改进的螯合剂缀合物的制作方法

专利名称：：改进的螯合剂缀合物的制作方法
技术领域：
：WO95/19187中公开了线性或环状的3-50聚体的合成肽与连接在肽羧基末端上的多齿螯合剂的缀合物，其可用作放射性药物。将PnAO、BnAO、和PentAO等二胺二肟称作适宜的螯合剂。WO99/60018中公开了用于血栓造影的二胺二將配位体与肽的二胺二肟螯合物缀合物。声称优选的这类螯合剂是具有Q=-(CH2)2NR(CH2)2-的二胺二將。本发明WO99/60018的二胺二肟-肽螯合剂缀合物是化学式I:Y然而它确实具有一些明显的缺点。因此在与99mTc螯合时，这种氮杂-二胺二肝生成几种可以用色语法分离和检测的锝化合物。在环境温度下，原始放射性标记的化合物(中间体)会随时间(2-3h)转化成稳定的产物。采用较高的pH(>pH8)和加热，可以促进这种中间体产物的转化。在医院放射药物学上这些条件是不理想的，因此需要具有较少中间体和/或较快中间体一产物转化速率的螯合剂。显然不希望要求加热和使用可能较高的pH,使所需的"mTc螯合物达到足够的放射化学纯度(RCP)，因为这类加热可以分解所连接的生物靶向分子或肽。化学式I的氮杂二胺二肟螯合剂的另一个问题，是桥头位置的叔胺氮碱性较强。这意味着在水溶液中生成相应的,Tc络合物时，至少有一部分叔胺发生质子化，结果使缀合物带上电荷。该电荷可以限制所标记的生物靶向部分的用途，因为该电荷可以使;改射性标记的缀合物更难穿过细胞膜。本发明提供另一种螯合剂体系(化学式I，式中丁=0,该体系克服化学式i式中T=N，Y=-0€2012顺-[肽]，了现有技术的这些问题，并提供一些能用放射性标记的缀合物，以便在室温和水溶液条件下，在接近中性的pH时获得优良的RCP。放射性金属络合物的稳定性是优良的。现有技术N2S2和N3S含硫醇双官能螯合剂具有一些缺点，硫醇对空气敏感，在中性到碱性条件下，在空气中能迅速氧化成相应的二硫化物。因此在使用前它们必须保存在惰性气氛中或保存在保护性基质中。采用另一种方法，可以把它们用作被保护的物质，例如疏代乙酸酯或四氢吡喃基半酮缩硫醇，但这些化合物必需在使用前用酸或碱并加热除去保护基。与本发明的螯合剂相比，所有这些特性都降低了这些螯合剂的方便性。因此，本发明的螯合剂适合范围广泛的生物耙向部分的缀合和》丈射性标记。发明详述在第一个方面，本发明提供具有生物靶向部分的二胺二將配位体螯合剂缀合物。术语"螯合剂缀合物，，，系指其中的金属螯合剂是以共价键与生物靶向部分结合的('缀合的，)化合物。所述螯合剂缀合物是化学式II的化合物R<l丄R1，化学式n式中R1、R2、和R3各自分别是R基；Y是-(A)n-X画Z式中X是-NR4-、-C02-、-N(C=S)-、-S(CO)-、-S-、或-O-;Z是生物靶向部分，R"虫立是R基；-(A)n-是连接基团，其中每个A独立是-CR2-、-CR=CR-、Nlo國C三C画、-NRCO-、-CONR隱、-S02NR-、-NRSOr、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4—8亚环杂烷基、C4—8亚环烷基、Cw2亚芳基、C3_12亚杂芳基或聚烷撑二醇、聚乳酸或聚乙醇酸部分；n是0—IO的整数值；每个R基独立是H或CwQ烷基、Cwo烷芳基、C2.u)烷氧烷基、d.K)羟烷基、C,.u)氟代烷基，或者2个或更多个R基与连接它们的原子一起形成饱和或不饱和的碳环、杂环。所谓术语"生物靶向部分"，系指3—100聚体的肽或肽类似物，它们可以是线性肽或环状肽，或它们的组合；单克隆抗体或其片段；或酶底物或抑制剂；合成受体结合化合物；寡核苷酸，或寡-DNA或寡-RNA片段。生物靶向部分可以是合成或天然来源的，但优选是合成的。优选的生物耙向部分是3—20聚体的肽，它们可以是合成或天然来源的，但优选是合成的。所谓术语"环状肽"，系指5—15个氨基酸的序列，其中二个末端氨基酸通过共价键结合起来的，共价键可以是肽键或二硫键或合成的非肽键，例如硫醚键、磷酸二酯键、二硅氧烷键或尿烷^t。所谓术语"氨基酸"，系指L-氨基酸或D-氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸模拟物(aminoacidmimetic)，它们可以是天然产生的，或者是纯合成来源的，可以是旋光纯的，即单对映体，因而是手性的，或对映体的混合物。本发明的氨基酸优选是旋光纯的。所谓术语"氨基酸模拟物"，系指天然存在的氨基酸的合成类似物，它们是电子等排物，即已经设计用来模拟天然化合物的空间和电子结构。对本领域的技术人员而言，这些电子等排物是众所周知的，它们包括但不限于酯肽(depsipeptides)、retro-inverso肽、碌L代酰胺、环烷、或1,5-二取代的四唑[参见M.Goodman,生物聚合物(Biopolymers)，24，137，(1985)]。适合本发明使用的肽包括一促生长素抑制素、抑生长肽(octreotide)、和类似物，—与ST受体结合的肽，其中ST系指由大肠杆菌和其它微生物产生的热稳定毒素；一层粘连蛋白片段，例如YIGSR、PDSGR、IKVAV、LRE和KCQAGTFALRGDPQG，—N-甲酰肽，用于靶向白细胞聚集的部位，一血小板因子4(PF4)及其片段，一包含RGD的肽，一Ct2-抗纤溶酶、纤连蛋白或(3-酪蛋白、血纤维蛋白原或血小板反应蛋白(thrombospondin)的肽片段。ctr抗纤溶酶、纤连蛋白、p-酪蛋白、血纤维蛋白原和血小板反应蛋白的氨基酸序列可以在下列参考文献中找到ct2-抗纤溶酶前体[MTone等人，生物化学杂志(J.Biochem.)，102，1033，(1987)];(3-酪蛋白[L.Hansson等人，基因(Gene),139，193，(1994)〗；纤连蛋白[A.Gutman等人，FEBSLett.，巡，145，(1996)];血小板反应蛋白-l前体[V.Dixit等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，5449，(1986)];R.F.Doolittle,Ann.Rev.Biochem.,11,195,(1984)。本发明的肽优选包括取自下列N-末端的氨基酸序列(i)CC2-抗纤溶酶，即NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val陽Ser-Pro隱Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu誦Lys-OH或其变异体，其中已经交换、添加或去除一个或多个氨基酸，例如NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH，NH2-Asn-Gln-Glu-Ala-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys曙Gly-OH,NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Gly-OH;或(ii)酪蛋白即Ac-Leu-Gly-Pro-Gly-Gln画Ser-Lys-Val-Ile隱Gly。本发明的合成肽可以采用常规固相合成方法制备，在P.Lloyd-Williams,F.Albericio和E.Girald所著合成肽和蛋白质的化学方法，CRCPress，1997中，叙述了这种常规固相合成方法。适合在本发明中使用的单克隆抗体或其片段包括抗B细胞表面表达的CD-204元原的抗体；抗白细月包(anti-leucocyte)抗体或抗4立细月包4元体；抗肌球蛋白抗体或抗癌胚抗原(CEA)抗体。适宜的酶底物或抑制剂包括葡萄糖和葡萄糖类似物，例如氟代脱氧葡萄糖；脂肪酸或弹性蛋白酶抑制剂。适合的合成受体结合化合物，包括雌二醇、雌激素、黄体酮(progestin)、孕酮(progesterone)、和其它类固醇激素；多巴胺D-l或D-2受体的配体，或多巴胺转运蛋白的配体，例如托烷；和血清素受体的配体。所谓术语"氟代烷基"，系指具有至少一个氟取代基的烷基，即该术语包括从一氟代烷基(例如-CH2F)到全氟烷基(例如CF"的基团。在本发明的二胺二肟螯合剂中，W优选是H。还优选至少一个W基是H，更优选所有的R"基都是H。每个W优选是d.3烷基、<:2.4烷氧烷基、Cw羟烷基或Q.3氟代烷基，最优选d.3烷基或C！.3氟代烷基。尤其最优选所有的R"基都是CH3。优选的化学式II的螯合剂缀合物，其中2个或更多个R基与连接它们的原子一起形成饱和或不饱和的碳环、杂环，包括这些具有3—6个原子，特別是5—6个原子的环。最优选的这些环是饱和碳环。优选的碳环是2个连接到相同或相邻碳原子上的R"基结合起来，形成3—6元、特别是5元或6元饱和环的那些碳环。设想连接基团-(A)n的作用是将金属配位时产生的体积较大的放射性金属络合物与生物靶向部分的活性位点隔开，所以，例如受体的结合不会被削弱。这种作用可以通过挠性(例如简单的烷基链)和/或刚性(例如环烷基或芳基间隔基)的结合来实现，其中挠性使体积大的基团对其本身不处于活性位点的位置具有自由度，而刚性使不处于活性位点的金属络合物定向。也可以利用连接基团的性质改进所得的缀合物放射性金属络合物的生物分布(biodistribution)。因此，例如在连接基团中引入醚基团将有助于使血浆蛋白结合减到最小。优选的连接基团-(A)n,具有构成-(A)部分的被连接原子的主链，其中包含2—IO个原子，最优选2—5个原子，特别优选2—3个原子。2个原子的最小连接基团主链具有一些优点，螯合剂能与生物靶向部分完全分离，所以能将任何相互作用减到最小。另一个优点是，X和Z基团可能的螯合物环尺寸是很大的(对于2个原子主链至少是8),以致这些基团不可能有效地与螯合剂竟争对放射性金属的配位。这样，在这种类型的缀合物中就能保持生物靶向部分的生物靶向特性，和二胺二肟螯合剂络合金属的能力。亚烷基或亚芳基等非肽连接基团也具有下述优点，即与缀合的生物靶向部分没有明显的氢键相互作用，所以连接基团不会环绕在生物耙向部分上。优选的亚烷基隔离基是-(CH2)n-，其中n是2—5。优选的亚芳基隔离基的化学式如下因此优选的Y基是-CH2CH2-X-Z，最优选-CH2CH2-NR气Z,尤其最优选Y=-CH2CH2-NH-Z。该基团具有另一个优点，其主干来源于中间体I^C(CH2CH2NH2)3，优选中间体HC(CH2CH2NH2)3，并且是对称的，因为具有不同链长的三胺要求使用在化学上能区别不同胺的合成策略(例如通过保护基)，所以其合成要容易得多。基团X是官能团，它很容易使螯合剂与生物靶向部分Z缀合。由于大多数肽和蛋白质都具有可用于官能化的羧基或氨基位点，当Z是肽和蛋白质时，优选的X基团是-NRt和-C02-,因为这些基团容易通过酰胺^t缀合，所以包含半胱氨酸的肽和蛋白质可以具有游离的巯基，当Z是包含半胱氨酸的肽和蛋白质时，优选的X基团是亲巯基(thiolphilic)基团，例如马来酰亚胺和丙烯酰胺，因为这些基团容易通过硫醚键缀合。本发明优选的二胺二肟螯合剂是对称的，即选择在-CY(R3)-部分上的二个-CR、R、NHCR、C(=N-0H)W取代基是相同的。这有优点，螯合剂不包含手性中心，因为这些中心可以产生非对映体的放射性金属络合物，并可能要求纯化特定的异构体。可以任选以酸式盐形式使用化学式II的螯合剂缀合物，即在用生物相容性酸使二胺二肟供体组或Y基团的一个或多个胺发生质子化的场合。例如采用在流动相中使用这些酸(例如乙酸或三氟乙酸)的HPLC纯化方法，或将生物相容性酸加到螯合剂缀合物溶液中，都可以直接获得这些盐类。盐的形式有助于纯化(例如通过沉淀或重结晶)或有利于溶解在水介质中(此后如果需要，可以很容易地调节pH)。本发明的螯合剂缀合物可以如下制备通过使化学式in的双官能螯合物与生物靶向部分反应式中a和b独立是0、1、和2。化学式III式中-r1、R2和R3各自独立是r基团；E是-(A)n-J式中J是适合与Z缀合的官能团；-(A)n-是连接基团，其中每个A独立是-CRr、-CR=CR-、-C三C-、-NRCO-、-CONR-、-S02NR-、-NRS02-、-CR2OCR2-、-CR2SCRr、-CR2NRCR2-、Q.s亚环杂烷基、(^4.8亚环烷基、C5.12亚芳基、Cm亚杂芳基或聚烷撑二醇、聚乳酸或聚乙醇酸部分；n是0—10的整数值；每个R基独立是H或Cw。烷基、C3-H)烷芳基、C2-H)烷氧烷基、羟烷基、C卜K)氟代烷基，或者2个或更多个r基团与连接它们的原子一起形成饱和或不饱和的碳环、杂环。所谓术语"适合缀合的官能团"，系指与相应的Z官能团(一般是胺、羧基或巯基)反应，使二胺二將螯合剂与Z发生化学结合的官能团。优选的这些适合缀合的官能团是-NR5R6、-C02M、-NCS、-NCO、-SM1、-OM1、马来酰亚胺或丙烯酰胺，其中RS和I^独立是R基或pG;M是H、阳离子、pG或活性酯；M'是H或pG;和P。是保护基。阳离子适合是带正电荷的反离子，例如金属离子、铵(NH4+)或季铵或憐离子。阳离子优选是生物相容性阳离子。术语'生物相容性阳离子，、'活性酯，、和'保护基，与下面定义的相同。当官能团是-NRSRS时，RS和Re至少其中之一是H，优选r5和r6二者都是H。所谓术语"保护基"，系指能抑制或降低不希望的化学反应的基团，但设计该基团具有足够的活性，在不会改变其余分子的足够緩和的条件下，该基团可以与上述的官能团分离开。在去掉保护以后，可以采用上述的基团使化学式III的双官能螯合物与生物相容性耙部分缀合。对本领域的技术人员而言，保护基是众所周知的，当J是-NI^RS时，保护基适合选自Boc(这里Boc是叔丁氧羰基)、Fmoc(这里Fmoc是药基甲氧羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧羰基、Dde[即1-(4,4-二曱基-2，6-二氧杂亚环己基)乙基]或Npys(即3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)；和当J是-C02pG时，保护基适合选自曱酯、叔丁酯和爷酯，当J是-OPG时，适宜的保护基是乙酰基、苯曱酰基、三苯甲基(Trt)或四丁基二曱基曱硅烷基。当J是-SpG时，适宜的保护基是三苯曱基、和4-曱氧千基。在TheorodoraW.Greene、和PeterG.M.Wuts所著的'在有机合成中的保护基，(JohnWiley&Sons,1991)中，叙述了对另一些保护基的使用。所谓术语"生物相容性阳离子"，系指带正电荷的反离子，它们与电离的带负电荷的基团生成盐，在所述的带正电荷的反离子也是无毒的场合，它们适合用于哺乳动物体，特别是人体的给药。适宜的生物相容性阳离子的实例包括碱金属(例如钠或钾)；碱土金属(例如钙或4JU;和4妄离子。优选的生物相容性阳离子是钠离子(Na+)。所谓术语"活性酯"，系指羧酸的酯衍生物，设计它们是较好的离去基团，因此它们更容易与在生物靶向部分上存在的亲核试剂例如胺反应。适宜的活性酯的实例是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、五氟苯酚、五氟苯硫酚、对硝基苯酚和羟基苯并三唑。因此可以使化学式III胺官能化的螯合剂(即J二NR5116)，通过酰胺4建与生物靶向部分的羧基缀合。这种偶合可以直接进行(例如采用固相肽合成)或在适宜的活化剂例如BOP[即苯并三唑-l-基氧基-三(二甲氨基)-辚]或N，N'-二环己基碳二亚胺(DCCI)存在下进行。这种偶合也可以利用本领域已知的适宜的中间体进行，例如利用生物靶向部分羧基的活化酯进行。另一种方法，可以首先将双官能螯合剂的侧胺基转化成异硫氰酸酯基团(-NCS)或异氰酸酯基团(-NCO)，这些基团通过分别生成硫脲和脲键与含胺的生物靶向部分缀合。另一种方法，可以使双官能螯合剂的侧胺基与二酸反应，通过连接基团引入末端羧基。在类似的方法中，可以使用带有羧基官能团(即J=-C02M)的双官能螯合剂，通过酰胺键直接与含胺的生物靶向部分偶合。双官能螯合物也可以带有设计与生物靶向部分上的巯基反应生成稳定的硫醚键的基团。这些基团的实例是马来酰亚胺(可以通过马来酸酐与相应的胺反应，然后加热与乙酸酐反应制备)、和丙烯酰胺(可以通过烯丙酰氯与胺反应制备)。在第二个方面，本发明提供上述螯合剂缀合物的放射性金属络合物。适宜的放射性金属可以是正电子发射体，例如"Cu、48V、52Fe、55Co、94mTc、或MGa;或y-发射体例如99mTc、川In、113mIn、或67Ga。对于诊断造影，最优选的放射性金属是Y-发射体，特别是99mTc。某些放射性核素的金属络合物，作为放射性治疗癌症等各种疾病或治疗血栓形成或再狭窄的;^文射性药物是有效的。适合这些放射性治疗应用的有效放射性同位素包括9GY、89Sr、67Cu、1G3Pd、186Re、188Re、169Er、153Sm、和198Au。更优选使生物輩巴向部分Z以这样的方式与螯合剂结合，使这种键不容易在血液中代谢，代谢会造成金属络合物在标记的生物靶向部分在生物体内达到所需的耙部位之前被切下。因此生物靶向部分优选通过不容易代谢的键(例如该键是酯键)与本发明的金属络合物共价结合。本发明优选的放射性金属络合物是对称的，即选择在-CY(R3)-部分上的二个-CR、R、NHCR、C(-N-OH)W取代基是相同。其优点是放射性金属络合物不包含手性中心，因为这些中心可以产生非对映异构体的放射性金属络合物和可能要求纯化特定的异构体。还优选螯合剂缀合物的放射性金属络合物是电中性的。相信本发明螯合剂的"m丁c络合物是中性的，Tc(V)二氧代络合物如上所示。在本发明的"，c-二胺二肟络合物中，W优选是H。还优选至少一个rs基是h。更优选所有的rS基都是H，每个r'优选是q-3烷基、c2—4烷氧烷基、C,—3羟烷基、或Q-3氟代烷基，最优选C,-3烷基或C卜3氟代烷基。最特别优选所有的Rt基都是CH3。对于99raTc络合物，优选的Y基与上面对螯合剂缀合物所述的相同。本发明优选的放射性金属络合物，其中2个或更多个R基与连接它们的原子一起形成饱和或不饱和的碳环、杂环，包括这些具有3—6个原子，特别是5或6个原子的环。最优选的这些环是饱和碳环。优选的碳环是2个连接到相同或相邻碳原子上的W基结合起来，生成3—6元、特别是5元或6元饱和环的那些^友环。可以使溶液中的适宜氧化态的放射性金属在适宜的pH下与螯合物缀合物反应，制备本发明的放射性金属络合物。该溶液可以优选包含对金属络合弱的配位体(例如葡萄糖酸根或柠檬酸根)，即放射性金属络合物是通过配位体交换或螯合转移(transchelation)制备的。这些条件对降低金属离子水解等不希望的副反应是有效的。当放射性金属离子是9^Tc时，常用的起始材料是来自"Mo发生器的高锝酸钠。锝在"m丁c高锝酸盐中以Tc(VII)氧化态存在，是相对不活泼的。因此低级氧化态Tc(I)—Tc(V)的锝络合物的制备，通常要求加入药物学上可接受的适宜还原剂，例如连二亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、曱脒亚磺酸、亚锡离子、Fe(II)或Cu(I)，以有利于络合。药物学上可接受的还原剂优选亚锡盐，最优选氯化亚锡、氟化亚锡或酒石酸亚锡。在第三个方面，本发明提供放射性药物，其中包括适合人体给药的无菌形式的上述螯合剂缀合物的放射性金属络合物。这些放射性药物适合以密封容器提供，该密封容器适合用皮下注射针能在一处或多处(例如在隔膜密封物上起褶皱处)刺穿，同时又保持整体是无菌的。这些容器可以装有一个或多个患者的剂量。优选的多剂量容器包括一个装有多个患者剂量的大容积的玻璃瓶(例如容积10—30cm3),因此可以在制备适合临床情况的切实可行的有效期内，按不同的时间间隔将单个患者的剂量从其中抽到临床级的注射器中。将预充填注射器设计容纳一个人的剂量，因此优选使用一次性注射器，或适合临床使用的其它注射器。预充填注射器可以任选具有注射器防护罩，以保护操作人员免受放射性剂量的辐射。这些适宜的放射性药物注射器防护罩在本领域是已知的，其中优选包括铅或鴒。适合诊断造影的放射性药物的99mTc放射性含量，是180—1500MBq,视在生物体内造影的位置、吸收和靶对本底的比例而定。就使用""Tc放射性药物进行心脏造影而言，对应激反应的研究可以4吏用约1110MBq(30mCi)，对于其余的研究可以使用约350MBq(10mCi)。在第四个方面，本发明提供制备99mTc放射性药物组合物的无放射性试剂盒。设计这些试剂盒用来获得适合人体给药的无菌放射性药品，例如直接注射到血流中的药品。对于"，c，试剂盒优选是冻干的，设计用来自99mTc放射性同位素发生器的无菌"，c-高锝酸盐(Tc(V)进行重建，获得适合人体给药的溶液，而不需进一步处理。适宜的试剂盒包括容器(例如用隔膜密封的玻璃瓶)，其中装有游离碱式盐或酸式盐形式的化学式II的螯合剂缀合物，以及药物可接受的还原剂，例如连二亚辟u酸钠、亚石克酸氢钠、抗坏血酸、甲脒亚磺酸、亚锡离子、Fe(II)或Cu(I)。药物学上可接受的还原剂优选亚锡盐，例如氯化亚锡或酒石酸亚锡。采用另一种方案，试剂盒可以任选包含金属络合物，当加入放射性金属时，金属络合物会发生金属转移作用(transmetallation)(即金属交换)，获得所需的产物。非放射性试剂盒还可以任选包括附加成分，例如转螯合剂(transchelator)、辐射防护剂、抗;微生物防腐剂、pH调节剂或填充剂。"转螯合剂"是能与锝迅速反应生成弱络合物，然后被二胺二肟置换的化合物。由于高锝酸盐的迅速还原与锝的络合作用进行竟争，所以将生成已还原的水解锝(RHT)的危险性降低到最小。这类适宜的转螯合剂，是弱有机酸即pKa为3—7的有机酸与生物相容性阳离子的盐。这类适宜的弱有机酸是乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、葡庚糖酸、苯曱酸、苯酚或膦酸。因此，适宜的盐是乙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡萄糖酸盐、葡庚糖酸盐、苯曱酸盐、酚酸盐或膦酸盐。优选的这类盐是酒石酸盐、葡萄糖酸盐、葡庚糖酸盐、苯曱酸盐、或膦酸盐，最优选膦酸盐，尤其最优选二膦酸盐。优选的这类转螯合剂，是MDP即亚甲基二膦酸与生物相容性阳离子的盐。所谓术语"辐射防护剂"，系指能通过捕获高活性的自由基，例如水辐射分解产生的含氧自由基，抑制氧化还原过程等降解反应的化合物。本发明的辐射防护剂适合选自抗坏血酸、对氨基苯曱酸(即4-氨基苯曱酸)、龙胆酸(即2,5-二羟基苯曱酸)、和它们与上述生物相容性阳离子的盐。所谓术语"抗微生物防腐剂"，系指抑制可能有害的微生物例如细菌、酵母菌、或霉菌生长的试剂。抗微生物防腐剂也可以具有一些杀菌的性能，这取决于剂量。本发明的抗微生物防腐剂的主要作用，是抑制任何这类微生物在放射性药物组合物重组后中的生长，即在放射性诊断制品本身内的生长。然而，还可以在重组前任选使用抗微生物防腐剂抑制可能有害的微生物在本发明的非放射性试剂盒的一种或多种成分中的生长。适宜的抗微生物防腐剂包括对鞋基苯曱酸酯类，即对羟基苯曱酸曱酯、乙酯、丙酯、或丁酯，或它们的混合物；苯甲醇；苯酚；甲酚；溴棕三甲铵和硫柳汞。优选的抗微生物防腐剂是对羟基苯曱酸酯类。术语"pH调节剂，，，系指用来确保重组试剂盒的pH在人或哺乳动物给药可接受范围(pH约4.0—10.5)内的化合物或化合物混合物。适宜的这类pH调节剂包括药物学上可接受的緩冲剂，例如麦黄酮、磷酸盐、或TRIS[即三(羟曱基)氨基曱烷]，和药物学上可接受的石威，例如碳酸钠、碳酸氢钠或它们的混合物。当以酸式盐形式使用化学式II的缀合物时，可任选在一个单独的玻璃瓶或容器中提供pH调节剂，所以试剂盒的使用者可以调节pH,将其作为多个操作步骤的一部分。所谓术语"填充剂"，系指在药物学上可接受的增量剂(bulkingagent)，它使材料在生产和冻干过程中容易处理。适宜的填充剂包括无机盐类，例如氯化钠、和水溶性的糖类，例如蔗糖、麦芽糖、或海藻糖。在第五个方面，本发明提供适合制备螯合剂-生物耙向部分缀合物的双官能二胺二肟螯合剂，其化学式ffl是化学式III式中R1、R2、和R3各自独立是R基；E是-(A)n-J式中J是适合与Z缀合的官能团；-(A)n-是连接基团，其中每个A独立是-CRr、-CR=CR-、-OC-、-皿CO-、-CONR-、-S02NR-、-NRS02-、-CR2OCR2-、-cr2scr2-、-cr2nrcr2-、c4-8亚环杂烷基、c4—8亚环烷基、<:5一12亚芳基、<33-12亚杂芳基或聚烷撑二醇、聚乳酸或聚乙醇酸部分；n是0—10的整数值；每个R基独立是H或C卜K)烷基、C3叫o烷芳基、<32-1()烷氧烷基、C卜10羟烷基、C卜u)氟代烷基，或者2个或更多个R基与连接它们的原子一起形成饱和或不饱和的碳环、杂环。所谓术语"适合缀合的官能团"，系指能与Z的相应官能团(一般是胺、羧基或巯基)反应，使二胺二肝螯合剂与Z发生化学结合的官能团。优选的这类适合缀合的官能团是-nr5r6、-C02m、-ncs、-nco、-sm1、-om1、马来酰亚胺或丙烯酰胺，其中RS和I^独立是R基或pG;M是H、阳离子、PG或活性酯；^^是H或pG;pG是保护基。阳离子适合是带正电荷的反离子，例如金属离子、铵离子(NH/)或季铵离子或辚离子。阳离子优选是生物相容性阳离子。术语"生物相容性阳离子"、"活性酯"和"保护基"与上面定义的相同。当官能团是-NRSRS时，至少115和116之一是11，优选115和r6二者都是H。在本发明化学式in的双官能螯合剂中，W优选是H。还优选至少一个W基是H，更优选所有的R"基都是H。每个Rt优选是C卜3烷基、C2—4烷氧烷基、C卜3羟烷基、或C卜3氟代烷基，最优选是C卜3烷基或C卜3氟代烷基。尤其最优选所有的R'基都是CH3。优选的双官能螯合剂，其中2个或更多个R基与连接它们的原子一起，生成饱和或不饱和的碳环、杂环，包括这些具有3—6个原子、特别是5个或6个原子的环。最优选的这些环是饱和碳环。优选的碳环是2个连接到相同或相邻碳原子上的W基团结合在一起形成3—6元、特别是5元或元饱和环的那些-友环。可以任选以酸式盐形式使用化学式III的螯合剂缀合物，即在用生物相容性酸使二胺二肟供体组或Y基团的一个或多个胺发生质子化的情况下。例如采用在流动相中使用这些酸(例如乙酸或三氟乙酸)的HPLC纯化方法，或者将生物相容性酸加到螯合剂缀合物溶液中，都可以直接获得这些盐类。盐的形式有助于纯化(例如通过沉淀或重结晶)，或者有助于溶解在水介质中(此后必要时，可以很容易地调节pH)。双官能螯合剂优选的连接基团-(A)n,具有连接构成-(A)部分的连接原子的主链，其中包含2—10个原子，最优选2—5个原子，特别优选2个或3个原子。2个原子的最小连接基团主链具有一些优点，在缀合以后，螯合剂与生物靶向部分完全分离，所以能将任何相互作用减到最小。另一个优点是，X和Z基团的潜在螯合物环尺寸可能很大(对2个原子的主链至少8),以致这些基团不可能与螯合剂有效地竟争对;改射性金属的配位。非肽连接基团例如亚烷基或亚芳基具有一些优点，与缀合的生物靶向部分没有明显的氢键相互作用，所以连接基团不会环绕在生物靶向部分上。优选的亚烷基隔离基是-(CH2)n-，其中n是2-5。优选的亚芳基隔离基的化学式如下因此优选的E基团是-CH2CH2-J，最优选-CH2CH2-NHR5或-CH2CH2-C02H，或其活性酯，特别优选E;CH2CH2-NH2。也可以通过例如与氯曱酸异丁酯和碱反应，将酸转化成混合的酸酐。混合的酸酐也与胺等亲核试剂反应。基团E;CH2CH2-NH2具有另一些优点，其主干来源于中间体R3C(CH2CH2NH2)3，优选中间体HC(CH2CH2NH2)3，并且是对称的，由于具有不同链长的三胺要求采用在化学上能区别不同胺的合成方案(例如通过保护基)，所以它的合成容易得多。本发明化学式III优选的双官能二胺二肟螯合剂是对称的，即选择-CY(R3)-部分上的二个-C(R2)2(R2)2NHCR、C(=N-OH)R1取代基是相式中a和b独立是O、1、和2。同的。这有一些优点，螯合剂不包含手性中心，因为这些中心可以生成非对映体的放射性金属络合物，并可能要求纯化特定的异构体。特别优选的双官能二胺二肟螯合剂的化学式如下这种化合物的酸式盐也在本发明的范围内。本发明的双官能二胺二肟螯合剂适合如下制备使用下列化合物(i)适宜的氯亚硝基(chloronitroso)衍生物C1誦C(R1)2-CH(NO)(ii)化学式C1-C(R1)2-C=NOH)R'的a-氯肝(chloro-oxime);(iii)化学式Br-C(R1)2-C(=0)R^的cc-溴酮;使化学式IV的化合物烷基化<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>化学式rv式中A、J、R2、RS和n与上面对化学式m定义的相同，然后用羟胺将所得二胺二酮产物转化成二胺二肟。S.Jurisson等人叙述了合成路线(i)[无机化学(Inorg.Chem.)，26,3576-82(1987)]。采用实施例3中所述的亚硝酰氯(NOC1)处理适宜的烯烃可以获得氯亚滩基化合物。Ramalingam,K.等人在合成通讯(Synth.Commun.,),25(5)，743—52(1995)中;Glaser等人在有机化学杂志(J.Org.Chem.),61(3),1047—48(1996)中；Clapp，LeallynB.等人在有机化学杂志，36(8),1169—70(1971)中；Saito，Giulichi等人在ShizenKagaku，47,41—9(1995)中；和Schulz,MantredZ.在化学(Chem.),21(11)，404—5(1981)中，给出合成氯亚硝基化合物更详细的资料。Nowotnik等人采用广泛的术语叙述了合成路线(iii)[四面体(Tetrahedron),50(29)，p.8617—8632(1994)]。a-氯-肟可以通过相应的a-氯-酮或ot-氯-醛的肟化获得，a-氯-酮或a-氯-醛可以在市场上买到。a-溴酮也可以在市场上买到。当J是-nh2时，化学式IV的三胺首先可以任选是单保护的(mono-protected)，使J基团的伯胺被保护。然后根据上述的路线(i)、(ii)、或(iii)制备二胺二將，最后除掉保护基。适宜的保护基在本领域是已知的，其中包括上述的BOC(即叔丁氧羰基)或Fmoc。化学式IV的化合物适合由HC(CH2CH2OAc)3制备，该方法是将一种或多种乙酸酯水解成伯醇，并用曱烷磺酰氯和吡啶将其转化成离去基团例如甲烷磺酸酯。然后可以用可以转化成所需官能团的适宜亲核试剂置换这个离去基团。采用氰化物阴离子产.生羧酸(即J=-C02H)。氰化物的酸解会产生所需的羧酸。为了产生胺，采用叠氮化物亲核试剂产生烷基叠氮化物。烷基叠氮化物氢化生成胺。为了产生硫醇(即J=-SH),用硫代乙酸阴离子置换该离去基团，获得硫代乙酸酯，在酸解时硫代乙酸酯就生成硫醇。在另一个方面，本发明提供化学式V的化合物HC(CH2CH2NR7R8)3化学式V式中！^和rs独立是h或pG,或R7和rs—起生成pG;或其盐。pG是上面定义的保护基。对于本发明的双官能螯合剂范围，化学式V的化合物是有效的前体。优选的化学式V的化合物是HC(CH2CH2NH2)2(CH2CH2nr7r8)，即上述单保护的三胺。最优选所有的W和rS基都是H,即本发明最优选的化合物是化合物HC(CH2CH2NH2)3或其酸式盐。图1示出化合物1—6的化学结构。图2显示化合物V的全部化学结构。图3示出采用叠氮化物合成实施例1的1,1,1-三(2-氨基乙基)胺的反应流程示意图。图4示出采用另一种方法合成实施例2的1，1,1-三(2-氨基乙基)胺的反应流程示意图。下面采用详细的非限制性实施例说明本发明。实施例1叙述了新化合物1,1,1-三(2-氨基乙基)甲烷的合成。实施例2提供l,l，l-三(2-氨基乙基)曱烷的另一种合成方法，该方法避免使用可能有危险的叠氮化物中间体。实施例3叙述了各种氯亚硝基烷烃前体的合成。实施例4叙述了本发明优选的胺取代双官能二胺二坊(化合物1)的合成。实施例5叙述了化合物1的苯曱酰胺缀合物(化合物2)的合成。实施例6示出如何能引入有效地将双官能螯合剂的末端胺官能转化成末端羧基官能的间隔基。实施例7叙述了血栓革巴向肽的固相合成。实施例8提供用靶向肽合成化合物5即化合物1缀合物的方法。实施例9叙述了化合物7和化合物8即包含环结构的二胺二肟类似物的合成。实施例IO将化合物2的"，c-放射性标记与氮杂类似物一一现有技术的螯合物(化合物3)的"，c放射标记进行比较，表明在中等条件即室温和碱性较低的pH下标记，本发明的螯合剂比现有技术的螯合物更有效和更迅速得多。因此，在室温下现有技术的螯合剂需要pH10和至少120min的时间才能达到超过80%的RCP，而标记化合物3在15min内就能达到超过95%RCP。实施例11表明化合物5用99mTc标记能获得高放射化学纯度的制剂。实施例12示出,Tc标记的化合物5与现有技术的化合物一一99mTc-化合物6在体外对血凝块吸收的比较，表明当与本发明的二胺二肟螯合剂缀合时，仍然保留了肽的生物靼向特性。实施例13示出了化合物9在适度条件下的"m丁c放射性标记，化合物9是具有环肽的化合物1的缀合物，并且具有多个比较敏感的二硫键。实施例l:1,1,1-三(2-氨基乙基)曱烷的合成。步骤l(a):3(甲氧羰基亚甲基)戊二酸二曱酯。采用3-氧代戊二酸二甲酯(87g，0.5mol)处理曱酯基亚曱基三苯基正膦(167g，0.5mol),用120。C的油浴将反应加热到IOO'C,在氮气氛中保持36h。然后将反应在真空中浓缩，油状残余物用600ml40/60石油醚(petrolether)/二乙基醚1:1磨碎。沉淀出氧化三苯膦，倾析/过滤出上清液。真空蒸发残余物是在高真空Bpt(沸点)(在0.2torr下炉温180—200°C)下用库格尔若蒸馏器(Kugelrohr)蒸馏，获得3-(甲氧羰基亚曱基)戊二酸二曱酉旨(89.08g,53%)。NMR'H(CDC13):S3.31(2H,s,CH2),3.7(9H，s,3xOCH3),3,87(2H，s，CH2),5.79(1H，s,=CH)ppm。NMR13C(CDC13),536.56,CH3，48.7,2xCH3，52.09和52.5(2xCH2);122.3和146.16C=CH;165.9,170.0和170.53xCOOppm。步骤l(b):3-(甲氧羰基亚甲基)戊二酸二甲酯的氢化。在氢气体(3.5bar)气氛中将3-(曱氧羰基亚曱基)戊二酸二曱基酯(89g,267mmol)的甲醇(200ml)溶液与(10%的炭载把50°/。水)(9g)振荡(30h)。通过硅藻土过滤溶液，在真空中浓缩，获得3-(曱氧羰基曱基)戊二酸二曱酯油产品(84.9g,94%)。NMR'H(CDC13)，52.48(6H，d,J=8Hz，3xCH2)，2.78(1H，hextet，J=8Hz，CH，)3.7(9H，s，3xCH3)。NMR13C(CDC13)，S28.6,CH;37.50，3xCH3;51.6,3xCH2;172.28,3xCOO。步骤l(c):将三曱酯还原和酯化成三乙酸酯在2L的3颈圆底烧瓶中，在氮气氛中，用三(曱氧羰基曱基)曱烷(40g，212mmo1)的四氬吹喃(200ml)溶液，小心处理氢化铝锂(20g,588mmol)的四氲呋喃(400ml)溶液lh。发生强烈的放热反应，使溶剂大量回流。用油浴将反应物在90。C加热回流3天。小心滴加乙酸(100ml)冷却反应，直到停止放出氢为止。在引起适当回流的速率下，用乙酸酐溶液(500ml)小心地处理搅拌的反应混合物。装备烧瓶进行蒸馏，搅拌，然后在90°C(油浴温度)加热到蒸馏出四氢呋喃。再加入一份乙酸酐(300ml)，反应返回到回流状态，搅拌，用油浴加热到140°C,保持5h。使反应冷却并过滤。用乙酸乙酯洗涤氧化铝沉淀物，合并的滤液用旋转式蒸发器在真空(5mmHg)中浓缩，水浴温度50。C，得到油。将油吸收到乙酸乙酯(500ml)中，用饱和石灰酸钾水溶液洗涤。分离乙酸乙酯溶液，在石克酸钠上干燥，在真空中浓缩，得到油。用库格尔若蒸馏器在高真空下蒸馏该油，获得三(2-乙酰氧基乙基)曱烷(45.3g，95.9%)油。在0.1mmHg下沸点(Bp.)220。C。NMR(CDC13)，51.66(7H，m,3xCH2,CH),2.08(1H,s，3xCH3);4.1(6H,t,3xCH20)。NMR13C(CDC13),520.9，CH3;29.34,CH;32.17,CH2;62.15,CH20;171，CO。步骤l(d):从三乙酸酯中除去乙酸酯基团用油浴将三(2-乙酰氧基乙基)曱烷(45.3g，165mM)的曱醇(200ml)和880氨(100ml)溶液加热到80°C，保持2天。用另一部分880氨(50ml)处理反应，用油浴加热到8(TC，保持24h。加入另一部分880氨(50ml)，将反应加热到80。C，保持24h。然后将反应在真空中浓缩，除去所有的溶剂，得到油。将该油吸收到880氨(150ml)中，加热到80。C，保持24h。然后将反应在真空中浓缩，除去所有的溶剂，得到油。用库格尔若蒸馏器蒸馏，获得乙酰胺，在0.2mm下，沸点170—180。C。将包含气泡的乙酰胺洗涤干净，继续蒸馏。三(2-轻乙基)曱烷(22.53g,92%)在0.2mm沸点220。C下蒸馏。NMR!H(CDC13)，51.45(6H，q，3xCH2),2.2(1H，quintel,CH);3.7(6H,t,3xCH2OH);5.5(3H,brs，3xOH)。NMR13C(CDC13),522.13,CH;33.95,3xCH2;57.8,3xCH2OH。步骤l(e):将三元醇转化成三(甲烷磺酸酯)。在氮气氛中在搅拌下，在水冷却的三(2-羟乙基)曱烷(10g,0.0676mol)二氯甲烷(50ml)溶液中，以温度不升高到15。C以上的速率，緩慢地滴加曱烷磺酰氯(40g,0.349mol)二氯甲烷(50ml)溶液。然后以温度不升高到15。C以上的速率，滴加溶解在二氯曱烷(50ml)中的吡啶(21.4g,0.27mol,4eq),发生放热反应。反应保持在室温下搅拌24h,然后用5N盐酸溶液(80ml)处理，分层。水溶液层用另一份二氯曱烷(50ml)萃取，合并有机萃取物，在硫酸钠上干燥，过滤，在真空中浓缩，获得含有过量曱烷磺酰氯杂质的三[2-(曱基磺酰氧基(methylsulphonyloxy))乙基]曱烷，理论产量是25.8g。NMR'H(CDC13)，54,3(6H，t,2xCH2),3.0(9H,s，3xCH3)2(1H，hextet，CH)，1.85(6H，q，3xCH2)。步骤l(f):1,1,1-三(2-叠氮基乙基)曱烷的制备。在氮气中搅拌三[2-(甲基磺酰氧基)乙基]甲烷[来自步骤1(e)，含有过量的曱基磺酖氯杂质](25.8g,67mmol,理论量)的无水DMF(250ml)溶液，用叠氮化钠(30.7g,0.47mol)分批处理15min。观测到》文热，用冰浴冷却反应。在30min后,用油浴将反应混合物力口热到50。C,寸呆持24h。反应混合物变成棕色。使反应冷却，用碳酸钾稀溶液(200ml)处理，用40/60石油醚/二乙基醚10:1(3x150ml)萃取三次。用水(2x150ml)洗涤有机萃取物，在硫酸钠上干燥，过滤。在石油/乙醚溶液中加入乙醇(200ml)，使三叠氮化物保持在溶液中，在真空中将体积缩小到不低于200ml,加入乙醇(200ml)，在真空中重新浓缩，除去最后的痕量石油，留下不低于200ml乙醇溶液。这种三叠氮化物乙醇溶液直接在步骤1(g)中使用。注意:不要除去所有的溶剂，因为叠氮化物有可能爆炸，在任何时候叠氮化物都应保存在稀溶液中。在真空中蒸发不到0.2ml的溶液，除去乙醇，用NMR分析这个小试样。画R'H(CDC13)，S3.35(6H,t，3xCH2)，1.8(1H，septet,CH)，1.6(6H，q,3xCH2)。歩骤l(g):1,1,1-三(2-氨基乙基)甲烷的制备用10%的炭载钯(2g，50%水)处理三(2-叠氮乙基)甲烷(15.06g，0.0676mol)(假定来自前面反应100%产率)的乙醇(200ml)溶液，氢化12h。每2h排空反应容器，以除去反应中释放的氮气，重新充入氢气。取样进行NMR分析，以证明三叠氮化物完全转化成三胺。警告未还原的叠氮化物能在蒸馏时发生爆炸。通过硅藻土垫(celitepad)过滤反应物，以除去催化剂，在真空中浓缩，获得三(2-氨基乙基)甲烷油。采用库^"尔若蒸馏器蒸馏在0.4mm/Hg沸点180—20CTC下进一步纯化该油，获得无色的油(8.1g,三元醇的总产率为82.7%)。雨R!H(CDCl3),2.72(6H,t，3xCH2N)，1.41(H,septet,CH),1.39(6H，q,3xCH2)。NMR13C(CDC13),539.8(CH2NH2),38.2(CH2),31.0(CH)。实施例2:1,1,1-三(2-氨基乙基)甲烷的另一种制备方法。步骤2U):用对甲氣基-苄胺使三甲酯酰胺化。将三(甲氧羰基曱基)曱烷[2g,8.4mmol;和上述的步骤1(b)同样制备]溶解在对曱氧基-千胺(25g,178.6mmol)中。建立蒸馏设备，在氮气流中加热到12(TC,保持24h。采用收集的甲醇量监测反应的进展。将反应混合物冷却到环境温度，加入30ml乙酸乙酯，然后搅拌30min,沉淀三酰胺产物。采用过滤分离三酰胺，滤饼用足够量的乙酸乙酯洗涤几次，除去过量的对曱氧基-千胺。在干燥后获得4.6g，100%的白色粉末。在下一个步骤中直接使用这种高度不溶的产品，而不需进一步纯化或表征鉴定。步骤2(b):1,1,1-三2-(对曱氧基苄氨基)乙基l甲烷的制备在1000ml用水-水浴冷却的3颈圆底烧瓶中，将步骤2(a)的三酰胺(10g，17.89mmo1)小心地加入到250ml1M硼烷溶液(3.5g,244.3mmo1)中。加入完成后，除掉冰-水浴，将反应混合物緩慢加热到60°C。反应混合物在60°C下搅拌20h。抽取反应混合物试样(lml),与0.5ml5NNCI混合，静置30min。向试样中加入0.5ml50NaOH，然后加入2ml水，搅拌溶液，直到所有的白色沉淀物全都溶解为止。溶液用乙醚(5ml)萃取，蒸发。将残余物溶解在乙腈中，浓度lmg/ml，采用MS进行分析。如果在MS光谱中见到一酰胺和二酰胺(M+H/z-520和534),反应是不完全的。为了使反应进行完全，再加入100ml1M硼烷THF溶液，反应混合物在60。C下搅拌6h以上，按照前面的采样方法，取新的试样。当需要时，再继续加入1M硼烷THF溶液，直到完全转化成三胺为止。将反应混合物冷却到环境温度，緩慢加入5NHC1，[注意会产生大量的泡沫！]。加入HC1，直到观测不到释放气体为止。混合物搅拌30min，然后蒸发。将块状物悬浮在NaOH水溶液(20—40%;1:2w/v)中，搅拌30min。然后用水(3倍体积)稀释混合物。然后混合物用乙醚(2xl50ml)萃取[注意不要使用卣化溶剂]。然后用水(1x200ml)、盐水(150ml)洗涤合并的有机相，在硫酸镁上干燥。蒸发后得到油状物7.6g,84%画R'H(CDCl3)，5:1.45,(6H，m，3xCH2;1.54，(1H,septet,CH);2.60(6H,t，3xCH2N);3.68(6H,s,ArCH2);3.78(9H，s,3xCH30);6.94(6H，d,6xAr)，7.20(6H，d，6xAr)NMR13C(CDC13),5:32.17，CH;34.44,CH2;47.00,CH2;53.56，ArCH2;55.25,CH30;113.78,Ar;129.29,Ar;132.61，Ar;158.60,Ar;步骤2(c):l，l,l-三(2-氨基乙基)曱烷的制备。将1,1,1-三[2-(对甲氧基千氨基)乙基]甲烷(20.0g，0.036mol)溶解在甲醇(100ml)中，加入Pd(OH)2(5.0g)。将混合物氬化(在压热器中，3bar，100°C),搅拌5h。在10h和15h后分别加入另二份(2x5g)Pd(OH)2。将反应混合物过滤，滤液用曱醇洗涤。采用前面实施例1所述的方法，蒸发合并的有机相，残余物在真空中蒸馏(lxl(T2，110°C),获得2.60g(50%)l，l,l-三(2-氨基乙基)曱烷。实施例3:3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷的制备。用cardice和曱醇浴将2-曱基丁-2-烯(147ml,1.4mol)和亚硝酸异戊酯(156ml，U6mo1)的混合物冷却到-30。C，用安装在顶部的空气搅拌器强烈搅拌，以保持温度低于-2(TC的速率，滴加浓盐酸(140ml，1.68mol)进行处理。处理约需lh，因为会释放大量的热，所以处理时必须小心地进行，以防过热。加入乙醇(100ml)，以降〗氐加入结束时生成的浆液的粘度，反应物在-20—-10。C下再搅拌2h,使反应完全。在真空下过滤收集沉淀物，用4x30ml冷(-20。C)乙醇和100ml水冷的水洗涤，在真空中干燥，获得3-氯-3-曱基-2-亚硝基丁烷白色固体。将乙醇滤液和洗液合并，用水(200ml)稀释，冷却，在-10。C静置lh,同时进一步结晶出大量3-氯-3-曱基-2-亚硝基丁烷。过滤收集沉淀物，用最少的水洗涤，在真空中干燥，获得3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷(115g,0.85mol,73°/。)，采用NMR分析总产物的纯度>98%。NMR]H(CDC13),作为异构体混合物(异构体1,90%)1.5d,(2H，CH3)，1.65d，(4H,2xCH3),5.85,q，和5.95，q，以及1H。(异构体2,10%),1.76s,(6H，2xCH3),2.07(3H，CH3)。以类似的方法从亚乙基环戊烷制备l-氯-l-(l-亚硝基乙基)环戊烷(产率55%)[有机化学杂志，36(8),p.1169—70]。以类似的方法从亚乙基环己烷制备l-氯-l-(1-亚硝基乙基)环己烷(产率63°/。)[有机化学杂志，36(8),p.1169—70]。5H(CDC13;270MHz)，1.52(3H，dJHH7Hz,CH3),1.48-2.20(10H，m,CH2x5),5.96(1H，q，JHH7Hz，CH)。以类似的方法从l-曱基-环己烯制备1-氯-l-曱基-2-亚硝基-环己烷(产率57%)[Ind.J.Chem.SectB16B(10),917—20(1978)，Z.Chem.，21(11)404—5(1981),J.Pract.Chem.,320(3)，433—51(1978)]。SH(CDC13;270MHz)，1.41-2.28(11H,m,CH3，CH2x4),5.72-5.79(1H，m,CH)。实施例4:双fN-(1,l-二甲基-2-N-羟基亚胺丙基)2-氨基乙基1-(2-氨基乙基)曱烷(化合物l)的合成。在氮气氛中，在室温和强烈搅拌下，在三(2-氨基乙基)曱烷(4.047g,27.9mmol)的无水乙醇(30ml)溶液中,加入无水碳酸钾(7.7g，55.8mmol,2eq)。将3-氯-3-曱基-2-亚硝基丁烷(7.56g,55.8mol，2eq)溶解在无水乙醇(100ml)中，将75ml这种溶液緩慢地滴加到反应混合物中。然后在反应中加入二氧化硅载带的TLC[这些板按100/30/5^f吏用二氯曱烷、甲醇、浓氨(0.88sg)进行实验；并喷淋茚三酮和加热，使TLC板成象]。随着流量(RF)按该顺序增加，可以看见一、二、和三烷基化的产品。分析用的HPLC是采用RPR反相柱进行的，乙腈在3%氨水中的变化率为7.5—75%。反应在真空中浓缩，除去乙醇，重新悬浮在水(110mi)中。用乙醚(100ml)萃取水浆，除去一些三烷基化的化合物和亲脂性的杂质，在水层中留下一烷基化和所需的二烷基化产品。用乙酸铵(2eq，4.3g，55.8mmol)緩沖该水溶液，确保优良的色谱。在用所准备的自动HPLC纯化之前，该水溶液在4。C下存》t过夜。产品(2.2g,6.4醒ol，23%)。质谱；正离子10V圆锥电压。求得344;算得M+H=344。丽R'H(CDCl3)，S1.24(6H，s，2xCH3)，1.3(6H，s，2xCH3),1.25-1,75(7H，m,3xCH2,CH),(3H,s,2xCH2)，2.58(4H,m，CH2N)，2.88(2H,t,CH2N2),5.0(6H，s,NH2,2xNH,2xOH)。NMR!H((CD3)2SO),51.14xCH;1.29,3xCH2;2.1(4H,t,2xCH2);画R13C((CD3)2SO)，S9.0(4xCH3)，25.8(2xCH3),31.02xCH2，34.6CH2，56.82xCH2N;160.3，C=N。HPLC条件在采用25mmPRP柱时，流量为8ml/minA-3。/。氨溶液(sp.gr=0.88)/水。时间％B07.51575.02075.0227.5307.5每个实验的载荷是3ml水溶液，在时间窗为12.5—13.5min进行收集。实施例5:化合物2—化合物l的苯甲酰胺缀合物的制备用冰浴在氮气氛中将化合物1(0.5g，1.45mmol)的无水乙腈(50ml)和三乙胺(150mg，1.45mmol)溶液冷却到0°C。在搅拌下在反应物中加入苯曱酸酐(330mg,1.45mmol),使反应物上升到室温，搅拌过夜。在真空中除去乙腈，将残余物重新溶解在二氯甲烷(50ml)中，用碳酸钾水溶液(2x50ml)洗涤，分离，在硫酸钠上干燥。用二氯甲烷(2x50ml)萃取碳酸钾水溶液，在硫酸钠上干燥。在真空中将合并的二氯曱烷萃取物浓缩成胶状物。HPLC分析表明，产物并不象要求的那么纯，因此采用自动制备型HPLC进行纯化，获得化合物2。采用TLC和分析使用的HPLC，所分析的产物为一个色斑。HPLC条件在采用150mmx25mmPRP柱时，流量为8ml/min;每个实验试样都装载在2ml30%的乙醇水溶液中。八=3%氨溶液(sp.gr=0.88)/水。B-乙腈时间％B07.51575.02075.0307.5在15.25—16,5min洗脱所需的产物。真空蒸发产物溶液，获得无色玻璃状的泡沫(304mg，0.68mmol，47%)，熔点(m.p.)55°C。丽R'H(CDC13)，1.26(12H，s,4xCH3),1.43(2H,m，CH2)，1.57(4H，m，CH2),1.75(1H,m,CH),1.823(6H，s,2xCH3)，2.58(4H,m，2xCH2N)，3.56(2H,m，CH2NHCO)，6.95(1H,m，NHCO),7.42(3H,m,3xArH),7.79(2H,d,ArH)。NMR13C(CDC13),10.09，25.7，26.1,28.5。32.8，33.3，37.93，57.57，127.0，128.4,131.4，158.98，168.15。M/SC24H41N503M+H=448实测值448在100:30:5/CH2Cl2:MeOH:880氨条件下，流量(RF)为0.8，使用水合茚三酮显现。实施例6:双f(1,l-二曱基-2-N-羟基亚胺丙基)2-氨基乙基1-(2-(戊二酰胺)乙基)曱烷f化合物4;化合物l的戊二酰胺衍生物l的合成用水浴在氮气氛中将化合物1(0.5g，1.45mmo1)的无水乙腈(50ml)和三乙胺(150mg,1.45mmo1)溶液冷却到0。C。在4觉^^下在反应物中加入戊二酸酐(165mg，1.45mmo1),使反应物上升到室温，搅拌过夜。用过滤收集过夜生成的沉淀物，在真空中干燥，获得不纯的标题化合物试样(267mg,0.583mmol，40%)。在真空中浓缩滤液，获得无色的玻璃状物，将玻璃状物与已收集的沉淀物一起重新溶解在5%0.880sg氨水(50ml)中，采用自动制备型HPLC纯化。HPLC条件在采用150mmx25mmPRP柱时，流量为8ml/min;每个实验的试样装载在2ml溶液中。八=3%氨溶液(sp.gr=0.88)/水。B-乙腈时间％B07.51575.02075,0227.5317.5在15.25—16.5min洗脱所需的产物。在真空中蒸发产物溶液，获得无色玻璃状的泡沫(304mg，0.68mmo1，47%)，熔点54.8°C。采用TLC和分析型HPLC,所分析的产物为一个色斑。NMR'H(DMSO)，0.7(12H，s，4xCH3)，0.85(4H，m,2xCH2)，1.0(1H，m,CH)，1.3(6H,s,2xCH3)，1.3(4H,m,2xCH2),1.6(2H，m,CH2)，1.75(6，m，3xCH2),2.6(2,m，2xOH)，3.2(2H，t,丽)，7.3(1H,t，丽)。NMR13C(CD3SO)，8.97,20.51,20.91,25.09，25.60,31.06,33.41，33.86,56.89,66,99，160.07，1712.34，174.35,174.56。M/SC22H43N505M+H=457实测值457.6实施例7:被保护的肽Ac-NOEOVSP(3-1)YTLLKG的合成通过将Fmoc-Gly-锚定到树脂上，在2-氯三笨曱基固相树脂上装配被保护的肽Ac-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)國Gln(Trt)誦Val画Ser(tBu)-Pro-Tyr(31)-Thr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-OH,然后用适当4呆护的氨基酸以及偶联剂DCCI和HOBt进行陆续脱保护/偶联循环。采用0.5%FTA将末端的天冬酰胺乙酰基化并从树脂上切下，所得肽无需进一步纯化。实施例8:化合物5—化合物l的肽缀合物的合成从固相树脂上切下实施例7^f皮保护的Ac-NQEQVSPY(3I)TLLKG肽，然后采用苯并三唑-l-基-氧代三吡咯烷-鳞六氟磷酸盐和1-羟基苯并三唑作为偶联剂，使其与溶液中的化合物1偶联。通过用试剂K(试剂K是82.5%TFA、5%苯酚、5%处理过的水、5%苯硫基甲烷和2.5%乙二硫醇)脱保护，获得化合物5。首先采用使用TFA的RP-HPLC纯化粗肽，接着使用乙酸进行第二次纯化和盐交换，冻干，用0.22pm过滤器过滤，最后冻干，获得化合物5。为了比较，采用同样的方法制备现有技术相同肽即Ac-NQEQVSPY(31)TLLKG的氮杂-二胺二將螯合物缀合物(化合物6—见图1)。实施例9:1-(1-{3-(2-氨基乙基)-5-U-(1-羟基亚氨基乙基)环己基氨基l戊氨基l环己基)乙酮二肟化合物71的制备。在室温和强烈搅拌下，在氮气氛中，在l,l，l-三(2-氨基乙基)曱烷(0.96g，6.6mmo1)的无水乙醇(7.5ml)溶液中，加入石友酸钾(无水的)(1.8g,13画ol)和三乙胺(1,33g，13mmo1)。在1h内滴加l-氯-l-(1-亚硝基乙基)环己烷(2.3g，13mmo1)的二氯曱烷(30ml)溶液。然后混合物在室温下搅拌18h。然后在减压下除去溶剂。然后在反应残余物中加入水(30ml)和乙醚(25ml)。然后分离水相和有机相。HPLC:恒溶剂成分90%B(MeOH)，10o/o(NH3,3%)。乙醚萃取物HPLC表明有二个主要带一一第一个带二肟，第二个带三肟。二肟(0.55g，20%),FABm/z424(M+H),HRMS:实测值424.3642,计算值424.3652(C23H45N502)。NMR:SH(CDC13;270固z),1.34—1.72(33H,m,CH,CH2xl3，CH3x2)，2.18—2.33(4H,m，NCH2x2),2.56—2.69(2H，m,NCH2)。采用类似的方法制备化合物1-(1-{3-(2-氨基乙基)-5-[1-(1-羟基亚氨基乙基)环己氨基]戊氨基}环己基)乙酮二肝[化合物8]:化合物8FABm/z396(M+H),HRMS:实测值396.3322,计算值396.3339(C21H42N503)。实施例10:将化合物2与相应的氮杂-类似物(化合物3,现有技术)的99mTc放射性标记进行比较制备包含下列成分的冻干制品23jig化合物2(化合物1的苯甲酰胺衍生物一见实施例3),36吗氯化亚锡二水合物，90吗亚曱膦酸(Medronate)三钠，4.0mg乙酸钠，在氮气(USP/NF)中将其密封在10ml玻璃瓶中。这是在室温下采用来自"，c发生器的"，c-高锝酸盐溶液重组的。采用HPLC和ITLC(瞬时薄层色谱)研究RCP。将这些结果与化合物3的结果对比，这些结果示于表1和2中表l:ITLC放射化学纯度结果(％):<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表2:化合物2的ITLC和HPLC放射化学纯度的结果(％):<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表中RHT=还原型水解锝实施例11:化合物5—化合物1的肽缀合物的""^c放射性标记在氮气中将包含下列成分的冻干制剂密封在10ml的玻璃瓶中50|ugPABA(对氨基苯甲酸)，30pgSnCl2,90|LLgMDP(亚曱基二膦酸)，1.32mgNaHC03,98|agNa2C03,4mgNaOAc。从冷藏库中取出玻璃瓶，在室温下放置15min,然后用100jil包含化合物5即肽-螯合剂缀合物Ac-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-(I-Tyr)-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-[化合物1](在2ml水中包含2mg)的溶液，和Xml"，c-高锝酸盐溶液重组，在室温下来自AmertecII99mTc发生器的放射性浓度为0.5GBq/ml。采用离子室测定放射性。采用ITLC和HPLC测定RCP。对不同X值的结果示于表3:表3:化合物5的ITLC和HPLC放射化学纯度结果(％):<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>实施例12:99mTc标记的化合物5的体外血凝块吸收与99mTc标记的化合物6(现有技术)的体外血凝块吸收根据实施例10进行"mTc放射性标记。从冷藏库(-20。C)中取出血浆(每个实验项目5ml)和凝血酶(100单位/ml)，解冻到室温。在使用前观测血浆，确保没有血凝块生成或样品降解的迹象。将10|al"，c-化合物5或"，c-化合物6加到一个5ml的血浆(大鼠、兔、狗和人)瓶中。将10lal,Tc-DTPA平行地加到装有5ml血浆的第二个玻璃瓶中，作为阴性对照。向四个瓶中加入800nl的钙三(羟甲基)氨基曱烷緩冲剂和40pl牛凝血酶溶液，产生生成凝块的孵育混合物(富含钙/凝血酶的生成血凝块的緩冲液)。将800pl三(羟曱基)氨基甲烷緩冲盐溶液加入到40|ilAnalaR水中，产生不生成凝块的孵育混合物即本底结合试验混合物(缺乏4丐/凝血酶的不生成血凝块的緩冲液)。在富含钙/凝血酶和缺乏4丐/凝血酶的二种孵育混合物中，分别加入400|il用试验制品("，c-化合物5或"，c-化合物6)或放射性标记的阴性对照(99mTc-DTPA)示踪的人血浆，每个试验平行做四个。向各瓶中加入一个脱血纤蛋白棒，以利于血浆生成凝块。每个试验瓶在环境温度下孵育lh。通过向每个P7瓶中加入lml0.4MEDTA溶液而停止反应。将前面用试验制品和阴性对照示踪的400^1血浆样品加入到各个玻璃闪烁瓶中，测定存在的总放射性(一式四份)。采用碘化钠闪烁扫描法测定与这些标准品有关的放射性。将每个P7瓶中的内容物倒在真空歧管上各个BSA封闭的硝基纤维素膜滤器上。用2mlTBST溶液冲洗每个P7瓶，然后用四个5ml的TBST溶液冲洗每个滤器。血凝块在真空歧管上干燥lh。然后将滤纸转移到各个闪烁瓶中，测定存在的放射性。通过用不生成凝块的混合物中存在的总放射性，减去生成凝块的混合物中存在的总放射性，求出试验制品与硝基纤维素膜滤器的非特异性结合的因数。采用单独在凝块中存在的放射性，除以血浆标准品中存在的平均放射性，然后乘以100，将凝块单独的吸收(特异性或非特异性)表示为血浆中试验制品的吸收百分率吸收％=滤器上凝块的吸收％—滤器的吸收％x100(已校正本底)将特异性结合百分率规定为放射性吸收，放射性吸收只是由于因子XIIIa在血纤蛋白和试验制品之间形成异肽共价4建引起的。特异性结合是从用放射性标记的试验制品校正本底(硝基纤维素滤膜)后的吸收百分率，减去用放射性同位素标记的对FXIIIa没有亲和力的阴性对照(99mTc-DTPA)修正本底(硝基纤维素滤膜)后的吸收百分率计算的试验制品的特异性结合=试验制品的吸收。/。-DTPA的吸收％(对凝块)(在凝块中)(在凝块中)对体外效力的影响比较"，c-化合物5和"，c-化合物6在体外生成血浆凝块中的吸收数据。在这种凝血模型中，这两种分子(30.66±5.01，与29力9±6.33比较)的效力没有显著性差异(p〉0.Q5)。化合物9是化合物1与所示环肽的缀合物，即[化合物l]-Cys-Cys-Glu-Leu-Cys画Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Ala-Cys-Tyr-OH。化合物9是采用与实施例7和8相似的方法制备的，使用99mTc的溶液(制剂1)标记的，或者利用才艮据实施例IO的冻千试剂盒(制剂2)标记。对于制剂1,将100吗的化合物9溶解在lmlpH8.5的硼酸盐緩冲液中。将该溶液转移到P6瓶中密封。在室温下加入lml9^Tc-高锝酸盐溶液(1.0GBq/ml,来自AmertecII发生器)以及O.lmlSnCl2溶液(10mgSnCl2，溶于100mlN2吹扫过的盐水中)。采用离子室测定放射性。采用ITLC和HPLC测定RCP。制剂1表明，采用ITLC测定，RCP为96%，采用HPLC测定，RCP为82%。图1显示化合物1-6的化学结构。图2显示化合物5的化学结构-肽-鳌合剂缀合物，即Ac漏Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-(I-Tyr)-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-[化合物1〗。图3显示经叠氮化物生成1，1，1-三(2-氨乙基)甲烷的路线。图4显示l，l,1-三(2-氨乙基)甲烷的另一种合成法。权利要求1.化学式如下的化合物HC(CH2CH2NR7R8)3式中R7和R8独立地是H或PG，或R7和R8一起形成PG；其中PG是保护基；或其盐。2.化合物HC(CH2CH2NH2)3。全文摘要本发明涉及改进的化学式(II)的具有生物靶向分子的螯合剂缀合物，其适合与放射性金属生成金属络合物。放射性金属络合物、特别是具有放射性金属^99mTc的放射性金属络合物，适合用作放射性药物。化合物1-6的化学结构。文档编号A61P9/08GK101607913SQ20091020352公开日2009年12月23日申请日期2002年7月10日优先权日2001年7月10日发明者C·M·阿彻尔,H·J·瓦德斯沃斯,T·恩格尔申请人:通用电气健康护理有限公司