，残渣加与上述甲醇等量的水使溶解，放 冷，通过DlOl型大孔树脂吸附柱(装柱的树脂约60g，内径2cm，长12cm)，以大约是上述甲 醇量的2-10倍的水(优选5-7倍于甲醇，例如甲醇量约50mL，则水大约300mL)洗脱，弃去 水液，再用15-45% wt (优选30% wt)的与上述甲醇等量的乙醇(例如300mL)洗脱，弃去洗 脱液，继用75-95% wt (优选80% wt)的约为上述甲醇量的2-6倍的(优选3_5倍于甲醇) 乙醇(例如甲醇量约50mL，则该乙醇大约200mL)洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解 并转移至量瓶中(例如供试品为6g，则优选量瓶为5mL，加甲醇至刻度，过微孔滤膜(优选 0. 2-0. 3 μ m的微孔滤膜)，取续滤液，制成供试品溶液；
2.对照品溶液的制备分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rf、丹参酮 II A、黄芪甲苷、芒柄花素中至少两种对照品(与所测定的中成药所含有的成分相对应)， 加甲醇制成对照品溶液，对照品溶液的浓度为0. 01-0. ang/mL，过微孔滤膜，取续滤液，得对 照品的溶液；
3.对照药材溶液的制备分别取白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川弯、当归、黄芪、 香附中至少两种对照药材(与所测定的中成药所含有的成分相对应)，按供试品溶液制备 方法制成对照药材溶液；
4.色谱条件色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，优选 WatersACQUITY UPLC BEH Cw柱，规格2. 1_X 50_，优选填充剂的粒径约为1. 7 μ m ；以水 为流动相A，乙腈为流动相B，按照下表1的A :B的不同比例进行梯度洗脱；即以水为流动 相A，以乙腈为流动相B，按照由100% WtA依次减少A的量增加B的量直至100% wt的B 的次序进行梯度洗脱；洗脱时间一般在60分钟即可，超过60分钟也可；紫外检测的检测波 长201-320nm，优选20H90nm，更优选203480nm，例如检测波长203nm(当中成药含有并需 检测白芍、人参、甘草和/或青蒿时)，当中成药含有并需检测丹参、川芎和/或当归 时)；也可同时采用质谱检测。
表1 UPLC流动相梯度
权利要求
1.一种复方中成药的超高压液相检测方法，该复方中成药含有白芍、人参、丹参、青蒿、 甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种药材或药材成分，该检测方法包括(1).供试品溶液的制备，称取供试品，加入相当于供试品5-10倍量的甲醇，溶解，滤 过，滤液回收溶剂并浓缩至干，残渣加与上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通过大孔树脂吸 附柱，以上述甲醇量的2-10倍的水洗脱，弃去水液，再用15-45%wt的与上述甲醇等量的乙 醇洗脱，弃去洗脱液，继用75-95% wt的为上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脱，收集洗脱液， 蒸干，残渣用甲醇溶解并移至量瓶，加甲醇至刻度，过微孔滤膜，取续滤液，制成供试品的溶 液，所述供试品溶液的浓度为每ml相当于供试品0. I-IOg ；(2).对照药材溶液的制备，分别白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川弯、当归、黄芪和香附 中至少两种对照药材，按供试品溶液的制备的方法制成对照药材溶液；(3).超高压液相的色谱条件，以水为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱；(4).测定，吸取上述供试品和对照药材溶液各2μ L，注入超高压液相色谱仪，测定；(5).结果检测，在供试品的色谱中，在与对照药材的色谱相同保留时间的位置上，检视 是否分别有相应的色谱峰。
2.如权利要求1所述的超高压液相检测方法，其中，所述的检测方法还包括增加对照 品溶液的制备的步骤；该对照品溶液的制备包括分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb1、人 参皂苷Rf、丹参酮ΙΙΑ、黄芪甲苷、芒柄花素中至少两种与所述中成药中成分相对应的对照 品，加甲醇，过微孔滤膜，取续滤液，得到对照品溶液；在所述的步骤(4)中增加吸取对照品 溶液2μ L注入超高压液相色谱仪并测定的步骤；以及，所述步骤( 为在供试品的色谱中， 在与对照品和对照药材的色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰。
3.如权利要求1所述的超高压液相检测方法，其中，所述的步骤(2)中对照药材选自白 芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归中至少一种，该检测方法采用紫外检测器，检测波长 为201-320nm ；所述的步骤O)中对照药材选自黄芪和/或香附，该检测方法采用质谱检测ο
4.如权利要求2所述的超高压液相检测方法，其中，对照药材选自白芍、人参、丹参、青 蒿、甘草、川弯、当归中至少一种时，对照品选自芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rf、 丹参酮IIA中与上述对照药材相对应的至少一种，该检测方法采用紫外检测器，检测波长 为201-320nm ；对照药材选自黄芪和/或香附，对照品选自黄芪甲苷和/或芒柄花素，该检 测方法采用质谱检测器。
5.如权利要求1所述的超高压液相检测方法，其中，步骤(3)所述的流动相为以水为流 动相A，以乙腈为流动相B，按照由100% wt的A依次减少A的量增加B的量直至100% wt 的B的次序进行梯度洗脱。
6.如权利要求1所述的超高压液相检测方法，其中，该检测方法中所采用的微孔滤膜 为孔径小于0. 45 μ m的微孔滤膜。
7.如权利要求2所述的超高压液相检测方法，其为含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川 芎、当归、黄芪和香附的复方中成药的超高压液相检测方法，其包括制备对照品溶液，为用 甲醇制成每ImL分别含芍药苷0. 06mg/mL、甘草苷0. 02mg/mL、人参皂苷Rb1O. ang/mL、丹参 酮II A 0. 016mg/mL、黄芪甲苷RblO. ang/mL、芒柄花素0. 02mg/mL的溶液作为对照品溶液； 按照所述的供试品溶液的制备方法制备白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪和香附的对照药材溶液，将对照品溶液和对照药材溶液进行所述步骤(3)和(4)的检测，得到对 照品和对照药材的指纹图谱，然后在所述步骤(5)中，在供试品的色谱中，在与对照药材和 对照品色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰。
8.如权利要求7所述的超高压液相检测方法，其中，所述的超高压液相色谱仪是以 十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂；以水为流动相A，以乙腈为流动相B。
9.如权利要求8所述的超高压液相检测方法，其中，该检测方法采用紫外检测器和/或 质谱检测器；所述的紫外检测器的检测波长在201-205nm下检测白芍、人参、甘草、青蒿，检 测波长在255j90nm检测丹参、川芎、当归。
10.如权利要求1-9任一项所述的超高压液相检测方法，其中，所检测的复方中成药包 括乌鸡白凤丸和/或含有乌鸡白凤丸的中药组方的中药制剂；所述的含有乌鸡白凤丸的中 药组方的中药制剂包括乌鸡白凤丸的水蜜丸、乌鸡白凤丸的水丸、乌鸡白凤胶囊和/或乌 鸡白凤口服液。
全文摘要
本发明提供了一种含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种药材的中成药的超高压液相检测方法，包括制备供试品溶液、对照品药材溶液，以乙腈∶水作为流动相，紫外检测器和/或质谱检测器，检测波长为201-320nm，进行UPLC的测定；结果检测是在供试品的色谱中，在与对照药材色谱相同保留时间的位置上，检视是否有相应的色谱峰；本发明的检测方法与薄层鉴别以及HPLC检测方法相比，成功地提高了色谱图的分辨率，缩短了分析周期，结果更精确稳定。
文档编号A61K36/258GK102028840SQ20091017452
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月28日 优先权日2009年9月28日
发明者李志猛, 林瑞超, 王钢力, 聂黎行, 陈佳 申请人:中国药品生物制品检定所