专利名称：改进的螯合剂共轭物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用生物靶分子改进的螯合剂共轭物，适合与放射性金属(radiometals)生成络合物。特别是与99mTc的放射性金属络合物，适合用作放射性药物。
背景技术：
二胺二肟是一种已知类型的螯合剂，已经证明它能与放射性金属99mTc生成如下的络合物。
Q＝-(CH2)3-，即亚丙基胺肟或PnAO；Q＝-(CH2)4-，即亚丁基胺肟或BnAO；Q＝-(CH2)5-，即亚戊基胺肟或PentAO；S.Jurisson等人首先公开了配位体PentAO[无机化学(Inorg.Chem.)，26，3576-82(1987)]，他证明，它与长寿命放射性金属99mTc的金属络合物是中性的，具有Tc(V)二氧核心(即TcO2+)。J-MLo等人叙述了PentAO的合成和它与99mTc的络合作用[Appl.Rad.Inst，44，1139-46(1993)]。
US-5688487公开了用于缺氧症成象的二胺二肟螯合物-共轭物，其中包含C2-5亚烷基桥以及硝基咪唑生物靶分子。还叙述了硝基咪唑在C1(肟甲基)位置上的共轭作用。
WO 95/04552公开了BnAO和PentAO的硝基咪唑共轭物。用实施例证明在C1位置(肟甲基)上的轭合作用。
至于用作放射性药物，WO 95/19187公开了线性或环状的3-50个链节的合成肽与固定在肽羧基终端上的多齿螯合剂的共轭物。将PnAO、BnAO、和PentAO等二胺二肟称作适宜的螯合剂。
WO 99/60018公开了用于血栓成象的二胺二肟配位体与肽的二胺二肟螯合物共轭物。声称优选的这类螯合剂是具有Q＝-(CH2)2NR(CH2)2-的二胺二肟。
本发明WO 99/60018的二胺二肟-肽螯合剂共轭物是化学式I 化学式1式中T＝N，Y＝-CH2CH2NH-[肽]，然而它确实具有一些明显的缺点。因此在与99mTc螯合时，这种氮杂-二胺二肟生成几种可以用色谱法分离和检测的锝化合物。在环境温度下，可在(2-3h)时间内，将最初用放射性同位素标记的化合物(中间体)转化成稳定的产品。采用较高的pH(＞pH8)和加热，可以促进这种中间体的转化。在医疗放射性药物学上这些条件是不理想的，因此需要具有较少中间体和/或中间体—产品转化速率较快的螯合剂。显然不希望要求加热和使用可能较高的pH，使所需的99mTc螯合物达到足够的放射化学纯度(RCP)，因为这类加热可以分解固定的生物靶分子或肽。化学式I的氮杂二胺二肟螯合剂的另一个问题，是桥头位置的叔胺氮碱性较强。这意味着在水溶液中生成相应的99mTc络合物时，至少有一部分叔胺发生质子化，结果使共轭物带上电荷。该电荷可以限制所标记的生物靶部分的用途，因为该电荷可以使放射性同位素标记的共轭物更难穿过细胞膜。
本发明提供另一种螯合剂体系(化学式I，式中T＝C)，该体系克服了现有技术的这些问题，并提供一些能用放射性同位素标记的共轭物，以便在室温和水溶液条件下，在接近中性的pH获得优良的RCP。放射性金属络合物的稳定性是优良的。现有技术N2S2和N3S包含硫醇的双官能螯合剂具有一些缺点，硫醇对空气灵敏，在中性到碱性条件下，在空气中能迅速氧化成相应的二硫化物。因此在使用前它们必须保存在惰性气氛中或保存在保护性基质中。采用另一种方法，可以把它们用作被保护的物质，例如硫代乙酸盐或四氢吡喃基半酮缩硫醇，但这些化合物必需在使用前用酸或碱并加热除去保护基。与本发明的螯合剂相比，所有这些特性都降低了这些螯合剂的方便性。因此，本发明的螯合剂适合范围广泛的生物靶部分的轭合作用和用放射性同位素标记。
发明详述在第一个方面，本发明提供具有生物靶部分的二胺二肟配位体螯合剂共轭物。术语“螯合剂共轭物”，系指其中的金属螯合剂是以共价键与生物靶部分结合的(‘轭合的’)化合物。螯合剂共轭物是化学式II的化合物 化学式II式中R1、R2、和R3各自分别是R基；Y是-(A)n-X-Z式中X是-NR4-、-CO2-、-N(C＝S)-、-S(C＝O)-、-S-、或-O-；Z是生物靶部分，R4分别是R基；-(A)n-是连接剂基团，其中每个A分别是-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-NRCO-、-CONR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8亚环杂烷基、C4-8亚环烷基、C5-12亚芳基、C3-12亚杂芳基或聚烷撑二醇、聚乳酸或聚乙醇酸部分；n是0-10的整数值；每个R基分别是H或C1-10烷基、C3-10烷芳基、C2-10烷氧烷基、C1-10羟烷基、C1-10氟代烷基，或2个或多个R基，它们与它们固定在其上的原子一起，形成碳环、杂环、饱和或不饱和的环。
所谓术语“生物靶部分”，系指3-100个链节的肽或肽类似物，它们可以是线性肽或环状肽，或它们的组合；单克隆抗体或其断片；或酶作用物或抑制剂；结合合成受体的化合物；寡核苷酸，或寡-DNA或寡-RNA断片。生物靶部分可以是合成或天然来源的，但优选是合成的。优选的生物靶部分是3-20个链节的肽，它们可以是合成或天然来源的，但优选是合成的。所谓术语“环状肽”，系指5-15个氨基酸的排序，其中二个终端氨基酸是通过共价键结合起来的，共价键可以是肽键或二硫键或合成的非肽键，例如硫醚、磷酸二酯、二硅氧烷、或尿烷键。
所谓术语“氨基酸”，系指L-或D-氨基酸，氨基酸类似物或拟态氨基酸(amino acid mimetic)，它们可以是天然产生的，或合成来源纯化的，纯度可以是任选的，即单对映体，因而是手性的，或对映体的混合物。本发明的氨基酸优选是任选纯度的。所谓术语“拟态氨基酸”，系指合成的天然氨基酸类似物，它们是电子等排物，即用来模拟天然化合物的空间和电子结构。对本领域的技术人员而言，这些电子等排物是众所周知的，它们包括但不限于depsipeptides、retro-inverso肽、硫代酰胺、环烷、或1，5-二取代的四唑[参见M.Goodman，生物聚合物(Biopolymers)，24，137，(1985)]。
适合本发明使用的肽包括—生长激素释放抑制因子、octreotide、和类似物，—与ST受体结合的肽，其中ST系指由大肠杆菌和其它微生物产生的热稳定的毒素；—昆布氨酸断片，例如YIGSR、PDSGR、IKVAV、LRE、和KCQAGTFALRGDPQG，—N-甲酰肽，用于白细胞堆积物的靶位置，—血小板因子4(PF4)和其断片—包含RGD的肽，—α2-抗血纤维蛋白酶、粘连蛋白或β-酪蛋白、血纤维蛋白原或thrombospondin的肽断片。α2-抗血纤维蛋白酶、粘连蛋白、β-酪蛋白、血纤维蛋白原和thrombospondin的氨基酸排序可以在下列文献中找到α2-抗血纤维蛋白酶母体[M.Tone等人，生物化学杂志(J.Biochem.)，102，1033，(1987)]；β-酪蛋白[L.Hansson等人，基因(Gene)，139，193，(1994)]；粘连蛋白[A.Gutman等人，FEBS Lett.，207，145，(1996)]；thrombospondin-1母体[V.Dixit等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，83，5449，(1986)]；R.F.Doolittle，Ann.Rev.Biochem.，53，195，(1984)。
本发明的肽优选包括根据下列N-终端进行的氨基酸排序(i)α2-抗血纤维蛋白酶，即NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH或其变种，其中已经交换，加入或除去一种或多种氨基酸，例如NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH，NH2-Asn-Gln-Glu-Ala-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH，NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Gly-OH；或(ii)酪蛋白即Ac-Leu-Gly-Pro-Gly-Gln-Ser-Lys-Val-Ile-Gly。
本发明的合成肽可以采用常规固相合成方法制备，在P.Lloyd-Williams，F.Albericio和E.Girald所著合成肽和蛋白质的化学方法，CRC Press，1997中，叙述了这种方法。
适合在本发明中使用的单克隆抗体或其断片包括对在B-细胞表面上表达的CD-20抗原的抗体；抗白细胞(antileucocyte)或抗粒性白细胞的抗体；抗阻凝蛋白的抗体或对癌胚抗原(CEA)的抗体。
适宜的酶作用物或抑制剂包括葡萄糖和葡萄糖类似物，例如氟代脱氧葡萄糖；脂肪酸或弹性蛋白酶抑制剂。
适合结合合成受体的化合物，包括雌二醇、雌激素、黄体酮(progestin)、黄体酮(progesterone)、和其它类固醇激素；对多巴胺D-1或D-2受体的配位体，或多巴胺运输者，例如托烷；和血清素受体配位体。
所谓术语“氟代烷基”，系指具有至少一个氟取代基的烷基，即该术语包括从一氟代烷基(例如-CH2F)到全氟烷基(例如CF3)的基团。
在本发明的二胺二肟螯合剂中，R3优选是H。还优选至少一个R2基是H，更优选所有的R2基是H。每个R1优选是C1-3烷基、C2-4烷氧烷基、C1-3羟烷基、或C1-3氟代烷基，最优选C1-3烷基或C1-3氟烷基。尤其最优选所有的R1基是CH3。
优选的化学式II的螯合剂共轭物，其中2个或多个R基，与它们固定在其上的原子一起，形成碳环、杂环、饱和或不饱和的环，这些螯合剂共轭物包括具有3-6个原子，特别是5-6个原子的这些环。最优选的这些环，是饱和的碳环。优选的碳环是固定在相同或邻接碳原子上的2R1基结合起来，形成的3-6个原子，特别是5或6个原子的饱和环。
发明人设想，连接剂基团-(A)n的作用是将体积较大的放射性金属络合物隔开，这些络合物是利用金属配位作用由生物靶部分的活性位置生成的，所以，例如受体的结合并未削弱。这种作用可以通过挠性结合(例如简单的烷基链)来实现，使体积大的基团对其本身远离活性位置和/或刚性的位置，例如对取向于远离活性位置的金属络合物的环烷基或芳基隔离基的位置，具有自由度。也可以利用连接剂基团的性质改进所得的共轭物放射性金属络合物的生物分布(biodistribution)。因此，例如在连接剂中引入醚基团有助于减少结合的血浆蛋白。优选的连接剂基团-(A)n，具有构成-(A)n部分的被连接原子的主链，其中包含2-10个原子，最优选2-5个原子，特别优选2-3个原子。2个原子的最小连接剂基团主链具有一些优点，螯合剂能与生物靶部分完全分离，所以能将任何相互作用减小到最小。另一个优点是，X和Z基团可能的螯合物环尺寸是很大的(对于2原子主链至少8)，以致这些基团不可能有效地与螯合剂竞争对放射性金属的配位。这样，在这种类型的共轭物中就能保持生物靶部分的生物靶特性，和二胺二肟螯合剂络合金属的能力。
亚烷基或亚芳基等非肽连接剂基团也具有一些优点，与轭合的生物靶部分没有明显的氢键相互作用，所以连接剂不会环绕在生物靶部分上。优选的亚烷基隔离基是-(CH2)n-，其中n是2-5。优选的亚芳基隔离基的化学式如下
式中a和b分别是0、1、和2。
因此优选的Y基是-CH2CH2-X-Z，最优选-CH2CH2-NR4-Z，尤其最优选Y＝-CH2CH2-NH-Z。该基团具有另一个优点，它来源于中间体R3C(CH2CH2NH2)3，优选中间体HC(CH2CH2NH2)3，它是对称的，它的合成要容易得多，因为具有不同链长的三胺要求使用在化学上能区别不同胺(例如通过保护基)的合成方案。
基团X是官能团，它很容易使螯合剂与生物靶部分Z具有轭合作用。由于大多数肽和蛋白质都具有可用于官能化的羧基或氨基位置，当Z是肽和蛋白质时，优选的X基团是-NR4-和-CO2-，因为这些基团容易通过酰胺键轭合，所以包含半胱氨酸的肽和蛋白质可以具有游离的硫醇基团，当Z是包含半胱氨酸的肽和蛋白质时，优选的X基团是亲硫醇的(thiolphilic)基团，例如马来酰亚胺和丙烯酰胺，因为这些基团容易通过硫醚键轭合。
本发明优选的二胺二肟螯合剂是对称的，即选择在-CY(R3)-部分上的二个-CR22R22NHCR12C(＝N-OH)R1取代基是相同的。这有优点，螯合剂不包含手性中心，因为这些中心可以产生非对映的放射性金属络合物，并可能要求纯化特定的异构体。
可以任选以酸性盐形式使用化学式II的螯合剂共轭物，即在用生物兼容的酸使二胺二肟供体位置上或Y基团的一个或多个胺发生质子化的场合。例如采用在流动相中使用这些酸(例如乙酸或三氟乙酸)的HPLC纯化方法，或将生物兼容的酸加到螯合剂共轭物中，都可以直接获得这些盐类。盐的适宜形式有助于纯化(例如通过沉淀或重结晶)或有利于溶解在水介质中(此后如果需要，可以很容易地调节pH)。
本发明的螯合剂共轭物，可以通过化学式III的二官能螯合物与生物靶部分反应制备 化学式III
式中R1、R2和R3各自分别是R基团；E是-(A)n-J式中J是适合与Z轭合的官能团；-(A)n-是连接剂基团，其中每个A分别是-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-NRCO-、-CONR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8亚环杂烷基、C4-8亚环烷基、C5-12亚芳基、C3-12亚杂芳基或聚烷撑二醇、聚乳酸或聚乙醇酸部分；n是0-10的整数值；每个R基分别是H或C1-10烷基、C3-10烷芳基、C2-10烷氧烷基、C1-10羟烷基、C1-10氟代烷基，或2个或多个R基团，它们与它们固定在其上的原子一起，生成碳环、杂环、饱和或不饱和的环。
所谓术语“适合轭合的官能团”，系指与相应的Z官能团(一般是胺、羧基、或硫醇基团)反应，使二胺二肟螯合剂与Z发生化学结合的官能团。优选的这些适合轭合的官能团是-NR5R6、-CO2M、-NCS、-NCO、-SM1、-OM1、马来酰亚胺或丙烯酰胺，其中R5和R6分别是R基或PG；M是H、阳离子、PG或活性酯；M1是H或PG；和PG是保护基。阳离子适合是带正电荷的反离子，例如金属离子、铵(NH4+)或季铵或离子。阳离子优选是生物兼容的阳离子。术语‘生物兼容的阳离子’、‘活性酯’、和‘保护基’与下面定义的相同。当官能团是-NR5R6时，R5和R6至少其中之一是H，优选R5和R6二者都是H。
所谓术语“保护基”，系指能抑制或降低不希望的化学反应的基团，但设计该基团具有足够的活性，在不会改变其余分子的足够缓和的条件下，该基团可以与上述的官能团分离开。在去掉保护以后，可以采用上述的基团使化学式III的双官能螯合物与生物兼容的靶部分轭合。对本领域的技术人员而言，保护基是众所周知的，当J是-NR5R6时，保护基适合选自Boc(这里Boc是叔丁氧羰基)、Fmoc(这里Fmoc是芴基甲氧羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧羰基、Dde[即1-(4，4-二甲基-2，6-二氧杂亚环己基)乙基]或Npy s(即3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)；和当J是-CO2PG时，选自甲酯、叔丁酯、和苄酯，当J是-OPG时，适宜的保护基是乙酰基、苯甲酰基、三苯甲基(Trt)或四丁基二甲基甲硅烷基。当J是-SPG时，适宜的保护基是三苯甲基、和4-甲氧苄基。在Theorodora W.Greene、和Peter G.M.Wuts所著的‘在有机合成中的保护基’(John Wiley & Sons，1991)中，叙述了对另一些保护基的使用。
所谓术语“生物兼容的阳离子”，系指带正电荷的反离子，它们与电离的带负电荷的基团生成盐，在所述的带正电荷的反离子也是无毒的场合，它们适合用于哺乳动物体，特别是人体的给药。适宜的生物兼容的阳离子的实例包括碱金属(例如钠或钾)；碱土金属(例如钙或镁)；和铵离子。优选的生物兼容的阳离子是钠离子(Na+)。
所谓术语“活性酯”，系指羧酸的酯衍生物，设计它们是较好的离去基团，因此它们更容易与在生物靶部分上存在的亲核体例如胺反应。适宜的活性酯的实例是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、五氟酚、五氟硫酚、对硝基酚、和羟基苯并三唑因此可以使化学式III胺官能化的螯合剂(即J＝-NR5R6)，通过酰胺键与生物靶部分的羧基轭合。这种偶合可以直接进行(例如采用固相的肽合成)或在适宜的活化剂例如BOP[即苯并三唑-1-基氧-三(二甲氨基)-]或N，N′-二环己基碳二亚胺(DCCI)存在下进行。这种偶合也可以利用本领域已知的适宜的中间体进行，例如利用活化的生物靶部分羧基的酯类进行。另一种方法，可以首先将双官能螯合剂的侧胺基转化成异硫氰酸酯基团(-NCS)或异氰酸酯基团(-NCO)。这些基团通过分别生成硫脲和尿素键与包含胺的生物靶部分轭合。另一种方法，可以使双官能螯合剂的侧胺基与二酸反应，通过连接剂基团引入终端羧基。在类似的方法中，可以使用包含羧基官能团(即J＝-CO2M)的双官能螯合剂，通过酰胺键直接与包含胺的生物靶部分偶合。双官能螯合物也可以包含设计与生物靶部分上的硫醇基团反应的基团，生成稳定的硫醚键。这些基团的实例是马来酰亚胺(可以通过马来酸酐与相应的胺反应，然后加热与乙酸酐反应制备)、和丙烯酰胺(可以通过烯丙酰氯与胺反应制备)。
在第二个方面，本发明提供上述螯合剂共轭物的放射性金属络合物。适宜的放射性金属可以是正电子发射体，例如64Cu、48V、52Fe、55Co、94mTc、或68Ga；或γ-发射体例如99mTc、111In、113mIn、或67Ga。对于诊断成象，最优选的放射性金属是γ-发射体，特别是99mTc。某些放射性核素的金属络合物，作为放射性治疗癌症等各种疾病或治疗血栓症或再狭窄的放射性药物是有效的。适合这些放射性治疗应用的同位素包括90Y、89Sr、67Cu、103Pd、186Re、188Re、169Er、153Sm、和198Au。更优选使生物靶部分Z以这样的方式与螯合剂结合，使这种键不容易在血液中进行新陈代谢，新陈代谢会造成金属络合物在标记的生物靶部分在生物体内达到所需的靶位置之前分离开。因此生物靶部分优选通过不容易新陈代谢的键(例如该键是酯键)与本发明的金属络合物共价结合。
本发明优选的放射性金属络合物是对称的，即选择在-CY(R3)-部分上的二-CR22R22NHCR12C(＝N-OH)R1取代基是相同。其优点是放射性金属络合物不包含手性中心，因为这些中心可以产生非对映异构的放射性金属络合物和可能要求纯化特定的异构体。还优选螯合剂共轭物的放射性金属络合物是电中性的。
相信本发明螯合剂的99mTc络合物是中性的，Tc(V)二氧络合 物如上所示。
在本发明的99mTc-二胺二肟络合物中，R3优选是H。还优选至少一个R2基是H。更优选所有的R2基是H，每个R1优选是C1-3烷基、C2-4烷氧烷基、C1-3羟烷基、或C1-3氟代烷基，最优选C1-3烷基或C1-3氟代烷基。尤其特别优选所有的R1基都是CH3。对于99mTc络合物，优选的Y基与上面对螯合剂共轭物所述的相同。
本发明优选的放射性金属络合物，其中2个或多个R基与它们固定在其上的原子一起，生成碳环、杂环、饱和或不饱和的环，这些放射性金属络合物包括具有3-6个原子，特别是5或6个原子的这些环。最优选的这些环是饱和的碳环。优选的碳环是其中固定在相同或邻接碳原子上的2R1基结合起来，生成3-6个原子，特别是5或6个原子的饱和环。
可以使适宜氧化状态的放射性金属的溶液在适宜的pH下与螯合物共轭物反应，制备本发明的放射性金属络合物。该溶液可以优选包含对金属络合弱的配位体(例如葡萄糖酸盐或柠檬酸盐)，即放射性金属络合物是通过配位体交换或螯合转移(transchelation)制备的。这些条件对降低金属离子水解等不希望的副反应是有效的。当放射性金属离子是99mTc时，常用的起始材料是来自99Mo发生器的高锝酸盐。锝在99mTc高锝酸盐中以Tc(VII)氧化状态存在，是相对不活泼的。因此Tc(I)-Tc(V)较低氧化状态锝络合物的制备，通常要求加入药物学上可接受的适宜还原剂，例如连二亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、甲脒硫酸、亚锡离子、Fe(II)或Cu(I)，以有利于络合。药物学上可接受的还原剂优选亚锡盐，最优选氯化亚锡、氟化亚锡、或酒石酸亚锡。
在第三个方面，本发明提供放射性药物，其中包括适合人体给药的无菌形式的上述螯合剂共轭物的放射性金属络合物。这些放射性药物适合以密封容器提供，该密封容器适合用皮下注射针能在一处或多处(例如在隔膜密封物上起褶皱处)刺穿，同时又保持整体是无菌的。这些容器可以装有一个或多个患者的剂量。优选的多剂量容器包括一个装有多个患者剂量的大容积的玻璃瓶(例如容积10-30cm3)，因此可以在制剂适合临床情况的切实可行的使用期限内，按不同的时间间隔将单个患者的剂量从其中抽到临床级的注射器中。将预充填注射器设计容纳一个人的剂量，因此优选一次性使用的注射器，或适合临床使用的其它注射器。预充填注射器可以任选具有注射器防护罩，保护操作人员免受放射性剂量的辐射。这些适宜的放射性药物注射器防护罩在本领域是已知的，优选其中包括铅或钨。
适合诊断成象的放射性药物的99mTc放射性含量，是180-1500MBq，视在生物体内成象的位置、吸收、和靶对本底的比例而定。就使用99mTc放射性药物进行心脏成象而言，对应激反应的研究可以使用约1110MBq(30mCi)，对于其余的研究可以使用约350MBq(10mCi)。
在第四个方面，本发明提供制备99mTc放射性药物组合物的无放射性的工具。设计这些工具用来获得适合人体给药的无菌的放射性药品，例如直接注射到血流中的药品。对于99mTc，工具优选是冻干的，用于重组来自99mTc放射性同位素发生器无菌的99mTc-高锝酸盐(TcO4)，获得适合人体给药的溶液，而不需进一步处理。适宜的工具包括容器(例如用隔膜密封的玻璃瓶)，其中装有游离碱或酸性盐形式的化学式II的螯合剂共轭物，以及药物学上可接受的还原剂，例如连二亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、甲脒硫酸、亚锡离子、Fe(II)或Cu(I)。药物学上可接受的还原剂优选亚锡盐，例如氯化亚锡或酒石酸亚锡。采用另一种方案，工具可以任选包含金属络合物，当加入放射性金属时，金属络合物会发生金属转移作用(transmetallation)(即金属交换)，获得所需的产品。
非放射性工具还可以任选包括附加成分，例如转移螯合剂(transchelator)、辐射防护剂、抗微生物保存剂、pH调节剂或填充剂。“转移螯合剂”是能与锝迅速反应生成弱络合物，然后被二胺二肟置换的化合物。由于高锝酸盐的迅速还原与锝的络合作用进行竞争，所以将生成已还原的水解锝(RHT)的危险性降低到最小。这类适宜的转移螯合剂，是弱有机酸即pKa为3-7的有机酸与生物兼容阳离子的盐。这类适宜的弱有机酸是乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、葡庚糖酸、苯甲酸、酚或膦酸。因此，适宜的盐是乙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡萄糖酸盐、葡庚糖酸盐、苯甲酸盐、酚盐或膦酸盐。优选的这类盐是酒石酸盐、葡萄糖酸盐、葡庚糖酸盐、苯甲酸盐、或膦酸盐，最优选膦酸盐，尤其最优选二磷酸盐。优选的这类转移螯合剂，是MDP即亚甲基二膦酸与生物兼容阳离子的盐。
所谓术语“辐射防护剂”，系指能通过捕获高活性的游离基，例如水辐射分解产生的含氧游离基，抑制氧化还原过程等降解反应的化合物。本发明的辐射防护剂适合选自抗坏血酸、对氨基苯甲酸(即4-氨基苯甲酸)、龙胆酸(即2，5-二羟基苯甲酸)、和它们与上述生物兼容阳离子的盐类。
所谓术语“抗微生物保存剂”，系指抑制可能有害的微生物例如细菌、酵母菌、或霉菌生长的试剂。抗微生物保存剂也可以具有一些杀菌的性能，这取决于剂量。本发明的抗微生物保存剂的主要作用，是抑制任何这类微生物在放射性药物组合物后重组过程中，即在放射性诊断产品本身内的生长。然而，还可以在重组前任选使用抗微生物保存剂抑制可能有害的微生物在本发明的非放射性工具的一种或多种成分中生长。适宜的抗微生物保存剂包括对羟基苯甲酸酯，即对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、或丁酯，或它们的混合物；苄醇；酚；甲酚；溴棕三甲铵、和乙基汞硫代水杨酸钠。优选的抗微生物保存剂是对羟基苯甲酸酯。
术语“pH调节剂”，系指用来确保重组工具的pH在人或哺乳动物给药可接受范围(pH约4.0-10.5)内的化合物或化合物混合物。适宜的这类pH调节剂包括药物学上可接受的缓冲剂，例如麦黄酮、磷酸盐、或TRIS[即三(羟甲基)氨基甲烷]，和药物学上可接受的碱，例如碳酸钠、碳酸氢钠、或它们的混合物。当以酸性盐形式使用化学式II的共轭物时，可任选在一个单独的玻璃瓶或容器中提供pH调节剂，所以工具的使用者可以调节pH，将其作为多个操作步骤的一部分。
所谓术语“填充剂”，系指在药物学上可接受的增量剂(bulkingagent)，它使材料在生产和冻干过程中容易处理。适宜的填充剂包括无机盐类，例如氯化钠、和水溶性的糖类，例如蔗糖、麦芽糖、或海藻糖。
在第五个方面，本发明提供适合制备螯合剂-生物靶部分共轭物的双官能二胺二肟螯合剂，其化学式III是 化学式III式中R1、R2、和R3各自分别是R基；E是-(A)n-J式中J是适合与Z轭合的官能团；-(A)n-是连接剂基团，其中每个A分别是-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-NRCO-、-CONR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8亚环杂烷基、C4-8亚环烷基、C5-12亚芳基、C3-12亚杂芳基或聚烷撑二醇、聚乳酸或聚乙醇酸部分；n是0-10的整数值；每个R基分别是H或C1-10烷基、C3-10烷芳基、C2-10烷氧烷基、C1-10羟烷基、C1-10氟代烷基，或2个或多个R基，它们与它们固定在其上的原子一起，生成碳环、杂环、饱和或不饱和的环。
所谓术语“适合轭合的官能团”，系指能与相应的Z官能团(一般是胺、羧基、或硫醇基团)反应，使二胺二肟螯合剂与Z发生化学结合的官能团。优选的适合轭合的这类官能团是-NR5R6、-CO2M、-NCS、-NCO、-SM1、-OM1、马来酰亚胺、或丙烯酰胺，其中R5和R6分别是R基或PG；M是H、阳离子、PG或活性酯；M1是H或PG和PG是保护基。阳离子适合是带正电荷的反离子，例如金属离子、铵(NH4+)或季铵、或 离子。阳离子优选是生物兼容的阳离子。术语“生物兼容的阳离子”、“活性酯”、和“保护基”与上面定义的相同。当官能团是-NR5R6时，至少R5和R6之一是H，优选R5和R6二者都是H。
在本发明化学式III的双官能螯合剂中，R3优选是H。还优选至少一个R2基是H，更优选所有的R2基都是H。每个R1优选是C1-3烷基、C2-4烷氧烷基、C1-3羟烷基、或C1-3氟代烷基，最优选是C1-3烷基或C1-3氟代烷基。尤其最优选所有的R1基都是CH3。
优选的双官能螯合剂，其中2个或多个R基与它们固定在其上的原子一起，生成碳环、杂环、饱和或不饱和的环，这些双官能螯合剂包括具有3-6个原子，特别是5或6个原子的这些环。最优选的这些环是饱和的碳环。优选的碳环是其中固定在相同或邻接碳原子上的2R1基团结合起来，生成3-6个，特别是5或6个原子的饱和碳环。
任选以酸性盐的形式，即在二胺二肟的共体位置上或Y基团中的一个或多个胺用生物兼容的酸质子化的场合，可以使用化学式III的螯合剂共轭物。这些盐可以例如采用HPLC纯化在流动相中使用的这些酸(例如乙酸或三氟乙酸)，或在螯合剂共轭物溶液中加入生物兼容的酸直接获得。盐的形式可以有效地帮助纯化(例如通过沉淀或重结晶)，或可以有助于溶解在水溶性介质中(此后如果需要，可以很容易调节pH)。
双官能螯合剂优选的连接剂基团-(A)n，具有连接构成-(A)n部分的原子的主链，其中包含2-10个原子，最优选2-5个原子，特别优选2或3个原子。2个原子的最小连接剂基团主链具有一些优点，在轭合以后，螯合剂与生物靶部分完全分离，所以能将相互作用减小到最小。另一个优点是，X和Z基团的螯合物环尺寸可能很大(对2个原子的主链至少8)，以致这些基团不可能与螯合剂有效地竞争对放射性金属的配位。
非肽连接剂基团例如亚烷基或亚芳基具有一些优点，与轭合的生物靶部分没有明显的氢键相互作用，所以连接剂不会围绕在生物靶的周围。在n是2-5时，优选的亚烷基隔离基是-(CH2)n-。优选的亚芳基隔离基的化学式如下 式中a和b分别是0、1、和2。
因此优选的E基团是-CH2CH2-J，最优选-CH2CH2-NHR5或-CH2CH2-CO2H，或其活性酯，特别优选E＝-CH2CH2-NH2。也可以通过例如与氯甲酸异丁酯和碱反应，将酸转化成混合的酸酐。混合的酸酐也与胺等亲核体反应。基团E＝-CH2CH2-NH2具有另一些优点，它来源于中间体R3C(CH2CH2NH2)3，优选中间体HC(CH2CH2NH2)3，它是对称的，由于具有不同链长的三胺要求采用在化学上能区别不同胺的合成方案(例如通过保护基)，所以它的合成容易得多。
本发明化学式III优选的双官能二胺二肟螯合剂是对称的，即选择-CY(R3)-部分上的二个-C(R2)2(R2)2NHCR12C(＝N-OH)R1取代基是相同的。这有一些优点，螯合剂不包含手性中心，因为这些中心可以生成非对映的放射性金属络合物，并可能要求纯化特定的异构体。特别优选的双官能二胺二肟螯合剂的化学式如下
这种化合物的酸性盐也在本发明的范围内。
本发明的双官能二胺二肟螯合剂适合使用下列化合物(i)适宜的氯亚硝基(chloronitroso)衍生物Cl-C(R1)2-CH(NO)R1；(ii)化学式Cl-C(R1)2-C＝NOH)R1的α-氯肟(chloro-oxime)；(iii)化学式Br-C(R1)2-C(＝O)R1的α-溴酮，然后用羟胺将二胺二酮产物转化成二胺二肟。
使化学式IV的化合物烷基化制备 化学式IV式中A、J、R2、R3和n与上面对化学式III定义的相同，S.Jurisson等人叙述了合成路线(i)[无机化学，26，3576-82(1987)]。采用实施例3中所述的亚硝酰氯(NOCl)处理适宜的链烯可以获得氯亚硝基化合物。Ramalingam，K.等人在合成通讯(Synth.Commun.，)，25(5)，743-52(1995)中；Glaser等人在有机化学杂志(J.Org.Chem.)，61(3)，1047-48(1996)中；Clapp，Leallyn B.等人在有机化学杂志，36(8)，1169-70(1971)中；Saito，Giulichi等人在Shizen Kagaku，47，41-9(1995)中；和Schulz，Mantred Z.在化学(Chem.)，21(11)，404-5(1981)中，给出合成氯亚硝基化合物更详细的资料。Nowotnik等人采用广泛的术语叙述了合成路线(iii)[四面体(Tetrahedron)，50(29)，p.8617-8632(1994)]。α-氯-肟可以通过相应的α-氯-酮或α-氯-醛的肟化获得，它们可以在市场上买到。α-溴酮也可以在市场上买到。
当J是-NH2时，化学式IV的三胺首先可以任选是单保护的(mono-protected)，使J基团的伯胺被保护。然后根据上述的路线(i)、(ii)、和(iii)制备二胺二肟，然后除掉保护基。适宜的保护基在本领域是已知的，其中包括上述的BOC(即叔丁氧羰基)或Fmoc。
化学式IV的化合物适合由HC(CH2CH2OAc)3制备，该方法是将一种或多种乙酸酯水解成伯醇，并用甲烷磺酰氯和吡啶将其转化成离去基团例如甲烷磺酸酯。然后可以用可以转化成所需官能度的适宜亲核体置换这个离去基团。采用氰化物阴离子产生羧酸(即J＝-CO2H)。氰化物的酸性水解会产生所需的羧酸。为了产生胺，采用氮化物亲核体生成烷基氮化物。烷基氮化物氢化生成胺。为了产生硫醇，(即J＝-SH)，用硫代乙酸阴离子置换离去基团，获得硫代乙酸酯，在酸性水解时硫代乙酸酯就生成硫醇。
在另一个方面，本发明提供化学式V的化合物HC(CH2CH2NR7R8)3化学式V式中R7和R8分别是H或PG，或R7和R8一起生成PG；或其盐。
PG是上面定义的保护基。对于本发明的双官能螯合剂范围，化学式V的化合物是有效的母体。优选的化学式V的化合物是HC(CH2CH2NH2)2(CH2CH2NR7R8)，即上述单保护的三胺。最优选所有的R7和R8基都是H，即本发明最优选的化合物是化合物HC(CH2CH2NH2)3或其酸式盐。
图1示出化合物1-6的化学结构。图2详细地示出化合物V的化学结构。图3示出采用氮化物合成实施例1的1，1，1-三(2-氨基乙基)胺的反应流程示意图。图4示出采用另一种方法合成实施例2的1，1，1-三(2-氨基乙基)胺的反应流程示意图。
下面采用详细的非限制性实施例说明本发明。实施例1叙述了新化合物1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷的合成。实施例2提供1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷的另一种合成方法，该方法避免使用可能有危险的氮化物中间体。实施例3叙述了各种氯亚硝基烷烃母体的合成。实施例4叙述了本发明优选的胺取代双官能二胺二肟(化合物1)的合成。实施例5叙述了化合物1的苯甲酰胺共轭物(化合物2)的合成。实施例6示出如何能引入隔离基，它能有效地将双官能螯合剂终端的胺官能转化成终端的羧基官能。实施例7叙述了血栓靶肽的固相合成。实施例8提供用靶肽合成化合物5即化合物1共轭物的方法。实施例9叙述了化合物7和8的合成，它们是包含环结构的二胺二肟类似物。
实施例10将用99mTc放射同位素标记化合物2与用99mTc放射同位素标记氮杂类似物——现有技术的螯合物(化合物3)进行比较，实施例10表明，在中等条件即室温和碱性较低的pH下标记，本发明的螯合剂比现有技术的螯合物更有效和更迅速得多。因此，在室温下现有技术的螯合剂需要pH10和至少120min的时间才能达到超过80％的RCP，而标记化合物3在15min内就能达到95％RCP。实施例11表明，化合物5用99mTc标记，能获得高放射化学纯度的制剂。实施例12示出99mTc标记的化合物5与现有技术的化合物——99mTc-化合物6在生物体外对血凝块吸收的比较，实施例12表明，当其与本发明的二胺二肟螯合剂轭合时，仍然保留了肽的生物靶性质。实施例13示出在适度条件下用99mTc放射性同位素标记化合物9，化合物9是具有环状肽的化合物1的共轭物，其中具有比较灵敏的二硫化物键。
实施例11，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷的合成。
步骤1(a)3(甲氧羰基亚甲基)戊二酸二甲酯。
采用3-α-氧代戊二酸二甲酯(87g，0.5mol)处理甲酯基亚甲基三苯基正膦(167g，0.5mol)，用120℃的油浴将反应加热到100℃，在氮气氛中保持36h。然后将反应在真空中浓缩，含油的残余物用600ml 40/60石油醚(petrol ether)/二乙基醚1∶1磨碎。沉淀出氧化三苯膦，倾析/过滤出上清液。真空蒸发残余物是在高真空Bpt(沸点)(在0.2torr下炉温180-200℃)下用库格尔若蒸馏器(Kugelrohr)蒸馏，获得3-(甲氧羰基亚甲基)戊二酸二甲酯(89.08g，53％)。
NMR1H(CDCl3)δ3.31(2H，s，CH2)，3.7(9H，s，3xOCH3)，3.87(2H，s，CH2)，5.79(1H，s，＝CH)ppm。
NMR13C(CDCl3)，δ36.56，CH3，48.7，2xCH3，52.09和52.5(2xCH2)；122.3和146.16C＝CH；165.9，170.0和170.5 3xCOO ppm。
步骤1(b)3-(甲氧羰基亚甲基)戊二酸二甲酯的氢化。
在氢气体(3.5bar)气氛中将3-(甲氧羰基亚甲基)戊二酸二甲基酯(89g，267mmol)的甲醇(200ml)溶液与(10％的炭载钯50％水)(9g)振荡(30h)。通过硅藻土过滤溶液，在真空中浓缩，获得3-(甲氧羰基甲基)戊二酸二甲酯油产品(84.9g，94％)。
NMR1H(CDCl3)，δ2.48(6H，d，J＝8Hz，3xCH2)，2.78(1H，hextet，J＝8Hz，CH，)3.7(9H，s，3xCH3)。
NMR13C(CDCl3)，δ28.6，CH；37.50，3xCH3；51.6，3xCH2；172.28，3xCOO。
步骤1(c)将三甲酯还原和酯化成三乙酸酯在2L的3颈圆底烧瓶中，在氮气氛中，用三(甲氧羰基甲基)甲烷(40g，212mmol)的四氢呋喃(200ml)溶液，小心处理氢化铝锂(20g，588mmol)四氢呋喃(400ml)溶液1h。发生强烈的放热反应，使溶剂大量回流。用油浴将反应加热到90℃，回流3天。小心滴加乙酸(100ml)冷却反应，直到停止放出氢为止。在引起适当回流的速率下，用乙酸酐溶液(500ml)小心地处理搅拌的反应混合物。装备烧瓶进行蒸馏，搅拌，然后加热到90℃(油浴温度)，蒸馏出四氢呋喃。加入另一部分乙酸酐(300ml)，反应返回到回流状态，搅拌，用油浴加热到140℃，保持5h。使反应冷却并过滤。用乙酸乙酯洗涤氧化铝沉淀物，合并的滤液用旋转式蒸发器在真空(5mmHg)中浓缩，水浴温度50℃，得到油。将油吸收到乙酸乙酯(500ml)中，用饱和碳酸钾水溶液洗涤。分离乙酸乙酯溶液，在硫酸钠上干燥，在真空中浓缩，得到油。用库格尔若蒸馏器在高真空下蒸馏该油，获得三(2-乙酰氧基乙基)甲烷(45.3g，95.9％)油。在0.1mmHg下沸点(Bp.)220℃。
NMR1H(CDCl3)，δ1.66(7H，m，3xCH2，CH)，2.08(1H，s，3xCH3)；4.1(6H，t，3xCH2O)。
NMR13C(CDCl3)，δ20.9，CH3；29.34，CH；32.17，CH2；62.15，CH2O；171，CO。
步骤1(d)从三乙酸酯中除去乙酸酯基团用油浴将三(2-乙酰氧基乙基)甲烷(45.3g，165mM)的甲醇(200ml)和880氨(100ml)溶液加热到80℃，保持2天。用另一部分880氨(50ml)处理反应，用油浴加热到80℃，保持24h。加入另一部分880氨(50ml)，将反应加热到80℃，保持24h。然后将反应在真空中浓缩，除去所有的溶剂，得到油。将该油吸收到880氨(150ml)中，加热到80℃，保持24h。然后将反应在真空中浓缩，除去所有的溶剂，得到油。用库格尔若蒸馏器蒸馏，获得乙酰胺，在0.2mm下，沸点170-180℃。将包含气泡的乙酰胺洗涤干净，继续蒸馏。三(2-羟乙基)甲烷(22.53g，92％)在0.2mm沸点220℃下蒸馏。
NMR1H(CDCl3)，δ1.45(6H，q，3xCH2)，2.2(1H，quintel，CH)；3.7(6H，t，3xCH2OH)；5.5(3H，brs，3xOH)。
NMR13C(CDCl3)，δ22.13，CH；33.95，3xCH2；57.8，3xCH2OH。
步骤1(e)将三元醇转化成三(甲烷磺酸盐)。
在氮气氛中在搅拌下，在冰冷却的三(2-羟乙基)甲烷(10g，0.0676mol)二氯甲烷(50ml)溶液中，以温度不升高到15℃以上的速率，缓慢地滴加甲烷磺酰氯(40g，0.349mol)二氯甲烷(50ml)溶液。然后以温度不升高到15℃以上的速率，滴加溶解在二氯甲烷(50ml)中的吡啶(21.4g，0.27mol，4eq)，发生放热反应。反应保持在室温下搅拌24h，然后用5N盐酸溶液(80ml)处理，分层。水溶液层用另一份二氯甲烷(50ml)萃取，合并有机萃取物，在硫酸钠上干燥，过滤，在真空中浓缩，获得含有过量甲烷磺酰氯杂质的三[2-(甲基磺酰氧基(methylsulphonyloxy))乙基]甲烷，理论产量是25.8g。
NMR1H(CDCl3)，δ4.3(6H，t，2xCH2)，3.0(9H，s，3xCH3)2(1H，hextet，CH)，1.85(6H，q，3xCH2)。
步骤1(f)1，1，1-三(2-叠氮基乙基)甲烷的制备。
在氮气中搅拌三[2-(甲基磺酰氧基)乙基]甲烷[来自步骤1(e)，含有过量的甲基磺酰氯杂质](25.8g，67mmol，理论量)的无水DMF(250ml)溶液，用氮化钠(30.7g，0.47mol)分批处理15min。观测到放热，用冰浴冷却反应。在30min后，用油浴将反应混合物加热到50℃，保持24h。反应混合物变成棕色。使反应冷却，用碳酸钾稀溶液(200ml)处理，用40/60石油醚/二乙基醚10∶1(3×150ml)萃取三次。用水(2×150ml)洗涤有机萃取物，在硫酸钠上干燥，过滤。在石油/乙醚溶液中加入乙醇(200ml)，使三氮化物保持在溶液中，在真空中将体积缩小到不低于200ml，加入乙醇(200ml)，在真空中重新浓缩，除去最后留在不低于200ml乙醇溶液中的痕量石油。这种三氮化物乙醇溶液直接在步骤1(g)中使用。
注意不要除去所有的溶剂，因为氮化物有可能爆炸，在任何时候氮化物都应保存在稀溶液中。
在真空中蒸发不到0.2ml的溶液，除去乙醇，用NMR分析这个小试样。
NMR1H(CDCl3)，δ3.35(6H，t，3xCH2)，1.8(1H，septet，CH)，1.6(6H，q，3xCH2)。
步骤1(g)1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷的制备用10％的炭载钯(2g，5 0％水)处理三(2-叠氮乙基)甲烷(15.06g，0.0676mol)(假定来自前面反应100％的产品)乙醇(200ml)溶液，氢化12h。每隔2 h排空反应容器，除去反应释放的氮气，用氢重新装填。取样进行NMR分析，以证明三氮化物完全转化成三胺。
警告未还原的氮化物能在蒸馏时发生爆炸。通过次乙酰塑料滤料(pad)过滤反应混合物，除去催化剂，在真空中浓缩，获得三(2-氨基乙基)甲烷油。采用库格尔若蒸馏器蒸馏在0.4mm/Hg沸点180-200℃下进一步纯化该油，获得无色的油(8.1g，三元醇的总产率为82.7％)。
NMR1H(CDCl3)，2.72(6H，t，3xCH2N)，1.41(H，septet，CH)，1.39(6H，q，3xCH2)。
NMR13C(CDCl3)，δ39.8(CH2NH2)，38.2(CH2)，31.0(CH)。
实施例21，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷的另一种制备方法。
步骤2(a)用对甲氧基-苄胺使三甲酯酰胺化。
将三(甲氧羰基甲基)甲烷[2g，8.4mmol；和上述的步骤1(b)同样制备]溶解在对甲氧基-苄胺(25g，178.6mmol)中。建立蒸馏设备，在氮气流中加热到120℃，保持24h。采用收集的甲醇量监测反应的进展。将反应混合物冷却到环境温度，加入30ml乙酸乙酯，然后搅拌30min，沉淀三酰胺产品。采用过滤分离三酰胺，滤并用足够量的乙酸乙酯洗涤几次，除去过量的对甲氧基-苄胺。在干燥后获得4.6g，100％的白色粉末。在下一个步骤中直接使用这种高度不溶的产品，而不需进一步纯化或表征鉴定。
步骤2(b)1，1，1-三[2-(对甲氧基苄氨基)乙基]甲烷的制备。
在1000ml用冰-水浴冷却的3颈圆底烧瓶中，将步骤2(a)的三胺(10g，17.89mmol)小心地加到250ml 1M硼烷溶液(3.5g，244.3mmol)中。在完全加入后，除掉冰-水浴，将反应混合物缓慢加热到60℃。反应混合物在60℃下搅拌20h。抽取反应混合物试样(1ml)，将反应混合物与0.5ml 5N NCl混合，静置30min。在试样中加入0.5ml 50 NaOH，然后加入2ml水，搅拌溶液，直到所有的白色沉淀物溶解为止。溶液用乙醚(5ml)萃取，蒸发。将残余物溶解在乙腈中，浓度1mg/ml，采用MS进行分析。如果在MS光谱中见到一酰胺和二酰胺(M+H/z＝520和534)，反应是不完全的。为了使反应进行完全，再加入100ml 1M硼烷THF溶液，反应混合物在60℃下搅拌6h以上，按照前面的采样方法，抽取新的试样。当需要时，再继续加入1M硼烷THF溶液，直到完全转化成三胺为止。
将反应混合物冷却到环境温度，缓慢加入5N HCl，[注意产生大量的泡沫！]。加入HCl，直到观测不到释放气体为止。混合物搅拌30min，然后蒸发。有块状物悬浮在NaOH水溶液(20-40％；1∶2w/v)中，搅拌30min。然后用水(3个体积)稀释混合物。然后混合物用二乙基醚(2×150ml)萃取[注意不使用卤化的溶剂]。然后用水(1×200ml)、盐水(150ml)洗涤合并的有机相，在硫酸镁上干燥。蒸发后产品油为7.6g，84％NMR1H(CDCl3)，δ1.45，(6H，m，3xCH2；1.54，(1H，septet，CH)；2.60(6H，t，3xCH2N)；3.68(6H，s，ArCH2)；3.78(9H，s，3xCH3O)；6.94(6H，d，6xAr)，7.20(6H，d，6xAr)NMR13C(CDCl3)，δ32.17，CH；34.44，CH2；47.00，CH2；53.56，ArCH2；55.25，CH3O；113.78，Ar；129.29，Ar；132.61，Ar；158.60，Ar；步骤2(c)1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷的制备。
将1，1，1-三[2-(对甲氧基苄氨基)乙基]甲烷(20.0g，0.036mol)溶解在甲醇(100ml)中，加入Pd(OH)2(5.0g)。将混合物氢化(在压热器中，3bar，100℃)，搅拌5h。在10h和15h后分别加入另二份(2×5g)Pd(OH)2。将反应混合物过滤，滤液用甲醇洗涤。蒸发合并的有机相，残余物在真空中蒸馏(1×10-2，110℃)，采用前面实施例1所述的方法，获得2.60g(50％)1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷。
实施例33-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷的制备。
用cardice和甲醇浴将2-甲基丁-2-烯(147ml，1.4mol)和亚硝酸异戊酯(156ml，1.16mol)冷却到-30℃，用安装在顶部的空气搅拌器强烈搅拌，以保持温度低于-20℃的速率，滴加浓盐酸(140ml，1.68mol)进行处理。处理约需1h，同时释放大量的热。处理必须小心地进行，以防过热。加入乙醇(100ml)，降低加入结束时生成的浆体的粘度，反应在-20--10℃下再搅拌2h，使反应完全。在真空下过滤收集沉淀物，用4×30ml冷(-20℃)乙醇和100ml冰冷的水洗涤，在真空中干燥，获得3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷白色固体。将乙醇滤液和洗液合并，用水(200ml)稀释，冷却，在-10℃静置1h，同时进一步结晶出大量3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷。过滤收集沉淀物，用最少的水洗涤，在真空中干燥，获得3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷(115g，0.85mol，73％)，采用NMR分析总产品纯度＞98％。
NMR1H(CDCl3)，作为异构体混合物(异构体1，90％)1.5d，(2H，CH3)，1.65d，(4H，2xCH3)，5.85，q，和5.95，q，以及1H。(异构体2，10％)，1.76s，(6H，2xCH3)，2.07(3H，CH3)。
以类似的方法从亚乙基环戊烷制备1-氯-1-(1-亚硝基乙基)环戊烷(产率55％)[有机化学杂志，36(8)，p.1169-70]。
以类似的方法从亚乙基环己烷制备1-氯-1-(1-亚硝基乙基)环己烷(产率63％)[有机化学杂志，36(8)，p.1169-70]。
δH(CDCl3；270MHz)，1.52(3H，d JHH7Hz，CH3)，1.48-2.20(10H，m，CH2×5)，5.96(1H，q，JHH7Hz，CH)。
以类似的方法从1-甲基-环己烯制备1-氯-1-甲基-2-亚硝基-环己烷(产率57％)[Ind.J.Chem.Sect B 16B(10)，917-20(1978)，Z.Chem.，21(11)404-5(1981)，J.Pract.Chem.，320(3)，433-51(1978)]。
δH(CDCl3；270MHz)，1.41-2.28(11H，m，CH3，CH2×4)，5.72-5.79(1H，m，CH)。
实施例4双[N-(1，1-二甲基-2-N-羟基亚胺丙基)2-氨基乙基]-(2-氨基乙基)甲烷(化合物1)的合成。
在氮气氛中，在室温和强烈搅拌下，在三(2-氨基乙基)甲烷(4.047g，27.9mmol)的无水乙醇(30ml)溶液中，加入无水碳酸钾(7.7g，55.8mmol，2eq)。将3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷(7.56g，55.8mol，2eq)溶解在无水乙醇(100ml)中，将75ml这种溶液缓慢地滴加到反应混合物中。然后在反应中加入二氧化硅载带的TLC[这些板按100/30/5使用二氯甲烷、甲醇、浓氨(0.88sg)进行实验；并喷淋茚三酮和加热，使TLC板成象]。随着流量(RF)按该顺序增加，可以看见一、二、和三烷基化的产品。分析用的HPLC是采用RPR反相柱进行的，乙腈在3％氨水中的变化率为7.5-75％。反应在真空中浓缩，除去乙醇，重新悬浮在水(110ml)中。用乙醚(100ml)萃取水浆，除去一些三烷基化的化合物和亲脂性的杂质，在水层中留下一烷基化和所需的二烷基化产品。用乙酸铵(2eq，4.3g，55.8mmol)缓冲该水溶液，确保优良的色谱。在用所准备的自动HPLC纯化之前，该水溶液在4℃下存放过夜。
产品(2.2g，6.4mmol，23％)。
质谱；正离子10V圆锥电压。求得344；算得M+H＝344。
NMR1H(CDCl3)，δ1.24(6H，s，2xCH3)，1.3(6H，s，2xCH3)，1.25-1.75(7H，m，3xCH2，CH)，(3H，s，2xCH2)，2.58(4H，m，CH2N)，2.88(2H，t，CH2N2)，5.0(6H，s，NH2，2xNH，2xOH)。
NMR1H((CD3)2SO)，δ1.1 4xCH；1.29，3xCH2；2.1(4H，t，2xCH2)；NMR13C((CD3)2SO)，δ9.0(4xCH3)，25.8(2xCH3)，31.0 2xCH2，34.6 CH2，56.8 2xCH2N；160.3，C＝N。
HPLC条件在采用25mm PRP柱时，流量为8ml/minA＝3％氨溶液(sp.gr＝0.88)/水。
B＝乙腈时间％B0 7.515 75.020 75.022 7.530 7.5每个实验的载荷是3ml水溶液，在最佳时间12.5-13.5min收集。
实施例5化合物2——化合物1的苯甲酰胺共轭物的制备。
用冰浴在氮气氛中将化合物1(0.5g，1.45mmol)的无水乙腈(50ml)三乙胺(150mg，1.45mmol)溶液冷却到0℃。在搅拌下在反应中加入苯甲酸酐(330mg，1.45mmol)，使反应上升到室温，搅拌过夜。在真空中除去乙腈，将残余物重新溶解在二氯甲烷(50ml)中，用碳酸钾水溶液(2×50ml)洗涤，分离，在硫酸钠上干燥。用二氯甲烷(2×50ml)萃取碳酸钾水溶液，在硫酸钠上干燥。在真空中将合并的二氯甲烷萃取物浓缩成胶状物。HPLC分析表明，产品并不象要求的那么纯，因此采用所准备的自动HPLC纯化该材料，获得化合物2。采用TLC和分析使用的HPLC，将产品分析为一个色斑。
HPLC条件在采用150mm×25mmPRP柱时，流量为8ml/min；每个实验试样都装载在2ml 30％的乙醇水溶液中。
A＝3％氨溶液(sp.gr＝0.88)/水。
B＝乙腈时间 ％B0 7.51575.02075.0227.5307.5在15.25-16.5min洗提所需的产品。在真空中蒸发产品溶液，获得无色玻璃状的泡沫(304mg，0.68mmol，47％)，熔点(m.p.)55℃。
NMR1H(CDCl3)，1.26(12H，s，4xCH3)，1.43(2H，m，CH2)，1.57(4H，m，CH2)，1.75(1H，m，CH)，1.823(6H，s，2xCH3)，2.58(4H，m，2xCH2N)，3.56(2H，m，CH2NHCO)，6.95(1H，m，NHCO)，7.42(3H，m，3xArH)，7.79(2H，d，ArH)。
NMR13C(CDCl3)，10.09，25.7，26.1，28.5。32.8，33.3，37.93，57.57，127.0，128.4，131.4，158.98，168.15。
M/S C24H41N5O3M+H＝448求得448在100∶30∶5/CH2Cl2∶MeOH∶880氨条件下，流量(RF)为0.8，使用水合茚三酮用肉眼观测。
实施例6双[(1，1-二甲基-2-N-羟基亚胺丙基)2-氨基乙基]-(2-(戊二酰胺)乙基)甲烷[化合物4；化合物1的戊二酰胺衍生物]的制备。
用冰浴在氮气氛中将化合物1(0.5g，1.45mmol)的无水乙腈(50ml)三乙胺(150mg，1.45mmol)溶液冷却到0℃。在搅拌下在反应中加入戊二酸酐(165mg，1.45mmol)，使反应上升到室温，搅拌过夜。用过滤收集过夜生成的沉淀物，在真空中干燥，获得不纯的标题化合物试样(267mg，0.583mmol，40％)。在真空中浓缩滤液，获得无色的玻璃，将玻璃与已收集的沉淀物一起重新溶解在5％0.880 sg氨水(50ml)中，采用所准备的自动HPLC纯化。
HPLC条件在采用150mm×25mm PRP柱时，流量为8ml/min；每个实验的试样装载在2ml溶液中。
A＝3％氨溶液(sp.gr＝0.88)/水。
B＝乙腈时间 ％B0 7.51575.02075.0227.5317.5在15.25-16.5min洗提所需的产品。在真空中蒸发产品溶液，获得无色玻璃状的泡沫(304mg，0.68mmol，47％)，熔点54.8℃。采用TLC和分析用HPLC，将产品分析为一个色斑。
NMR1H(DMSO)，0.7(12H，s，4xCH3)，0.85(4H，m，2xCH2)，1.0(1H，m，CH)，1.3(6H，s，2xCH3)，1.3(4H，m，2xCH2)，1.6(2H，m，CH2)，1.75(6，m，3xCH2)，2.6(2，m，2xOH)，3.2(2H，t，NH)，7.3(1H，t，NH)。
NMR13C(CD3SO)，8.97，20.51，20.91，25.09，25.60，31.06，33.41，33.86，56.89，66.99，160.07，1712.34，174.35，174.56。
M/S C22H43N5O5M+H＝457求得457.6实施例7被保护的肽Ac-NQEQVSP(3-I)YTLLKG的合成。
通过将Fmoc-Gly-固定到树脂上，将被保护的肽Ac-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Tyr(3I)-Thr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-OH组合在2-氯代三苯甲基固相树脂上。然后用适当保护的氨基酸以及偶合剂DCCI和HOBt陆续去掉保护作用/偶合环。采用0.5％FTA将终端的天冬酰胺乙酰基化并与树脂分离，采用肽不需进一步纯化。
实施例8化合物5-化合物1的肽共轭物—的合成。
使实施例7被保护的Ac-NQEQVSPY(3I)TLLKG肽从固体树脂上分解，然后采用苯并三唑-1-基-氧代三吡咯烷-六氟磷酸盐和1-羟基苯并三唑作为偶合剂，使其在溶液中与化合物1偶合。通过用试剂K(试剂K是82.5％TFA、5％酚、5％处理过的水、5％苯硫基甲烷、和2.5％乙烷二硫醇)去掉保护作用获得化合物5。首先采用使用TFA的RP-HPLC纯化粗肽，接着使用乙酸进行第二步纯化和盐交换，用0.22μm过滤器过滤，最后冻干，获得化合物5。
为了比较，采用同样的方法制备现有技术相同肽即Ac-NQEQVSPY(3I)TLLKG的氮杂-二胺二肟螯合物共轭物(化合物6-见图1)。
实施例91-(1-{3-(2-氨基乙基)-5-[1-(1-羟基亚氨基乙基)环己基氨基]戊氨基}环己基)乙酮二肟[化合物7]的制备。
化合物7在室温和强烈搅拌下，在氮气氛中，在1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷(0.96g，6.6mmol)的无水乙醇(7.5ml)溶液中，加入碳酸钾(无水的)(1.8g，13mmol)和三乙胺(1.33g，13mmol)。在1h内滴加1-氯-1-(1-亚硝基乙基)环己烷(2.3g，13mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液。然后混合物在室温下搅拌18h。然后在减压下除去溶剂。然后在反应残余物中加入水(30ml)和乙醚(25ml)。然后分离水相和有机相。
HPLC恒溶剂成分90％B(MeOH)，10％(NH3，3％)。乙醚萃取物HPLC表明有二个主要带——第一个带二肟，第二个带三肟。二肟(0.55g，20％)，FAB m/z 424(M+H)，HRMS求得424.3642，算得424.3652(C23H45N5O2)。
NMRδH(CDCl3；270MHz)，1.34-1.72(33H，m，CH，CH2×13，CH3×2)，2.18-2.33(4H，m，NCH2×2)，2.56-2.69(2H，m，NCH2)。
采用类似的方法制备化合物1-(1-{3-(2-氨基乙基)-5-[1-(1-羟基亚氨基乙基)环己氨基]戊氨基}环己基)乙酮二肟[化合物8] 化合物8FAB m/z 396(M+H)，HRMS求得396.3322，算得396.3339(C21H42N5O3)。
实施例10将化合物2的99mTc放射性同位素标记与相应的氮杂-类似物(现有技术的化合物3)进行对比。
制备包含下列成分的冻干制品23μg化合物2(化合物1的苯甲酰胺衍生物-见实施例3)，36μg氯化亚锡二水合物，90μg Medronate三钠，4.0mg乙酸钠，在氮气(USP/NF)中将其密封在10mL玻璃瓶中。
这是在室温下采用来自99mTc发生器的99mTc-高锝酸盐盐水重组的。采用HPLC和ITLC(瞬时薄层色谱)研究RCP。将这些结果与化合物3的结果对比，这些结果示于表1和2中
表1ITLC放射化学纯度结果(％)
表2化合物2的ITLC和HPLC放射化学纯度的结果(％)
表中RHT＝还原水解的锝实施例11化合物5——化合物1的肽共轭物——的99mTc放射性同位素标记。
在氮气中将冻干的制品密封在10ml的玻璃瓶中，冻干的制品包括50μg PABA(对氨基苯甲酸)，30μg SnCl2，90μg MDP(亚甲基二膦酸)，1.32mg NaHCO3，98μg Na2CO3，4mg NaOAc。
从冷藏库中取出玻璃瓶，在室温下放置15min，然后用100μl包含化合物5即肽螯合剂共轭物Ac-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-(I-Tyr)-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-[化合物1](在2ml水中包含2mg)的溶液，和Xml99mTc-高锝酸盐盐水重组，在室温下来自AmertecII99mTc发生器的放射性浓度为0.5GBq/ml。采用离子室测定放射性。采用ITLC和HPLC测定RCP。对不同X值的结果示于表3表3化合物5的ITLC和HPLC放射化学纯度结果(％)
实施例12在生物体内用99mTc标记的化合物5的血凝块吸收与99mTc标记的化合物6(现有技术)的血凝块吸收。
根据实施例10进行99mTc放射性同位素标记。从冷藏库(-20℃)中取出血浆(每个实验项目5ml)和凝血酶(100单位ml-1)，解冻到室温。在使用前观测血浆，确保没有凝块生成或试样降解的迹象。
将10μl99mTc-化合物5或99mTc-化合物6加到一个5ml的血浆(老鼠、兔、狗、和人)瓶中。将10μl99mTc-DTPA平行地加到包含5ml血浆的第二个玻璃瓶中作为阴性基准。在四个瓶中加入800μl的钙三羟甲基氨基甲烷缓冲剂和40μl牛的凝血酶溶液，产生生成凝块的孵化混合物(生成凝块的缓冲剂，钙/凝血酶丰富)。不生成凝块的孵化，是在40μl AnalaR水中加入800μl三羟甲基氨基甲烷缓冲剂缓冲的盐水溶液，产生结合本底的化验混合物(不生成凝块的缓冲剂，钙/凝血酶不足)。
在二个钙/凝血酶丰富和二个钙/凝血酶不足的孵化混合物中，每个都加入400μl用实验制品(99mTc-化合物5或99mTc-化合物6)或用放射性同位素标记的阴性基准(99mTc-DTPA)示踪的人的血浆，每个实验平行做四个。在每个瓶中都加入一个脱纤维蛋白的棒，以利于血浆生成凝块。每个化验瓶在环境温度下孵化1h。在每个P7瓶中加入1ml0.4 M EDTA溶液停止反应。
将前面用实验制品和阴性基准示踪的400μl血浆试样加入特殊的玻璃闪烁瓶中，测定(四个平行试样)存在的总放射性。采用碘化钠闪烁扫描法测定与这些标准有关的放射性。将每个P7瓶中的混合物倒在真空歧管上特殊的BSA封闭的硝基纤维素过滤器上。用2ml TBST溶液冲洗每个P7瓶，然后用四个5ml的TBST溶液冲洗每个过滤器。血凝块在真空歧管上干燥1h。然后将滤纸转移到特殊的闪烁瓶中，测定存在的放射性。
通过从不生成凝块的混合物中存在的总放射性，减去生成凝块的混合物中存在的总放射性，提出实验制品对硝基纤维素过滤器的非特异结合因子。采用单独在凝块中存在的放射性，除以血浆标准中存在的平均放射性，然后乘100，将凝块单独的吸收(特异的或非特异的)表示为血浆中实验制品的吸收百分率吸收％＝过滤器上凝块的吸收％-过滤器的吸收％×100(已校正本底)将特异结合百分率规定为放射性吸收，放射性吸收只是由于XIIIa因子在纤维蛋白和实验制品之间生成异肽共价键引起的。特异结合是从用放射性同位素标记的实验制品校正本底(硝基纤维过滤器)后的吸收百分率，减去用放射性同位素标记的对FXIIIa没有亲和力的阴性基准(99mTc-DTPA)修正本底(硝基纤维素过滤器)后的吸收百分率计算的实验制品的特异结合＝实验制品的吸收％-DTPA的吸收％(对凝块) (在凝块中) (在凝块中)对在生物体外效力的影响。
比较99mTc-化合物5和99mTc-化合物6在生物体外生成血浆凝块中的吸收数据。处于这种凝结形式的这两种分子(30.66±5.01与29.69±6.33比较)的效力没有明显的差别(p＞0.05)。
实施例13化合物9的99mTc标记。
化合物9化合物9是化合物1与所示环状肽的共轭物，即[化合物1]-Cys-Cys-Glu-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Ala-Cys-Tyr-OH。
化合物9是采用与实施例7和8相似的方法制备的，在溶液中采用99mTc标记(制剂1)，或利用根据实施例10的冻干工具标记(制剂2)。
对于制剂1，将100μg的化合物9溶解在1ml pH8.5的硼酸盐缓冲剂中。将该溶液转移到P6瓶中密封。在室温下加入1ml99mTc-高锝酸盐盐水溶液(1.0GBq/ml，来自AmertecII发生器)以及0.1mlSnCl2溶液(10mg SnCl2在100ml N2吹扫过的盐水中的溶液)。采用离子室测定放射性。采用ITLC和HPLC测定RCP。
制剂1表明，采用ITLC测定，RCP为96％，采用HPLC测定，RCP为82％。
权利要求
1.化学式如下的螯合剂共轭物 式中R1、R2、和R3各自分别是R基；Y是-(A)n-X-Z式中X是-NR4-、-CO2-、-N(C＝S)-、-N(C＝O)-、-S-、或-O-；Z是生物靶部分；R4分别是R基；-(A)n-是连接剂基团，其中每个A分别是-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-NRCO-、-CONR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8亚环杂烷基、C4-8亚环烷基、C5-12亚芳基、C3-12亚杂芳基或聚烷撑二醇、聚乳酸或聚乙醇酸部分；n是0-10的整数值每个R基分别是H或C1-10烷基、C3-10烷芳基、C2-10烷氧烷基、C1-10羟烷基、C1-10氟代烷基，或2个或多个R基，它们与它们固定在其上的原子一起，生成碳环、杂环、饱和或不饱和的环。
2.权利要求1的螯合剂共轭物，其中R3是H。
3.权利要求1和2的螯合剂共轭物，其中每个R2是H。
4.权利要求1-3的螯合剂共轭物，其中X是-NR4-或-CO2-。
5.权利要求1-4的螯合剂共轭物，其中-(A)n-包括2-10个原子的主链。
6.权利要求1-5的螯合剂共轭物，其中Y是-CH2CH2-X-Z。
7.权利要求1-6的螯合剂共轭物，其中R1是C1-3烷基、C2-4烷氧烷基、C1-3羟烷基、或C1-3氟代烷基。
8.权利要求1-7的螯合剂共轭物，其化学式如下 式中每个R1分别是C1-3烷基或C1-3氟代烷基。
9.权利要求8的螯合剂共轭物，其中R1基均为CH3。
10.权利要求1-9的螯合剂共轭物，其中Z是3-20个链节的肽。
11.权利要求1-10的螯合剂共轭物的放射性金属络合物。
12.权利要求11的放射性金属络合物，其中放射性金属络合物是电中性的。
13.权利要求11和12的放射性金属络合物，其中放射性金属是99mTc。
14.一种放射性药物，其中包括权利要求11-13的适合人给药形式的放射性金属络合物。
15.权利要求14的放射性药物，其中放射性金属是99mTc。
16.制备权利要求15的99mTc放射性药物的工具，其中包括(i)权利要求1-10的螯合剂共轭物；(ii)生物兼容的还原剂。
17.权利要求16的工具，其中生物兼容的还原剂是亚锡。
18.化学式如下的化合物 式中R1、R2、和R3各自分别是R基；E是-(A)n-J式中J是适合与Z轭合的官能团；-(A)n-是连接剂基团，其中每个A分别是-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-NRCO-、-CONR-、-SO2NR-、-NRSO2-、CR2OCR2-、CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8亚环杂烷基、C4-8亚环烷基、C5-12亚芳基、C3-12亚杂芳基或聚烷撑二醇、聚乳酸或聚乙醇酸部分；n是0-10的整数值；每个R基分别是H或C1-10烷基、C3-10烷芳基、C2-10烷氧烷基、C1-10羟烷基、C1-10氟代烷基，或2个或多个R基，它们与它们固定在其上的原子一起，生成碳环、杂环、饱和或不饱和的环。
19.权利要求18的化合物，其中J是-NR5R6、-CO2M、-NCS、-NCO、-SM1、-OM1、马来酰亚胺或丙烯酰胺，其中R5和R6分别是R基或PG；M是H、阳离子、PG或活性酯；M1是H或PG；和PG是保护基。
20.权利要求18或19的化合物，其中R3是H。
21.权利要求18-20的化合物，其中每个R2是H。
22.权利要求18-21的化合物，其中R1是C1-3烷基、C2-4烷氧烷基、C1-3羟烷基、或C1-3氟代烷基。
23.权利要求18-22的化合物，其中-(A)n-包括2-10个原子的主链。
24.权利要求18-23的化合物，其中E是-CH2CH2-J。
25.权利要求24的化合物，其中J是-NHR5，R5是H或C1-3烷基。
26.如下的化合物
27.化学式如下的化合物HC(CH2CH2NR7R8)3式中R7和R8分别是H或PG，或R7和R8一起形成PG；其中PG是保护基；或其盐。
28.化合物HC(CH2CH2NH2)3。
29.制备权利要求18的化合物的方法，其中包括采用下列化合物使化学式IV的化合物烷基化化学式C1-C(R1)2-CH(NO)R1的氯亚硝基化合物；或化学式C1-C(R1)2-C(＝NOH)R1的α-氯肟；或Br-C(R1)2-C(＝O)R1的α-溴酮，接着用羟基胺将二胺二酮产物转化成二胺二肟； 化学式IV式中A、J、R1、R2、R3、和n与权利要求18定义的相同。
30.制备权利要求26的化合物的方法，其中包括采用下列化合物使HC(CH2CH2NH2)3烷基化(i)化学式C1-C(CH3)2-CH(NO)CH3的氯亚硝基衍生物；或(ii)化学式C1-C(CH3)2-C(＝NOH)CH3的α-氯肟衍生物；或(iii)化学式Br-C(CH3)2-C(＝O)CH3的氯亚硝基衍生物；接着用羟基胺将二胺二酮产物转化成二胺二肟。
全文摘要
本发明涉及用生物靶分子改进的化学式(II)的螯合剂共轭物，适合与放射性金属生成金属络合物。特别是与放射性金属99mTc的放射性金属络合物，适合用作放射性药物。
文档编号A61K51/00GK1527727SQ02814008
公开日2004年9月8日 申请日期2002年7月10日 优先权日2001年7月10日
发明者C·M·阿彻尔, H·J·瓦德斯沃斯, T·恩格尔, C M 阿彻尔, 瓦德斯沃斯, 穸 申请人:阿默沙姆公开有限公司