专利名称：：抑制BCL11B表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种siRNA，特别涉及一种抑制BCL11B表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434及应用。
背景技术：
：血液肿瘤是发病率较高的恶性肿瘤之一，每年全国约有IO万初发病人，严重危害人们、尤其是青少年的健康，T细胞肿瘤是血液肿瘤的一种主要类型，主要由于T细胞恶性克隆增殖而形成，包括多种类型的T细胞白血病和淋巴瘤，多数恶性程度高，治疗效果差，预后不良。临床治疗上一直存在难治疗、耐药和易复发等难题，因此寻找更有效和特异的治疗方案一直是研究者的一个重要目标。随着对肿瘤细胞的分子特点的逐渐明确，不断发现肿瘤T细胞特异的分子，设计和研制有效的靶向治疗药物，成为提高T细胞肿瘤治疗效果的一个重要手段。BCL11B(B细胞淋巴瘤/白血病11B)基因是近期发现的一个BCL家族的新成员，在T细胞发育、分化和增殖中发挥重要的调节作用。BCL11B表达异常、基因突变及基因断裂和重排与T细胞肿瘤发生有一定关系，在T细胞——急性淋巴细胞白血病(T-ALL)中，多见涉及BCL11B基因位点的一些染色体异位，引起了其表达水平在白血病T细胞中明显升高。近年来，利用RNA干扰技术，将化学合成的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)转导至特定的细胞，沉默相关基因的表达，是研究基因功能最有效的手段之一，也是靶向基因治疗最有吸引力的方法之一。选择特异性的靶基因合成有效的siRNA，并且选择合适转染方式，使其在宿主细胞中高效作用，是实施这一靶向治疗措施的重点。有效的靶向治疗是目前国内外不断在寻找的辅助治疗方法，靶向针对BCL11B基因的siRNA序列对于开发新的抗T细胞肿瘤基因药物和提高T细胞肿瘤的治疗效果有重要的意义，具有很大的应用前景和经济价值。
发明内容本发明的首要目的在于提供一种能高效地抑制BCL11B表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434。本发明的另一目的在于提供上述siRNA-434的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种抑制BCL1IB表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434，序列如下所示正义链5，-UCACCUGUGGCCAGUGUCAAAUGAA-3'反义链5，-UUCAUUUGACACUGGCCACAGGUGA-3，。所述抑制BCL11B表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434应用于抑制BCL11B基因的表达。所述抑制BCL11B表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434应用于制备治疗T细胞肿瘤的药物。所述T细胞肿瘤为T细胞白血病。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果1、本发明的抑制BCL1IB表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434能高效抑制BCLllB基因的表达，mRNA的下调程度达到26倍，蛋白表达的抑制率达到41.73%，如图4和图5所示。2、本发明的抑制BCLllB表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434能有效抑制肿瘤性T细胞的增殖，如图6所示。3、本发明的siRNA-434序列对于开发新的抗T细胞肿瘤基因药物和提高T细胞肿瘤的治疗效果有重要的意义，其具有很大的应用前景和经济价值。图1是实施例1中通过荧光显微镜光观察Molt-4细胞转染效率图，其中A为转染AlexaRedOligo白光图(200X);B为转染AlexaRedOligo荧光图(200X);C为对照组白光图(200X);D为对照组荧光图(200X)。图2是实施例1中通过流式细胞仪检测Molt-4细胞转染效率图，其中A为转染AlexaRedOligo的散点图；B为转染AlexaRedOligo的柱形图；C为对照组的散点图；D为对照组的柱形图。图3是实施例2确定实时定量PCR条件的效果图，其中A是内参基因|32m标准品扩增图；B是目的基因BCL1IB标准品扩增图。图4是实施例2的实验组和对照组的实时定量PCR结果图。图5是实施例2的实验组和对照组的WesternBlot图，其中A为48h后BCLllB蛋白水平变化图；B为72h后BCLllB蛋白水平变化图。图6是通过A皿exinV/PI双染流式细胞图仪得到的实验组和对照组的凋亡图。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1siRNA的合成和转染T淋巴细胞白血病细胞株(Molt-4)(购自中科院上海细胞所)细胞条件的稳定，具体步骤如下(1)设计和得到siRNA在GenBank(http:〃blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)里查找B(X11B基因序歹lj(ACCESSIONNM_138576)，然后根据Invitrogen公司(www.invitrogen.com)4提供的StealthTMRNAi设计法则，在线设计针对BCL11B的siRNA。本发明所涉及的抑制BCLlIB表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434是从BCLlIB基因序列434bp开始的25ntsiRNA，其正义链序列为5，-UCACCUGUGGCCAGUGUCAAAUGAA-3，；反义链序列为5'-UUCAUUUGACACUGGCCACAGGUGA-3'。同时设计与目的基因序列无同源性的non-silencingscrambledcontrol(SC)对照25ntsiRNA，其正义链序列为5，-CCAAAGGACGAGAGCAGGUUCAUAA-3，；反义链序列为5，-UUAUGAACCUGCUCUCGUCCUUUGG-3，。上述siRNA均由美国Invitrogen公司化学合成。(2)准备处于对数生长期的Molt-4细胞将Molt-4细胞接种于含体积分数10%新生牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在含体积百分数5%C02的培养箱37t:连续培养，23天传代一次，得到处于对数生长期的Molt-4细胞。(3)测试Molt-4细胞的转染效率A、收集2.5X1()6个步骤(2)制备的处于对数生长期的Molt_4细胞，200g离心10min，完全去除上清；B、用100ii1预热至室温的NucleofectorSolution和Supplement混合液(Amaxa，德国)悬浮细胞；C、加入lOOnMAlexaRedOligo(Invitrogen,美国)，混匀后加入核转杯(Amaxa，德国)，启动Molt-4特异性程序C-005，同时设置对照组，为与转染AlexaRedOligo的步骤相同，但是没有加入AlexaRedOligo;D、程序完成后立刻用核转染试剂盒(Amaxa，德国)里配套的移液器将转染后的细胞液接种于培养瓶中，终体积为5ml;E、放入培养箱10小时后利用荧光显微镜和流式细胞仪检测荧光值，分析转染效率。通过荧光显微镜和流式细胞仪检测的结果分别如图1和图2(其中图2的A和B图中P3和P2分别是散点图和柱形图的阳性细胞，而C和D图是细胞对照的本底。)所示，可见通过上述转染方法的转染效率稳定在39.98±5.47%。实施例2将siRNA-434转染Molt-4细胞后，检测BCL11B基因在mRNA和蛋白水平的表达，明确其干扰效应。(1)实验分组实验组为转染siRNA-434，对照组分别为无关序列对照组(SC)、转染条件对照组(MOCK)和空白对照组(NC)，实验方法同实施例1步骤(2)，各组的siRNA量均为3i!g。转染条件对照组是除了不加siRNA，其余处理条件同实验组，空白对照组是没有任何处理的细胞。(2)荧光实时定量PCR检测分别收集各组转染后24h、48h和72h的细胞，按常规方法提取RNA合成cDNA。荧光实时定量PCR总反应体积为25y1，包括dATP、dCTP和dGTP各O.lmmol/L，dUTP0.2mmol/L，0.75UAmpliTaqGold聚合酶，O.25U尿嘧啶糖基酶(UNG)，1XPCR缓冲液，4.5,l/LMgCl2，以及O.5iimol/L上、下游引物，0.1iimol/L的6FAM-TAMRA探针和2iUcDNA或标准品。应用于荧光实时定量PCR的引物和探针具体序列见表1。在50°C、2min，95°C、5min变性后，共进行45循环扩增，每一循环包括95°C、15s和64°C、lmin。根据样本中的！^m拷贝数，计算100000个！^m拷贝中所含BCLllB拷贝数。计算公式为n=100000XBCL1IB/P2m。P2m和BCLllB标准品扩增曲线图见图3，两条曲线均拟合良好，相关系数分别为0.998和0.999。继续分析各实验组BCLllB拷贝数，结果显示，转染后24h、48h和72h，与各对照组相比，siRNA-434组BCLllB的mRNA表达水平均明显下调，下调倍数约为26倍不等(表2，图4)。表1应用于实时定量PCR的引物和探针序列引物和探针序列功能5'-CACCCCCGACGAAGATGACCAC-3'上游引物5'-CGGCCCGGGCTCCAGGTAGATG-3'下游引物5'-6FAM-TCACCCACGAAAGGCATCTGTCCCAAGCA-TAMRA-3'探针5'-CTCGCGCTACTCTCTCTTTCT-3'上游引物5'-TACATGTCTCGATCCCACTTAACTAT-3'下游引物5'-6FAM-CTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCA—TAMRA-3'探针表2:实时定量PCR检测转染后BCL11B基因mRNA水平变化(BCL11Bcipies/105P2mcopies)组^\24h48h72hsiRNA-434313.77±91.9278.62±19.2388.73±40.42SC18.08±59.75144.48±28.81221.90±31.88MOCK358.50±3楊129.03±19.23411.24±338.48NC508.63±123.55508.63±123.55508.63±123.55(3)蛋白水平检测分别收集转染后48h和72h的细胞，应用蛋白裂解液试剂盒，提取总蛋白，WesternblotECL发光法及Imagequantition灰度分析软件检测、分析转染后各组BCLllB蛋白水平的表达情况。具体方法如下A、收集各组不同时间段的细胞，数目为1Xl(f个，用RIPA蛋白提取试剂盒(申能博彩，上海)提取总蛋白；B、SDS-PAGE电泳将各组样品按常规方法定量并变性后加样于10%的SDS-PAGE胶中(每孔加样量约为30iig)，恒压60V30min后改为80V45min;C、转膜将切好的NC膜(Invitrogen，美国)和脱脂棉预先泡在转膜液中1530min，用半干转仪(Bio-Rad，美国)按照安全盖+电转盖+脱脂棉+SDS-PAGE胶+NC膜+脱脂棉+电机板的顺序从上向下排列，恒压15V15min;D、封膜用3X的BlockingReagent(封闭试剂)封膜lh后用WashingBuffer(洗涤缓冲液)洗涤2次，每次5min;E、一抗、二抗的孵育将NC膜按所需要的蛋白分子量大小(!3-actin为42kD，BCLlIB蛋白为96kD)和预染Marker的位置剪成两条，分别放入1:500的小鼠抗人|3-actin—抗(武汉博士德公司)和1:5000的兔抗人BCLlIB—抗(Bethyl，美国)4°C过夜，或37°Clh后用WashingBuffer洗涤3次，每次5min。再分别放入1:500的羊抗小鼠和羊抗兔二抗(eBioscience，美国)37t:孵育lh，用WashingBuffer洗涤3次，每次5min;F、ECL显色通过ECL显色试剂盒(碧云天，上海)显色，经显影、定影后观察内参P-actin和目的蛋白BCL11B的表达量，根据实验结果调整曝光时间。最后通过Imagequantition灰度分析软件检测、分析转染后各组BCL11B蛋白水平的表达情况。Westernblot结果(见图5)显示，与各对照组相比，转染后48h、72h，siRNA-434组BCL11B蛋白水平表达均明显下调，其中以72h作用较好，与SC组相比，抑制率达到了41.73%即本发明提供的抑制BCL11B表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA_434能有效下调Molt-4细胞中BCL11B基因的表达。实施例3此实施例表明了siRNA-434下调Molt-4细胞BCLllB表达后所产生的生物学效应。包括形态学变化、细胞增殖和凋亡和周期的变化等。(1)形态学变化各组取约1X104细胞，按常规方法进行Hoechst33258(碧云天，上海)，核染色，染色后用荧光显微镜观察细胞形态。结果显示siRNA-434组细胞呈明显的凋亡细胞状态，细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白，而其余各对照组细胞核呈正常的蓝色。(2)CCK-8法检测细胞增殖情况转染结束立即取各组细胞约1X104个，每组平行取3孔，放入培养箱中72h后加入10iU的CCK-8溶液(同仁化学研究所，日本)，再37°C孵育lh，于450nm处检测各组0D值，计算抑制率。结果显示，与各对照组相比，siRNA-434组可以明显抑制细胞的增殖(表3)。表3:CCK-8法检测转染72h后对Molt_4细胞增殖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*:P<0.05siRNA-434VS其余各组(3)流式细胞仪检测细胞凋亡情况转染72h后取各组细胞约lX10s个，用预冷的PBS洗涤细胞2次，1ml结合缓冲液洗细胞2次，离心去上清，加入200y1结合缓冲液，重悬细胞后，分别加入10ylA皿exinV和5PI溶液，轻轻混匀，避光反应30min，立即上机检测，Winmdi软件分析结果。结果显示，与各对照组相比，siRNA-434组细胞早期和中晚期凋亡均有增加(图6)。(4)流式细胞仪检测细胞周期变化情况转染72h后取各组细胞约1X105个，用4t:预冷的70%乙醇固定24h，随后用PBS洗涤细胞，去除固定液，加lg/L的RNaseA200y1，100mg/L的碘化丙锭800ill，置4t:冰箱内，30min后在流式细胞仪测定DNA含量的变化。结果显示，与各对照组相比，siRNA-434组细胞未见明显细胞周期变化(表4)。此结果说明了抑制BCLllB基因的表达对Molt-4细胞周期没有影响，提示本发明的siRNA-434主要是通过促进细胞凋亡，而非调节肿瘤细胞的周期，将其生长增殖阻滞在某一阶段，从而发挥抗白血病细胞的生物学效应。表4:流式细胞仪检测各组细胞周期情况组别^^^、G1/G0%_(G2+M)%_S%~~siRNA-43456.45±16.901.40±0.4242.15±17,32SC48.75±5.160.80±1.1350.45±6.29MOCK50.45±8.133.60±4.5345.90±12.73NC47息3.393.60±1.8448.85±1.63上述实验结果说明了本发明提供的抑制BCLllB表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434具有明显的抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的功能。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING〈110〉暨南大学〈120〉抑制BCLllB表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434及应用〈130>1〈160>4〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>25〈212>RNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223>siRNA-434的正义链〈400>1ucaccuguggccaguguc朋aug朋25〈210>2〈211>25〈212>RNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223>siRNA-434的反义链〈400>2皿c3皿ugac3cuggccac3gguga25〈210>38〈211>25〈212>RNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223>SC组的siRNA的正义链〈400>3cca朋gg3Cgagagc3gguucfiima〈210>4〈211>25〈212>RNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223>SC组的siRNA的反义链〈400>4uimugaaccugcucucguccuuugg权利要求一种抑制BCL11B表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434，其特征在于所述siRNA-434序列如下正义链5’-UCACCUGUGGCCAGUGUCAAAUGAA-3’反义链5’-UUCAUUUGACACUGGCCACAGGUGA-3’。2.权利要求1所述抑制BCLlIB表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434的应用，其特征在于所述siRNA-434用于抑制BCLllB基因的表达或用于制备治疗T细胞肿瘤的药物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述T细胞肿瘤为T细胞白血病。全文摘要本发明公开了一种能高效地抑制BCL11B表达和肿瘤性T细胞增殖的siRNA-434及应用。所述的siRNA-434序列为正义链5’-UCACCUGUGGCCAGUGUCAAAUGAA-3’；反义链5’-UUCAUUUGACACUGGCCACAGGUGA-3’。所述的siRNA-434能高效抑制BCL11B基因的表达，mRNA的下调程度达到2～6倍，蛋白表达的抑制率达到41.73％，同时所述的siRNA-434能有效抑制肿瘤性T细胞的增殖。本发明所述的siRNA-434对于开发新的抗T细胞肿瘤基因药物和提高T细胞肿瘤的治疗效果有重要的意义，具有很大的应用前景和经济价值。文档编号A61K48/00GK101696412SQ200910193249公开日2010年4月21日申请日期2009年10月23日优先权日2009年10月23日发明者李扬秋,杨力建,陈少华,陈思,黄欣申请人:暨南大学;