专利名称：：用于预防或治疗aids的组合物和方法
技术领域：
：本发明提供了用于在人类患者中预防或治疗获得性免疫缺陷综合征(AIDQ的组合物和方法，以及对抗HIV感染的疫苗。
背景技术：
：自从HIV-I发现以来(Barre-Sinoussi等，1983)，搜寻对抗AIDS的疫苗一直是一个重大问题。经典的靶向HIV-I包膜蛋白的疫苗途径的失败，指出了使用另一种靶、例如被称为Tat的HIV-I转录蛋白的反式激活子的重要性，这是由于它的细胞外功能参与了摧毁对抗HIV感染细胞的免疫细胞性应答(Jeang等，1999)。Tat主要以两种不同长度存在，86-87个残基或99-101个残基，它们显示出多方面的活性(Jeang等，1999)。由于存在非同义的单核苷酸多态性，在第二个外显子编码序列中产生了终止密码子，长的形式在除了亚型D之外所有HIV-I亚型的临床分离物中是主要的(Jeang等，1999)。Tat被分成六个区域(Kuppuswamy等，1989)，具有一个参与大多数Tat活性的所谓的基本区。生物活性Tat变体的NMR研究显示，基本区和其他功能区良好地暴露于溶剂，并包围由部分N-末端与非常保守的Trp11构成的核心(Wlopor^se等，2000；Gregoire等，2001；Watkins等，2008)。在不同的Tat变体间，这种折叠在水性溶液中是相似的，但是当暴露于疏水溶剂时可以急剧变化(Wlopor^se等，1999)。Tat是柔性蛋白，并且结构性变化对于它与其药理学靶的结合是必需的(Loret等，1992)。Tat主要在被感染细胞的核中发现，在那里它起到反式作用转录激活子(trans-actingtranscriptionalactivator)的作用(Wong-Staal等，1985;Fujisawa等，1985)，在那里已知它通过复杂的过程参与启动转录和RNA链延伸(Cullen，1990)，所述过程涉及细胞蛋白与病毒mRNA上的茎-凸环前导RNA、——TAR(反式激活响应区)的相互作用和Tat的乙酰化(Bres等，2002)。研究显示，它也参与HIV-IRNA的反转录(Harrich等，1997)。尽管缺乏信号序列，但Tat是唯一被HIV-I感染的细胞分泌的HIV-1蛋白，并且以可检测的水平在HIV-I感染的细胞的培养物上清液(0.1-lng/ml)(Ensoli等，1990；Westendorp等，1995b；Chang等，1997)和HIV-1感染的患者的血清(l_40ng/ml)(Xiao等，2000；Westendorp等，1995b)中发现。细胞外Tat表现出多方面的活性(Jeang等，1999)，但是最重要的是通过穿越细胞膜、经线粒体途径引起凋亡，来触发未感染的T细胞的凋亡(Chen等，2002，Campbell等，2004，deMareuil等，2005)。在SHIV-1激惹的称猴中细胞外Tat的体内中和引起⑶8+T细胞的升高，并且HIV-I感染的⑶4+T细胞变得检测不到(Watkins等，2006)。因此，Tat在HIV-I发病机理中的作用不仅是作为HIV-1在被感染细胞中复制的必需蛋白，而且作为细胞外毒素(Gallo，1999)。因此，这与开发靶向Tat的疫苗是相关的(Goldstein,1996)。但是，具有针对Tat的抗体的血清反应阳性患者不能识别来自所有HIV-I亚型的Tat变体(Campbell等，2007b)。此外，这些抗体不能减缓疾病向AIDS的进展4(Senkaali等，2008)。显然，如以前提出的使用主要在欧洲和北美发现的B亚型Tat的Tat疫苗(Godstein,1996；Zagury等，1998；Cafaro等，1999)，只有低的可能性能够提供针对世界其他地方、特别是非洲的HIV-I感染的治疗和预防性效应。此外，使用B亚型Tat的Tat疫苗甚至对于在欧洲和北美提供治疗和预防性效应也具有低的可能性，这是由于免疫系统不能中和细胞外！"at。到目前为止，对抗Tat的两种主要的疫苗策略使用了失活的(hgury等，1998)或具有完全活性的(Cafaro等，1999)B亚型欧洲Tat变体的86个残基的版本。这两种方法在猕猴上进行了试验，随后进行同源SHIV-I激惹(Cafaro等，1999；Pauza等，2000)。在分别在食蟹猕猴(Cafaro等，1999)和恒河猕猴(Pauza等，2000)上进行的这两项研究中，观察到了病毒血症的显著降低，在原发感染过程中没有显示出完全保护。另一项研究显示了在Tat疫苗接种的食蟹猕猴上进行SHIV-I激惹后感染的长期控制(Maggiorella等，2004)。这些研究指出，使用生物活性Tat的疫苗似乎是安全的方法，正如在猴子上进行的安全性研究所指示的，在这些安全性研究中没有观察到局部或全身性毒性或不利效应(Cafaro等，1999，2001；Caselli等，1999；Goldstein等，2000)。有趣的是注意到，在恒河猴上的Tat疫苗研究中因为用SIV激惹(Allen等，2002)或用编码Tat-Rev蛋白的重组病毒接种(Verrier等，200没有观察到保护作用，出现了冲突的结果。这些冲突的结果可以由免疫接种方案、病毒原液、病毒激惹途径和动物物种的不同来解释。在第一项研究中SIVTat和HIV-ITat之间的差异，以及第二项研究中Tat-Rev重组蛋白不具有天然Tat折叠或天然Rev折叠的可能性，可以解释缺乏保护作用。但是，更费解的是使用表达Tat、Env和Gag的相似病毒载体的两项其他研究的结果给出了相反的结论。一项研究显示了载体化的Tat的效力，但是feig和Env没有效力(Mittelaar等，2002)，而另一项研究显示了载体化的Gag和Env的效力，但是Tat没有效力(Liang等，2005)。两项研究的主要区别在于一个在疫苗和SHIV二者中使用了利用TatBru序列进行的同源激惹(Mittelaar等，2002)，另一个在疫苗中使用iTatBru序列并在SHIV中使用TatJr进行了异源激惹(Liang等，2005)。HIV-IJr和HIV-IBru都是B亚型的(图1)，但是它们的Tat序列具有不保守的突变，诱导了构象变化(Gregoire&Loret.，1996)。疫苗与用于激惹的病毒之间的这些突变可能解释了在第二项研究中Tat载体化的疫苗缺乏效力(Liang等，2005)。显然，第二项研究更近似于现实，因为接种疫苗的人不可能暴露于同源病毒感染，但是在那种情况下为什么使用同源Gag和Env(Liang等，2005)？在过去20年间，已经使用同源SHIV/猕猴模型测试了靶向HIV-I包膜蛋白的HIV-I疫苗研究并已获得成功O^inberg等，2002)。但是，临床试验没有成功(Vanichseni等，2004)。这是由于HIV-I的高遗传多样性，这也是应该使用遗传上不同的病毒在猕猴中进行异源SHIV激惹以确定疫苗是否能够在人类中有效对抗HIV-I感染的原因Weinberg等，2002)。如果成功的同源SHIV激惹有助于显示Tat疫苗接种在体内的重要性，那么在世界范围内发开用于人类的Tat疫苗必须考虑到Tat的遗传多样性。重要的是注意到使用B亚型TatBru进行免疫接种，不能刺激针对来自A和CHIV-I亚型的Tat变体的有效应答，而这些亚型占世界上感染的75%(Opi等，2002)。随着发现血清反应阳性的长期不进展(LTNP)患者与血清反应阳性的快速进展(RP)患者相比具有较高水平的Tat抗体，对开发Tat疫苗的兴趣增加了(Re等，1995；vanBaalen等，1997；Zagurry等，1998；Re等，2001；Addo等，2001；Belliard等，2003)。有趣的是，注意到了使用11000稀释的血清，在欧洲仅在30%的RP患者中识别到TatBru(Zagury等，1998)，在非洲这一数字仅为10到14%(Butto等，2003)。如果测试来自亚型A、C和D的其他Tat变体，这一百分数在非洲可以达到高达50%(Campbell等，2007)。该结果再一次显示出Tat变体中的突变能够如何影响免疫原性，但是它也显示出大量血清反应阳性患者不能识别Tat。此外，非洲RP患者中的Tat抗体对发展到AIDS没有影响(Sankali等，2008)。对于大多数HIV-I感染患者来说，已显示当他们的血液中存在Tat时该蛋白不被识别，并且识别到Tat的患者不能中和该蛋白。Tat被人类免疫系统识别如此不良的原因，可能是由于Tat的基本区与人类蛋白例如鱼精蛋白中发现的表位的序列相似性。显然，引发针对Tat基本区(IV区)的免疫应答将导致对人类的自身免疫应答。IV区在Tat变体之间非常保守(图1)，但是它不被来自HIV-I感染的患者的血清识别(Campbell等，2007)。有趣的是，注意到了HIV感染的母亲所生的新生儿有三分之二成功逃脱了HIV-I感染(Beattie等，2001)。直到18个月之前他们是血清反应阳性的，然后发生血清反应逆转。这种高比例的新生婴儿抵抗HIV感染，排除了可能是由于抗HIV先天性免疫的遗传因素。有可能的是，对免疫系统识别Tat的抑制存在于成年人中但不存在于新生婴儿中，因为鱼精蛋白随着性成熟出现。应该更多地注意在成年人中出现的抗HIV-I天然免疫性。在低比例的人类群体中观察到了针对HIV-I的天然免疫性，其覆盖了不同的机制，从趋化因子突变到产生针对HIV-I包膜的中和抗体的能力(综述参见Marmor等，2006)。天然免疫性可以是先天的或获得的，后者当然是疫苗开发最感兴趣的。具有针对HIV-I的天然免疫性的患者可以暴露并持续血清反应阴性(EPS)，或可以是血清反应阳性和长期不进展者(LTNP)。在大多数情况下，这种天然免疫性被证明是先天免疫性。但是，存在非常稀少的患者类型，他们高度暴露于病毒并显然由于获得性免疫性而对HIV-I有抗性。已经对呈EPS的肯尼亚性工作者进行了深入研究，她们对HIV-I的抗性似乎与她们发展出针对HIV-I的有效的CD8T细胞应答的能力相关(McMichael&Rowland-Jones，2001)。但是，矛盾之处在于，在EPS肯尼亚缝纫工人中的CD8T细胞应答与最终发展为AIDS的血清反应阳性的肯尼亚性工作者相比，在量值上低5倍(Alimonti等，2006)。使事情更加费解的是，在象牙海岸、越南和柬埔寨的类似EPS患者群体中进行的研究显示，他们不具有HIV-I特异性的CD8T细胞应答而是具有自然杀伤(NK)细胞应答(Scott-Algara等，2003Jennes等，2006)、针对HIV-1包膜蛋白的抗体(Nguyen等，2006)或影响病毒进入步骤的细胞因子(Saez-Cirion等，2006)。尽管认为这些肯尼亚EPS患者具有先天性免疫性，但是至少对于她们中在性工作结束后变成血清反应阳性的一部分人来说，已证明它是获得性免疫性(Kaul等，2001)。更有趣的是在加蓬鉴定到的EPS群体的研究(Huet等，1989)。在非洲，在80年代期间，在被称为“HautOgooue”的加蓬的边远地区，发现了HIV-I感染的患者没有发展出AIDS(Delaporte等，1988)。决定进行流行病学调查并对750位妊娠女性进行了两年，其中25位被鉴定为血清反应阳性(Huet等，1989)。在两年的调查期间，从这25位血清反应阳性女性中，23位发生血清反应逆转并变成EPS。尽管EPS患者通常没有可检测到的病毒，但能够从一位名为Oyi的患者在她仍然是血清反应阳性时分离和克隆了HIV-I毒株(Huet等，1989)。与其他在第一次暴露于HIV后许多年构成的性工作者或药物滥用者EPS群体相反，加蓬群体是在原发感染期间构成的，这也解释了为什么能够克隆到病毒。所有被HIV-IOyi感染的女性发生了血清反应逆转，但是维持了针对HIV-I的CTL应答，并具有针对PM的抗体(Huet等，1989)。该群体中高比例的EPS表型(92%)表明血清反应逆转可能是由于获得性免疫性而不是先天性免疫性。在该流行病学调查发表后10年，这23位女性健康良好，在她们的血液中不再可以检测到HIV-I或感染迹象。此外，与其他中非国家相比，在加蓬的HIV-I感染似乎非常低(Delaporte等，1996)。HIV-1Oyi具有与常规HIV-1毒株类似的基因，除了tat基因之外，该基因具有在其他Tat变体中从未发现的突变(Gregoire&Loret，1996)。使用TatOyi进行免疫接种，在兔中产生了能够识别不同Tat变体、甚至具有高达38%的突变的变体的抗体，这对于其他Tat变体是不可能的(Opi等，200。TatOyi表现出诱导了针对在Tat变体中保守的三维表位的体液免疫应答，该体液应答可能能够中和细胞外Tat。在80年代期间，细胞外Tat的作用是未知的，因此在该加蓬群体中没有检测针对Tat的抗体的存在(Huet等，1989)。使用合成的TatOyi辅以佐剂对7只恒河猕猴进行了免疫接种，然后在TatOyi预防接种的猕猴和对照猕猴上进行了使用欧洲SHIVBX08的异源激惹。TatOyi预防接种的猕猴与对照猕猴相比，具有较低的病毒血症并伴有CD8T细胞的升高。此外，在TatOyi预防接种的猕猴中，在激惹后8周时不再可以检测到SHIV感染的细胞。有趣的是，注意到了具有最低病毒血症的猕猴没有针对SHIV包膜蛋白的抗体。对猕猴再次进行激惹，制造了短期的血清反应阳性和血清反应转变(Watkins等，2006)。因此，能够在猕猴上实验复制在对EPS患者的领域中发现的情况。重要的是，注意到了该“EPS猕猴”具有可检测到的病毒血症(watkins等，2006)。这是非常有希望的结果，因为它是异源SHIV激惹，并且它显示了显著降低HIV感染的细胞的水平是有可能的。该目标在HAART治疗下的血清反应阳性患者中从未实现过。发明概述本发明提供了在患者中预防或治疗获得性免疫缺陷综合征(AIDQ的方法，其中向患者施用能够刺激针对Tat蛋白的免疫应答的包含氨基酸序列WKHPGSQPKTACNNCYCKRCCLHCQVCFTKKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSKTHQVSLSKQPASQPRGDPTGPKES(SEQIDNO1)的蛋白，或所述蛋白的变体，或编码所述蛋白或变体的多核苷酸。优选，所述蛋白或变体能够刺激针对2、3、4或更多种HIV-I亚型的免疫应答。在优选实施方案中，所述蛋白或变体能够刺激针对选自A、B、C、D、E、F、G、H、J和K的两种、三种、四种、五种或更多种HIV-I亚型的Tat蛋白的免疫应答。最优选，所述蛋白或变体能够刺激针对五种HIV-I亚型、优选为A、B、C、D和E的免疫应答。优选，所述蛋白包含氨基酸序列MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACNNCYCKRCCLHCQVCFTKKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSKTHQVSLSKQPASQPRGDPTGPKESKKKVERETETDPED(SEQIDNO2)或由该序列构成。SEQIDNO:2与W000/61067中描述的HIVOyiTat蛋白的差异在于22位的半胱氨酸，其恢复了反式激活能力。本文中使用的蛋白表现出Tat的功能活性，即在HeLaP4细胞分析中能够进行HIV-I基因反式激活(图4)。7在22位用半胱氨酸取代丝氨酸加强了原始TatOyi序列的免疫原性，正如使用对TatOyiC22的识别比对TatOyiS22更好的100名血清反应阳性患者群体的血清所显示的(图2)。TatOyiCys22的反式激活活性证实了3D结构是正确的，并允许对蛋白进行表征以用于临床试验。本发明的另一个主题是包含具有反式激活能力的TatOyi蛋白作为活性成分的疫苗，所述TatOyi蛋白在22位上包含半胱氨酸并优选选自SEQIDNO:1或SEQIDNO:2。在优选实施方案中，疫苗包含佐剂。本发明的另一个主题是对温血动物进行免疫接种的方法，所述方法包含注射有效量的含有SEQIDNO:1或SEQIDNO2中的至少一个的蛋白和佐剂。该方法可以进一步包含确定蛋白是否触发了针对五种或更多种HIV-I亚型的免疫应答的步骤，其中蛋白刺激了针对来自至少五种HIV-I亚型的Tat蛋白的免疫应答。图1的图显示了在三个群体中抗TatIgG的检测，一个是越南EPS患者(η=25)，第二个是法国血清反应阳性患者(n=100)，第三个是法国血清反应阴性的未接触过抗原的患者(n=20)。在代表了5种主要HIV-I亚型的Tat变体的ELISA滴定曲线中，使用患者血样观察了三种类型的血清学图样。图IA显示了使用来自越南EPS患者的血清获得的6种Tat变体的识别。对于6种Tat变体来说Tat抗体水平是不相同的，对于越南患者来说TatCM240被识别得最好。图IB显示了只识别一种或两种Tat变体的另一种患者，并主要在法国血清反应阳性群体(n=100)中观察到。图IC不存在任何Tat变体的识别(0D低于0.1)，这对于法国血清反应阴性群体(n=20)来说是典型的，但是一半的法国血清反应阳性群体和三分之一的越南EPS群体也是同样。图2的图显示了用法国血清反应阳性群体(η=100)的血清的识别7种Tat变体。Tat变体代表来自HIV-I亚型A(Ugl1RP)、B(ΗΧΒ2)、C(96BW),D(Eli)和E(CM240)，对应于字母Α、B、C、D和Ε。字母0对应于TatOyiSer22,0c22对应于TatOyiSer220该实验显示，Cys22突变不改变TatOyi的识别，而是增强了原始TatOyi序列的免疫原性。这肯定是由于与Tat野生型更相似的半胱氨酸区域。Sl显示了来自在分析HPLC中在25分钟处具有单峰的纯化的亚级份的等份试样的质谱图。观察到的分子量(MW)几乎完全对应于TatOyiCys22的预计分子量11578。纯化是成功的，没有分子量低于或高于11578的痕量肽。5784.5处的峰对应于11575处的峰的暗影峰(shadowpeak)(质量除以2)。Si的图显示了使用HIVLTR转染的HeLa细胞进行的反式激活分析。使用细胞培养物分析法，使用带有HIVLTR控制下的细菌Iac-Z基因的HeLaP4细胞测试了合成的TatOyiCys22的生物学活性。活性Tat蛋白能够跨过细胞质和细胞膜并“反式激活”IacZ基因，正如通过β-半乳糖苷酶的细胞质积累所显示的。将&105个细胞/孔在M孔板中、在37°C和5%CO2下、在补充10%胎牛血清的Dulbecco修改的Eagle培养基(DMEM)中温育。在M小时后将细胞用PBS洗涤，并加入用补充0.01%鱼精蛋白(Sigma)和0.1%牛血清白蛋白(Sigma)的DMEM稀释的Tat蛋白。测试了一种浓度的两种Tat蛋白(500nM),以便验证β-半乳糖苷酶的水平对于细胞外Tat是剂量依赖性的。在37°C、5%CO2下16小时后，将细胞用PBS洗涤并裂解。提取蛋白，使用可商购的抗原捕获酶联免疫吸附分析(β-半乳糖苷酶ELISA，RocheMolecularBiochemicals)测量β-半乳糖苷酶含量。在405nm处测量吸光值。Ml显示了TatOyiSer22和TatOyiCys22的圆二色性(CD)光谱。在20°C下、在20mMpH4.5的磷酸缓冲液存在下，在JASCOCorp.的J-810分光偏振仪(日本)上使用10(^111程长，在沈0-17811111范围内记录了⑶光谱。使用步进式自动响应程序(JASCO)，以0.5nm的间隔收集数据。⑶光谱被显示为每个酰胺的Δε。蛋白浓度对于TatOyiSer22来说是lmg/ml，对于TatOyiCys22来说是0.;3mg/ml。两个CD光谱是相同的，显示出cyS2ker突变没有诱导可以被⑶检测到的变化。■显示了iTatOyiCys22的分子建模。分子建模使用hsightII2002软件包进行，该软件包包括生物聚合物、发现和同源性软件(Biopolymer，DiscoverandHomology)(Accelrys，SanDiego,CA)建立了对应于TatOyiSer22(数据未显示)和TatOyiCys22的两个模型。模型从TatEli的NMR结构(Watkins等，2008)使用CV力场和共轭梯度算法以进行能量最小化而获得。两个模型是相同的，cys22ser突变没有诱导可以从分子建模推演出的变化。有趣的是观察到了含有Glu100突变的C-末端非常接近于在Tat变体中具有最保守序列的区域3和4。发明详述本发明人观察到，对HIV感染有抗性的患者(越南EPS患者)能够识别代表5种主要HIV-I亚型的Tat变体(图1A)。这些结果显示了有能力交叉识别不同Tat变体的Tat抗体能够恢复针对HIV的有效细胞免疫应答。在此基础上，本发明提供了在患者中预防或治疗获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的方法，其中给患者施用能够刺激针对Tat蛋白的免疫应答的包含氨基酸序列SEQIDN01或2的蛋白，或所述蛋白的变体。优选，蛋白能够刺激针对两种、三种、四种或更多种HIV-I亚型的免疫应答。最优选，蛋白能够刺激针对来自至少5种HIV-I亚型的Tat变体的免疫应答。在优选实施方案中，给患者施用包含氨基酸序列SEQIDNO:2的蛋白，最优选由氨基酸序列SEQIDNO2构成的蛋白。在另一个实施方案中，给患者施用包含序列SEQIDN0:1或2的截短形式的蛋白。例如，蛋白可以在N-末端被截短1到10个氨基酸、优选1到8个、优选1到6个、优选1到4个、优选1或2个氨基酸。也可以给患者施用包含在C-末端被截短了1到14个氨基酸、优选1到12个、优选1到10个、优选1到8个、优选1到6个、优选1到4个、优选1或2个氨基酸的氨基酸序列SEQIDNO:1或2的蛋白。被施用的蛋白可以是源自于SEQIDNO:1或SEQIDNO2的变体。优选，蛋白变体与SEQIDNO:1或SEQIDNO2的差异在于保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是同类别氨基酸之间的取代。这些类别包括例如具有不带电荷的极性侧链的氨基酸，例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；具有碱性侧链的氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有酸性侧链的氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸；以及具有非极性侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。优选，能够刺激针对优选来自至少5种HIV-I亚型的Tat蛋白的免疫应答的蛋白变体，显示出与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2至少80%、优选至少85%、优选至少90%、优选至少95%的同一性。同源性或同一性使用序列分析软件、例如威斯康星大学生物技术中心遗传学计#1/1SΡΛWii^lJ/Γ^^^(SequenceAnalysisSoftwarePackageoftheGeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter),1710UniversityAvenue,Madison,WI53705来测量。将氨基酸序列进行比对以最大化同一性。可以在序列中人工导入间隙以获得适合的比对。一旦建立起最佳的比对，就通过相对于位置的总数记录其中两个序列的氨基酸相同的所有位置，建立起同源性或同一性的程度。要施用的蛋白变体也可以包含化学修饰，例如将肽键修饰成假肽键。术语“假肽键”是指与参比肽相似的化合物，但是其中一个或多个肽键一CO--NH-被与肽键等效的被称为假肽键的键取代，所述假肽键例如一CH2—NH-,-CH2—S—,-CH2—0—,—CO—CH2—C0—、一CH2—CH2_。术语“变体”还包含一个或几个氨基酸被不是天然氨基酸的化学残基取代。也包含了被L-氨基酸的取代。在本发明的另一方面，蛋白通过其C-端末端或赖氨酸残基共价键合到聚乙二醇(PEG)分子、特别是1500或4000MW的PEG上，以降低尿清除率和使用的治疗剂量，并增加在血浆中的半衰期。在另一个实施方案中，通过将蛋白包含在用于药物投送系统的生物可降解和生物相容聚合物材料中形成微球来增加蛋白的半衰期。聚合物和共聚物是例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)(正如在SoonKapHahn等的US2007/0184015中所描述)。在另一个实施方案中，蛋白连接到载体上或与载体结合。载体在本
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中是公知的(Plotkin，1999)。细菌载体(即源自于细菌的载体)包括但不限于霍乱毒素B亚基(CTB)、白喉毒素突变体(CRM197)、白喉类毒素、B型链球菌αC蛋白、脑膜炎球菌外膜蛋白(OMPC)、破伤风类毒素、不能分型的流感嗜血杆菌的外膜蛋白(例如Ρ6)、Β型脑膜炎球菌的重组3类膜孔蛋白(rPorB)、热杀死的单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)禾口f同绿1叚单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)重组夕卜蛋白Α。另——禾中载体是匙孔血蓝蛋白(KLH)。源自病毒的载体的例子在本
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是公知的，包括乙型肝炎表面抗原(HBsAg)粒子和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)。在优选实施方案中，能够刺激针对Tat蛋白、优选来自至少5种HIV-I亚型的Tat蛋白的免疫应答的蛋白变体，能够起到反式激活作用。有利地，蛋白变体能够刺激针对来自HIV-I亚型A、B、C、D和E的Tat蛋白的免疫应答(E亚型HIV毒株主要在东南亚观察到，但是通常被认为是A亚型毒株的重组形式)。蛋白或变体可以是重组蛋白或优选为化学合成的蛋白，其可以以固相合成并优选以快速FMOC策略进行合成。当蛋白通过化学合成生产时，本发明的多肽可以合成为单一序列的形式，或为几个序列然后彼此连接的形式。化学合成可以在固相或溶液中进行，这两种合成技术对于本
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的专业人员来说都是熟知的。这些技术具体描述在Atherton和证印ard的“《固相肽合成》(Solidphasepeptidesynthesis)，，(IRLpressOxford，1989)，和Houbenweyl在Ε.Wunsch出版的"《有机化学方法》Vol.15-1和II中(MethodenderorganischenChemie,[MethodsinOrganicChemistry],Vol.15-1andII),Stuttgart,1974,以及下列在此以其全文引为参考的文章中:PEDawson等(Science1994；266(5186):776-9)；GGKochendoerfer等(1999;3(6):665-71)；etPEDawson等，Annu.Rev.Biochem.2000;69923-60。蛋白也可以使用本
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的专业人员公知的遗传工程技术来生产。当蛋白通过遗传工程生产时，它在NH2-末端包含对应于第一个起始密码子翻译的附加的甲硫氨酸残基。这些技术详细描述在Maniatis等的《分子克隆实验指南》(MolecularCloning:amolecularmanual),ColdSpringHarbor,1989中。蛋白可以进而以纯化的形式获得，即以表现出至少80%、85%、90%、95%或更高的纯度的形式。纯度相对于混合物中存在的被认为是污染物的其他蛋白而定义。该纯度使用考马斯亮蓝、通过SDS-PAGE的比色测定来评估。条带的密度测量值能够对纯度进行定量。纯度也可以通过反相HPLC，通过计算各种峰的面积来测量。可以使用几种类型的治疗性组合物来引发针对来自至少5种HIV-I亚型的Tat蛋白的免疫应答。本发明的主题是药物组合物，其包含其能够刺激针对Tat蛋白、优选来自至少5种HIV亚型的Tat蛋白的免疫应答的含有氨基酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的蛋白或所述蛋白的变体，与可药用载体的组合。被建议适合用作疫苗的免疫原性组合物，最容易可以直接从以本文所公开的方式制备的免疫原性iTatOyiCys22蛋白和/或肽(例如SEQIDNO.:1、2或SEQIDNO.:1或2的片段)制备。优选，抗原性材料被彻底透析以除去不想要的小分子量分子，和/或冷冻干燥以便更方便地配制在所需介质中。含有肽序列作为活性成分的疫苗的制备在本
技术领域：
中已被普遍了解，由美国专利证书4，608，251,4,601，903,4,599，231,4,599，230,4,596，792和4.578，770所示例。典型地，这样的疫苗被制备成可注射液作为溶液或悬液，也可以制备适合于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。制备物也可以被乳化。活性免疫原性成分通常与可药用并与活性成分相容的赋形剂混合。适合的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，疫苗可以包含少量辅助性物质例如润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂或增强疫苗有效性的佐剂。疫苗常规可以通过注射例如皮下或肌肉内注射来肠胃外给药。适合于其他给药方式的其他制剂包括栓剂、以及在某些情况下的口服制剂。对于栓剂来说，传统的粘合剂和载体可以包括例如聚亚烷二醇或甘油三酯这样的栓剂可以从含有0.5%到10%、优选1-2%活性成分的混合物形成。口服制剂包括常用赋形剂例如药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末的形式，并包含10-95%、优选25-70%的活性成分。蛋白可以作为中性或盐形式配制成疫苗。可药用盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成)，以及与无机酸例如盐酸或磷酸或者有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以源自于无机碱例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，以及有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。疫苗以与剂型相容的方式、并以例如治疗有效和免疫原性的量给药。给药量取决11于待治疗的对象，包括例如个体免疫系统合成抗体的能力以及所需的保护程度。需要给药的活性成分的精确量取决于医师的判断。但是，适合的剂量范围在每次接种几百毫克活性成分的量级。用于初次给药和加强针的适合方案也是可变的，但是典型为在初次给药继以后续接种或其他给药。施用方式可以广泛变化。任何用于疫苗给药的常规方法都是适用的。它们被认为包括了在生理可接受固体基质上口服施用，或在生理可接受的分散相中通过注射等肠胃外施用。疫苗的剂量将取决于给药途径，并将随着宿主的大小而变。在优选实施方案中，本发明的组合物还包含佐剂。佐剂可以选自能够促进或增加蛋白的免疫原性的任何物质、混合物、溶质或组合物，所述蛋白包含氨基酸序列SEQIDNO1或SEQIDNO:2或其变体，其中佐剂能够增强免疫应答。佐剂的实例优选包括磷酸钙，但是也包括ALUM磷酸盐、ALUM氢氧化物、MontanideCpG、QS21、ISCOM或单磷酰脂A。疫苗实现佐剂效应的其他方法包括使用试剂例如氢氧化铝或磷酸铝(alum)，通常作为0.05到0.的磷酸缓冲盐水溶液使用，与作为0.25%溶液使用的合成的糖类聚合物(卡波普)混合，通过在70°C到lOrC之间的温度下分别热处理30秒到2分钟的时间，使疫苗中的蛋白聚集。也可以使用通过用胃蛋白酶处理过的针对白蛋白的抗体(Fab)重新激活进行聚集，与细菌细胞例如微小隐孢子虫(C.parvum)或革兰氏阴性细菌的内毒素或脂多糖组分进行混合，在生理可接受的油介质例如二缩甘露醇一油酸(AracelA)中乳化或用20%的全氟化碳(Fluosol-DA)溶液作为区段替代物进行乳化。在许多情况下，希望进行多次疫苗给药，通常不超过6次疫苗接种、更通常不超过4次疫苗接种、优选为一次或多次、通常至少约3次疫苗接种。疫苗接种一般将以2到12周的间隔、更通常3到5周的间隔进行。为了维持抗体的保护水平，将需要以1-5年、通常3年的间隔期定期加强。免疫接种的过程后可以进行抗原的抗体分析。本发明的蛋白组合物可以使用本
技术领域：
的专业人员已知的任何常规方法制备。通常情况下，将蛋白与可药用稀释剂或赋形剂例如水或磷酸缓冲盐水溶液混合。赋形剂或稀释剂的选择取决于所选的药物形式、给药的方法和途径以及药学实践。适合的赋形剂或稀释剂以及在药物制剂方面的要求，详细描述在《Remington药物学》(Remington'sPharmaceuticalSciences)中,其代表了本
技术领域：
的参考著作。另一种药物组合物包含氨基酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或其如上所定义的变体的编码多核苷酸。这样的药物组合物通过例如注射施用于宿主(称为DNA疫苗接种)，并且所述核酸在体内表达Tat多肽。这样的DNA疫苗通常由质粒载体构成。已经显示，投送裸露的DNA效率很低，通常需要一些载体来改进DNA投送和摄取到细胞内。已经开发了两种类型的载体(1)病毒载体(腺病毒、慢病毒、麻疹病毒)，或⑵非病毒载体例如聚合物(特别是阳离子聚合物)、被囊的DNA(脂质体，包含阳离子脂类，其与聚阴离子例如DNA和RNA自发并快速相互作用，产生脂质体/核酸复合物)或与金微粒相连的DNA。此外，可以有利地使用辅助细胞摄取核酸的试剂，例如钙离子、细菌蛋白、病毒蛋白和其他转染促进剂。上面提到的组合物可以通过在疫苗领域经常使用的任何常规途径给药，例如肠胃外(静脉内、肌肉内，皮下等)途径。在本发明的情况下，对于可注射组合物来说优选使用肌肉内给药。这样的给药可以有利地在大腿或手臂肌肉中进行。本发明的组合物也可以有利地进行口服给药。在本发明的情况下，还可以推荐通过鼻、阴道或直肠粘膜给药。给药也可以通过给予单剂，或例如在DO和1个月、3个月、6个月和12个月时给予重复剂量而进行。优选使用加强针在JO和1个月和3个月时进行注射，其周期性可以由治疗医师容易地确定。一般来说，每剂将包含约5μg到约500μg蛋白、优选在10到200μg之间。更优选的剂量可以是约50μg蛋白作为免疫原。本
技术领域：
的专业人员也可以考虑其他的剂量范围。在需要时，起始剂量后可以任选跟有重复的加强。本发明还打算覆盖用作医药产品、特别是用作针对HIV感染的预防性或治疗性疫苗的药物组合物。根据优选方面，本发明的主题是使用本文所述的蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸对人体进行免疫接种。因此，本发明优选涉及施用所述多肽或多核苷酸以便诱导特异性体液应答的方法。进而，本发明提供了用于诱导HIV中和抗体的方法，所述方法包含施用足以诱导所述体液应答的量的如上所定义的药物组合物。“特异性体液应答”的表达打算是指这样的应答，所述应答包含产生特异性针对在Tat变体之间非常保守的表面的抗体。特异性抗体的产生可以使用本
技术领域：
的专业人员公知的常规技术，例如ELISA、RIA或western印迹容易地确定。本文中使用的Tat蛋白和变体，对于开发能够用于保护和/或治疗大量或甚至所有具有HIV风险或感染HIV的个体的疫苗，是有价值的候选物。如果没有进行抗病毒治疗的血清反应阳性患者的病毒血症降低、淋巴细胞CD4细胞升高和/或淋巴细胞CD8细胞含量降低，即可认定治疗效果。更具体来说，当至少55位HIV血清反应阳性的患者群体的30%在中断他们的HAART治疗6个月后，将他们的病毒血症维持在50个拷贝/ml以下时，即可认定治疗效果。在患有确定的AIDS的患者中，这样的抗Tat疫苗能够限制某些病理状况的发病率，所述病理状况例如卡波济氏(Kaposi's)肉瘤或似乎与Tat蛋白在被HIV感染的细胞分泌后的直接作用相关的神经综合征。在无症状的患者中，本发明的药物组合物由于降低病毒血症、升高淋巴细胞⑶4细胞和/或降低淋巴细胞CD8细胞含量，预计将延迟朝向AIDS的发展。这样的疫苗将允许患者恢复针对HIV感染细胞的有效的免疫细胞应答，而看起来在感染发作时情况不是这样。具体来说，恢复其活性被Tat抑制的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、NK细胞和巨噬细胞的活性。疫苗接种因此将具有使患者变成至少不进展者的结果。在本文中提供了用于消除HIV感染的细胞并提供针对AIDS的治愈性治疗的疫苗接种。附图和实施例对本发明进行说明，但不限制其范围。实施例材料与方法蛋白合成。Tat蛋白按照Barany和Merrifield(1980)的方法，在自动合成仪(ABI433A,PerkinElmer,AppliedBiosystemInc.)上，在预先装载HMP的树脂(0·5-0.65mmol)(PerkinElmer,AppliedBiosystemInc.,ForsterCity,CA)上进行组装。使用HIVLTR转染的HeLa细胞进行反式激活分析。使用细胞培养物分析法，使用带有HIVLTR控制下的细菌Iac-Z基因的HeLaP4细胞测试了合成的TatOyiCys22的生物学活性。活性Tat蛋白能够跨过细胞质和细胞膜并“反式激活”lacZ基因，正如通过β-半乳糖苷酶的细胞质积累所显示的。在37°C和5%CO2下，将2xl05个细胞/孔在M孔板中补充有10%胎牛血清的Dulbecco修改的fegle培养基(DMEM)中温育。在M小时后将细胞用PBS洗涤，并加入用补充0.01%鱼精蛋白(Sigma)和0.牛血清白蛋白(Sigma)的DMEM稀释的Tat蛋白。测试了一种浓度的两种Tat蛋白(500nM)，以便验证β-半乳糖苷酶的水平对于细胞外Tat是剂量依赖性的。在37°C、5%CO2下16小时后，将细胞用PBS洗涤并裂解。提取蛋白，使用可商购的抗原捕获酶联免疫吸附分析(β-半乳糖苷酶ELISA，RocheMolecularBiochemicals)测量β-半乳糖苷酶含量。在405nm处测量吸光度值。圆二色性(CD)在20°C下、在20mMpH4.5的磷酸缓冲液存在下，在JASCOCorp.的J-810分光偏振仪(日本)上使用IOOym程长，在沈0-17811111范围内记录了⑶光谱。使用步进式自动响应程序(JASCO)，以0.5nm的间隔收集数据。CD光谱被显示为每个酰胺的Δε。分子建模分子建模使用hsightII2002软件包进行，该软件包包括生物聚合物、发现禾口同源性软件(Biopolymer,DiscoverandHomology)(Accelrys,SanDiego,CA)。模型从TatEli的NMR结构(Watkins等，2008)、使用CV力场和共轭梯度算法进行能量最小化而获得。人类血清。暴露的持续血清反应阴性(EPS)患者(n=25)是越南静脉内药物滥用者(IDU)，他们通过共用针头高度暴露于HIV-I感染的风险并从1996年起跟踪(Truong等，200，并提供了他们对科学研究的同意书(Tran等，2006)。法国人类血样从一组20位HIV-I血清反应阴性和100位HIV-I血清反应阳性的高加索人患者获得。它们在Marseille的医院中心收集。大多数HIV-I血清反应阳性患者处于抗反转录病毒疗法(HAART)下。征集的法国血清反应阴性群体参加者被告知了研究的目的(根据1975年发布并在1983年修订的赫尔辛基宣言)。所有血样在每个群体的本国收集并冷冻。ELISA分析。人类或小鼠血清中的抗tat抗体通过标准的酶联免疫吸附分析(ELISA)、使用MaxisorpU96免疫板(Nunc)进行。在4°C下，将板用pH4.5的IOOmM磷酸缓冲液稀释的每种Tat变体以0.5μg/孔包被16小时。目前，在世界上存在5种主要的HIV-I亚型A和C亚型是优势的(72%)并主要在非洲、印度和南美发现；B亚型(10%)主要在欧洲和北美发现；D亚型主要在非洲发现，E亚型(现在被描述为重组形式CRF01AE)主要在东南亚发现(Hemelaar等，2006)。Tat的变异性符合这种地理多样性，在来自HIV_1A、B、C、D和E亚型的Tat变体中观察到了高达40%的突变，它们不改变Tat活性但是影响Tat的免疫性质(Opi等，2002，2004)。这是我们使用TatUgIlRPJatHXB2、Tat92Br、TatEli和TatCM240代表HIV-1A、B、C、D和E亚型的原因。这5种合成的蛋白具有Tat生物活性，其大小为99到101个残基，是目前本领域中Tat的优势形式(Jeang等，1999)。在同一板上将TatOyiCys22和TatOyiSer22的识别与这5种Tat变体进行了比较。然后将板在室温下与200μ1补充有2%牛奶的PBS温育1小时。加入用补充有0.2%牛奶的PBS不同稀释的血清(一块板用一种血清)，并在室温下轻轻摇动1小时。向每个孔加入在补充2%牛奶的PBS中11000稀释的第二抗体(来自Sigma的抗人或抗小鼠IgG过氧化物酶)，并在室温下轻轻摇动1小时。在每个后续步骤之间将板用200μ1IXPBS/0.05%吐温20(Genaxis)洗涤3次。向每个孔加入100μ1ABTS(来自Sigma的2，2’-连氮基-双-3-乙基苯并-噻唑啉-6-磺酸)进行显色，吸光度在EL800通用微孔板读板器(BIO-TEKINSTRUMENT，INC)上在405nm处读取。实施例1来自越南EPS患者的血清能够识别来自5种主要HIV-I亚型的Tat变体，包括iTatOyi。在EPS患者中检测的抗TatIgG我们能够在越南EPS患者群体中检测Tat抗体。我们使用代表5种主要HIV-I亚型的Tat变体、包括TatOyi，在三个群体上进行了ELISA测试，一个群体是越南EPS患者(n=25)，第二个是法国血清反应阳性患者(n=100)，第三个是法国血清反应阴性未接触过抗原的患者(η=20)。在ELISA测试中观察到了三种类型的血清学图样(图1)。第一种图样的特征在于特异性识别(0D高于0.1)所有Tat变体，并只在EPS群体(η=25)中观察到。图IA显示了使用来自越南EPS患者的血清获得的6种Tat变体的识别。对于6种Tat变体来说Tat抗体的水平是不同的，并且来自HIV-1〇1240的1~站(01灯等，1996)被该患者识别得最好。第二种血清学图样的特征在于不存在对至少一种Tat变体的特异性识别，并主要在血清反应阳性群体(η=100)中观察到。图IB显示了使用来自法国血清反应阳性患者的血清获得的仅仅一种Tat变体的识别。血清反应阳性患者能够识别一种以上Tat变体，但是不能识别所有Tat变体(Campbell等，2007)。第三种血清学图样是不识别任何Tat变体，其特征在于OD低于0.1。图IC显示了使用来自法国血清反应阴性患者的血清获得的没有Tat变体的识别。在所有未接触过抗原的法国血清反应阴性患者群体的志愿者中观察到了这种血清学图样，但是也在一半的法国血清反应阳性患者和三分之一的越南EPS群体中观察到(数据未显示)。有趣的是，注意到了TatCM240在越南群体中被识别得最好，其次是TatOyi，如图IA中所示。TatCM240是越南特有的HIV-IE亚型的代表(Lan等，2003)。TatOyi在这些越南患者中的良好识别显示出TatOyi的特异性免疫特征。在血清反应阳性患者中没有观察到6种Tat变体的交叉识别与EPS患者的主要差异显示在图IB中。只有一半的患者具有Tat抗体，并且它们的血清一般能够识别一种或两种Tat变体(图1B)。该结果与使用乌干达血清反应阳性患者群体时观察到的非常相似(Campbell等，2007)。但是，该研究的设计是不同的，因为在法国血清反应阳性群体中在一年内进行了5次采血。非常有趣的是注意到针对Tat的抗体在某些患者中可消失，并且当他们再次具有针对Tat的抗体时，是所识别的相同的Tat变体(数据未发表)。大多数法国血清反应阳性患者(75%)被B亚型HIV-I毒株感染，并且75%有效识别iTatHXB2、TatOyiSer22或TatOyiCys22。但是，有趣的是观察到iTatOyi比TatHXB2识别得更好，尽管TatHXB2序列与欧洲B亚型Tat变体具有最接近的同源性。EPS越南人群体的情况相同，这些结果证实了TatOyi的特异性免疫特征。我们预计，Ser/cys22突变将不会改变TatOyi的免疫识别。这被法国血清反应阴性群体所证实，因为Cys22突变不改变TatOyi的识别。有趣的是，可能是由于富含半胱氨酸区域与野生型Tat变体的同源性，观察到TatOyiCys22的识别甚至比TatOyiS22更好。在法国血清反应阳性群体中，TatUgIlRP和TatCM240的滴定曲线通常是相同的15(数据未显示)。这表明在这两种变体中相似的表位被识别，并人为地增加了识别这两种变体的患者的数量。在越南EPS患者中，正如图IA所示，TatUgIlRP和TatCMMO的滴定曲线是不同的，其中顶部的曲线是iTatCM240所致。这表明在越南人中，TatCM240和E亚型Tat变体存在另一个共有的表位。对于越南和法国患者二者来说，TatOyi与TatHXB2之间的滴定曲线也通常是相同的(数据未显示)。图1和图2显示在Tat变体之间不存在共同表位，因为我们的Elisa测试几乎总是可以鉴定出感染患者的HIV-I亚型。因此，EPS患者中TatIgG抗体的检测可能是由于不属于HIV-I的病原体的感染这一可能性，是非常不可能的。讨论TatOyi(101个残基)具有在来自快速进展者患者的Tat变体中从未发现过的突变(Gr6goire&Loret，1996)，并且我们推测这些突变使得I^tOyi能够具有对应于Tat变体中非常保守的区域的3D表位(Opi等，2002，Watkins等，2006)。因此，TatOyi在越南EPS群体中被非常好地识别，并且这种识别不能用与TatHXB2的共同表位来解释，这是令人吃惊的。该研究显示，来自在泰国患者中鉴定到的HIV-ICM240的Tat(Carr等，1996)在越南EPS患者中识别得最好。HIV-ICM240在东南亚是典型的，该结果表明在EPS中可能发生了针对Tat的获得性体液应答，并可能是他们尽管多次暴露但仍对HIV-I有抗性的原因。在该EPS越南群体中，对于⑶4-GP120复合体也观察到了特异性体液应答(Lopalco等，2005)。该EPS越南群体具有与欧洲患者的EPS群体相似的HIV-I免疫性征兆(Lopalco等，2005)，并且TatCM240的识别证实了EPS越南患者被HIV感染过并成功地抵抗了HIV-I感染。另一方面，显示出三分之一的EPS患者没有可检测的Tat抗体，他们对HIV的抗性不是由于Tat抗体(数据未显示)。最近在这个完全相同的越南EPS群体中鉴定到了先天性免疫性，其中5位患者在他们的CD4淋巴细胞细胞因子中具有影响HIV进入步骤的突变(Saez-Cirion等，2006)。有趣的是了解到这些患者中的一位属于在本研究中不识别Tat的EPS。在血清反应阳性患者的血清中已检测到Tat抗体，并观察到了其与长期不进展者(LTNP)状态的关联性Gagury等，1998；Re等，2001Belliard等，200。在这些研究中使用了变性的Tat变体或肽，并且只在三分之一的血清反应阳性患者中检测到Tat抗体(hgury等，1998)。我们开发了一种检测Tat抗体的新方案，其中使用了pH4.5下的完整Tat变体以维持Tat的三维结构，并且在血样的低稀释度(1/4)下开始检测。这种新方案能够将检测到特异性Tat抗体增加到50%的血清反应阳性患者。但是，令人惊异的是，在其血液中具有细胞外Tat的血清反应阳性患者中有50%不能识别任何Tat变体。另一方面，尽管在血清反应阳性患者中Tat抗体的浓度比EPS患者高两倍，但EPS患者中Tat抗体的量对于HIV感染的细胞产生的Tat的可能量来说，仍是巨大的。在越南人中奇怪的是TatOyi的识别。在使用1/1000血样稀释度对越南群体进行的第一次筛选实验中，我们能够在56%的EPS患者中检测到针对TatOyi的抗体的存在。这种从％血样稀释度开始的新方案能够指出，在EPS群体中其他Tat变体被明显识别(图1A)。结论只有一半的血清反应阳性患者具有针对Tat的抗体，并且不能识别6种Tat变体。此外，这些针对Tat的抗体可能消失。这些特性可以解释它们不能中和细胞外Tat。已经显示，Tat能够在细胞毒性T淋巴细胞中诱导凋亡(Westendorp等，1995)并由于Fas配体的过表达而抑制巨噬细胞(Cohen等，1999)。在EPS群体中唯一的针对HIV-I的细胞应答是自然杀伤(NK)细胞所致，并且Tat能够在NK细胞中诱导细胞凋亡(Poggi等，2002)。我们的结果表明，对于不同Tat变体具有交叉识别能力的Tat抗体，能够恢复针对HIV的有效的细胞免疫应答。在EPS群体的大多数患者中特异性识别Tat的IgG的存在，表明发生了针对Tat的获得性免疫性，并能够恢复它们的细胞免疫性。这种获得性免疫性在越南Tat变体中可能是由于与带有TatOyi的加蓬人中观察到的突变相似的突变。在TatOyi特有的突变中，Glu100似乎是非常引人关注的，因为负电荷的出现能够诱导针对TatOyi表面的免疫原性，所述表面对应于在Tat变体之间高度保守的表面。实施例2=TatOyiCys22的合成、纯化和表征在固相肽合成中装配Tat0yiCys22(SEQIDNO:2)。在切除树脂前，从707mg的理论量获得了330mg粗物质。合成产率是46.7%，与合成TatOyiSer22时观察到的相似。使用三氟乙酸将树脂和保护基团从蛋白物质上切下。蛋白物质首先通过用叔丁基醚(TBE)沉淀进行纯化，以除去溶解在TBE中的游离保护基。将沉淀干燥并重新悬浮在0.1%TFA的水性缓冲液中，然后通过过滤(0.22μm)除去树脂。将无树脂的蛋白物质(约240mg)冷冻干燥，并分成称为F1、F2、F3和F4的约60mg的四个部分，以最高20mg/ml的浓度重新悬浮在0.1%TFA的水性缓冲液中。每部分含有约150D单位。使用Beckman高压液相色谱(HPLC)装置，使用BeckmanC8反相柱(10x150mm)对每部分进行纯化。缓冲液A是含有0.1%TFA的水，缓冲液B是含有0.1%TFA的乙腈(Merck)。梯度是在40分钟内缓冲液B从15到35%，流速为2ml/min。从C8反相分离后获得的不同亚级份中，能够在亚级份中检测到Trp的典型吸收光谱。HPLC分析使用MerckRP-8柱6x100mm)进行，使用了相同的缓冲液，但是使用的梯度为40分钟内从10到50%，流速为每分钟0.8ml。具有Trp的典型吸收光谱的亚级份的特征在于25分钟处的单峰，其与TatOyiSer22具有相同的保留时间(数据未显示)。突变不改变iTatOyi的疏水性。使用在HPLC中在25分钟处具有单峰的亚级份，观察到了对应于！"atOyiCys22的预计11578丽的质量(图3)。通过质谱没有观察到污染物。有趣的是，注意到了使用在-22°C储存6个月后的Tat0yiCys22获得了同样的质谱图。活性成分不存在降解对于疫苗接种活动来说是令人鼓舞的。纯化的！"atOyiCys22的总量相当于^Onm处OD单位的三分之一和蛋白物质的总量的1/5。使用TatOyiCys22进行了进一步的表征，例如反式激活分析(图4)和圆二色性(图5)。反式激活分析使用TatHXB2作为对照进行。使用TatOyiCys22观察到了与TatHXB2水平相似的反式激活，而变体TatOyiSer22不能进行反式激活。Cys22突变使得能够让生物学测试显示出TatOyiCys22具有与其他有活性Tat变体相似的结构。在同一天，对iTatOyiCys22和TatOyiSer22进行了圆二色性(CD)。CD光谱(图5)显示，突变Cys22Ser不诱导能够使用⑶检测到的结构变化。为了评估可能由突变诱导但是不能用CD检测到的可能的变化，进行了TatOyiCys22和TatOyiSer22的分子建模(图6)。分子建模证实了突变kr22Cys不诱导结构性变化。Ser与Cys之间的唯一差别是侧链中的不同原子(氧代替硫)。硫和氧在门捷列夫表的同一族中，共有作为亲核物质的化学相似性。硫比氧大，与硫相连的氢比与氧相连的氢更不稳定。这似乎是为什么iTat0yiCys22能够反式激活而Tat0yikr22不能的唯一解释。有趣的是，观察到了含有Glu100突变的C-末端与Tat变体中具有最保守序列的区域3和4非常接近。实施例3使用！"atOyiCys22免疫接种使用TatOyiCys22(SEQIDNO2)进行了小鼠的免疫接种。使用比临床试验所计划使用的浓度高1000倍浓度的TatOyiCys22，在小鼠上没有观察到毒性(数据未显示)°参考文献AddoMM,AltfeldΜ,RosenbergES,EldridgeRL,PhilipsMN，HabeebK,KhatriA,BranderC,RobbinsGK,MazzaraGP,GoulderPJ,WalkerBD；andHIVControllerStudygroup:TheHIV-IregulatoryproteinsTatandRevarefrequentlytargetedbycytotoxicTlymphocytesderivedfromHlV-l-infectedindividuals.(HIV-1调控蛋白Tat和Rev经常被源自于HIV-1感染的个体的细胞毒性T淋巴细胞靶定)NatlAcadSciUSA2001,98，1781-1786.Alimonti,J.B.,Kimani,J.,Matu,L.,Wachihi,C.,Kaul,R.,Plummer,F.A.,&Fowke,K.R.CharacterizationofCD8T-cellresponsesinHIV-I-exposedseronegativecommercialsexworkersfromNairobi,Kenya.(在来自肯尼亚内罗毕的暴露于HIV-I的血清反应阴性的商业性工作者中⑶8T-细胞应答的表征)ImmunolCellBiol.2006,84:482-485.Allen,Τ.Μ.，L.Mortara,B.R.Mothe,Μ.Liebl,P.Jing,B.Calore,Μ.Piekarczyk,R.Ruddersdorf,D.H.0'Connor,Χ.Wang,C.Wang,D.B.Allison,J.D.Altman,A.Sette,R.C.Desrosiers,G.Sutter,andD.I.ffatkins.Tat-vaccinatedmacaquesdonotcontrolsimianimmunodeficiencyvirusSIVmac239replication.(Tat疫苗接种的猕猴不控制猿免疫缺陷病毒SIVmac239的复制)J.Virol.2002，76:4108-4112.AryaSK,GuoC,JosephsSF,Wong-StaalF:Trans_activatorgeneofhumanT-IymphotropicvirustypeIII(HTLV-III)(人类III型嗜T-淋巴细胞病毒(HTLV-III)的反式激活子基因)Science1985,229:69-73.Barany,G.&Merrifield,R.B.Thepeptide:Analysis,Synthesis,Biology.(月太分析、合成、生物学)第2卷.GrossE编著，MeinhoferJ.AcademicPress,NewYork,19801-284.Barre-SinoussiF,ChermannJC,ReyF,NugeyreMT,ChamaretS,GruestJ,DauguetC,Axler-BlinC,Vezinet-BrunF,RouziouxC,RozenbaumW,MontagnierL.IsolationofaT-Iymphotropicretrovirusfromapatientatriskforacquiredimmunedeficiencysyndrome(AIDS).(从具有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)风险的患者分离嗜T-淋巴细胞反转录病毒)1983.Science.1983，220:868-871.BellCM,ConnellBJ,CapovillaA,VenterWD,StevensWS,PapathanasopoulosMA:MolecularcharacterizationoftheHIVtypelsubtypeCaccessorygenesvif，vpr,andvpu.(1型HIVC亚型的附属基因vif、vpr和vpu的分子表征)AIDSResHumRetroviruses2007，23:322-330.BelliardG，RomieuA，ZaguryJF,DaliH，Chaloin0，LeGrandR，LoretE，BriandJP,RoquesB，DesgrangesC，MullerS.SpecificityandeffectonapoptosisofTatantibodiesfromvaccinatedandSHIV—infectedrhesusmacaquesandHIV-infectedindividuals.(来自疫苗接种和SHIV感染的恒河猕猴和HIV感染的个体的Tat抗体对凋亡的特异性和影响)Vaccine.2003,21:3186-3199.BerkhoutB，SilvermanRH,JeangKT.Tattrans-activatesthehumanimmunodeficiencyvirusthroughanascentRNAtarget.(Tat通过新生RNA革巴反式激活人类免疫缺陷病毒)Cell.1989,59:273-282.BhoopatL，RithapornTS,KhunamornpongS，BhoopatT，TaylorCR,ThornerPS:CellreservoirsinlymphnodesinfectedwithHIV-lsubtypeEdifferfromsubtypeB-identificationbycombinedinsitupolymerasechainreactionandimmunohistochemistry.(HIV-1E亚型与B亚型感染的淋巴结中的细胞储库的差异通过原位聚合酶链反应和免疫组织化学的组合进行鉴定)ModPathol2006,19:255-263.BresV，TagamiH，PeloponeseJM,LoretE，JeangKT,NakataniY，EmilianiS，BenkiraneM，KiernanRE.DifferentialacetylationofTatcoordinatesitsintera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