Mntf肽组合物及使用方法

专利名称：Mntf肽组合物及使用方法
MNTF肽组合物及使用方法本公开内容总的涉及使用MNTF肽及其类似物治疗神经元疾病的组合物及方法。相关申请的交叉引用本申请要求2008年2月21日提交的题为“MNTF肽组合物及使用方法”的美国临 时专利申请No. 61/066，669的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
背景技术：
下述包括在理解本公开内容上有用的信息。不承认本文提供的任何信息为现有技 术或与现有的公开内容相关，或不承认明确或隐含引用的任何出版物或文件为现有技术。已发现胚胎运动神经元的存活取决于源自相关的发育中骨骼肌的特定营养物质。 已报道某些骨骼肌产生能够通过防止胚胎运动神经元的衰退和随后的自然细胞死亡来增 强运动神经元存活和发育的物质。这些物质被广泛称为神经营养因子(NTF)，其为对选 定神经元群的存活、生长、维持及功能性能力起促进作用的一类专化蛋白质(例如Chau， R. Μ. W.，et al.，6 Chin. J Neuroanatomy 129，1990)。可通过功能性神经组织的急性或进行性丧失来整体或部分表征影响中枢和/或 外周神经系统的各种神经退行性、神经肌肉和神经元疾病、疾病或病况。US 6309877、US 7183373、US 6841531、US 6759389 和 US 20060052299 报道了被 称为运动神经元营养因子(MNTF)的特定神经营养因子(NTF)，其具有在运动神经元上发挥 营养作用的能力，所述文献内容通过引用整体并入本文。发明概述本文所述内容为具有包括但不限于所述发明概述中阐述、描述或引用的许多特性 和实施方式的技术。不希望其为包含全部的且所述权利要求不为所述发明概述确定的特征 或实施方式所限制，其仅因说明而非限制的目的而被包括。因此，一方面，本公开内容涉及新型肽和组合物，其包含对调节神经元细胞的活力 和增殖有用的MNTF分子的一部分，从而提供易于合成及在治疗中枢和/或外周神经系统中 的广泛的神经退行性、神经肌肉疾病、疾病或病况上为治疗有效的神经营养肽。一方面，本公开内容涉及包含至少两个连续残基的合成和/或纯化的MNTF肽或其 类似物，其包括在 LGTFWGDTLN CWMLSAFSRY ARCLAEGHDGPTQ (SEQ ID NO 1)的位置 17 和 18 处的FS残基，且对诱导或调节神经元细胞的活力和生长有用。在某些实施方式中，MNTF肽或其类似物包括包含SEQ ID NO :1 22的序列类似 物。在某些实施方式中，MNTF肽或其类似物为2聚体、3聚体、4聚体或5聚体非棕榈酰化 肽。在某些其他实施方式中，MNTF肽或其类似物为2聚体、3聚体、4聚体、5聚体或6聚体 棕榈酰化肽。在某些方面中，本公开内容提供组合物，其包含通过与渗透增强剂共价键合 (bonding)/键合(linkage)或缀合，或者在固相合成期间通过经由肽键添加所述渗透增强 剂而被N-末端修饰的MNTF肽或其类似物。在某些实施方式中，丽TF肽由下列构成i)SEQ ID NO 1的2个和6个之间的连 续氨基酸；ii)SEQ ID NO :1的2个和5个之间的连续氨基酸；iii)SEQ ID NO :1的3个和
35个之间的连续氨基酸；iv)SEQ ID NO 1的至少2个连续氨基酸；v) SEQ ID NO 1的至少 3个连续氨基酸；或vi)它们中任一项的类似物，例如i) ν)中任一项的功能衍生物。在 i)、iv)和ν)中所述MNTF肽不具有由SEQ IDNO :2构成的氨基酸序列。在某些其他实施方 式中，MNTF肽或其类似物具有选自SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 22或它们的功能衍生物的 氨基酸序列。优选MNTF肽或其类似物具有MNTF活性。在一些方面中，将所述MNTF肽类似物共价连接(例如在N-末端处通过肽键)至 2 22碳的脂肪酸分子(例如棕榈酸)。一方面，本公开内容提供了皮肤药学组合物，其包 含具有选自 LGTFWGDTLNCWMLSAFSRYARCLAEGHDGPTQ(SEQ ID NO 1)的至少 2 个连续氨基酸 残基(包括FS)的肽或其类似物，及药学可接受载质。在一些实施方式中，所述MNTF肽或其类似物包含SEQ ID NO 1的苯丙氨酸-丝 氨酸二肽和SEQ ID NO :1中的1 30个额外的氨基酸，任选具有在SEQ ID NO :1中所述序 列的1 5个连续氨基酸取代的所述MNTF肽或其类似物、或酯、酰胺、前药和/或它们的盐 形式。在另一实施方式中，所述MNTF肽类似物在N-末端处被缀合或共价连接或通过肽 键连接至2 22碳的脂肪酸分子(例如棕榈酸)以增强皮肤渗透性和/或油溶解性。LGTFffGDTLN CWMLSAFSRY ARCLAEGHDG PTQ(SEQ ID NO 1)FSRYAR (SEQ ID NO 2)FS (SEQ ID NO 3)FSR (SEQ ID NO 4)AFS (SEQ ID NO 5)FSRY (SEQ ID NO 6)SAFS (SEQ ID NO 7)AFSR (SEQ ID NO 8)LSAFS (SEQ ID NO 9)SAFSR (SEQ ID NO 10)AFSRY(SEQ ID NO 11)FSRYA (SEQ ID NO 12)MLSAFS(SEQ ID NO: 13)LSAFSR(SEQ ID NO: 14)SAFSRY(SEQ ID NO: 15)AFSRYA(SEQ ID NO: 16)SRYAR (SEQ ID NO : 17)RYAR (SEQ ID NO : 18)YAR (SEQ ID NO : 19)SRYA (SEQ ID NO : 20)RYA (SEQ ID NO : 21)SRY (SEQ ID NO : 22)另一方面，提供用于通过给细胞培养物体外施用所述MNTF肽或其类似物，或者给 遭受神经损伤或神经退行性疾病的个体体内施用所述MNTF肽或其类似物，以促进细胞增
4殖或稳定不适当的细胞死亡，和/或在两种情况下恢复正常细胞行为来调节神经元细胞的 活力和/或生长的组合物和方法。另一方面，提供了提高有神经通路损伤症状的受试者的 运动功能的方法，其包括给有需要的受试者施用运动神经元营养因子(MNTF)肽或其类似 物。因此，一方面，本公开内容涉及新型肽和组合物，其包含对调节神经元细胞的活力 和增殖有用的MNTF分子的一部分，从而提供易于合成及在治疗广泛的皮肤疾病(包括皮下 区域神经和肌肉的神经移植术)上为治疗有效的神经营养肽。一方面，本公开内容涉及合成和/或纯化的MNTF肽或其的类似物，其包含对诱导 或调节邻近皮肤的神经元细胞的活力和生长有用的FS结构域。另一方面，通过给细胞培养物体外施用所述MNTF肽或其类似物，或者给遭受神经 损伤或神经退行性疾病的个体体内施用所述MNTF肽或其类似物，以促进细胞增殖或稳定 不适当的细胞死亡，和/或在两种情况下恢复正常细胞行为来调节神经元细胞的活力和/ 或生长的组合物和方法。一方面，提供了修复受试者中损伤的神经通路的方法，其包含给有需要的受试者 施用MNTF肽或其类似物，其中所述损伤的神经通路与皮肤损伤或病况相关，其中以对治疗 所述皮肤病况或疾病，由此在所述受试者中损伤的神经通路被修复来说有效的量施用所述 MNTF肽或其类似物。


图1示例示MNTF肽对运动神经元存活的存活测定。从大鼠脊髓中培养运动神经 元，并在BDNF、GDNF和CNTF存在下于培养基中生长3天。3天后，所述细胞在无常规营养 因子但有指定的10μ g/ml的MNTF肽下生长。48小时后确定活细胞数。所述坐标图示五个 样品的平均+/-SD值(BDNF =脑源性神经营养因子；GDNF =胶质细胞源性神经营养因子； CNTF=睫状神经营养因子)。发明详述已发现胚胎运动神经元的存活取决于源自相关的发育中骨骼肌的特定营养 物质。已报道某些骨骼肌产生能够通过防止胚胎运动神经元的衰退和随后的自然 细胞死亡来增强运动神经元存活和发育的物质。(0' Brian, R. J. and Fischbach, G. D. , 6J. Neurosci. 3265 (1986) ；Hol lyday, Μ. and Hamburger, V. , 170J. Comp· Neurol.311 (1976). McManaman, J. L. , et al.,263J. Biol. Chem. 5890(1988) ；Oppenheim, R. W.，et al.，240Science, 919 (1988)；及 Smith, R. G.，et al.，6J. Neurosci. 439 (1986))。人运动神经元营养因子(MNTF)为源自骨骼肌组织的特定NTF，已显示其可减少运 动神经元损伤位点的发炎，加强神经再生并促进运动神经元的存活。已在各种大鼠神经系 统(包括外周坐骨神经(控制下肢肌肉)、外周肌皮神经(控制上肢肌肉)、颅面神经(控 制面部和头部肌肉)、颅舌下神经(控制舌)及控制颈部、胸部和上肢肌肉的脊髓的一部 分)中检测了 MNTF。在所述脊髓模型中，在大鼠半节脊髓中的神经移植上使用MNTF ;MNTF 减少发炎、限制变性及加强所述移植神经的再生。大量研究已证明，当在神经上直接使用本 文所述的合成的MNTF或肽类似物时，所述合成的MNTF或肽类似物在大鼠外周神经模型系 统中对于营养(trophic)和营养(tropic)作用的功效。此外，已显示MNTF可促进运动神
5经元的再生和存活。在某些生长和发育阶段期间在脊椎动物的神经系统中发生神经元细胞的死亡。因 此，来自相关靶组织的可溶性神经元营养因子的添加有助于缓解神经元死亡的所述现象。因此，本公开内容的方面和实施方式为神经元疾病的治疗提供了包含所述MNTF 肽或其类似物的方法和组合物。本公开内容的方面和实施方式涉及与运动神经元营养因子的作用相关的功能蛋 白结构域，其已被鉴定且定位于MNTF分子中的短重叠序列。包括SEQ ID NO 2 22中结 构域的所述蛋白结构域足以调节神经元细胞的活力和增殖。此外，包含所述结构域的截短 的MNTF肽或类似物本身足以显示在运动神经元/神经母细胞瘤细胞杂交物中的刺激生物 活性。^JL阐述了在本公开内容涉及的所述技术中使用的某些术语。除另有说明外，在本文 和随附的权利要求中使用时下列术语具有下列含义。在说明书下文或其他地方没有定义的 那些术语应具有其公认的含义。本文所用“运动神经元营养因子或运动神经元营养因子”包括在运动神经元的营 养和维持中涉及的因子。本文所用术语“运动神经元营养因子”、“MNTF”、“MNTF肽”、“运动 神经元营养因子类似物”和“MNTF类似物”分别涉及本文所述的肽及其类似物且具有本文 所定义的功能特性。其可包括所述参照MNTF序列的序列和功能同源物。运动神经元营养 因子可促进定向神经前体细胞的发育和分化，或其可诱导或加强分化神经细胞的生长(如 神经轴突突起)和存活。“MNTF活性”包括下列活性的一种或多种促进神经元的生长，促 进神经元的维持，促进神经轴突突起，促进经轴突切断的运动神经元的轴突再生，促进运动 功能，修复损伤的神经通路，再生神经通路或缓解神经元缺陷。通常以以对产生CNS或PNS 的完全分化神经细胞(例如，运动神经元)来说有效的量提供本公开内容的运动神经元营 养因子。本文提供了所述量的指导且基于本文公开的方案和方法其可由本领域技术技术人 员轻易确定。在 Chau，R. M. W. ,et al, Muscle Neuronotrophic Factors Specific for Anterior Horn Motoneurons of Rat Spinal Cord、Recent Advances in Cellular and Molecular Biology, Vol. 5,Peeters Press, Leuven,Belgium,pp. 89-94 (1992)中已报道了 MNTF 肽，及在例如 US 6309877、US 7183373、US 6841531、US 6759389 和 US 20060052299 中发现的MNTF肽，其内容通过引用整体并入本文。在某些实施方式中，样本包括合成和/ 或纯化的MNTF肽或其类似物，其包含SEQ ID NO :2 22结构域的一部分和模拟其结构和 /或功能的分子，其包括截短的序列同源物和类似物，且其对诱导或调节神经元细胞的活力 和生长有用。此外，MNTF肽也包括在 Chau，R. M. W.，et al.，The Effect of a 30kD Protein from Tectal Extract of Rat on Cultured Retinal Neurons,34Science in China, Series B,908 (1991)、Chau, R. M. W. , et al. , Muscle Neuronotrophic Factors Specific for Anterior Horn Motoneurons of RatSpinal Cord、 Recent Advances in Cellular and Molecular Biology, Vol.5, Peeters Press, Leuven, Belgium, pp. 89-94(1992)、 Chau, R. M. W. , et al. , The Effectof a 30kD Protein from Tectal Extract of Rat on
6Cultured Retinal Neurons,34Science in China, Series B,908 (1991)> Chau, R. M. W., et al. , Cloning of Genes for Muscle-Derived Motoneuronotrophic Factor 1(MNTFl) and Its Receptor by Monoclonal Antibody Probes, (abstract)19Soc. for Neurosci. parti,252 (1993)、Chau, R. M. W. , et al. , Cloning of Genes for Muscle-Derived Motoneuronotrophic Factorl (MNTFl) and Its Receptor by Monoclonal Antibody Probes, (abstract) 19Soc. for Neurosci. parti, 252 (1993)中所述的 MNTF 肽，其内容通过 引用整体并入本文。在某些实施方式中，MNTF肽或其类似物可包括自MNTF结构域活性位点之一的序 列(例如两个氨基酸的MNTF肽，如SEQ ID NO :3)。在某些实施方式中，所述MNTF肽由在SEQ ID NO :2 22中所述的序列构成。在 其他一些实施方式中，所述MNTF肽类似物包括在SEQID NO :2 22中所述的MNTF肽的功 能衍生物。本文所述MNTF肽及其类似物包括源自MNTF (即源自SEQ ID NO 1)的肽和它们的 功能衍生物。所述化合物包括具有SEQ ID NO 2 22之一的氨基酸序列的肽和具有在SEQ ID NO 2 22中提供的氨基酸序列的肽的功能衍生物。本申请所用“类似物”包括已被修饰但保留MNTF活性(例如相对于33聚体MNTF， SEQ ID NO: 1，通过截短、取代、共价连接至另一部分等)的肽。MNTF肽类似物包括例如MNTF 肽的酯、酰胺、前药和/或盐形式。MNTF肽类似物包括通过连接至另一部分而被共价修饰的 MNTF肽，例如将MNTF肽共价连接至亲脂部分(例如脂肪酸)、载质分子或异源多肽以产生 融合蛋白。在某些实施方式中，本发明所述的类似物包括“保守”取代(例如相对于SEQ ID NO :1)。保守的氨基酸取代包括使用同组内的同义氨基酸的氨基酸替换，其具有足够相似的 物理化学特性即组成员间的取代会保持分子的生物学功能(Grantham，Science, Vol. 185， pp. 862-864(1974))。MNTF类似物还包含本文所述的肽或类似物的MNTF功能衍生物。在一 些实施方式中，与在SEQ ID NO 1或其截短形式(包括SEQ ID NO :2 22)所示的序列相 比，所述MNTF类似物包括20 %、25 %、30 %、35 %或多达40 %的保守氨基酸取代。本文所用MNTF的“功能衍生物”指依据已知方法从氨基酸部分侧链或末端的N-或 C-基上存在的功能基制备的衍生物且当其为药学可接受时即当其不破坏蛋白/肽活性或 不把不可接受的毒性给予包含它们的药物组合物时其被包含在本公开内容中。所述衍生物 包括例如羧基的脂肪酯或酰胺和游离氨基的N-酰基衍生物、及游离羟基的0-酰基衍生物 和用酰基形成的例如链烷酰基或芳酰基、前药、功能基的盐或它们的组合。同义氨基酸组包括在表I、II和III中所定义的组表 I同义氨基酸的广义组氨基酸一同义组Ser-—Ser、Thr、Gly、AsnArg-—Arg、Gln、Lys、Glu、HisLeu-—lie、Phe> Tyr> Met、VaULeuPro-—Gly、Ala、Thr、ProThr-—Pro、Ser、Ala、Gly、His、Gin、Thr
7
同义氨基酸的狭义组氨基酸-同义组Ser-—SerArg——ArgLeu——lie、Met、LeuPro-—ProThr-—ThrAla-—AlaVal-—ValGly-—Glylie-—Ile、Met、LeuPhe-—PheTyr-—TyrCys-—Ser、CysHis—HisGln-—GlnAsn——AsnLys——LysAsp——AspGlu—GluMet-—lie、Leu、MetTrp-—Trp在本文所提供的化合物(例如肽和蛋白)中使用的氨基酸可为基因编码的氨基 酸、天然存在的非基因编码的氨基酸或合成的氨基酸。可将上述之任一种的L-和D-对映 体用于所述化合物。对下列基因编码的氨基酸(和它们的残基)本文使用下列缩写丙氨 酸(Ala，Α)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)； 甘氨酸(Gly，G)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(lie，I)； 亮氨酸(Leu, L)；赖氨酸(Lys, K)；蛋氨酸(Met, Μ)；苯丙氨酸(Phe, F)；脯氨酸(Pro, P)； 丝氨酸(Ser, S)；苏氨酸(Thr, T)；色氨酸(Trp, W)；酪氨酸(Tyr, Y)及缬氨酸(Val, V)。非基因编码和在本文所述化合物中存在的某些常见氨基酸包括，但不限于 β-丙氨酸(b-Ala)及其他ω-氨基酸(如3_氨基丙酸(Dap)、2，3_ 二氨基丙酸(Dpr， 2)、4_氨基丁酸等)、α-氨基异丁酸(Aib)、ε-氨基己酸(Aha)、δ -氨基戊酸(Ava)、 甲基甘氨酸(MeGly)、鸟氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit)、叔丁基丙氨酸(t_BuA)、叔丁基甘氨酸 (t-BuG)、N_甲基异亮氨酸(MeIle)、苯基甘氨酸(Phg)、环己丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle， J)、2_萘丙氨酸(2-Nal)、4-氯苯丙氨酸(Phe (4-C1))、2_氟苯丙氨酸(Phe (2-F))、3_氟苯 丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、青霉胺(Pen)、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧 酸(Tic)、β -2-噻吩丙氨酸(Thi)、蛋氨酸亚砜(MSO)、高精氨酸(hArg)、N-乙酰赖氨酸 (AcLys)、2，3-二氨基丁酸(Dab)、2，3-二氨基丁酸(Dbu)、对氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2))、 N-甲基缬氨酸(MeVal)、高半胱氨酸(hCys)、3_苯并噻唑_2_基-丙氨酸(BztAla，B)和高
9丝氨酸(hSer)。涉及的更多氨基酸类似物包括磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、羟脯氨酸、Y-羧 基谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、抑胃酶氨酸、α -甲基-丙氨酸、对苯甲酰_苯基丙 氨酸、炔丙基甘氨酸和肌氨酸。无论现在还是将来，本文所述肽可有任何L-或D-构型的上 述氨基酸、或本文所述或本领域已知的任何其他氨基酸。可互相取代的氨基酸通常属于相似的类或亚类。如本领域任一技术人员所知，主 要取决于所述氨基酸侧链的化学和物理特性而将氨基酸分进不同类中。例如，通常认为一 些氨基酸为亲水性或极性氨基酸而认为其他的为疏水性或非极性氨基酸。极性氨基酸包 括有酸性、碱性或亲水性侧链的氨基酸而非极性氨基酸包括有芳香族或疏水性侧链的氨基 酸。可进一步将非极性氨基酸细分成包括尤其是脂肪族氨基酸。本文所用的氨基酸种类的 定义如下“非极性氨基酸”指具有在生理ρΗ下不带电、非极性且通常被水溶液排斥的侧链的 氨基酸。基因编码的疏水性氨基酸的例子包括Ala、Ile、Leu、Met、Trp、Tyi^nVal。非基 因编码的非极性氨基酸的例子包括t-BuA、Cha和Nle。“芳香族氨基酸”指具有包含至少一个具有共轭η -电子系统的环的侧链(芳香 基)的非极性氨基酸。所述芳香基可用取代基(如烷基、烯基、炔基、羟基、磺基、硝基和氨 基及其他基团)进一步取代。基因编码的芳香族氨基酸的例子包括苯丙氨酸、酪氨酸和色 氨酸。通常遇到的非基因编码的芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘丙氨酸、β -2-噻吩 丙氨酸、3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸、1，2，3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟 苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。“脂肪族氨基酸”指具有饱和或不饱和直链、支链或环烃侧链的非极性氨基酸。基 因编码的脂肪族氨基酸的例子包括:Ala、Leu、Val和lie。非编码的脂肪族氨基酸的例子 包括Nle。“极性氨基酸”指具有在生理ρΗ下带电或不带电的侧链的亲水性氨基酸，且其具有 其中由两个原子共用的电子对被所述原子中的一个更近占有的键。极性氨基酸通常为亲水 性的，即其具有具有可被水溶液吸引的侧链的氨基酸。基因编码的极性氨基酸的例子包括 天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和丝氨酸。非基因编码的极性氨基酸的例子包括瓜 氨酸、高半胱氨酸、N-乙酰赖氨酸和蛋氨酸亚砜。“酸性氨基酸”指具有小于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于氢离子的丧失，酸 性氨基酸在生理PH下通常具有带负电荷的侧链。基因编码的酸性氨基酸的例子包括天冬 氨酸和谷氨酸。“碱性氨基酸”指具有大于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于水合氢离子的结 合，碱性氨基酸在生理PH下通常具有带正电荷的侧链。基因编码的碱性氨基酸的例子包 括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非基因编码的碱性氨基酸的例子包括鸟氨酸、2，3-二氨基 丁酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。“可电离氨基酸”指在生理ρΗ下可带电的氨基酸。所述可电离氨基酸包括酸性和 碱性氨基酸，例如D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-精氨酸、D-赖氨酸、D-羟赖氨酸、 D-鸟氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-羟赖氨酸或L-鸟氨酸。如本领域技术人员所了解，所述分类不是绝对的。许多氨基酸显示出多于一种的
10特征性质，且可因此被包括在多于一种分类中。例如酪氨酸既有非极性芳香环又有极性羟 基。因此，酪氨酸具有可被描述为非极性、芳香化和极性的多种特征。然而，非极性环是占 优势的，因此普遍认为酪氨酸是非极性的。同样，除了能形成二硫键之外，半胱氨酸也具有 非极性的特征。因此，虽然半胱氨酸没有被严格划分为疏水性氨基酸或非极性氨基酸，但在 许多情况下，可用其来为肽赋予疏水性或非极性。在一些实施方式中，本文所述极性氨基酸可包括例如精氨酸、天冬酰胺、天冬氨 酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、高半胱氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、 苏氨酸及结构相关的氨基酸。在一实施方式中，所述极性氨基酸为可电离氨基酸(如精氨 酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟赖氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。可使用的极性或非极性氨基酸残基的例子包括，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、蛋 氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等。本文术语“盐”指本文所述肽或其类似物的羧基盐和氨基的酸加成盐。可通过本领 域已知的方法形成羧基盐，且其包括无机盐(例如钠、钙、铵、铁或锌盐等)和与有机碱(例 如，与胺(如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等))所形成的盐。酸性盐包括，例 如无机酸(如盐酸或硫酸)盐和有机酸(如醋酸或草酸)盐。当然，所述的任何盐必须保 留本文所述的肽或其类似物的活性。“前体”为在人体或动物体中可被转换成本文所述的肽的化合物。可通过本领域熟知的任何方案(如固相合成或液相合成)制备本公开内容的肽。 作为固相合成，例如对应于要合成的肽C末端的氨基酸被结合至不溶于有机溶剂的支持物 上，并通过反应的交替重复，其中一个反应为具有用适当的保护基保护的α-氨基和侧链 功能基的氨基酸以C-末端至N-末端的顺序依次被缩短，而其中另一个为释放结合至树脂 或肽α-氨基的保护基的氨基酸，所述肽链从而以此方式延伸。取决于使用的保护基的类 型，在很大程度上由tBoc方法和Fmoc方法分类固相合成方法。通常使用的保护基包括对于氨基的tBoc (叔丁氧羰基)Xl-Z (2-氯苄氧羰基)、 Br-Z (2-溴苄氧羰基)、Bzl (苄基)、Fmoc (9-芴甲氧羰基)、Mbh (4,4' - 二甲氧基二苯甲 基)、Mtr (4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)、Trt (三苯甲基)、Tos (甲苯磺酰基)、Z (苄 氧羰基)和C12-Bzl(2，6 二氯苄基)；对于胍基的NO2 (硝基)和Pmc (2，2，5，7，8-五甲基色 烷-6-磺酰基；及对于羟基的tBu (叔丁基)。在所需肽的合成后，其要经受去保护反应并从固体支持物上切割出。可用Boc方 法的氟化氢或三氟甲烷磺酸及用Fmoc方法的TFA进行所述肽切割反应。然后获得的粗肽要经受纯化。通过所述目的已知的任一方法即包括提取、沉淀、色 谱、电泳等的任何常规方案进行纯化。例如，可使用HPLC(高效液相色谱)。可使用常用于 蛋白纯化的基于水_乙腈的溶剂进行所述洗脱。基本上以纯化的形式提供本文所述的肽，以适于在药物组合物中、作为活性成分、 在需要MNTF活性和/或由此的调节的病变中使用。本文所用术语“生物活性肽”和“生物活性片段”指依据上述运动神经元分化因子 (MNDF)和/或运动神经元营养因子(MNTF)的肽或多肽，其中MNDF可使干细胞分化成运动 神经元，而其中MNTF显示出神经保护、修复和治疗功能。本文所用例示MNTF肽及其类似物包括本文已证明的足以使干细胞分化成运动神
11经元的那些。本文所用“预防”指整体或部分预防、或改善或控制。本文所用术语“治疗”指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或预防性 (preventative)措施。需要治疗者包括已患所述疾病者和易于患所述疾病者，或者诊断患 所述疾病者或要预防所述疾病者。本文所用参照本文所述的化合物或组合物的“有效量”指对于诱导所需的生物学、 药学或治疗结果有效的量。所述结果可为病征、症状的缓解、或疾病、疾病或病况的原因、或 生物系统所需的其他任何改变。术语“百分比(％ )同一性”指在两个或多个序列的比较中发现的序列相似性的百 分比。例如，可使用任何合适的软件电子化确定百分比同一性。同样，通过将一个序列的序 列与第二个序列相比较来确定两个序列(或两个序列中各个或两个的一个或多个部分)间 的相似性。本文所用术语“同源性和同源物”包括包含同源于目的蛋白序列的氨基酸序列的 肽。所述肽与相关序列(例如超过所述同源序列的至少约15、20、30、40、50、100个以上的连 续氨基酸/多肽的区域)通常具有至少约70%的同源性，并可为至少约80%、90%、95%、 97%或99%同源性。取决于所述肽和参照序列的长度，相对于参照序列(例如SEQID NO 1)其还可包含多达约25%、30%、40%或50%的保守氨基酸变化。治疗的一般方面提供了治疗患有神经元疾病的患者的方法，其包含给患者施用运动神经元营养因 子(MNTF)肽或其类似物。本文所用神经元疾病可包括通过功能神经组织的急性、进行性或逐渐丧失整体或 部分表征或相关联的疾病、疾病或病况。“神经退行性疾病”指通过功能神经组织的进行性、逐渐丧失表征的与中枢或外周 神经系统相关的疾病。碰在美国专利No. 6，309，877,6, 759，389和6，841，531 (及共同在审美国专利申请系 列 No. 10/858，144,10/858, 286,10/858, 543 和 10/858，545)中描述了来自大鼠肌肉组织的 两种运动神经元营养因子(MNTF1和MNTF2)的分离和鉴定及源自人视网膜母细胞瘤cDNA 文库的重组MNTFl F6基因的随后克隆，将这些文献通过引用整体并入本文。如在国际申 请No. PCT/US2004/038651中所述，发现定位于人染色体22q 22内的MNTFl F6基因序列 编码33个氨基酸的MNTFl多肽，将所述文献通过引用整体并入本文。MNTFl F6分子内对MNTFl的已知生物活性似乎足够的两个重叠结构域被确认。 (见国际申请No. PCT/US04/01468或美国专利申请系列No. 10/541，343 (被授权为美国专利 No7, 183，373)，将这些文献通过引用整体并入本文)。被命名为“WMLSAFS”和“FSRYAR”结 构域的所述结构域的每一个足以用类似于MNTFl F6 33聚体的方式刺激源自细胞系的运 动神经元的增殖。同样地，所述“FSRYAR”结构域足以用类似于MNTFl F6 33聚体的方式 由运动神经元体内指导肌肉目标的选择性再神经切除。另外，当使用所述“FSRYAR”结构域 来引发免疫应答时，其提供了足以产生识别包含“FSRYAR”序列的MNTF肽(包括MNTFl F6 33聚体)的抗体的抗原表位。
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此外，可如本文所述的使用包含SEQ ID NO :1的至少两个连续残基的所述MNTF 肽，只要所述肽至少包含在SEQ ID NO 1的位置17和位置18处分别存在的苯丙氨酸和丝
氨酸残基。在人胎儿孕育期中的第9周期间运动神经元营养因子(MNTF)在表达上达到峰值 (Di，X. et al.，Acta Anatomica Sinica 29 :86_89，1998)。基于在发育的人体中 MNTF 的 表达，我们推断MNTF可促进运动神经元的分化和/或存活。使用方法MNTFl和/或其肽类似物促进哺乳动物运动神经元在体外的存活。因此，本文所述 技术提供了作为神经元细胞培养物的生长因子/补充物的MNTF肽或其类似物的使用、包括 用于促进干细胞衍生的神经元细胞系的存活的方法、通过用有效量的MNTF肽或其类似物 体外培养干细胞衍生的神经元细胞。如美国专利申请No. 12/093,452、PCT/US06/043874所述，其他的MNTF肽已在干 细胞的分化中显示出功效。本文所提供的MNTF肽具有相似的生物活性，并因此调节多能胚 胎干细胞至运动神经元的分化，且增强ES细胞衍生的运动神经元的存活。ES细胞与RA和 MNTF类似物的接触可指导所述细胞产生运动神经元。MNTF和截短的MNTF分子包括但不限于包含MLSAFSRYAR结构域的分子、被称作运 动神经元分化因子(MDNF)的分子、在美国专利申请No. 12/093，452、PCT/US06/043874中被 证明可诱导干细胞或部分分化的神经元细胞分化成运动神经元的分子。所述制剂提供了从 干细胞培养物中产生和/或分离一群运动神经元的新型方法。所述方法包括胚胎干细胞与视黄酸(RA)和运动神经元分化因子(MNDF)的接触。 在本文所述的一实施方式中，用RA同时用运动神经元分化因子接触胚胎干细胞。另外，所 述方法包括部分分化的神经元细胞与运动神经元分化因子的接触。以对产生分化的神经细 胞有效的量提供所述因子。基于本文所公开的方案和方法，可由本领域技术人员轻易确定 所述量。例如可通过FACS分选分离或富集分化的运动神经元。例如基于GFP的运动神经 元标记方法的使用允许纯的ES细胞衍生的运动神经元群的表征。我们已使用了从自胚状 体的细胞的混合群中分离纯的运动神经元细胞群的所述规程。使用胶原酶和分散酶将胚状 体分解成单个细胞。然后用GFP来FACS分选所述单个细胞，因为在群中表达由HB9启动子 控制的GFP的细胞为真的运动神经元。因此，本技术另一方面涉及如下分离和/或纯化一群分化的神经细胞的方法(a) 获得或产生在运动神经元特异性启动子控制下表达增强的绿色荧光蛋白(eGFP)的胚胎干 细胞培养物；(b)将胚胎干细胞的培养物与对于产生表达eGFP的分化的神经细胞有效的量 的RA和MNTF相接触；(d)在分化的神经细胞中检测eGFP的表达；和(f)分离表达eGFP的 分化的神经细胞。MNTF肽及其类似物如熟知本领域和本公开内容的技术人员所了解，包含MNTF活性结构域及其肽类 似物的序列可将神经保护、修复和治疗功能体内和体外给予运动神经元。可合成或重组产 生、或从自然细胞中分离本文所述的MNTF因子。本文经由常用的三字母命名的使用或通过其单字母命名来命名包含本公开内容
13的MNTF肽或其类似物的蛋白或肽中的氨基酸残基的序列。在教课书(如Biochemistry， Second Edition, Lehninger, Α. ，Worth Publishers, New York, N. Y. (1975)) RMfff 述三字母和单字母命名的一览表。当氨基酸序列被水平列出时，希望氨基末端在左边而希 望羧基末端在右端。技术人员应了解，取决于大量因素，包含各种MNTF肽或其类似物的肽的准确化学 结构会有所不同。例如，因为在分子中发现了可电离的羧基和氨基，可以酸性盐或碱性盐、 或以中性形式获得给定的多肽。由于本发明的目的，从而希望包含SEQ ID NO :2 22中列 出的序列/结构域的保留MNTF肽生物活性的肽的任何形式在本文所述技术的范围内。在 某些实施方式中，所述公开内容包括基本上由SEQ ID NO :2 22中列出的序列/结构域构 成的保留MNTF肽的生物活性的肽组合物。本公开内容包括保留MNTF的能力的MNTF肽类似物的使用，所述MNTF的能力是施 行神经保护、促进运动神经元的存活、维持和/或修复，或在某些情况下使干细胞分化成运 动神经元的能力。可使用可从美国生物技术信息中心(www. ncbi. nlm. nih. gov)公共可得的BLAST 程序进行序列的全面比对，以将多肽序列与相应的SEQID NO :1片段相比较。在进行全面比 对之前，可将SEQ ID N0:1提交至GenBank。可将美国生物技术信息中心提供的默认参数 用于全面比对。应了解本文所述技术包括肽类似物的使用，其中用其他的氨基酸取代一个或多个 氨基酸。在一些实施方式中，运动神经元营养因子肽类似物包含对SEQ ID NO :1的至少2 个连续氨基酸残基的片段的一个或多个保守氨基酸取代。在一些实施方式中，所述2个连 续氨基酸残基为F-S。基于模型(实验确定的)肽结构，技术人员可使用已知的合理药物设计方法进行 MNTF及其他类似的结构域模拟物或结合分子的合理设计。合理药物设计的目标为制备生 物活性肽或靶化合物的结构类似物。通过创造所述类似物，改造药物成为可能，其比天然分 子更有活性或更稳定，其对改变有不同的易感性，或其影响各种其他分子的功能。在一方法 中，可产生靶分子或其片段的三维结构。这可通过X射线晶体学、计算机模拟或通过两种方 法的组合完成。可在计算机化的合理药物设计(即分子模拟和分子_分子互作模拟)方法中使用 本文所公开的三维MNTF分子和相关结构，以确认与MNTF的活性部分结合的候选化合物。在 本领域中已知能模拟候选化合物与例如本文所述的原子坐标间互作的各种计算机化药物 设计程序，且所述程序的操作在合理药物设计领域普通技术人员的理解内。制备方法应了解可通过本领域熟知的方法(包括但不限于通过固相合成的化学合成和通 过HPLC从化学反应的其他产物的纯化、或通过在体外翻译系统或在活细胞中表达编码包 含本文所述的MNTF肽或其类似物的肽或多肽的核酸序列(例如DNA序列)的制备)制备包 含本公开内容所述MNTF肽或其类似物的组合物。可分离和大规模透析组合物的MNTF肽或 其类似物以去除一种或多种不需要的小分子量分子和/或被冻干以使更易配入所需媒质。 还应了解在制备入MNTF肽成分中的额外氨基酸、突变、化学修饰等(无论何者)应基本上 不干扰MNTF对接序列的受体识别。
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对应于MNTF的一种或多种片段的肽或多肽在长度上通常应为至少两个氨基酸残 基，且可包含2、3、4或5个氨基酸残基。在某些实施方式中，所述MNTF肽类似物包含6个 氨基酸残基及功能衍生物，例如棕榈酰化物。可通过本领域普通技术人员已知的方法(如 使用自动化肽合成机器(如从Applied Biosystems (Foster City, CA)可得的机器)的肽 合成)合成肽序列。本文所述技术包括源自SEQ ID NO :1 22的环肽的合成和使用。通过靶氨基酸与能与选定的侧链或末端残基反应的有机衍生化试剂间的反应将 共价修饰引入肽中。使用有机衍生化试剂共价修饰多肽为本领域技术人员所熟知。例如，用 α-卤代乙酸(和相应的胺)(如氯乙酸或氯乙酰胺)与半胱氨酰残基反应以给出羧甲基或 甲酰胺基甲基衍生物。可通过与ρΗ 5. 5 7. O的焦碳酸二乙酯或与ρΗ 6的对溴苯酰甲基 溴在IM 二甲胂酸钠溶液中反应而将组氨酰残基衍生化。赖氨酰和氨末端残基可与琥珀酸 或其他羧酸酐反应。可通过与苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮、茚三酮之中的一种 或多种常规试剂的反应修饰精氨酰残基。通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应将谱 标记引入至酪氨酰残基；最常见的是，使用N-乙酰咪唑和四硝基甲烷来分别形成O-乙酰酪 氨酰类和3-硝基衍生物。可通过与碳二亚胺类(R’ -N-C-N-R')(如1-环己基-3-(2-吗 啉-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基_3 (4氮鐺4，4-二甲基戊基)碳二亚胺)反应来选择性 地修饰羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)。此外，通过与铵离子反应使天冬氨酰和谷氨酰残基 转换成天冬酰胺酰或谷氨酰胺酰残基。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基可被去酰胺至相应的 谷氨酰和天冬氨酰残基。其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的 羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creight0n，1983， Proteins !Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman& Co. , San Francisco, PP. 79-86)，N-末端胺的乙酰化和在一些情况下、C-末端羧基的酰胺化。可在测定和用于测定的试剂盒中以游离的形式或连接至载质分子(如蛋白或固 体颗粒)的形式及连接至标记物或示踪物(例如生物素或荧光素异硫氰酸酯)的修饰的肽 使用本文所述的MNTF肽或其类似物。可用本领域熟知的双功能试剂(包括1，1双(重氮乙酰基)2乙苯、戊二醛、N-羟基 琥珀酰亚胺酯(例如4-叠氮基水杨酸酯、同型双功能酰亚胺酯(包括双琥珀酰亚胺酯(如 3，3’ - 二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸))和双功能马来酰亚胺(如双-N-马来酰亚胺基-1， 8_辛烷))))进行MNTF肽或其类似物与水不溶性支持基质间的交联。甲基_3-[(对叠氮 基苯基)二硫代]丙亚胺酸酯之类的双功能试剂产生在光存在下能形成交联的光活性中间 体。另外，可将反应性水不溶性基质(如溴化氰活化的碳水化合物)用于蛋白固定。可使用本文所述的双功能试剂进行MNTF肽或其类似物与包括第二 MNTF肽或其类 似物的第二蛋白间的交联。在一些实施方式中，有插入的间隔基，例如二巯基或二氨基或多 个氨基酸残基(例如，甘氨酸)。所述间隔基也可为同型或异型双功能交联剂，例如异型双 功能交联剂N-(4-羧基-环己基-甲基)_马来酰亚胺。可通过标准的重组DNA技术制备长肽或多肽(如融合蛋白)。例如，用已包含异源 蛋白的商用表达载体克隆编码MNTFl肽片段的DNA片段，其结果为MNTFl肽片段框内融合 进异源蛋白。在某些实施方式中，可使用编码MNTFl肽的核酸和/或本文所述成分例如来体外 或体内产生用于本文所述各种组合物和方法的肽。例如，在某些实施方式中，编码MNTFl肽
15的核酸为例如重组细胞中的载体成分。可表达所述核酸以产生包含MNTFl肽序列的肽或多 肽。所述肽或多肽可从细胞中分泌、或作为细胞的一部分或在细胞内。化合物筛选基于其在本领域可接受的动物细胞培养疾病(disease)和病症(disorder)模型 系统中治疗神经元疾病的能力，由本文所述的筛选方案确认的化合物可进一步被区分且所 述化合物的功效可被评估。在测试化合物和天然提取物库的许多药物筛选测定中，需要高 通量的测定以使在给定的时间段内调查的化合物的量最大化。通常使用在无细胞系统(如 可用纯化或部分纯化的蛋白得到的系统)中进行的测定作为“主要”筛选，其中所述筛选可 产生以允许由测试化合物介导的分子靶中改变的快速发展和相对容易检测。此外，在体外 系统中一般忽略测试化合物细胞毒性和/或生物利用度的影响，而主要着重于药物对分子 靶的作用，如可表现在与受体蛋白的结合亲和力的改变。因此另一方面，提供了鉴定用于促进运动神经元生长或存活的化合物的方法。在 一实施方式中，所述方法包括下列步骤i)制备包含候选化合物的样品，ii)将细胞与所述 样品接触，iii)确定涉及在信号传导通路中化合物的表达或活性是否被调节，及iv)确定 所述样品是否能促进运动神经元的生长或存活的步骤。在其他实施方式中，所述方法还包 括确定包含候选化合物的样品是否被MNTF肽或其类似物所调控，或调控MNTF肽或其类似 物(例如活性、表达等)。另一方面，本文所述技术包括促进运动神经元生长或存活的方法 或通过施用由本文所述筛选方案鉴定的化合物进行神经元疾病治疗的方法。在一例示筛选测定中，在其中所述化合物一般能结合MNTF肽的条件下使目的化 合物与包含MNTF结合蛋白(例如表达MNTF肽受体的细胞)和MNTF肽的混合物接触。然后 添加包含测试化合物的组合物至所述混合物中。受体/MNTF肽复合物的检测和定量为确定 测试化合物在抑制(或强化)受体蛋白和MNTF肽间复合物形成上的功效提供了方法。可 进行对照测定以为比较提供基线，其中添加分离和纯化的MNTF肽至受体蛋白中，且在无测 试化合物下定量受体/MNTF肽复合物的形成。可通过各种技术检测MNTF肽和MNTF肽间的复合物形成。例如，可使用例如以可 检测的方式标记的蛋白(如放射性标记、荧光标记或酶标记的MNTF肽)通过免疫测定或通 过色谱检测定量复合物形成的调节。对于无细胞测定，通常需要固定MNTF肽或MNTF肽结 合蛋白以便于从蛋白之一的非复合物形式中分离受体/MNTF肽复合物，及便于适应测定的 自动化。例如，可提供融合蛋白，其添加了允许将蛋白结合至基质的结构域。例如可将谷胱 甘肽-S-转移酶/受体(GST/受体)融合蛋白吸收到谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical, St. Louis, Mo.)或谷胱甘肽衍生化微滴度板上，然后将其与MNTF肽(例如35S标记的MNTF 肽)和测试化合物相结合，并在有助于复合物形成的条件(例如在盐和PH的生理条件下， 尽管需要稍微更严格的条件)下温育。温育后，洗涤所述珠以去除任何未结合的MNTF肽， 并直接(例如，在闪烁器中放置的珠)或在复合物解离之后的悬液中确定基质珠_结合的 放射性标记。或者从所述珠上解离所述复合物，通过SDS-PAGE胶分离，并使用标准的电泳 技术从胶上定量珠级分中发现的MNTF肽的水平。用于在基质上固定蛋白的其他技术适于在受试者测定中使用。例如，可利用生物 素和链酶亲和素的缀合固定MNTF肽蛋白的可溶部分。例如，可使用本领域熟知的技术(例 如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals, Rockford，111.)由生物素-NHS (N-羟基-琥珀酰
16亚胺)制备生物素化的受体分子，并在用链酶亲和素包被的96孔板(Pierce Chemical)的 孔中将其固定。或者与MNTF肽反应但不干扰配体结合的抗体可被衍生至板的孔中，且通 过抗体缀合在孔中捕获所述受体。如上所述，MNTF肽制剂和测试化合物在存在受体的板孔 中温育，且可定量孔中捕获的受体/hedgehog复合物的量。除了上文所述的GST固定复合 物的方法之外，检测所述复合物的例示方法包括使用与MNTF肽反应或与受体蛋白反应且 与MNTF肽竞争性结合的抗体的复合物免疫检测；及依赖于检测与MNTF肽相关的酶活性的 酶联测定。在后一种情况下，可化学缀合或以与MNTF肽的融合蛋白提供所述酶。有这样 一个例子，所述MNTF肽可被化学交联或与碱性磷酸酶基因融合，并可用酶的显色底物(例 如对硝基苯碱性磷酸酯)评估复合物中捕获的MNTF肽的量。同样地，可提供包含MNTF肽 和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白，且通过使用1-氯_2，4- 二硝基苯检测GST活性来定量 复合物的形成(Habig et al. , J Biol Chem，249 :7130 (1974))。对于用于定量在复合物 中捕获的蛋白之一的免疫检测，可使用抗所述蛋白的抗体(如抗MNTF肽抗体)。或者，在 复合物中要被检测的蛋白可为以融合蛋白形式“附加表位标签的”，其除了所述MNTF肽或 MNTF肽序列之外，包括针对易得(例如，来自商业来源)抗体的第二多肽。例如，也可使用 抗GST部分的抗体将上文所述GST融合蛋白用于结合的定量。其他有用的表位标签包括 包括从c-myc的10个残基序列的myc表位(例如见Ellison et al.，J Biol Chem 266 21150-21157(1991))及 pFLAG 系统(International Biotechnologies, Inc.)或 pEZZ 蛋 白 A 系统(Pharamacia, N. J.)。组合物药物组合物包括与药学可接受稀释剂和/或载质一起的本文所公开的一种或多 种MNTF肽或其类似物。合适的载质/稀释剂为本领域所熟知，且包括盐水或其他无菌水介 质，其任选包括更多的成分，如盐缓冲液和防腐剂、或糖、淀粉、盐或其混合物。可以适于施用方案和/或患者需要的任何合适形式提供包含MNTF肽的组合物来 使用。本文所述技术包括对建立和繁殖干细胞、神经前体细胞、分化的神经细胞和干细 胞衍生的运动神经元有用的培养基。所述培养基特别适于干细胞的分化和干细胞衍生的运 动神经元的长期培养。需要用成形素和/或生长因子补充所述细胞培养基，并依据希望培养的个体细胞 类型对其进行优化。所述补充和优化在本领域普通技术人员了解内。在一些实施方式中， 可用在下列近似水平(或在一有效数字内)的任何或全部下列成形素和/或生长因子补充 所述细胞培养基0. 001 1 μ M的RA，0. 001 1 μ M的Shh或Shh拮抗剂和/或0. 01 250 μ g/ml的一种或多种MNTF肽或其类似物。本文所述的药物制剂包括作为可选成分的药学可接受载质、稀释剂、增溶剂或乳 化剂及在本领域可用的盐类型。所述物质的例子包括正常的盐溶液(如生理缓冲的盐溶液 和水)。在药物制剂中有用的载质和/或稀释剂的具体非限制性例子包括水和生理可接受 的缓冲盐溶液(如PH 7.0 8.0的磷酸盐缓冲溶液)。适合的药用载质包括，但不限于无 菌水、盐溶液(如Ringer’ s溶液)、醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或 淀粉)、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡，脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。所 述药用制剂可为无菌和需要的，且其可与不与活性化合物发生有害反应的助剂(例如润滑
17齐U、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂，着色剂和/或芳香物质等) 混合。如需要，其也可与其他活性物质(例如酶抑制剂)结合以降低代谢降解。可在药物组合物中配制本文所提供的化合物，其除了所述肽之外，可包括药学可 接受载质、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质复合物、 脂质体、渗透增强剂、载质化合物及其他药学可接受的载质或赋形剂等。一般以为了治疗目的的施用制备药物组合物。药物组合物也包括一种或多种有效 成分(如干扰素、抗菌药物、消炎剂、麻醉剂等)。胃肠外递送的制剂可包括还可包含缓冲 剂、脂质体、稀释剂及其他合适的添加剂的无菌水溶液。包含本文所提供的肽的药物组合物 包括渗透增强剂以加强肽的消化道递送。渗透增强剂可被分类为属于五个大类别即脂肪 酸、胆汁盐、螯合剂、表面活性剂和非表面活性剂之一 (Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems8,91-192 (1991) ；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7，1-33 (1990))。可包括来自所述大类别的一个或多 个的一种或多种渗透增强剂。作为渗透增强剂的各种脂肪酸及它们的衍生物包括例如=CabryliC酸、戊酸、油 酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、蓖酸酯、 甘油单油酸酯(又名ι-单油酰基-消旋-甘油酯)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油 1-癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、单-和二 -甘油酯及它 们的生理可接受的盐(即油酸盐、月桂酸盐、癸酸盐、肉豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、亚 油酸盐等)° (Lee et al. , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92(1991) ；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7，1(1990) ；El-Hariri et al.，J.Pharm. Pharmacol. 44，651-654(1992))。在某些实施方式中，例示MNTF肽类似物包括具有渗透增强剂(例如被共价连接至 所述肽上的一个或多个功能基的一种或多种脂肪酸)的MNTF肽的功能衍生物。在一些实施 方式中，所述MNTF肽类似物包括在SEQ ID NO :1 22中所示且还具有用渗透增强剂(例 如脂肪酸和/或从2 22个碳原子的烷羰基(Alk-C(O)-))的N-末端修饰的肽，和/或具 有保护基(其选自苄氧羰基、叔丁氧羰基、芴-甲氧羰基和烯丙氧基羰基)的MNTF肽的功 能衍生物，且Y为OH或NH2。在一些实施方式中，所述烷羰基包含10 20、12 18或2 22个碳。在某些实施方式中，在MNTF肽类似物上适合的N末端修饰为通过棕榈酰化(例如 棕榈酸)。胆汁的生理作用包括脂质和脂溶性维生素分散和吸收的促进作用(Brimton， Chapter 38In :Goodman & Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.，Hardman et al. McGraw-Hill, New York, N. Y.，pages 934-935(1996))。各种天然胆 汁盐及其合成衍生物可作为渗透增强剂。因此，术语“胆汁盐”包括天然存在的任何胆汁成 分及任何其合成的衍生物。可使用包含一种或多种渗透增强剂的复合物制剂。例如可使用胆汁盐与脂肪酸 组合来制备复合物制剂。螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨 酸盐(如水杨酸钠、5甲氧基水杨酸盐和高香草酸盐)、胶原的N-酰基衍生物、聚乙二醇单 十二醚_9及β - 二酮(烯胺)的N-氨酰基衍生物(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92(1991) ；Muranishi, Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 7,1-33(1990) ；Buur et al. , J. Control Rel. 14, 43-51 (1990))。螯合剂具有也充当DNA酶抑制剂的添加优势。表面活性剂包括例如十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂醚和聚氧乙 烯-20-十六烧基醚(Lee et al. , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92 (1991))；及全氟化合物乳剂(如 FC-43) (Takahashi et al. , J. Pharm. Phamacol. 40,252-257(1988)) ο非表面活性剂包括例如不饱和的环尿素、烷基-和 1- “ lil^Sltl^^ (Lee et al. , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92(1991))；及非留体消炎剂(如双氯芬酸钠，吲哚美辛和保泰松) (Yamashita et al. , J.Pharm. Pharmacol. 39,621-626(1987))。通常的药学可接受的载质包括，但不限于结合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙 烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)、填料(例如乳糖及其他糖类、微晶纤维素、果胶、明 胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)、润滑油(例如，硬脂酸镁、滑石粉、氧 化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、 醋酸钠等)、解体剂(例如淀粉、淀粉羟乙酸钠等)或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠等)。本文所提供的组合物另外还包含在药物组合物中以其领域中建立的使用程度按 惯例发现的其他辅助成分。因此，例如所述组合物可包含更多的兼容性药学活性材料(如 止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎药)，或可包含在本文所述的物理配制的各种剂量形式 的组合物中有用的更多材料，如染料、香料剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。 然而，当添加所述材料时，其不应过度干扰本文所提供组合物成分的生物活性。无论通过何种方法将化合物导入至患者内，可使用胶体分散系统作为递送媒质以 增强肽的体内稳定性和/或使所述肽靶向特定的器官、组织或细胞类型。胶体分散系统包 括但不限于高分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶 束、混合胶束、脂质体和脂质未鉴定结构的肽复合物)。胶体分散系统的例子为多种脂质 体。脂质体为微观球体，其具有由双层构型中排列的脂质构成的一个或多个外层包围的水 性核心(通常见 Chonn et al. , Current Op. Biotech. 6，698-708 (1995))。在某些实施方式中，可将MNTF肽及MNTF类似物并入生物分布导向部分(包括一 种或多种聚合物)或与其结合使用，以导向本文提供的MNTF肽或MNTF类似物或其他化合 物的生物分布邻近所需目标或允许它们的连续释放。活性剂包括例如对提高治疗效果、对 优化生物分布和生物利用度、对减少组织损伤、对促进愈合或对提高患者的舒适度有用的 化合物；例示活性剂包括血管活性剂、麻醉剂，针对缺血的治疗剂、生长因子和细胞因子。 或者，可在本文提供的组合物中使用微米颗粒或纳米颗粒聚合物珠剂型。本文所提供化合 物可与活性剂结合使用，且可在具有大量连接至其上的配体或抗配体分子的颗粒剂型中被 包裹。本文单独或与其他的活性剂组合提供的MNTF肽和MNTF类似物及其他化合物以所 述方式随着时间被释放来提供持续的治疗效果。对于在本文所述的方法中有用的其他活性 剂(如生长因子、细胞因子等)，持续释放的剂型也是有用的。由于扩散和颗粒基质侵蚀，来 自颗粒剂型的活性剂释放可发生。生物降解速度直接影响活性剂释放动力学。在某些实施方式中，本文所述MNTF肽、MNTF类似物和化合物的控制释放的胃肠外 制剂可被制成植入物、油性注射或颗粒体系。颗粒体系包括微球、微颗粒、微囊、纳米囊、纳
19米球和纳米颗粒。微囊包含作为中央核心的治疗蛋白。在微球中所述治疗物被分散在整个 颗粒中。可将脂质体用于控制的释放及捕获的药物的药物靶向。在某些实施方式中，可局部(locally)、局部(topically)、经鼻、口服、胃肠道、气 管内、膀胱内、阴道内、至子宫、皮下、肌肉、关节周围、关节腔内、至脑脊液(ICSF)、至脑组织 (如颅内施用)、至脊髓、至伤口、腹膜内或胸腔内或全身(例如静脉内、动脉内、肝门内或直 接至器官)施用本文所述的包含MNTF肽和MNTF类似物的药物组合物。如本领域已知，可使用各种导管或递送途径来完成冠状动脉内递送。例如，适于 本文所述用途的各种通用导管及改良导管可从商业供销商(如Advanced Cardiovascular Systems (ACS)、Target Therapeutics和Cordis)处获得。此外，如本领域已知，在通过直 接注射进冠状动脉完成心肌递送的情况下，可使用大量方法来将导管导入到冠状动脉内。 举例而言，可将导管便利的导入股动脉并将其逆行穿过髂动脉和腹主动脉而进入冠状动脉 内。或者，最初将导管导入肱动脉或颈动脉内并使其逆行穿过至冠状动脉。本领域可发现 所述及其他技术的详细描述(见例如Topol，E J(ed.)，The Textbook of Interventional Cardiology,2nd Ed. (W. B. Saunders Co. 1994) ；Rutherford, RB, Vascular Surgery,3rd Ed. (W. B. Saunders Co.1989) ；Wyngaarden J Bet al. (eds.), The Cecil Textbook of Medicine, 19th Ed. (W. B. Saunders, 1992)；及 Sabiston，D, The Textbook of Surgery, 14th Ed. (W. B. Saunders Co. 1991))。可胃肠外施用本文所提供的化合物。某些化合物可与药学可接受载质或稀释剂 结合以制备药物组合物。合适的载质和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸盐缓冲液。可为 胃肠外、肌肉内、脑内、静脉内、皮下或透皮施用制备所述组合物。施用的制剂可包含所述 试剂。所述试剂的例子包括阳离子剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)和脂转染剂(例如 IipofectamTM 禾口 transfectamTM)。局部施用的制剂可包括贴剂、软膏、洗剂、乳剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体
和粉末。常规的药学载质、水、粉末或含油碱、增稠剂等可为必要和希望的。涂层手套、避孕 套等也是有用的。口服施用的组合物包括粉末或颗粒、水或非水介质的悬液或溶液、胶囊、 药囊或药片。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或粘合剂是希望的。胃肠外施用的组 合物可包括可包含缓冲剂、稀释剂或其他适合的添加剂的无菌水溶液。在一些情况下，将用 肽治疗患者与其他传统的治疗方式相结合以提高治疗方案的功效。本文所用术语“治疗方 案”应包含治疗性、姑息性和预防性方式。剂量可取决于大量因素，其包括要治疗的病情的严重性和反应性，和持续数天至 数月的治疗过程、或直到实现治疗或达到病情的减弱。可通过标准的药学方案在细胞培养 物或实验动物中确定本文所提供的化合物的毒性和疗效。例如，可确定LD5tl(致死群体的 50%的剂量)和ED5tl(对群体中50%治疗有效的剂量)。在毒性和疗效间的剂量比为治疗 指数，且其可用LD5tZED5tl表示。显示出大治疗指数的化合物是有用的。当使用显示毒性副 作用的化合物时，应小心设计递送系统，其可将所述化合物靶向至感染组织的位点以使其 对未感染细胞的潜在损害最小化并由此减少副作用。可在制备一系列人体中使用的剂量中使用从细胞培养物测定和动物研究中获得 的数据。所述化合物的剂量在包括有很小或没有毒性的ED5tl的一系列循环浓度内。取决于 使用的剂型和使用的施用途径，所述剂量在所述范围内变化。对于本文所用的任何化合物，
20最初可由细胞培养物测定估计治疗有效剂量。可在动物模型中制定剂量以达到循环的血浆 浓度范围，其包括在细胞培养物中确定的IC5tl(即达到了症状的半-最大抑制的测试化合物 的浓度)。可使用所述信息来更准确的确定在人体中有用的剂量。例如可通过高效液相色 谱测量血浆中的水平。可从患者体内药物积累量的测量计算剂量方案。剂量可依个体化合 物(包括MNTF肽和MNTF类似物)的相对功效而变化，且通常基于动物模型体内和体外发 现的有效EC50s对其进行估计。本领域技术人员应理解所述剂量将依MNTF肽或其类似物 如何和在哪里被施用(例如体外、体内、局部、全身等)而变化。例如，一方面，可施用MNTF肽和MNTF类似物以在靶位点处(在ES干细胞的细胞 培养物中)达到约0. 01微克/毫升(μ g/mL) 约lmg/ml、约0. 1 μ g/mL 约50 μ g/mL、 约 0· 1 μ g/mL 约 150 μ g/mL、约 1 μ g/mL 约 200 μ g/mL 及约 0· 1 μ g/mL 约 500 μ g/ mL(包括所述范围的任一范围)的最终浓度。取决于施用的途径，替代性的合适剂量可从例如约0. 1 μ g至约Ig的总剂量而变 化。在文献中提供了递送具体剂量和具体方法的指导且对于本领域从业者通常可得。本 领域技术人员将使用不同的核苷酸制剂，而非蛋白或其抑制剂。同样地，本文所提供的多 核苷酸、多肽和化合物的递送对具体的细胞、条件和位置是特异的。通常而言，剂量通常在 0. 01mg/kg 1000mg/kg体重的范围中，且更通常在例如0. lmg/kg 300mg/kg体重的范围 中，并可以每天、每周、每月或每年一次或多次，或甚至在2 20年的时间跨度期间一次或 多次递送。在某些实施方式中，可在手术后24小时即刻给定剂量。在另一实施方式中，可 从2小时至达24小时间给定剂量。取决于颗粒制剂的半衰期和清除率，可每3 4天、每 周或每两周施用长效组合物。基于在体液或组织中测量的药物残留时间和浓度，本领域普 通技术人员可轻易估计给药的重复频率。成功治疗后，需要使患者经历维持性治疗以防止 病情的复发，其中以在0.01mg/kg 100mg/kg体重的范围内的维持剂量、每天一次或多次 至每20年一次施用所选定化合物。在某些疾病的治疗或预防中，适当的剂量水平通常应为 约0. 001mg/kg 100mg/kg患者体重/天，其可以单剂量或多剂量施用。合适的剂量水平可 为约1 约40mg/kg/天。在某些实施方式中，以达到约Ιμπιο 约lmmol、约ΙΟμπιοΙ 约500 μ mol、或约30 μ mol 约300 μ mol和约25 μ mol 约300 μ mol损伤位点上最终浓 度的体内浓度，且包括约25 μ mol、或约220 μ mol或约300 μ mol损伤位点上的最终浓度，且 仍更通常在约1 μ mol 约100 μ mol之间的量施用本文所提供的包括MNTF肽或其类似物 的化合物。在某些实施方式中，可施用1、5、10、20、50、100、150或200mg/kg的剂量。可在诊断、治疗、预防中、及作为研究试剂和在试剂盒中使用本文所述化合物。可 常规完成用于检测目的化合物(例如MNTF肽和MNTF类似物)的方法的规定。所述规定可 包括酶缀合、放射性标记或任何其他合适的检测系统。也可制备用于检测目的化合物有无 的试剂盒。本文所用脊髓损伤可包括由肿瘤、机械性损伤和化学性损伤所致的损伤。在某些方面，提供了组合物和治疗性治疗方法，其包含当神经通路被损伤或预期 所述损伤时，以足以维持神经通路(包括修复损伤的通路或抑制其上的更多损伤)的时间 和浓度给受试者施用本文所定义的治疗有效量的MNTF肽或其类似物。另一方面，本文所述技术包括用于维持神经通路的组合物和治疗性治疗方法。所
21述治疗方法包括当神经通路被损伤或预期所述损伤时，给受试者施用可刺激内源性MNTF 的治疗有效浓度的化合物。本文所述的方面和实施方式提供了保护神经元不受与神经损伤的机体免疫和发 炎反应有关的组织破坏性影响的方法。在某些实施方式中，提供了刺激损伤的神经元和神经通路的细胞修复(包括再生 损伤的树突或轴突)的方法、组合物和装置。一方面，本发明的MNTF肽或其类似物在修复损伤的外周神经系统神经通路中是 有用的。尤其，MNTF对修复损伤的神经通路(包括切断或损伤神经纤维)有用。具体而言， 本文所述MNTF能刺激完整轴突的神经再生(其包括髓鞘的血管化和再造化)。可用能在 位点处维持MNTF的生物兼容性、生物吸收性载质给损伤位点提供所述MNTF，且如果需要的 话，可提供指导轴突从切断神经元的近端向远端生长的方法。例如，当要诱导的神经再生超 过延伸距离，例如大于IOmm时，需要指导轴突生长的方法。设想了能提供所述功能的许多 载质。例如，有用的载质包括本文所公开的基本不溶性材料和粘性溶液，其包含层粘连蛋 白、透明质酸或胶原、或其他合适的合成、生物兼容性聚合物材料(如聚乳酸、聚羟基乙酸 或聚丁酸和/或它们的共聚物)。在某些实施方式中，在跨越损伤通路的神经向导通道中安置MNTF肽或其类似物。 所述通道可起到保护覆盖和用于指导突起生长的物理方法的作用。有用的通道包含生物兼 容性膜，其在结构上为管状的、具有足以横跨待修复神经中缺口的直径，且具有适于接受切 断的神经末端的开口。所述膜可由任何生物兼容性、无刺激性材料(如硅酮或生物兼容性 聚合物(如聚乙烯或聚乙烯醋酸乙烯酯))制成。所述外壳也由生物相容性、生物吸收性聚 合物(包括例如胶原、透明质酸、聚乳酸、聚丁酸和聚羟基乙酸)组成。在一实施方式中，所 述通道的外部表面基本上不通透。另一方面，本文所述的MNTF肽及其类似物可被用于保护不受与响应针对初始神 经组织的损伤的机体免疫/发炎应答有关的损伤。所述应答可后随例如由自身免疫功能障 碍、肿瘤病变、感染、化学或机械损伤、疾病，由流向神经元或神经胶质细胞的血液的阻断， 或由其他的神经创伤或周围材料引起的神经组织创伤。例如，认为在栓塞中风中由神经血 液供应的阻断之后的缺氧或缺血再灌注所致的原发性损伤是免疫相关的。另外，与大量原 发性脑肿瘤相关的至少部分损伤似乎也是免疫相关的。MNTF肽或其类似物的应用直接或系 统的缓解和/或抑制针对神经损伤的免疫相关应答。在一实施方式中，本文所述技术包含本文所述的MNTF因子中的任何一种的生物 活性类(系统发育)变异体(其包括保守氨基酸序列变异体；由简并核苷酸序列变异体编 码的蛋白；享有保守的MNTF结构域、且由在标准的严格条件下杂交至编码本文所公开、包 含的MNTF因子的DNA的DNA编码的MNTF因子)的使用。本文所述化合物也可用于研究的目的。因此，由所述肽显示的特异性杂交可被用 于测定、纯化、细胞产品制备及在本领域普通技术人员所了解的其他方法中使用。本文所用的技术性和科学性术语具有由本公开内容所属领域中的普通技术人员 普遍理解的含义，除非另有定义。本文参考本领域技术人员已知的各种方法。阐述参考 的所述已知方法的出版物及其他材料通过引用而像全面阐述样整体并入本文。阐述重组 DNA技术的普遍原理的标准参考文献包括Sambrook，J.，et al.，Molecular Cloning
22A Laboratory Manual，2d Ed. ， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Planview, N. Y. (1989)and Molecular Cloning :A Laboratory Manual，third edition(Sambrook and Russe1，2001)，jointly and individually referred to herein as "Sambrook"； McPherson，M. J.，Ed.，Directed Mutagenesis :A Practical Approach，IRL Press， Oxford (1991) ；Jones，J.，Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications，Oxford (1992) ；Austen，B. M. andWestwood, 0. M. R.，Protein Targeting and Secretion，IRL Press，Oxford(1991) ；Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed.， 1984) ；Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed.，1987) ；Handbook ofExperimental Immunology(D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller & Μ. P. Calos,eds.，1987) ；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al.，eds. ,1987, including supplementsthrough 2001) ；PCR :The Polymerase Chain Reaction，(Mullis et al.，eds.，1994) ；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al.，eds.，1991) ；The Immunoassay Handbook(D. Wild, ed.，Stockton Press NY，1994) ；Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed.， Academic Press，1996) ；Methods of Immunological Analysis(R. Masseyeff,W. H. Albert, and N. A. Staines, eds.，Weinheim :VCH Verlags gesellschaft mbH，1993)，Harlow and Lane(1988)Antibodies， A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Publications， New York， and Harlow and Lane(1999)UsingAntibodies :A Laboratory Manual Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor，NY(jointly and individually referred to herein as Harlow and Lane)，Beaucage et al.eds. ，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons,Inc.，New York，2000) ；and Agrawal,ed.， Protocols forOligonucleotides and Analogs,Synthesis and Properties Humana Press Inc. , New Jersey,1993) ；Teratocarcinomas and embryonic stem cells :A practical approach (E. J. Robertson, ed.，IRL Press Ltd. (1987) ；Guide to Techniques in Mouse Development (P. M. Wasserman et al. eds. , Academic Press (1993) ；Embryonic StemCell Differentiation in vitro (Μ. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225 900 (1993) ；Properties and uses of Embryonic Stem Cells Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P.D.Rathjen et al.，Reprod. Fertil. Dev.，10 :31 (1998)) ；CNS Regeneration :Basic Science and Clinical Advances,M. H. Tuszynski & J. H. Kordower, eds. ，Academic Press， (1999)0在各种专利和专利申请中描述了在本文所公开技术的应用中有用的某些技 术，所述专利和专利申请包括报道了从脑组织获得的多能神经干细胞的美国专利 No. 5，851，832 ；报道了从新生儿大脑半球产生神经母细胞的美国专利No. 5，766，948 ；报道 了哺乳动物神经嵴干细胞的使用的美国专利No. 5，654，183和5，849，553 ；报道了从哺乳动 物多能CNS干细胞培养物体外产生分化的神经元的美国专利No. 6，040，180 ；报道了神经 上皮干细胞、少突胶质细胞_星形胶质细胞前体、种系限制性的神经元前体的产生和分离 的TO 98/50526和W099/01159 ；及报道了从胚胎前脑获得并用包含葡萄糖、转铁蛋白、胰岛 素、硒、孕酮及许多其他生长因子的培养基培养的神经干细胞的美国专利No. 5，968，829。可在实行本文所述技术中利用技术人员已知的任何合适材料和/或方法；然而，
23本文描述了材料和/或方法的非限制性例子。可参考下列实施例、通过举例的方式而不通过限制的方式提供的某些方面中了解 本文所述技术。可从商业来源获得在下列例子中参考的材料、试剂等，除非另有强调。如本文所用，希望可通过在下列例子中所述的基本相似和/或相同的方案确定 MNTF肽和序列和/或其功能类似物的功效。此外，希望可依据本文所述的实验条件确定在 SEQ ID NO :1 22所述的任何MNTF肽及其类似物的效力。实施例1鼠,运云_肖Tfjffl胞/本夕陥MNTF胞死t白爐々 的测试实施例1示在大鼠运动神经元细胞体外存活模型中运动神经元营养因子(MNTF) 的6氨基酸类似物(GM6)和各种更短的肽类似物减弱细胞死亡的能力。以10μ g/ml进行 的GM6(SEQ ID NO 2)及其他类似物(3聚体、4聚体、5聚体)的施用证明了为类似物特异 性的运动神经元细胞死亡的减弱。所述类似物显示了使用包含最有效的末端苯丙氨酸的类 似物的营养作用的独特模式。所述数据表明在运动神经元细胞存活模型中GM6和一些类似 物为有效的营养因子。本实施例中的缩写/术语“GM6”和“6聚体”指MNTF的例示6氨基酸肽类似物。"Genervon，，禾口 "GB，，指 Genervon Biopharmaceuticals, LLC。“I. V.” 指静脉内。“NTS” 指 Neurological Testing Service，其为约定研究组织。GM6为合成的6氨基酸肽。以固体提供GM6，且通过NTS制备制剂(在4°C储存的 溶液)。GM6类似物包括GM6肽的序列同源物。“PD”指帕金森氏症。“BDNF”指脑源性神经营养因子。“⑶NF”指胶质细胞源性神经营养因子。“CNTF”指睫状神经营养因子“Genervon，，指 Genervon Biopharmaceuticals, LLC“GB，，指 Genervon Biopharmaceuticals, LLC方法和材料运动神经元的纯化和培养。从E14. 5 Sprague-Dawley 大鼠(Charles River Labs) 中制备脊髓运动神经元培养物。简言之，在0. 025%胰酶(Gibco)中于37°C消化解剖的脊髓 8分钟。将组织转移至包含补充2%马血清(Gibco)、胰岛素(5 μ g/ml)；腐胺(1X10D4M), 伴清蛋白(100 μ g/ml)、亚硒酸钠(3X10D8M)、孕酮(2 X 10 □ 8M)、葡萄糖(3. 6mg/ml)、青 霉素(100IU/ml)、链霉素(100 μ g/ml) ,DNA Sl (100 μ g/ml)和牛血清白蛋白(BSA ；0. 4% ) 的L-15培养基(Gibco)的溶液。然后用1-ml pipetman磨碎所述组织，并经在L-15中 10. 4% Optiprep (Nycomed Pharma)的缓冲垫在15mlFalcon管中分层所述悬液。将分层 的悬液以830Xg离心15分钟。在包含0. 5% BSA的PBS中悬浮分界面处的细胞，并使用 IgG-192 p75特异性抗体通过免疫亲和进行分离，随后通过使用磁微珠(Miltenyi Biotec) 的细胞分选来纯化所述运动神经元。所述运动神经元培养基由补充B27补充物(Gibco)、
24谷氨酸(25μΜ)、2-巯基乙醇(25 μ Μ)和2%马血清的神经基础培养基(Gibco)构成。除 非另有说明，所述运动神经元以3000细胞/盖玻片的密度被放置到包被层粘连蛋白的盖破 片上。在细胞接种的时间添加神经营养因子的混合物(NTF:lng/ml BDNFU00pg/ml⑶NF、 10ng/ml CNTF)。在培养24小时后，在缺乏NTF的运动神经元培养基中通过不同的稀释类 似物的添加来处理运动神经元。存活测定。如上所沭从E14. 5大鼠胚胎中制备脊髓运动神经元。在NTF存在下培 养细胞24小时，且通过计算钙黄绿素AM-阳性细胞数来评估活力(VI)。为进行活力研究， 在不存在NTF，但添加类似物或GM6下培养运动神经元。通过计算神经元数来计算存活的运 动神经元的百分比。统计学分析。以在NTF单独存在(对照)下存活的运动神经元数的百分比表示对 于各处理的存活的运动神经元数。每种条件使用五个皿。通过用post hoc Tukey' s测试 的单因素ANOVA分析了处理组间的差异的统计学意义。 处理组。所有组经警了 GM6、类似物或对照。
权利要求
MNTF肽或其类似物，其选自由SEQ ID NO1的2个和6个之间的连续氨基酸或其功能衍生物构成的肽，其中所述MNTF肽或其类似物表现出MNTF活性，且所述MNTF肽或其类似物不具有由SEQ ID NO2构成的氨基酸序列。
2.权利要求1的MNTF肽或其类似物，其至少含SEQID NO=I的氨基酸残基17和18。
3.权利要求1的MNTF肽或其类似物，其选自SEQID NO 3 SEQID NO :22。
4.权利要求1的MNTF肽或其类似物，其由SEQID NO 1的至少3个连续氨基酸构成。
5.权利要求1的MNTF肽或其类似物，其由SEQID NO :1的2个和5个之间的连续氨 基酸构成。
6.权利要求1的MNTF肽或其类似物，其由SEQID NO :1的3个和5个之间的连续氨基酸构成。
7.权利要求3的MNTF肽或其类似物，其具有SEQID NO :4的氨基酸序列。
8.权利要求3的MNTF肽或其类似物，其具有SEQID NO 6的氨基酸序列。
9.权利要求3的MNTF肽或其类似物，其具有SEQID NO 12的氨基酸序列。
10.权利要求1 9中任一项的MNTF肽或其类似物，其中所述MNTF肽或其类似物通过 与渗透增强剂共价键合而被修饰，由此所述组合物的组织渗透能力被提高。
11.权利要求10的MNTF肽或其类似物，其中所述MNTF肽或其类似物通过其N-末端与 所述渗透增强剂共价键合而被修饰。
12.权利要求11的MNTF肽或其类似物，其中所述渗透增强剂通过一个或多个游离氨基 的N-酰基衍生化与所述MNTF肽或其类似物共价连接。
13.权利要求10的MNTF肽或其类似物，其中所述渗透增强剂是任选被取代的2 22 碳的烷基羧酸，其中所述烷基羧酸任选被羟基化、不饱和化和/或硫化。
14.权利要求13的MNTF肽或其类似物，其中所述渗透增强剂是选自下列的脂肪酸 cabrylic酸、油酸、月桂酸、癸酸、辛酸、己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、戊酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻 酸、花生四烯酸、油酸、反油酸、芥酸和神经酸。
15.组合物，其含 权利要求1 14中任一项的MNTF肽或其类似物，和眷药学可接受载质。
16.促进神经元生长或维持的方法，所述方法包括给神经元细胞施用权利要求16的 组合物，其中所述组合物具有一种或多种选自下列的生物活性促进神经元的生长，促进 神经元的维持，促进神经轴突突起，促进经轴突切断的运动神经元的轴突再生，促进运动功 能，修复损伤的神经通路，再生神经通路或缓解神经元缺陷。
17.缓解患病症动物的神经元病症的方法，所述方法包括给所述动物施用对缓解所 述病症而言有效量的权利要求16的含MNTF肽或其类似物的组合物。全文摘要
本发明涉及新型运动神经元营养因子(MNTF)及其类似物，其包括能促进神经元生长和存活的组合物。提供了长度为二至六个氨基酸之间的MNTF肽及通过共价连接至另一部分而被修饰的所述MNTF肽的类似物。本文描述了其他实施方式。
文档编号A61K38/17GK101951942SQ200980105892
公开日2011年1月19日 申请日期2009年2月23日 优先权日2008年2月21日
发明者M·S·金迪, P-Y·D·寇 申请人:健能万生物制药公司