专利名称：低分子量透明质酸与多肽毒素的免疫原性偶联物的制作方法
技术领域：
本发明涉及透明质酸/多肽偶联物分子，及包含它们的药物组合物。本发明特别涉及透明质酸，和更为优选的低分子量透明质酸(LMW-HA)，以及激发针对透明质酸的抗体的LMW-HA/多肽偶联物分子，该抗体具有与A族和C族链球菌的交叉反应性。本发明的分子和包含它们的药物组合物在治疗与预防因A族和C族链球菌引起的感染方面，以及诊断因A族和C族链球菌引起的疾病方面是有用的。
背景技术：
透明质酸(HA)是一种天然存在的糖胺聚糖，由N-乙酰氨基葡糖和葡糖醛酸的重复单位组成。见
图1。HA存在于动物组织，如脊髓液、眼液、滑液、皮肤中，也存在于一些链球菌，如A族和C族链球菌的荚膜中。A族链球菌的这种具粘液或高度被有荚膜的菌株与罕有的严重感染和急性风湿热有关(Johnson et al.，1992，J.Infect.Dis.166374-382)。由A族和C族链球菌引起的人类侵袭性软组织感染伴随显著的发病率和死亡率。C族链球菌也与咽炎和反应性关节炎有关。此外，C族链球菌感染在马群中普遍流行。
A族和C族链球菌的粘液状菌落形态是由透明质酸组成的荚膜多糖大量产生的结果。最近有结果表明A族链球菌的透明质酸荚膜在这些生物的致病性方面表现出许多重要的作用。在其它情况中，HA荚膜保护粘液状A族链球菌不被吞噬，并且在致病力方面起重要作用(Wessels el al.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888317-21；Dale et al.1996，Infect.Immunol.641495-501；and Moses et al.1997 Infect.Immumol.65；64-71)。另外，HA荚膜调节M蛋白质介导的附着，并在A族链球菌对人类角质形成细胞上CD44的粘附中充当配体。A族链球菌的HA荚膜既是被高度保守的，又是表面暴露的，这表明在其它菌株细菌对咽部黏膜和皮肤的粘附中，HA可充当通用粘附位点(Schrager et al 1998，J.Clin.Invest.1011708-16)。
由于一旦建立就既难以治疗，又难以根治的抗性菌株的发展，使得对革兰氏阳性病原体，如链球菌感染的预防和治疗是尤其重要的。尽管多糖抗原、或免疫学无活性碳水化合物半抗原与胸腺依赖性(TD)抗原，如蛋白质的结合可增强它们的免疫原性，不过还不清楚这种免疫原性应答，如果是由HA激发，是否可以提供保护以防御含HA的细菌，如A族或C族链球菌。此外，在哺乳动物组织和链球菌中均存在HA的事实，使得以HA为碳水化合物抗原治疗或预防链球菌感染的进展复杂化，因为有可能引起针对宿主组织的自身免疫应答。
直至最近，HA仍被认为是一种非免疫原性分子(Meyer，1936，J.Biol Chem.114689 and Humphreys，1943，Biochem J.37460)。不过，更新的研究表明一些物种中天然存在HA的抗体(Underhill，1982，Biophys.Res.Commun.1081488)。Fillit等人采用与脂质体结合的HA在小鼠体内诱导出HA抗体。他们报导HA是免疫原性的，并且确定了分子的两个抗原决定簇。Fillit等人也指出HA在脂质体上的呈递模式对其免疫原性而言是重要的。最后，Fillit等人报导HA抗体与硫酸乙酰肝素具有交叉反应，并且这种交叉反应可以参与自身免疫血管疾病的发病机理(Fillit et al.，1988，J.Exp.Med.168971-982)。基于上文总结的报导，仍然不可预测HA或HA偶联物是否能激发对抑制或治疗含HA的细菌，如A族或C族链球菌引起的感染有用的免疫应答。
发明概述本发明提供了包含HA和与多肽或蛋白质载体偶联的LMW-HA的免疫原性组合物。本发明的偶联物(conjugate)分子对于激发抗体是有用的，该抗体与含HA的细菌，如A族和C族链球菌具有交叉反应性。在治疗与诊断由这种细菌，包括A族和C族链球菌引起的感染和疾病的方法中，本发明的偶联物分子及包含它们的药物组合物是有用的。
申请人惊奇地发现在哺乳动物中LMW-HA偶联物是具有免疫原性的。还要令人惊奇地是，申请人发现发明的偶联物激发的抗体与A族和C族链球菌发生交叉反应，却和与哺乳动物组织相关的天然HA仅发生最低的交叉反应。
将LMW-HA偶联于多肽的方法包括还原胺化作用、溴化氰处理、在载体上的自由氨基与LMW-HA上羧化物部分之间形成酰胺键、或利用接头分子。发明提供了包含LMW-HA偶联物分子的药物组合物，以及在治疗和诊断因含HA细菌，如A族和C族链球菌引起的感染方面，这些组合物作为疫苗激发抗体的用途。任何将碳水化合物T细胞非依赖性应答转化为T细胞依赖性应答的多肽都适于被用作载体。毒素或类毒素的实例如破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳毒素或类毒素、奈瑟球菌膜孔蛋白，如淋球菌的PorA、脑膜炎球菌的PorB。
本发明也提供了来源自免疫原性LMW-HA-多肽偶联物的药物组合物、疫苗和其它免疫学试剂。
发明进一步地涉及针对细菌感染而免疫哺乳动物的方法。该方法包括将有效量的发明药物组合物给予哺乳动物，以阻止来自引起疾病生物体的感染。该方法在预防或治疗因含HA的细菌，如A族和C族链球菌引起的感染方面是有用的。
发明也提供了一种利用发明的LMW-HA-多肽偶联物在哺乳动物，优选人类体内激发抗体的方法。发明也提供了在应答于采用发明的多糖-多肽偶联物免疫哺乳动物的过程中激发的免疫球蛋白组合物和分离的抗体。作为治疗剂和诊断试剂，这种免疫球蛋白和分离的抗体是有用的。
制得的免疫球蛋白和抗体对LMW-HA是特异的。本发明的偶联物分子在根据众所周知的方法产生单克隆抗体和抗独特型抗体方面也是有用的。
附图简述图1透明质酸(HA)的结构。
图2通过超声和/或酸处理产生抗原性低分子量LMW-HA。
图3链球菌HA保护性表位的结构；a)超声处理HA的四糖；b)透明质酸酶作用后产生的四糖。
图4兔抗血清对超声处理的HA-TT偶联物的ELISA滴度。
图5兔抗血清对酸水解的LMW-HA/TT偶联物的ELISA滴度图6兔抗血清对超声处理的LMW-HA/TT偶联物的滴度测定图7兔抗血清对酸水解的LMW-HA/TT偶联物的滴度测定图8在LMW-HA/HAS包被的板上，用酸水解的HA、超声处理的HA、超声处理的HA偶联物对兔抗血清#75295的抑制图9在LMW-HA/HAS包被的板上，用超声处理的HA、天然HA、D-葡糖醛酸、HA二糖和HA四糖对兔抗血清#75295的抑制图10在LMW-HA/HAS包被的板上，用超声处理的HA、天然HA、D-葡糖醛酸、HA二糖和HA四糖对兔抗血清#72700的抑制图11在LMW-HA/HAS包被的板上，用超声处理的HA、天然HA、HA二糖、HA四糖、和HA六/八糖对兔抗血清#72700的抑制图12BALB/c小鼠抗血清对LMW-HA/rPorB偶联物的ELISA滴度图13CD1小鼠抗血清对LMW-HA/rPorB偶联物的ELISA滴度图14采用兔抗血清被动免疫Balb/c小鼠；采用6型GAS(4,400cfu/mL)侵袭。分别地，针对PBS/CFA的兔抗血清；○针对超声处理的LMW-HA/TT的兔抗血清；●针对超声处理的LMW-HA/TT的兔抗血清；针对超声处理的LMW-HA/TT的兔抗血清。
图15采用兔抗血清被动免疫Balb/c小鼠；采用GAS type3(2.5×105cfu/mL)侵袭。分别地，针对PBS/CFA的兔抗血清；○针对超声处理的LMW-HA/TT的兔抗血清；●针对酸水解的LMW-HA/TT的兔抗血清；针对超声处理的LMW-HA/TT的兔抗血清。
发明详述透明质酸被用作免疫原以引起保护性和/或治疗性应答。HA尤其可用于产生与表面具有HA的细菌，如A族和C族链球菌交叉反应的免疫应答。不为理论所限制的情况下，与A族和C族链球菌交叉反应的表位被认为是约3或4个残基的长度，并且位于非还原末端。非还原末端葡糖醛酸残基是饱和或不饱和似乎并没有什么明显的差异，因为二种表位均是保护性的。另外，在血液和其它体液中，末端葡糖醛酸似乎被转化为不饱和葡糖醛酸。HA可以以葡糖胺基残基或葡糖醛酸基残基终止，当位于HA的非还原末端的葡糖醛酸或不饱和葡糖醛酸的比例增至超过N-乙酰葡糖胺的比例时，免疫应答便被增强了。
尽管可采用天然HA制备本发明的偶联物，优选地是采用大小为约3或4个糖到约2000个糖，或从约600道尔顿到约400Kd的LMW-HA制备偶联物。更为优选的LMW-HA，是大小从约4个糖或2个重复单位到约100个重复单位，或者约800道尔顿到约40Kd。LMW-HA的最为优选的大小是约4个重复单位到约10或约20个重复单位，或者约800道尔顿到约4或8Kd。通过包括超声处理(Kubo K；et al.GlycoconjJ.，1993，10(6)435)或通过化学方法(Blatter G，Carbohydr.Res.1996，288109-125 and Halkes K.M.Carbohydr.Res.1998，309161-164)和/或酶方法(De Luca et al.J.Am.Chem.Soc.19951175869-5870)的多种方法，可从典型地具有400Kd到几百万道尔顿分子量的天然HA(可获得自Sigma或根据U.S Patent No.4,141,973纯化而得)中获得LMW-HA。
发明也提供了在非还原末端含有葡糖醛酸残基的LMW-HA分子。一种获得葡糖醛酸末端HA片段的方法是根据Kubo K；et al.GlycoconjJ.，1993，10(6)435的方法采用超声处理天然HA。通过下述处理可增加具有葡糖醛酸末端的分子比例，即采用外-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶对超声产物进行处理，以除去任何非还原末端N-乙酰基葡糖胺基残基，并提供在分子的非还原末端含有较高比例的葡糖醛酸基残基的LMW-HA。一种获得LMW-HA的可选方法包括在温和酸性条件下处理天然HA，以生成在其非还原末端含有N-乙酰基葡糖胺基和葡糖醛酸基的混合物的分子。采用外-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶可将酸解聚LMW-HA的末端非还原葡糖胺基去除，从而提供在分子的非还原末端含有葡糖醛酸基残基的LMW-HA。见图2。发明也提供了在非还原末端含有4，5-不饱和葡糖醛酸基残基的LMW-HA分子。见图3。一种获得以4，5-不饱和葡糖醛酸基为末端的HA片段的方法是采用透明质酸酶对天然HA进行处理。
用于本发明的LMW-HA由片段组成，其中至少约90％的LMW-HA片段在其非还原末端含有葡糖醛酸或不饱和葡糖醛酸。优选的，用于本发明至少约95％的LMW-HA片段在其非还原末端含有葡糖醛酸或不饱和葡糖醛酸。
当采用超声处理时，天然HA可溶解在合适的溶剂中，如磷酸盐缓冲盐水，并且超声处理该溶液直至获得预期解聚量为止。见，例如Kubo et al.Glycoconj.J.，1993，10435。经过这种处理获得的LMW-HA优选的具有约为10-20Kd的分子量，并且在其非还原末端主要含有葡糖醛酸基残基，即超过95％。
此外，在温和酸性条件下对HA进行处理，可获得在其非还原末端含有N-乙酰基葡糖胺基残基和葡糖醛酸基残基的混合物的LMW-HA片段。通过该方法获得的LMW-HA片段中约有50％在其非还原末端含有葡糖醛酸。继酸处理之后，采用外-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶(可获得自Sigma)可将末端非还原葡糖胺基选择性地从片段中去除，从而暴露出位于分子末端的葡糖醛酸基残基。通过改变反应条件，可以控制含末端非还原葡糖胺基的片段的比例。例如，通过在不同的完成点采用加热或pH方法破坏酶以终止反应，从而获得预期比例的在其非还原末端含有葡糖醛酸的片段。
此外，通过本领域已知的方法可化学合成在还原末端含有N-乙酰基-β-D-葡糖胺或β-D-葡糖醛酸的LMW-HA。见Blatter G，Carbohydr.Res.1996，288109-125和Halkes K.M.Carbohydr.Res.1998，309161-164。例如，从相应的单糖可首先制备被合适地保护的葡糖胺-葡糖醛酸二糖。通过本领域已知的方法，如以α-三氯乙酰胺基吡喃葡糖为糖基供体的方法可将单糖偶联。获得的二糖可接着与其自身重复偶联，从而形成不同大小的LMW-HA。例如，位于二糖的葡糖醛酸部分的端基异构保护基团可以被选择性地去除。该位点优选的保护基团是4-甲氧苯基。就还原末端二糖，即第一个糖基受体而言，端基异构位点可被转化为甲氧基部分，例如，经硝酸高铈铵处理，首先将4-甲氧苯基转化为端基异构羟基。经三氯乙腈和DBU处理可将所得的端基异构羟基转化为α-trichloroacetimidate部分。经无水甲醇处理后，继而经三氟甲磺酸三甲基甲硅烷酯和三乙胺处理，可将α-trichloroacetimidate部分转化为甲氧基部分。就被用作糖基供体的二糖而言，如上述端基异构位点可被转化为α-trichloroacetimidate部分。将位于葡糖胺残基3位的保护基团选择性地去除后，上述甲氧基保护的二糖可被用作糖基受体。该位点优选的保护基团是氯乙酰基，该基团可以经乙醇中的硫脲和吡啶处理而去除。以交互方式可将二糖供体偶联到受体，从而生成LMW-HA，即每一连续偶联步骤生成具有附加重复单位的LMW-HA。葡糖胺残基的其它优选的保护基团是4，6-O-苯亚甲基和2-N-三氯乙酰胺基。葡糖醛酸残基的附加优选的保护基团是6-和4-O-苯甲酰基和C6甲酯。这些保护基团的用途和可选的保护基团在“Protective Groups In Organic Synthesis，”2ndEd.，by T.W.Greene and P.G.M.Wuts，1991，John Wiley&Sons，Inc.中有所描述，在此引入作为参考。
采用尿苷二磷酸糖和HA合成酶也可酶促合成HA片段。见，例如，De Luca et al.J.Am.Chem.Soc.1995 1175869-5870。以上两种方法可以合成在其末端含任意比例葡糖醛酸的LMW-HA。因此，通过酶降解、酶合成或化学合成形成LMW-HA可以获得产量超过约98％、或超过约99％的在其非还原末端含有葡糖醛酸或不饱和葡糖醛酸的LMW-HA片段。
通过本领域已知的方法可将LMW-HA偶联到载体上。见，例如，Dickand Beurret in Conjugate Vaccines，CruSe et al.eds.，Contrib.Microbiol.Immunol.，Basel，Karger，1989，vol.10，pp 48-114和Jennings and Sood in Neoglycocon jugatesPreparation andApplications，Lee et al.eds.，Chapter 10，pp 325-371，1994，Academic Press，San Diego。这些方法包括还原胺化作用、经由羧化物部分偶联、利用接头、利用溴化氰或其衍生物。当LMW-HA偶联到载体上时，优选的是避免改变位于多糖的非还原末端的表位。将LMW-HA偶联到载体的优选方法是通过直接偶联，如通过在还原末端糖的还原胺化作用。例如，通过采用，如氢硼化物使还原末端残基还原，继而通过高碘酸盐氧化作用和还原胺化作用可将还原末端基团选择性地导入LMW-HA中。见，例如Jennings U.S.Patent No.4,356,170。
也可采用在沿LMW-HA主链的不同部位将LMW-HA偶联到载体的方法。例如，通过利用高碘酸盐，在多糖的主链残基中生成醛基，可活化LMW-HA，继而在还原剂，如氢硼化物的存在下采用一种含游离氨基的载体对活化的LMW-HA进行处理。这些方法也允许超过一个的载体分子与可交联的单个LMW-HA的偶联。
发明的偶联物分子的多肽组分可以是任何在被偶联到LMW-HA时，可激发T细胞依赖性应答的生理学耐受性蛋白质或多肽。术语多肽意指一个通称，包括肽、多肽和包括天然的、修饰的、或重组蛋白质的蛋白质。用作载体的多肽实例包括，但不仅限于细菌毒素、类毒素、膜孔蛋白、外膜蛋白、和交叉反应性蛋白质物质。这种多肽包括，但不仅限于破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素、来源自链球菌的免疫原性多肽、来源自流感的免疫原性多肽、来源自脑膜炎球菌的免疫原性多肽、来源自肺炎球菌的免疫原性多肽、来源自大肠杆菌的免疫原性多肽。尤其优选的是破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、嗜血杆菌的膜孔蛋白多肽、大肠杆菌的膜孔蛋白多肽和奈瑟氏菌的膜孔蛋白多肽，如rPorB。见例如U.S.Patent No.5,439,808。
根据本发明制备的偶联物分子典型地包含一种至少结合了一个低分子量透明质酸片段的载体多肽或蛋白质，该结合通过位于多糖片段主链末端的单个结合位点进行。因此，如果需要的话，本发明提供了生成低分子量透明质酸偶联物分子的能力，其中的多糖组成除了一个末端外均被载体遮盖。这些类型的偶联物可被称为新糖蛋白。见，例如Dick and Beurret，supra。可选的，根据本发明可形成交联的偶联物。这类偶联物可被称为网格偶联物。见，例如Dick and Beurret，supra。
发明的偶联物分子中，LMW-HA与多肽或蛋白质的分子比例优选的是每分子多肽或蛋白质约1到约100个分子的LMW-HA。更为优选的比例是每分子多肽或蛋白质约10到约20个分子的LMW-HA或表位。可选的，通过重量可测定LMW-HA与多肽或蛋白质的比例。例如，发明的偶联物分子中LMW-HA重量与多肽或蛋白质重量之比为约10％到约500％。优选的，本发明的偶联物中LMW-HA重量与多肽或蛋白质重量之比为约30％到约100％。一种实施方案中，采用极低分子量的透明质酸，即低于约20个重复单位，形成偶联物，这样可增加表位的密度。通过调整偶联条件，尤其是结合反应中起始组分的比例，可改变LMW-HA/多肽或蛋白质比例。
除了提供包含有偶联到多肽或蛋白质上的低分子量透明质酸的偶联物分子以外，本发明也包括多价偶联物和包含多价偶联物的药物组合物和疫苗，其中不同多糖被偶联到单个多肽上。例如，低分子量透明质酸能以与其他多糖的多种组合方式被结合于多肽或蛋白质。这种多糖的实例是b型流感嗜血菌的荚膜多糖；B族链球菌Ia，和Ib，II，III，IV，V，VI和VIII型的英膜多糖；A族，B族和C族脑膜炎球菌的荚膜多糖；A族链球菌多糖。
根据本发明的免疫原性偶联物提供了有用的药物组合物，如疫苗，在给哺乳动物，尤其是人和马提供保护以免被含HA的细菌，如A族和C族链球菌感染方面，该药物组合物是重要的。此外，作为一种在出生前给新生儿提供保护性抗体的方式，这些疫苗可用于对孕妇给药。
发明的免疫原性组合物可被用于作为一种产生对预防、治疗和诊断用途有用的单克隆、多克隆或抗独特型抗体的方式。在对由含HA的细菌，如A族或C族链球菌引起的各种感染和疾病的监测和检测中，诊断学是尤其有用的。对那些尤其是被A族或C族链球菌感染，或处于被A族或C族链球菌感染危险中的个体而言，本发明的免疫原性组合物可被用于作为免疫原用于主动和被动免疫原性保护中。通过采用发明的任何免疫原性组合物对哺乳动物进行免疫，可生成用于被动保护的杀菌性抗体，然后将杀菌性抗体回收。用于本发明的杀菌抗体可以存在于血清、部分纯化的组分，如γ球蛋白组分、或纯化的抗体中。例如利用蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖，可从粗蛋白混合物，如血清或腹水中纯化得到IgG。蛋白质A结合到IgG的Fc部分。蛋白质G也结合到Fc区域，不过也可结合到Fab区域，使其可用于IgGs的F(ab)’2片段的纯化。利用蛋白质A-或蛋白质G-琼脂糖柱可以纯化IgGs的粗样品。上柱前，应采用缓冲液以至少1∶1的比例稀释血清样品、腹水或组织培养物上清液。上样后，采用洗涤缓冲液，如20mM磷酸钠、150mMNaCl，pH7.4，对柱进行洗涤，直至大部分杂质被除去为止。继而采用洗脱缓冲液，如100mM甘氨酸、pH3.0，洗脱IgG。IgG继而可通过透滤进行浓缩、或通过离子交换或大小排阻色谱进一步纯化。
“人源化”抗体(包括嵌合抗体和CDR-嫁接抗体)，抗体片段，尤其是基于所要求保护的单克隆抗体的双特异性抗体，以及在原核或真核细胞中产生的重组抗体相关产物，均在本发明的范围内。例如，基于对发明抗体的可变区进行结构(序列)信息的测定，培养宿主细胞，如大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞，可产生抗体片段，如Fab和F(ab’)2片段。见，例如U.S.Patent No.6,180,377。可变区的序列信息也使制备CDR-嫁接抗体成为可能。此外，采用转化的小鼠骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞可制备嵌合抗体(如小鼠/人类抗体)，并且通过杂交杂交瘤细胞可生成双特异性抗体。
发明的药物组合物和疫苗典型地通过将低分子量透明质酸和/或偶联物分散在合适的药学可接受载体，如生理盐水、磷酸盐缓冲盐水或其它可注射液体中而形成。药物组合物或疫苗可以是肠胃外给药，例如皮下、腹膜内或肌内。药物组合物，如疫苗中也可添加常用的添加剂；例如，稳定剂，如乳糖或山梨醇，和佐剂，如磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝、单磷酰脂A、QS21、或硬脂酰酪氨酸。这种药物组合物可以包含低分子量透明质酸、其偶联物、或低分子量透明质酸和/或其偶联物的抗体。该组合物可单独用药，或与至少一种其它试剂，如佐剂或稳定化合物联合用药，并可于任何无菌、生物相容药物载体，包括但不仅限于盐水、缓冲盐水、右旋糖和水中用药。该组合物可单独给予患者，或与其它试剂、药品、激素或生物反应调节物联合用药。
以足以引起免疫原性应答的量给予该药物组合物和疫苗。剂量通常为每公斤体重约0.1～50μg偶联物分子。剂量可根据个体的大小、重量或年龄调整，并且应在本领域技术水平范围内。可给予系列剂量以获得最佳免疫。通过测定抗体滴度或杀菌活性可监测个体的抗体应答，如有必要，可对个体加强免疫，以增强应答。
本发明提供了包含抗体，如纯化的抗体，γ球蛋白组分和血清的组合物，该组合物可用于为含HA的细菌，尤其是A族或C族链球菌所感染，或处于暴露于含HA的细菌，尤其是A族或C族链球菌的危险中的哺乳动物提供被动免疫。与显著的发病率和死亡率相关的侵袭性软组织感染属于诸多因链球菌引起的病理之一。见，例如Ashbaughet al.J.Clin.Invest.，1998，102550。本发明提供的IgGs、抗体片段、抗体、γ球蛋白组分和血清在抑制或预防由含HA的细菌，如A族和C族链球菌引起的感染，以及由这种感染引起的组织坏死和其它病理方面是有用的。包含抗体，如纯化的抗体、γ球蛋白组分和血清的药物组合物是典型地通过将抗体分散在合适的药物可接受载体，如生理盐水、磷酸盐缓冲盐水或其它可注射液体中而形成的。该药物组合物可以是肠胃外给药，例如皮下、腹膜内或肌肉。常用的添加剂也可被添加至该药物组合物中。该组合物可单独用药，或与至少一种其它试剂，如稳定化合物联合用药，并可溶于任何无菌、生物相容药物载体，包括但不仅限于盐水、缓冲盐水、右旋糖和水中用药。该组合物可单独给予患者，或与其它试剂、药品、激素或生物反应调节物联合用药。
以足以抑制细菌感染的量给予该包含抗体的药物组合物。剂量可根据个体的大小、重量或年龄调整，并且在本领域技术水平范围内。可给予系列剂量以获得最佳免疫。通过测定抗体滴度或杀菌活性可监测个体的剂量应答，如有必要，可对个体加强免疫，以增强应答。
根据本发明制备的抗体在不同免疫试剂制备和免疫测定方面也是有用的。例如，对免疫测定而言，可将低分子量透明质酸片段或其偶联物直接或通过接头，如多肽接头，固定在固体支持体上。可采用与制造偶联物相似的方法进行固定。该抗体可随后被应用在本领域技术人员所知的各种免疫测定体系中，包括用于检测含HA的细菌，如A族或C族链球菌的存在的放射免疫测定法和ELISA。这种测定法可被用于测定血清或其它体液中A族或C族链球菌抗体的存在，从而诊断个体中感染的存在。
此处给出的实施例意欲例证实施发明的不同方面，并且不以任何方式限定该发明的范围。说明书中引用的所有出版物、专利和论文均被全文引入本说明书中。
实施例1LMW-HA的制备酸水解解聚透明质酸将透明质酸(100mg，Lifecore lot 1-9062-5)添加至10ml 0.05NHCl溶液中。于80℃加热该混合物2小时，并搅拌以溶解全部固体。于100℃将该样品继续加热1.5小时。于不同时间从反应混合物中取出等分试样，并在配有Superose12 HR 10/30柱(Pharmacia)的Bio-Rad系统(Biologic)上进行分析，以监测解聚作用。采用0.5N Na0H中和该溶液，继而采用截留分子量(MWCO)为3,500的Diaflo膜进行透析后，再冻干。通过Superdex200PG(Pharmacia)柱对该产物进行分子大小分级分离，从而获得65mg固体产物。于500MHz对样品进行的1H-NMR分析证实透明质酸(HA)的二糖重复单位结构。通过大小排阻色谱，联合多角度激光散射光度测定法(SEC MALLS)估计产生片段的平均分子量约为12,000道尔顿。
非还原末端含D-葡糖醛酸的HA寡糖的制备采用0.1N HCl在80℃处理透明质酸(100mg，Lifecore lot 1-9062-5)10小时。采用0.5N NaOH中和该溶液，并通过SephadexG-20(Pharmacia)柱，用水洗脱进行脱盐。将脱盐产物冻干，并经β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶(EC 3.2.1.30；Calbiochem)处理，以生成具有约4到约20个重复单位，并在其非还原末端含有D-葡糖醛酸的LMW-HA片段。通过NMR光谱法和甲基化分析证实寡糖的结构。
超声解聚透明质酸将透明质酸(100mg，Lifecore lot 1-9062-5)溶于20ml 10mM PBS缓冲液中，并搅拌悬浮液直至溶解。采用450型Branson超声波仪(超声设置输出控制3；工作循环50％；温度2℃)对样品进行超声处理18小时。透析并冻干后，回收57mg固体产物。利用MiniDawn装置(Wyatt技术，Santa Barara，CA)和Superose12 HR 10/30柱(Pharmacia)通过SEC-MALLS测定所获超声处理的透明质酸的平均分子量为18,000道尔顿。于500MHz对样品进行的1H-NMR分析证实透明质酸的二糖重复单位结构。
实施例2LMW-HA偶联物的制备采用NaBH4还原酸处理的透明质酸将经盐酸解聚的透明质酸(65mg)溶解于6.5ml去离子水中。采用0.5N NaOH将pH调至10，并添加NaBH4至该溶液中。于室温保持该反应混合物2小时。采用1M乙酸破坏过量的NaBH4。采用MWCO为3,500的Diaflo膜透析除水后，继而冻干，获得35mg固体产物。对还原的酸处理透明质酸的高碘酸盐氧化将两份18mg已还原并分级的多糖样品分别溶解于1.3ml和0.87ml的10mM NaIO4水溶液中，从而实现分别为10％和20％的氧化程度(d.o.)。室温下于暗处搅拌反应2小时，并采用20μl乙二醇猝灭两份样品。继而将反应混合物透析，并冻干，获得17mg固体产物。酸处理的透明质酸-破伤风类毒素偶联物(LMW-HA/TT)的制备将经由高碘酸盐氧化的(d.o.10％和20％)酸处理的透明质酸(每份分别为10mg)和纯化的破伤风类毒素单体(每份样品5mg，StatensSerum Institute，Copenhagen，Denmark)溶解于0.5ml 0.2M pH7.4的磷酸钠溶液中。添加重结晶的氰基硼氢钠(每份样品添加10mg)，并于室温保持该混合物过夜。采用配有Superose12 HR 10/30柱(Pharmacia)的Bio-Rad(Biologic)系统于不同时间监测反应过程。通过在柱空隙体积中洗脱的UV(280nm)峰的递增显示多糖与蛋白质的偶联。偶联完成后，将溶解于1ml 0.1N NaOH中的10mgNABH4添加至每份样品中，以减少任何残余未偶联的醛。通过Superdex200PG(Pharmacia)柱(1.6×60cm)，并采用含0.01％硫柳汞的10mM PBS洗脱，纯化偶联物。将相当于空隙体积峰的级分合并，并于4℃储存。产物分别被指定为偶联物1和2，其多糖中分别有10％和20％的氧化程度。
经过超声处理的透明质酸的高碘酸盐氧化将两份分别为26mg和30mg已经超声处理的多糖分别溶解于2和1.5ml去离子水中，并分别采用0.65ml和1.5ml的10mM NaIO4水溶液处理，以实现分别为10％和20％的氧化程度(d.o.)。室温下于暗处搅拌反应2小时，并分别用20μl乙二醇猝灭。继而将溶液透析并冻干，分别获得24mg和25mg产物。
经过超声处理的透明质酸-破伤风类毒素偶联物(LMW-HA/TT)的制备将已经超声处理，并被高碘酸盐氧化的HA(每份样品7mg，d.o.分别为10％和20％)，和纯化的破伤风类毒素单体(每份样品3.5mg)溶解于350μl 0.2M pH7.4的磷酸钠溶液中。添加氰基硼氢钠(每份样品7mg)，并于室温下保持该混合物过夜。通过在不同时间从反应混合物中取出等分试样，继而采用配有Superose12 HR 10/30柱(Pharmacia)的Bio-Rad(Biologic)系统进行分析，从而监测每个偶联反应的过程。通过在柱空隙体积中洗脱的UV吸收峰(280nm)的递增显示多糖与多肽的偶联。偶联完成后，将NABH4(10mg溶解在1ml 0.1N NaOH中)添加至反应混合物中，以减少任何残余未偶联的醛。通过Superdex200PG(Pharmacia)柱，并采用含0.01％硫柳汞的10mM PBS洗脱，纯化偶联物。将相当于空隙体积峰的级分合并，并于4℃储存。产物分别被指定为偶联物3和4，其多糖中分别有10％和20％氧化程度。
经过超声处理的透明质酸与重组3类奈瑟球菌膜孔蛋白的偶联(LMW-HA/rPorB)将已经超声处理，并被高碘酸盐氧化的透明质酸(20mg，20％d.o.)，和rPorB(10mg)溶解于717μl 0.25M pH8.5的HEPES缓冲溶液中，该缓冲液含0.25M NaCl、0.05％Zwittergent Z3，14(Calbiochem，San Diego，CA)。添加氰基硼氢钠(20mg)，并于37℃温育该混合物1天。偶联完成后，将溶解于1ml 0.1N NaOH中的10mg硼氢化钠添加至反应混合物中，以除去任何残余的醛。通过Superdex200PG(Pharmacia)柱，并采用含0.01％硫柳汞的10mM PBS洗脱而纯化偶联物。通过在280nmUV吸光度的监测，将相当于空隙体积峰的级分合并，并于4℃储存。产物被标记为偶联物5。作为ELISA包被抗原的透明质酸-人血清白蛋白偶联物(LMW-HA/HAS)的制备将已经酸处理，超声处理，并被高碘酸盐氧化，具有10％d.o.的透明质酸，和人血清白蛋白(HAS，Fluka)溶解于0.5ml pH7.4的磷酸钠缓冲溶液中。添加氰基硼氢钠，并于37℃温育该混合物1天。偶联完成后，将溶解于0.1N NaOH中的硼氢化钠添加至反应混合物中，如对其它偶联物的描述一样，以除去任何残余的醛。将偶联物透析，并冻干。
表1LMW-HA/蛋白质偶联物的物理化学特性
分别通过咔唑(用于糖醛酸)(Bitter，T.1962 Anal.Biochem.4∶330)和考马斯(BioRad)分析测定偶联物中透明质酸和蛋白质的含量。
实施例3透明质酸寡糖抑制物的分离将3支安瓿含量，溶解于10mM PBS中的来源自Streptomyceshyalurolyticus(Sigma Biochemicals)的透明质酸酯裂解酶(EC4.2.2.1)添加至已经超声处理的透明质酸(60mg)中，并于37℃温育1.5小时。于水浴中使反应混合物100℃沸腾一分钟以终止反应。通过取出反应混合物的等分试样，并采用配有Superdex肽柱(Pharmacia)的BIO-RAD系统(Biologic)，采用10mM PBS为洗脱液以0.75ml/min的流速条件进行分析，从而监测酶消化的过程。将溶液于4℃储存直至进一步纯化。
通过用Mono-QHR5/5柱(Pharmacia)的阴离子交换色谱，以HPLC1090(Hewlett Packard 1090 Series II)系统进行寡糖的分离，该系统配有二极管阵列检测器、可编程自动进样器、级分收集仪、以及用于系统控制和数据收集/处理的Hewlett Packard Chemstation软件程序。于Tris-HCl缓冲溶液中采用氯化钠梯度成分以进行分离。将对应于二聚物(DP2)和四聚物(DP4)，分别于18～26分钟和28～31分钟洗脱所得的两份寡糖级分收集，冻干，并采用Sephadex G-10柱(Pharmacia)，并以去离子水为洗脱液进行脱盐。通过于500MHz检测寡糖的1H-NMR光谱以证实其结构。DP2寡糖对应的结构为Δ4，5-β-GlcU-(1，3)-D-GlcNAc，DP4对应的结构为Δ4，5-β-GlcU-(1，3)-β-D-GlcNAc-(1，4)-β-D-GlcU-(1，3)-β-D-GlcNAc。
实施例4血清学研究兔抗血清对低分子量透明质酸(LMW-HAs)的免疫特异性免疫原性研究对新西兰白兔进行10μg偶联多糖/剂LMW-HA/TT的皮下免疫，以21天为间隔免疫3次(第0、21和41天)，第一剂采用弗氏完全佐剂，第二剂和第三剂采用弗氏不完全佐剂。于21、31和41天抽取白兔耳血，并于第三次免疫后10天进行心脏穿刺试验。
兔抗血清在LMW-HA/HAS包被的板上的滴度采用溶解于PBS(50mM磷酸钠，150mM NaCl，pH＝7.4)中已经超声处理的LMW-HA/HAS或已经酸水解的LMW-HA/HAS偶联物(100μl约25ng PS/孔)于37℃包被微量滴定板(NUNC Polysorp)1小时。继而采用PBS+0.05％Tween20(PBS Tween，pH＝7.4)洗涤板，再于室温采用150μL/孔PBS+0.1％牛血清白蛋白(PBS+BSA，pH7.4)包被板。包被后，再次洗涤并将其储存于2～8℃直至使用。
在声处理过的LMW-HA/HAS或酸水解的LMW-HA/HAS包被的微量滴定板小孔中将兔抗血清用PBS Tween系列稀释超至终体积为100μl/孔，并于室温温育1小时。采用PBS Tween洗涤板，并于每孔添加100μl以1∶2,500在PBS Tween中稀释的山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶偶联物(Kirkegaard and Perry Laboratories)。于室温温育1小时后，再次洗涤板，并每孔添加100μl TMB底物溶液(KPL)。于室温温育该板5～10分钟后，每孔添加100μl的单组分终止溶液(KPL)以终止显色。于450nm处读每孔的光密度，并制得适于每一条件的滴定曲线。对在LMW-HA/HAS包被的板中兔抗血清与经超声处理的LMW-HA/TT结合的抑制如上所述包被微量滴定板。在超声处理过的LMW-HA/HAS偶联物包被的板中滴定兔抗-超声处理过的LMW-HA/TT抗血清。选择对应于最大信号约一半处的稀释度，作为适于抑制研究的稀释度。将兔抗血清稀释在PBS Tween中。在Titertubes(Bio-Rad)中，将抑制物系列稀释在含稀释的抗血清的缓冲液中，并从Titertubes中取出每份为100μl的样品，将其直接添加至已包被的微量滴定板孔中。室温下温育微量滴定板中的样品1小时。采用PBS Tween洗涤微量滴定板后，每孔添加100μl以1∶2,500在PBS Tween中稀释的山羊抗兔IgG-HRP偶联物(KPL)。室温下温育该板1小时，采用PBS Tween洗涤。每孔添加100μlTMB底物溶液(KPL)。室温温育该板5～10分钟后，每孔添加100μl的单组分终止溶液(KPL)以终止显色，于450nm处读取吸光度。抑制作用测定为采用不含任何抑制物的稀释抗血清得到的最大信号的百分比。
新西兰白兔的免疫应答采用已经超声处理的透明质酸-破伤风类毒素(LMW-HA/TT)或经酸水解的透明质酸-破伤风类毒素(LMW-HA/TT)偶联物，对八只新西兰白兔进行三次皮下注射免疫(每种偶联物接种四只白兔)。图4显示的是每只个体兔对经超声处理的LMW-HA/TT偶联物免疫原的免疫应答。全部四只白兔对透明质酸产生应答，ELISA滴度超过50,000。图5显示的是采用经酸水解的LMW-HA/TT偶联物免疫的个体兔的免疫应答。全部四只个体兔对透明质酸产生应答，ELISA滴度约为10,000，或者更高。
证实兔的免疫应答是特异性的，这取决于用于免疫的偶联物的性质。图6显示的是来源自经超声处理的LMW-HA/TT偶联物免疫的动物的抗体，一般比来源自经酸水解LMW-HA/HAS免疫的动物的抗体更容易与由经超声处理的LMW-HA/HAS包被的板反应。在这些不同包被抗原之间，至少在免疫反应性方面有一个数量级的差异。对于用酸水解的LMW-HA/TT偶联物免疫的动物而言情况也是如此。图7显示的是与超声处理的LMW-HA/HAS固相对照，这些抗血清对酸水解LMW-HA/HAS偶联物的一个数量级的优先。
超声处理的LMW-HA/TT在新西兰白兔体内产生的抗血清的特异性采用超声处理的LMW-HA/TT偶联物免疫的兔体内产生的抗血清的特异性是通过微量滴定板抑制试验检测的。对来自超声处理的LMW-HA/TT免疫的兔#75295的抗血清进行的抑制研究结果如图8和图9所示。图8显示的是用作抑制物的几类超声处理HA及几类酸水解HA。该试验中，所有形式的酸水解的HA均是与包被的超声处理的LMW-HA/HAS结合的抗体的不良抑制物。至于超声处理的抑制物种类，趋势似乎是超声处理产生的HA片段越小，该片段作为抑制物就越有效。这表明较小的HA分子与较大种类相比，每单位质量具有更多的表位。
图9所示结果进一步说明了该发现。在此，极高分子量的天然HA被认为是非常低效的抑制物，几乎比采用20kD HA为免疫原低3个数量级。该试验中也以较小种类作为抑制物。HA的四糖形式是相对有效的抑制物，而二糖和D-葡糖醛酸形式根本不抑制与固相结合的抗体。
采用来自也经由超声处理LMW-HA/TT偶联物免疫的兔#72700的抗血清，进行抑制研究所得的结果如图10和图11所示。这些结果与前述的通过兔#75295获得的结果十分相似。图10显示的结果与图9中显示结果相似。即HA的四糖形式与HA的超声处理(20K)免疫原形式抑制良好，而HA的二糖和天然形式则抑制不佳。采用HA的六糖形式进一步检验HA的大小和免疫反应性之间的关系。结果如图11所示。结果表明HA的这一形式可完全抑制抗体结合。从这些研究中，可以明显看出至少HA的四糖形式(两个重复亚单位)对完全抑制是必须的。HA的二糖形式不足以发挥抑制作用，并且分子的天然形式不是最佳抑制物。因此，就免疫识别而言，优选的是将大的天然HA分子的尺寸减小。
实施例5小鼠中的免疫原性研究小鼠体内产生的透明质酸-蛋白质偶联物的抗血清采用LMW-HA/蛋白质偶联物疫苗对BALB/c和CD1小鼠进行三次注射免疫。偶联物或者是与兔免疫一样的超声处理的LMW-HA/TT，或者是超声处理的HA与rPorB的偶联物(LMW-HA/rPorB)。LMW-HA/TT偶联物疫苗产生的免疫应答不大于阴性对照。然而，LMW-HA/rPorB偶联物在100％的免疫动物体内均可产生可检测的ELISA滴度。这些数据如分别针对BALB/c小鼠和CD1小鼠的图12和图13所示。
实施例6保护试验被动免疫采用LMW-HA/TT偶联物的兔抗血清在成年Balb/c小鼠体内的被动免疫中进行保护试验。于采用A族链球菌(GAS)6型或3型的LD90侵袭剂量进行侵袭(IP)前2个小时，将1倍稀释于无菌PBS的兔抗血清(0.5ml)进行腹膜内注射(IP)。经由磷酸盐缓冲盐水(PBS)和弗氏完全佐剂(CFA)免疫的兔的抗血清、以及针对偶联于至破伤风类毒素的A族链球菌碳水化合物产生的兔抗血清被作为对照血清包括于保护试验中。侵袭后10天内记录存活情况。
采用经PBS/CFA免疫的兔抗血清对Balb/c小鼠免疫2个小时后，以一定剂量范围的GAS 6型或3型IP侵袭，事先测定LD90s。测定的6型和3型的LD90分别为5×103和2×105cuf/ml。侵袭试验结果如图14和图15所示。
权利要求
1.一种免疫原性偶联物分子，包含与免疫学合适的多肽载体共价结合的透明质酸。
2.权利要求1的免疫原性偶联物，其中超过约50％的透明质酸分子具有非还原末端葡糖醛酸和/或不饱和葡糖醛酸残基。
3.权利要求2的免疫原性偶联物，其中透明质酸是分子量等于或低于约400Kd，并等于或高于约600道尔顿的低分子量透明质酸。
4.权利要求3的免疫原性偶联物，其中至少90％或超过90％的低分子量透明质酸片段具有非还原末端葡糖醛酸和/或不饱和葡糖醛酸残基。
5.权利要求3的免疫原性偶联物，其中至少95％或超过95％的低分子量透明质酸片段具有非还原末端葡糖醛酸和/或不饱和葡糖醛酸残基。
6.权利要求3的免疫原性偶联物，其中至少98％或超过98％的低分子量透明质酸片段具有非还原末端葡糖醛酸和/或不饱和葡糖醛酸残基。
7.权利要求3的免疫原性偶联物，其中至少99％或超过99％的低分子量透明质酸片段具有非还原末端葡糖醛酸和/或不饱和葡糖醛酸残基。
8.权利要求3的免疫原性偶联物，其中低分子量透明质酸大小为至少约4个糖基残基。
9.权利要求3的免疫原性偶联物，其中低分子量透明质酸具有约2到约20个二糖亚单位。
10.权利要求9的免疫原性偶联物，其中低分子量透明质酸具有约2到约10个二糖亚单位。
11.权利要求3的免疫原性偶联物，其中多肽载体选自破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素、来源自链球菌的免疫原性多肽、来源自流感的免疫原性多肽、来源自脑膜炎球菌的免疫原性多肽、来源自肺炎球菌的免疫原性多肽、和来源自大肠杆菌的免疫原性多肽。
12.权利要求3的免疫原性偶联物，其中多肽载体是来自奈瑟球菌的膜孔蛋白。
13.权利要求3的免疫原性偶联物，其中偶联物是直接连接的。
14.权利要求3的免疫原性偶联物，其中偶联物激发与表位结合的抗体，该表位包括作为低分子量透明质酸非还原末端糖的葡糖醛酸或不饱和葡糖醛酸。
15.权利要求3的免疫原性偶联物，其中偶联物激发与存在于细菌中的荚膜透明质酸结合的抗体。
16.权利要求15的免疫原性偶联物，其中细菌为A族链球菌或C族链球菌。
17.一种药物组合物，包含权利要求3的偶联物和药学可接受载体。
18.权利要求17的药物组合物，进一步包含生理学可接受的佐剂。
19.制备低分子量透明质酸-多肽偶联物分子的方法，包括将低分子量透明质酸片段与免疫学合适的多肽共价连接，其中约50％或大于50％的低分子量透明质酸片段在其非还原末端具有葡糖醛酸和/或不饱和葡糖醛酸残基。
20.权利要求19的方法，其中该方法包括将低分子量透明质酸与免疫学合适的多肽共价连接，包括还原胺化。
21.结合于权利要求3的免疫原性偶联物分子的纯化的抗体。
22.权利要求21的纯化的抗体，其中低分子量透明质酸片段大小为至少约4个糖基残基。
23.权利要求22的纯化的抗体，其中透明质酸片段大小为至少约4个糖基残基，并且不超过约40KD。
24.有效地治疗或抑制A族链球菌或C族链球菌感染的药物组合物，包含选自权利要求17的组合物激发的抗体、权利要求21的抗体、或偶联于脂质体的低分子量透明质酸激发的抗体。
25.在哺乳动物中激发抗体应答的方法，包括给予个体哺乳动物一定量的权利要求17的药物组合物，该量足以激发抗体应答。
26.权利要求25的方法，其中哺乳动物为人。
27.权利要求25的方法，其中药物组合物是通过肌内、皮下、腹膜内或静脉给药。
28.权利要求25的方法，其中药物组合物是以每公斤体重约0.1到约50微克的量给药。
29.在人体中激发有效水平的抗低分子量透明质酸抗体的疫苗，包含权利要求3的免疫原性偶联物。
30.在哺乳动物中抑制链球菌感染的方法，包括给予哺乳动物足以抑制感染的量的权利要求3的药物组合物。
31.抑制哺乳动物中由含HA的细菌引起的感染进展的方法，包括给予哺乳动物足以抑制感染进展的量的包括权利要求24的药物组合物的组合物。
32.权利要求31的方法，其中细菌是A族链球菌或C族链球菌。
33.用于检测由链球菌引起的感染的诊断免疫测定试剂盒，包含权利要求21的抗体。
全文摘要
本发明提供了治疗与预防由A族和C族链球菌引起的感染和疾病的抗原组合物及方法。特别是本发明提供了低分子量透明质酸、与载体连接的低分子量透明质酸及包含它们的组合物。该组合物激发针对低分子量透明质酸的抗体，该抗体具有与A族和C族链球菌的交叉反应性，并且具有与天然透明质酸最低的交叉反应性。在对那些被A族和C族链球菌感染或处于感染危险中的人提供主动和被动免疫原性保护方面，本发明尤其有用。另外，本发明还提供了对诊断由A族和C族链球菌引起的感染和疾病有用的方法和组合物。
文档编号A61K47/48GK1525869SQ02813943
公开日2004年9月1日 申请日期2002年5月10日 优先权日2001年5月11日
发明者F·米雄, S·穆尔, M·劳德－夏普, M·布拉克, , F 米雄, 夏普 申请人:巴克斯特国际有限公司, 巴克斯特健康护理股份有限公司